CN103596968B

CN103596968B - 用于亲和层析的洗涤溶液和方法

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Publication number: CN103596968B
Application number: CN201280027076.2A
Authority: CN
Inventors: A·弗劳恩舒
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2011-06-01
Filing date: 2012-05-31
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2032-05-31
Also published as: EP3428176A1; AU2012264626A1; MX2013014032A; US20140094593A1; WO2012164046A1; BR112013030628B1; KR20140029465A; SG194460A1; RU2013156669A; ES2688348T3; AU2012264626B2; DK2714714T3; US9663552B2; JP2014515389A; MX341620B; EP2714714B1; IL229237A0; BR112013030628A2; JP2017160215A; KR101953405B1

Abstract

本发明提供用于亲和层析的洗涤方法，其中包含精氨酸或精氨酸衍生物、pH大于8.0的洗涤溶液在没有非缓冲盐的情况下有效移除杂质，而同时增加洗脱物中的产物浓度并维持高百分比产量的回收产物。

Description

用于亲和层析的洗涤溶液和方法

发明背景

在亲和层析期间有效移除杂质是蛋白下游加工中的关键因素，所述杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)和产物相关杂质，如高分子量(HMW)和低分子量(LMW)物质。第一纯化步骤(“捕获步骤”)后的蛋白纯度显著影响生成纯化产物所需的后续步骤的类型和数目。所述捕获步骤同样关键，因为其浓缩产物，其使得在后续纯化步骤中可以应用按比例而言更小、费用更低的柱。因此，在第一层析步骤中优化杂质移除是重要的。在抗体纯化的情况中，该第一步骤通常基于对蛋白A或衍生物的亲和性。

需要低pH条件(如pH3–4)以从亲和柱中洗脱结合的目标蛋白，但低pH条件存在可能引起聚集的弊端。历史上，使用不太严格的条件如pH5–5.5以从柱中洗涤非特异性结合的杂质，而同时保留目标蛋白-蛋白A相互作用。然而，由于这些条件下(特别是在高加样密度下运作时)的目标蛋白部分洗脱，回收通常减少。

已显示氨基酸精氨酸使某些沉淀蛋白溶解(M,Tsumoto K,Nitta S,Adschiri T,Ejima D,Arakawa T和Kumagai I.Biochem.Biophys.Res.Commun.328,189-197(2005);Umetsu M,Tsumoto K,Hara M,Ashish K,Goda S,Adschiri T,Kumagai I.J BiolChem.2003年3月14日;278(11):8979-87)，减少聚集物形成(Arakawa T,TsumotoK.Biochem Biophys Res Commun.2003年4月25日;304(1):148-52)和Arakawa T,Biophys.Chem.127(2007),第1–8页(综述))并降低蛋白与表面的非特异性吸附(Ejima D,JChromato A,05和Schneider CP,J.Phys.Chem.B113(2009),第2050–2058页)。此外，与盐酸胍相反，未显示精氨酸使蛋白去折叠(Arakawa T,Biochem.Biophys.Res.Commun.304(2003),第148–152页和Nakakido M,Biophys.Chem.137(2008),第105–109页)。

如此，已使用精氨酸从亲和层析柱和其他类型纯化柱中洗脱蛋白。例如，Arakawa等描述使用包含0.5-2.0M精氨酸、pH4.1-5.0的洗脱缓冲液从蛋白A柱洗脱抗体的方法(Arakawa等.(2004)Protein Expression and Purification36:244-248;Tsumoto,K.等.(2004)Biotechnol.Prog.20:1301-1308;美国专利公开号20050176109)。另外，Ejima等的美国专利号7,501,495描述通过包含盐酸精氨酸的流动相溶液(developing solution)从凝胶过滤柱中洗脱蛋白的方法。Ghose等描述使用精氨酸梯度作为洗脱剂从未衍生化硅石中洗脱感兴趣的蛋白的方法(Ghose,S.等.(2004)Biotech.Bioeng.87:413-423)。Coffman等的美国专利公开号20030050450描述从包含Fc的分子与蛋白A的复合体中分离包含Fc的分子的方法，其中Fc/蛋白A复合体被加至疏水性相互作用柱(HIC)且所述柱用包含精氨酸的缓冲液洗涤。

Barron等描述用于蛋白A层析的中间洗涤溶液，所述洗涤溶液包含有溶于pH5.0-7.5磷酸盐/乙酸盐缓冲液的0.5-2.0M精氨酸(优选1M精氨酸，0.1M磷酸盐/乙酸盐缓冲液，pH5.0)。据报道此精氨酸洗涤步骤移除HCP污染物。该作者还测试了包含0.5-2.0M氯化钠、pH5.0-7.5的中间洗涤溶液，并报道NaCl洗涤不显示显著HCP减少(Barron等.,“ImprovingPurity on Protein A Affinity Media Through Use of an Arginine IntermediateWash Step(通过使用精氨酸中间洗涤步骤改善蛋白A亲和介质上的纯度)”,http:// www.priorartdatabase.com/IPCOM/000127319)。此外，Barron等报道降低洗涤缓冲液的pH在实验所用条件下产生有益效果。

长期以来一直需要改进技术以提高纯化过程和增加产物回收。本公开针对此需求并提供额外的益处。

发明内容

本发明提供用于亲和层析的有效率且强力的洗涤溶液以及使用此溶液的洗涤方法。此洗涤溶液在洗脱步骤前的洗涤步骤中应用，且所述应用可从加至基质上的起始材料中有效移除低分子量物质(LMW)、高分子量物质(HMW)和宿主细胞蛋白(HCP)，同时产生洗脱自亲和基质的高产量感兴趣的蛋白。此洗涤溶液的特征在于在高pH即8.0以上存在精氨酸，而不存在非缓冲盐。在高pH的所述精氨酸(或精氨酸衍生物)组合比更低pH的包含精氨酸的洗涤溶液移除显著更多杂质，并产生与高浓度的回收感兴趣的蛋白相关联的更尖的洗脱峰。

因此，在一个实施方式中，本发明提供使用结合感兴趣的蛋白的亲和层析(AC)基质来生成感兴趣的纯化蛋白(如抗体、抗体片段或蛋白)的方法，所述方法包括用包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0的pH、且不存在非缓冲盐的情况下洗涤AC基质。在一个优选实施方式中，所述洗涤溶液的pH为至少8.1，更优选至少8.5，甚至更优选至少8.9或9.0。在一个实施方式中，所述洗涤溶液的pH为约8.5-9.5。在另一个实施方式中，所述洗涤溶液的pH为约8.9-9.0。

在另一个实施方式中，所述方法还包括(a)将包含感兴趣的蛋白的混合物加样到AC基质上，(b)用包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0的pH洗涤AC基质；和(c)从AC基质洗脱感兴趣的蛋白，其中洗涤在没有非缓冲盐的情况下进行。

在一个特定实施方式中，所述AC基质是蛋白A基质。在各种其他实施方式中，所述AC基质选自蛋白G柱、蛋白A/G柱、蛋白L柱、固定化金属离子亲和层析(IMAC)柱、钙调节蛋白树脂柱、MEP HyperCel^TM柱、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱、结合谷胱甘肽S转移酶(GST)的柱、结合Strep-标签II的柱、和染料-亲和柱。在其他实施方式中，所述AC基质包含选自CaptureSelect IgG-CH1、CaptureSelect IgG-Fc(Hu)、CaptureSelect LC-kappa(Hu)、CaptureSelect LC-lambda(Hu)、CaptureSelect IgG4(Hu)、CaptureSelect IgG1(Hu)、CaptureSelect IgG3(Hu)、CaptureSelect IgM和CaptureSelect IgA的树脂。在其他实施方式中，所述AC基质包含选自IgSelect、KappaSelect、LamdaFabSelect、和Capto L的树脂。

感兴趣的合适蛋白包括但不限于抗体(和其他包含Fc区的蛋白，如Fc融合蛋白)和抗体片段，尽管本文所述结合亲和基质的其他蛋白也适合根据发明方法进行纯化。

另一方面，本发明提供使用蛋白A柱来生成纯化抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(如Fc融合蛋白)的方法，所述方法包括(a)将包含抗体、抗体片段、或蛋白的混合物加样到蛋白A柱上；(b)用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0(如约8.5-9.5或约8.9-9.0)的pH下洗涤蛋白A柱；和(c)从蛋白A柱洗脱抗体、抗体片段、或蛋白，其中洗涤在没有非缓冲盐的情况下进行。

另一方面，所述方法任选地包括在加样至蛋白A柱和/或将感兴趣的蛋白(如抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(例如Fc融合蛋白))从蛋白A柱洗脱前平衡蛋白A柱。例如，本发明提供使用蛋白A柱来生成纯化抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(如Fc融合蛋白)的方法，所述方法包括(a)平衡蛋白A柱(如使用平衡缓冲液，以调节pH和移出任何剩余贮存缓冲液)；(b)将包含抗体、抗体片段、或蛋白的混合物加样到蛋白A柱上；(c)用包含(i)精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0(如约8.5-9.5或约8.9-9.0)的pH洗涤蛋白A柱；和(d)从蛋白A柱洗脱抗体、抗体片段、或蛋白，其中洗涤在没有非缓冲盐的情况下进行。所述方法还包括在洗脱抗体、抗体片段、或蛋白前平衡蛋白A柱的步骤。

在一个特定实施方式中，所述洗涤溶液包含精氨酸或精氨酸-HCl，优选在约0.1-0.5M浓度范围内。在另一个特定实施方式中，精氨酸或精氨酸-HCl以0.25M或约0.25M的浓度存在。在其他特定实施方式中，所述洗涤溶液包含精氨酸衍生物，如选自乙酰精氨酸、N-α-丁酰-精氨酸、胍基丁胺、精氨酸(arginic acid)和N-α-特戊酰精氨酸的衍生物。

本发明方法在移除多种杂质方面有效，包括高和低分子量(分别为HMW和LMW)物质以及宿主细胞蛋白(HCP)。在一个特定实施方式中，所述洗涤溶液还包含一种或多种缓冲盐(如乙酸钠、磷酸钠或Tris)。

发明详述

本发明提供用于亲和层析如蛋白A层析的改良洗涤溶液，所述洗涤溶液在洗脱感兴趣的蛋白前加至柱上以移除杂质。所述改良洗涤溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物，pH大于8.0(如pH大于8.1，优选pH大于8.5，例如约8.5-9.5或约8.9-9.0)，不存在非缓冲盐。所述洗涤溶液通常是水溶液。

精氨酸或精氨酸衍生物在高pH的此独特组合比常用过程移除显著更多的杂质，而不影响回收。另外，此洗涤条件产生与洗脱物中更高浓度感兴趣的蛋白相关联的更尖洗脱峰，这对提高其他下游纯化工艺的性能有利。

有效移除杂质是感兴趣的蛋白的下游加工中的关键因素，所述杂质包括宿主细胞蛋白(HCP)和产物相关杂质，如高分子量(HMW)物质和低分子量(LMW)物质。亲和层析是感兴趣的蛋白(如抗体)多阶段纯化工艺的第一阶段，亲和层析后的感兴趣的蛋白的纯度显著影响后续纯化步骤的种类和数目。亲和层析的另一重要作用是浓缩产物，其使得可以在后续纯化步骤中应用按比例而言更小、费用更低的柱和储器(袋或钢槽)。因此，在亲和层析步骤中优化杂质移除而同时维持高中间浓度且不影响产量是特别重要的。

根据基质，低pH条件(通常为pH3–4)是从亲和基质洗脱感兴趣的结合蛋白的必要条件但具有可能引起聚集的缺点。历史上，使用不太严格的条件如pH5–5.5以从柱中洗涤非特异性结合的杂质，而同时保持感兴趣的蛋白和亲和基质的相互作用。然而，由于这些条件下(特别是在高加样密度下运作时)的感兴趣的蛋白部分洗脱，所述感兴趣的蛋白的回收通常减少。因此，在一个优选实施方式中，本发明提供的洗涤溶液优选在大于8.0的pH(如优选pH大于8.1，更优选pH大于8.5，例如约8.5-9.5或约8.9-9.0)下表现优异，其保持感兴趣的蛋白和亲和基质的结合，同时能移除杂质。

精氨酸洗涤通常包括非缓冲盐。然而，本发明的一个优势是本发明所用的洗涤步骤不需要存在非缓冲盐。本文所用的术语“非缓冲盐”指具有某一类型和浓度的盐，当在所用条件(如高pH)下加入酸或碱后该盐对维持洗涤溶液pH没有实质性贡献。非缓冲盐包括离子盐、卤素盐，包括包含Cl或Br的盐，特别是包含碱金属或碱土金属的卤素盐，所述碱金属或碱土金属包括钠(Na)、钾(K)、钙(Ca)或镁(Mg)、钠(Na)或钾(K)(即NaCl、KCl、CaCl₂和MgCl₂)。在一个特定实施方式中，所述洗涤在没有NaCl情况下进行。

术语“非缓冲盐”不包括缓冲盐，如乙酸钠、磷酸钠和Tris，这些盐在所用条件下对于维持洗涤溶液pH具有实质性贡献。因此，所述缓冲盐可包括在本发明洗涤溶液中。

普通收获物或细胞提取物中存在的杂质的高度生物物理多样性产生与层析介质固相和/或感兴趣的结合蛋白的非常多样化的相互作用模式。杂质的或强或弱的束缚可能是两种分子间非共价分子间相互作用的结果，如氢键、静电作用、疏水和范德华力或这些相互作用类型的组合。因此，发现数种不同机制的组合(即精氨酸或精氨酸衍生物与pH大于8.0组合)在移除杂质方面比传统技术更有效。

在洗涤溶液中使用精氨酸的情况下，据报道精氨酸能使某些沉淀蛋白溶解(Umetsu,M.等.(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.328:189-197;Tsumoto,K.等.(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.312:1383-1386)，减少聚集物形成(Arakawa,T.等.(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.304:148-152)，并降低蛋白与表面的非特异性吸附(Ejima,D.等.(2005)J.Chromatogr.A.1094:49-55)。尽管没有意图受机制限定，蛋白聚集减少可能源自对蛋白上疏水片的掩蔽，所述疏水片与精氨酸相互作用。此相互作用可在精氨酸上胍基团与蛋白上色氨酸基团之间发生，或通过精氨酸聚集形成疏水片，或可以是所述效果的组合。

本文所用的短语“高pH”指pH大于8.0，其与先前洗涤方法所用的包含精氨酸或精氨酸衍生物、在低或中性pH(如约5.0-7.0的pH)的洗涤溶液相比引起杂质的显著降低。例如，在一个实施方式中，与包含精氨酸处于低pH或中性7.0的pH的洗涤溶液相比，“高pH”洗涤引起HCP下降至少约2-3倍，和/或LMW水平下降至少约3-4倍，和/或聚集总体下降至少约30-50%或更多。

在特定实施方式中，所述洗涤溶液的“高”pH为至少约8.1，优选至少约8.5，更优选至少约8.5–9.5或约8.9-9.0。所述洗涤的示例性“高”pH条件包括例如，8.1或约8.1、8.2或约8.2、8.3或约8.3、8.4或约8.4、8.5或约8.5、8.6或约8.6、8.7或约8.7、8.8或约8.8、8.9或约8.9、9.0或约9.0、9.1或约9.1、9.2或约9.2、9.3或约9.3、9.4或约9.4、9.5或约9.5、10.0或约10.0、10.1或约10.1、10.2或约10.2、10.3或约10.3、10.4或约10.4和10.5或约10.5的pH值。所述洗涤溶液还可包含一种或多种缓冲液(即缓冲盐)以调整和/或维持pH。所述洗涤溶液可包括的典型缓冲液的非限制性示例包括Tris(三(羟甲基)甲胺)、bis-Tris、bis-Tris丙烷、组氨酸、三乙醇胺、二乙醇胺、甲酸盐、乙酸盐、MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)、磷酸盐、HEPES(4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸)、柠檬酸盐、MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸)、TAPS(3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸)、Bicine(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)、TES(2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N’-二(2-乙磺酸)、甲次砷酸盐(二甲胂酸)和SSC(柠檬酸钠盐水)。

发明的纯化方法在移除多种杂质方面有效，包括高和低分子量(分别为HMW和LMW)物质以及宿主细胞蛋白(HCP)。如实施例所详述，所述方法在减少洗涤洗脱物中的HMW物质、LMW物质、和HCP方面有效，同时获得高百分比产量的感兴趣的蛋白和高浓度的感兴趣的蛋白。例如，在多个实施方式中，本文所述方法产生高于97%，更优选高于98%，最优选高于99%产率的感兴趣的蛋白。

在其他实施方式中，本发明方法导致洗脱物中HMW或LMW污染物的百分比下降，该下降为至少约2倍下降，更优选至少约3倍下降，更优选至少约4倍下降，更优选至少约5倍下降，甚至更优选至少约6倍下降。在其他实施方式中，所述方法导致洗脱物中HCP的对数下降值(LRV)为至少约1.1、或至少约1.2、或至少约1.3、或至少约1.4、或至少约1.5、或至少约1.6、或至少约1.7、或至少约1.8、或至少约1.9、或至少约2.0、或至少约2.1、或至少约2.2、或至少约2.3、或至少约2.4、或至少约2.5、或至少约2.6、或至少约2.7、或至少约2.8、或至少约2.9、或至少约3.0。

尽管没有意图受限于某机制，高pH可能部分使HCP和HMW变性，而包括单体抗体在内的稳定蛋白在这些条件下不受影响。污染蛋白的变性可表现为微小的结构变化，这足以弱化非特异性结合。因此，所述洗涤溶液的高pH可通过使杂质与感兴趣的结合蛋白或亲和基质固体支持物的相互作用去稳定而有益于增加杂质移除。

因此，一方面，本发明提供使用结合感兴趣的蛋白的亲和层析(AC)基质来生成纯化蛋白(如抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(如Fc融合蛋白))的方法，所述方法包括在不存在非缓冲盐的情况下，用包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0的高pH(如优选pH大于8.1，更优选pH大于8.5，例如约8.5-9.5或约8.9-9.0)洗涤AC基质；之后从AC基质洗脱感兴趣的蛋白。AC基质任选地可在加样感兴趣的蛋白和/或洗脱感兴趣的蛋白之前被平衡。

本文所用的术语“亲和层析基质”或“AC基质”意在指固相介质，通常是凝胶或树脂，其能在感兴趣的蛋白和AC基质之间高特异性结合相互作用(如受体和配体、酶和底物或抗原和抗体之间)基础上分离生化混合物。因此，所述固相介质包含感兴趣的蛋白能根据缓冲条件可逆粘附的靶标。能组成AC基质的固定或固相介质的非限制性示例包括凝胶基质如琼脂糖珠(例如市售可得的琼脂糖凝胶基质)、和玻璃基质如多孔玻璃珠(例如市售可得的ProSep基质)。

感兴趣的蛋白与AC基质的结合通常经柱层析实现。即AC基质在柱内形成，包含感兴趣的蛋白的生化混合物流过所述柱，然后通过洗涤溶液流经该柱来洗涤柱，接着通过洗脱缓冲液流经该柱来从柱中洗脱感兴趣的蛋白。

或者，感兴趣的蛋白与AC基质的结合能通过批处理(batch treatment)实现，其中包含感兴趣的蛋白的生化混合物与AC基质在某一容器内一起孵育从而允许感兴趣的蛋白与AC基质结合，所述固相介质从所述容器中移除(如通过使用真空泵离心或过滤)，洗涤所述固相介质以移除杂质并再次回收(如通过使用真空泵离心或过滤)并从所述固相介质中洗脱感兴趣的蛋白。

在另一个实施方式中，可使用批处理和柱层析的组合。例如，感兴趣的蛋白与AC基质的初始结合能通过批处理实现，然后所述固相介质可被装入柱中，接着洗涤所述柱并从柱中洗脱感兴趣的蛋白。

特定固相基质的性质(尤其是固相附着的靶标的结合性质)决定能用该固相基质纯化的蛋白类型。例如，在本发明的一个优选实施方式中，AC基质是蛋白A柱，其包含一种细菌细胞壁蛋白(即蛋白A)作为固相附着的靶标，所述蛋白A特异性结合某些免疫球蛋白Fc区内的CH2和CH3结构域。本领域已明确蛋白A的结合性质。

因此，在本发明的优选实施方式中，感兴趣的蛋白(待纯化)是抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(如Fc融合蛋白)。此外，能用蛋白A层析纯化的其他蛋白包括包含Fc蛋白(如Fc融合蛋白)。只要任何蛋白能特异性结合蛋白A基质，其能根据发明方法纯化。多种蛋白A树脂在本领域熟知且适用于本发明。市售可得的蛋白A树脂的非限制性示例包括MabSelect、MabSelect Xtra、MabSelect Sure、重组蛋白A琼脂糖凝胶FF、rmp蛋白A琼脂糖凝胶FF、蛋白A琼脂糖凝胶CL-4B和n蛋白A琼脂糖凝胶4FF(均可市售获自通用电气医疗集团(GE Healthcare));ProSep A、ProSep-vA高容量、ProSep-vA Ultra和ProSep-Va UltraPlus(均可市售获自密理博(Millipore));Poros A和Mabcapture A(均可市售获自Poros);IPA-300,IPA-400和IPA-500(均可市售获自RGEN公司(RepliGen Corp.));Affigel蛋白A和Affiprep蛋白A(均可市售获自伯乐公司(Bio-Rad));蛋白A Ceramic Hyper D F(市售获自颇尔公司(Pall Corporation));Ultralink固定蛋白A和琼脂糖蛋白A(均可市售获自皮尔斯(PIERCE));以及蛋白ACellthru300和蛋白A Ultraflow(均可市售获自SterogenBioseparations)。

在另一个实施方式中，所述树脂是CaptureSelect IgG-CH1(适于纯化人IgG和所有Fab片段)、CaptureSelect IgG-Fc(Hu)(特异于人IgG，识别所有4个亚类)、CaptureSelect LC-κ(Hu)(适于纯化所有包含人κIg轻链的产物(先前称为CaptureSelectFabκ))、CaptureSelect LC-lambda(Hu)(适于纯化所有包含人λIg轻链的产物(先前称为CaptureSelect Fabλ))、CaptureSelect IgG4(Hu)(高度特异于人IgG4，不与其它亚类或物种有任何交叉结合)、CaptureSelect IgG1(Hu)(高度特异于人IgG1，不与其它亚类或物种有任何交叉结合)、CaptureSelect IgG3(Hu)(高度特异于人IgG3，不与其它亚类或物种有任何交叉结合)、CaptureSelect IgM(适合人、小鼠和大鼠IgM'的IgM树脂)、或CaptureSelect IgA(适于纯化人IgA、IgA-二聚体和分泌型IgA(sIgA))，所有这些均可市售获自BAC。在另一个实施方式中，所述树脂是IgSelect(用于纯化人IgG的亲和介质)、KappaSelect(用于纯化Fab(κ)片段的亲和介质)、LamdaFabSelect(用于纯化λFab片段的亲和介质)、或Capto L(用于捕获抗体和抗体片段的树脂)，所有这些均可市售获自通用电气医疗集团生命科学部(GEHealthcare Life Sciences)。

能用于发明的其它亲和层析系统包括例如蛋白G、蛋白A/G和蛋白L柱，各自同样具有本领域已确立结合性质的免疫球蛋白结合细菌蛋白。因此，AC基质能用于纯化抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白(如Fc融合蛋白)，所述AC基质是蛋白G基质、蛋白A/G基质或蛋白L基质。

AC基质的其他非限制性示例和其能有效纯化的蛋白类型包括下列：固定化金属离子亲和层析(IMAC)柱(用于纯化有金属离子亲和性的蛋白，如带组氨酸尾的蛋白)、钙调节蛋白树脂柱(用于纯化标记有钙调蛋白结合肽(CBP)的蛋白)、MEP HyperCel^TM柱(选择性结合免疫球蛋白的纤维素基质)、结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的柱(如选择性结合标记有MBP的蛋白的糊精Sepharose^TM树脂)、结合谷胱甘肽S转移酶(GST)的柱(如选择性结合标记有GST的蛋白的谷胱甘肽Sepharose^TM树脂)、和结合Strep-标签II的柱(如选择性结合标记有Strep-标签II的蛋白的Strep-Tactin^TM琼脂糖凝胶树脂)。此外，包含抗体作为附于固相的靶标的免疫亲和基质能用于纯化与附于固相的抗体特异性结合的感兴趣抗原。

尽管本文特别结合使用蛋白A层析的抗体纯化描述了感兴趣的发明，只要本领域已知任何蛋白(包括融合蛋白)选择性结合特定AC基质，所述蛋白能适于用本文所述洗涤方法来纯化。

本文所用的术语“抗体”包括全抗体和任意抗原结合片段(即“抗原结合片段”(也称为“抗原结合部分”))或其单链。全抗体是包含有至少2条重(H)链和2条轻(L)链的糖蛋白，所述重链和轻链由二硫键相互连接。各重链包含重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域C_H1、C_H2和C_H3。各轻链包含轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域C_L。V_H和V_L区还能细分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其间散布有称为框架区(FR)的更保守区域。各V_H和V_L包含3个CDR和4个FR，以下列顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。所述抗体的恒定区能介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语“抗体”还包括抗体的多聚体形式，如单抗体、双-scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体和化学偶联的Fab′多聚体。

本文所用的术语“抗体片段”(也称为“抗原结合片段”或“抗原结合部分”)指保留特异性结合抗原能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段行使。术语“抗原结合片段”涵盖的结合片段示例包括(i)Fab片段，一种由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种本质为Fab与部分铰链区的二价片段(参见FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(《基础免疫学》)(Paul编,第3版,1993)；(iv)Fd片段，由V_H和C_H1结构域组成；(v)Fv片段，由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成；(vi)dAb片段(Ward等.,(1989)Nature341:544-546))，由V_H结构域组成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；和(viii)纳米抗体(也称为单域抗体(sdAb))，所述抗体是包含单个可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。单域抗体包括V_HH片段(工程改造自骆驼中所发现重链抗体的单域抗体)以及V_NAR片段(获自软骨鱼类重链抗体(IgNAR，‘免疫球蛋白新抗原受体’)的单域抗体)。

此外，尽管Fv片段的2个结构域即V_L和V_H由分开的基因编码，其可用重组方法通过合成接头连接，所述接头能使它们成为单一蛋白链，其中V_L和V_H区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等.(1988)Science242:423-426;和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。所述单链抗体还意在被术语抗体的“抗原结合片段”所涵盖。这些抗体片段用本领域技术人员已知的常规技术获得，所述片段用与完整抗体相同的方式筛选效用。本发明还涵盖嵌合分子(或融合分子)，所述分子包含与另一多肽或分子融合的抗原结合域或等价物。

发明的洗涤溶液包含精氨酸或精氨酸衍生物。能用于本发明的精氨酸可以是天然氨基酸精氨酸(如L-精氨酸)、D-精氨酸或精氨酸衍生物。本文所用的术语“精氨酸衍生物”指通过化学或物理方法从D或L-型精氨酸衍生的分子，所述分子保留精氨酸的两性离子、两性或两极特性(如其可打破结合树脂主干、蛋白A配体或已结合的目标蛋白的杂质之间的非特异性相互作用)。

精氨酸衍生物的非限制性示例包括酰化精氨酸，如乙酰精氨酸和N-α-丁酰-精氨酸、胍基丁胺、精氨酸和N-α-特戊酰精氨酸。精氨酸或精氨酸衍生物能以酸加成盐形式使用。能形成酸加成盐的酸示例包括盐酸等。其他衍生物包括但不限于3-胍基丙酸、4-胍基丁酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸盐酸盐、L-2-氨基-3-胍基丙酸盐酸盐、Nω硝基-L-精氨酸苄酯对甲苯磺酸盐和高精氨酸。

洗涤溶液中精氨酸或精氨酸衍生物的浓度通常为0.05-0.85M(20℃时水中精氨酸溶解度上限)(如0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.55M、0.6M、0.65M、0.7M、0.75M、0.8M或0.85M)，最优选0.1-0.5M(如0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M或0.5M)。在多个实施方式中，精氨酸或精氨酸衍生物的浓度可为例如0.05M、0.1M、0.2M、0.25M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M或0.8M、或0.1-0.5M。在某些实施方式中，洗涤溶液中精氨酸或精氨酸衍生物的浓度为0.25M或更高。在特定实施方式中，精氨酸存在的浓度为0.1M或约0.1M、0.25M或约0.25M、或0.5M或约0.5M。

尽管本文结合亲和层析中的洗涤步骤描述了本发明，普通技术人员清楚了解在洗涤步骤前后都进行额外步骤以实现从亲和层析基质中纯化感兴趣的蛋白。例如，在洗涤和/或洗脱步骤前，发明方法可包括对亲和层析基质进行平衡的平衡步骤，和/或将包含感兴趣的蛋白的生化混合物(如细胞收获物)加至AC基质的加样或捕获步骤。

合适的平衡缓冲液一般具有大致中性的pH以匹配加样溶液(～7.0+/-0.5)从而防止沉淀。其通常不必包含盐(NaCl)，而仅有浓度刚足以缓冲(>约20mM)的缓冲液(用于此pH范围的磷酸盐)。就平衡缓冲液而言的合适条件根据AC基质和待纯化感兴趣的蛋白的性质而变化，普通技术人员能用本领域完善的方法和信息容易确定所述条件。实施例中列出用于在蛋白A柱上纯化抗体的平衡缓冲液的非限制性示例。

另外，上述洗涤步骤后，本发明的方法可包括洗脱步骤，其中向亲和层析基质应用洗脱缓冲液以从所述基质中洗脱感兴趣的蛋白。就洗脱缓冲液而言的合适条件会根据AC基质和待纯化感兴趣的蛋白的性质而变化，普通技术人员能用本领域完善的方法和信息容易确定所述条件。从AC基质中洗脱感兴趣的蛋白通常在酸性pH完成。实施例中列出用于在蛋白A柱上纯化抗体的洗脱缓冲液的非限制性示例。

另一方面，本发明提供在蛋白A纯化抗体或其他包含Fc蛋白期间从包含抗体的混合物移除杂质的方法。因此，本发明提供使用蛋白A柱来生成纯化抗体、抗体片段、或包含Fc区的蛋白的方法，所述方法包括

(a)将包含抗体、抗体片段、或蛋白的混合物加样到蛋白A柱上；

(b)用包含精氨酸或精氨酸衍生物的洗涤溶液在大于8.0的pH(如pH大于8.1，优选pH大于8.5，更优选约8.5-9.5或约8.9-9.0)洗涤蛋白A柱；和

(c)从蛋白A柱洗脱抗体、抗体片段、或蛋白，其中洗涤在没有非缓冲盐的情况下进行。所述方法还任选地包括在从蛋白A柱洗脱抗体或抗体片段前用平衡缓冲液洗涤蛋白A柱。所述方法还任选地包括在加样感兴趣的蛋白和/或洗脱感兴趣的蛋白前平衡蛋白A柱。

精氨酸(和精氨酸衍生物)的优选浓度和浓度范围如上所述。例如，在一个实施方式中，精氨酸的浓度为约0.25M或0.25M。在另一个实施方式中，精氨酸的浓度范围为0.1-0.5M。优选的pH和pH范围也如上所述。例如，pH为大于8.0的pH(如优选pH大于8.1，更优选pH大于8.5，如约8.5-9.5或约8.9-9.0)。

本发明还通过下列实施例说明，所述实施例不应构成其他限制。所述实施例特别涉及本发明的优选实施方式。本申请中引用的所有参考文献、专利和公开专利申请的内容通过引用明确全文纳入本文。

实施例

实施例1：单独的高pH不增加产物纯度

本实施例中，评价仅凭pH对亲和层析期间从包含抗体的溶液中移除杂质的效果。具体地比较两种洗涤溶液：一种包含1M NaCl,pH7.0且一种包含1M NaCl,pH9.0。

通过深层过滤收获包含0.2-3.0g/L单克隆抗体#1的澄清、哺乳动物细胞培养物上清并用ALC柱(具体是蛋白A柱(通用电气医疗集团))根据下表1所述条件纯化：

表1：就实施例1而言蛋白A柱的操作条件

*RST,停留时间;**加样密度:根据预定的动态结合容量:每升树脂36g抗体

向平衡的柱加样澄清收获物并首先用W1-N7(1M NaCl，pH7.0)或W2-N9(1M NaCl，pH9.0)洗涤，如下表2所述：

表2：测试洗涤溶液列表

*,pH用1M Tris调整

然后，所述柱用表1所述平衡缓冲液洗涤(即20mM NaH₂PO4/Na₂HPO4，pH7.0)，随后在低pH洗脱。所述洗脱物通过分析型ALC来分析抗体浓度，通过分析型尺寸排阻层析(SEC)分析HMW/LMW，通过酶联免疫吸附试验分析HCP含量，所述试验在同一细胞系上展开。

下表3显示使用表2所示的2种不同洗涤溶液的蛋白A纯化的单克隆抗体#1的百分比产量。

表3：比较低和高pH对ALC表现的影响

*以ml计的加样→以g计的洗脱物

如表3所示，pH从中性(pH7.0)变化到碱性(pH9.0)对产量、洗脱物整体浓度(poolconcentration)、HMW或LMW物质水平或HCP水平没有影响。因此，这些结果显示仅凭高pH不引起产物纯度增加。然而，如下列实施例所示，高pH与精氨酸组合对产物纯度产生显著影响。

实施例2：精氨酸(与高pH组合)是关键赋形剂

本实施例中，比较多种洗涤的能力以确定哪种洗涤和pH对亲和层析期间从包含抗体的溶液移除杂质最有效。具体地比较四种洗涤溶液：一种包含1M NaCl,pH7.0；一种包含250mM精氨酸,pH7.0；一种包含250mM精氨酸,pH8.9；和一种包含500mM Tris,pH8.9。包含Tris以确定单独的Tris是否对移除杂质有影响。

通过深层过滤收获包含0.2-2.5g/L单克隆抗体#3的澄清、哺乳动物细胞培养物上清并用ALC柱(具体是蛋白A柱(通用电气医疗集团))根据下表4所述条件纯化：

表4：实施例2的蛋白A柱的操作条件

*RST,停留时间;**加样密度:每升树脂30g抗体

向平衡的柱加样澄清收获物并首先用W1-N7、W3-Arg7、W4-Arg9或W5-T9洗涤，如下表5所述：

表5：测试洗涤溶液列表

**,pH用1M Tris调整

然后，所述柱用表4所述平衡缓冲液洗涤(即20mM NaH₂PO4/Na₂HPO4,pH7.0)，随后在低pH洗脱。所述洗脱物通过分析型ALC来分析其抗体浓度，通过分析型尺寸排阻层析(SEC)分析HMW/LMW，通过酶联免疫吸附试验分析HCP含量，所述试验在同一细胞系上展开。

下表6显示使用表5所示的4种不同洗涤溶液蛋白A纯化的单克隆抗体#3的百分比产量。

表6：包含NaCl的ALC洗涤缓冲液与不同pH值下基于精氨酸的缓冲液和基于Tris的缓冲液的比较

*以ml计的加样→以g计的洗脱物;**未精确测定的HCP值;***，洗涤进行12CV而非6CV。

如表6所示，显然基于精氨酸的缓冲液在移除HMW、LMW和HCP方面比基于高盐的洗涤更有效。此外，此效果在高pH条件下放大。特别地，与包含精氨酸缓冲液在pH7.0(W3-Arg7)相比，没有非缓冲盐的情况下使用包含精氨酸缓冲液在8.9的高pH(W4-Arg9)引起HCP的3倍下降、LMW水平的4倍下降、和聚集物水平从2.3%降至1.5%。尽管产量相当，更高的pH还增加整体浓度。

由于Tris用于调整包含精氨酸缓冲液中的pH且需要接近300mM Tris以达到pH8.9，包括了包含500mM Tris在高pH(如W5-T9)的洗涤。然而，如表6所示，W5-T9对移除HMW或LMW没有影响。事实上，W5-T9的HCP水平甚至高于包含NaCl的洗涤。鉴于此洗涤在Tris的最佳条件下进行(例如，意味着与其他缓冲液所用最高浓度相比几乎2倍的Tris浓度和洗涤时间加倍)，结果提示单独Tris没有洗涤效果。此外，显然仅凭高pH不产生所需的杂质移除。

实施例3：精氨酸与高pH组合显著减少杂质

本实施例中，评价三种不同洗涤缓冲液条件对三种单克隆抗体纯度的影响。具体地比较三种洗涤溶液：(1)低pH(W6-Ace5)，(2)高盐(W1-N7)，(3)在高pH的精氨酸(W7-Arg9)。

通过深层过滤收获三种单克隆抗体(#1、#2、和#4)并用ALC柱(具体是蛋白A柱(通用电气医疗集团))根据下表7所述条件纯化：

表7：实施例4的蛋白A柱的操作条件

*RST,停留时间;**加样密度:根据预定的动态结合容量:分别为每升树脂36/42/36g抗体By/Qg/Bp;***,若洗涤1为20mM乙酸钠,pH5.0，则省略步骤。

向平衡的柱加样澄清收获物并首先如下表8所述洗涤：

表8：测试洗涤溶液列表

*,与W4-Arg9相似，但pH调整使用L-精氨酸，而不是Tris

然后，所述柱用表7所述平衡缓冲液洗涤(如20mM NaH₂PO4/Na₂HPO4,pH7.0)，随后在低pH洗脱。所述洗脱物通过分析型ALC来分析其抗体浓度，通过分析型尺寸排阻层析(SEC)分析HMW/LMW，通过酶联免疫吸附试验分析HCP含量，所述试验在同一细胞系上展开。

表9概括了不同ALC洗涤缓冲液条件对洗脱物中三种单克隆抗体纯度的影响，

由抗体产量、洗脱物整体浓度、HCP水平和HMW水平评价。

表9：就三种单克隆抗体(#1、#2和#4)而言用低pH(W6-Ace5)、高盐(W1-N7)或精氨酸在高pH(W7-Arg9)洗涤后ALC表现的比较总结

粗体行代表收获物组成;浓度,洗脱物浓度;HCP,宿主细胞蛋白;HMW,高分子量物质;LRV,对数下降值;NA,不适用。

如上表9所示，用低pH(W6-Ace5)洗涤产生84.5-94.8%的产量(平均：90.7%)且用高盐(W1-N7)洗涤产生平均98.7%产量(97.6-100%)。用精氨酸在高pH(W7-Arg9)洗涤产生所有3种洗涤的最高产量，平均97.2%产量(94.1-98.8%)。

比较ALC中应用的不同洗涤缓冲液与不同抗体时，洗脱物浓度不显示清晰趋势。总体上，发现彼此相当的范围且没有一种洗涤恒定地产生最低或最高浓度。

在杂质移除方面，能在三种洗涤缓冲液间确立一般顺序。用低pH洗涤(W6-Ace5)恒定获得最低HCP下降，然后是高盐洗涤(W1-N7)。用精氨酸、高pH9.0洗涤(W7-Arg9)获得最高的杂质移除。特别地，就移除的对数级而言，用低pH洗涤(W6-Ace5)后获得平均1.3log，高盐洗涤(W1-N7)后获得1.6log且精氨酸、高pH9.0洗涤(W7-Arg9)后实现1.9log的最高移除。

在HMW水平方面，这些水平就三种不同单克隆抗体而言不统一且HMW的移除是单克隆抗体依赖性的。总体上，低pH洗涤(W6-Ace5)在降低HMW水平方面是效果最差的洗涤溶液。用高盐洗涤(W1-N7)获得较好结果。然而，用精氨酸、高pH9.0洗涤(W7-Arg9)恒定地获得ALC洗脱物中最低的HMW值。与高pH9.0洗涤(W7-Arg9)相比，低pH洗涤(W6-Ace5)中两种单克隆抗体分别呈现HMW的3.1或3.9倍下降，而单克隆抗体#2仅显示边际下降。

总之，本实施例证明精氨酸和高pH的新组合相较标准洗涤缓冲液显著改善抗体纯度和浓度，如产量、整体浓度、HCP整体含量和HMW整体水平所测定的。用精氨酸和高pH的特定组合洗涤产生较高产物纯度和较高洗脱物浓度，同时产物损失最小化。此外，HCP和HMW水平下降减少了后续下游加工步骤的负担并增加在质量和盈利方面的总体工艺表现。另外，由于任何污染物如HCP或HMW物质可成为进一步产物聚集的核，其在捕获步骤中的减少会减慢杂质相关的聚集过程。

Claims

1.一种使用结合感兴趣的蛋白的亲和层析(AC)基质来生成感兴趣的纯化蛋白的方法，所述方法包括用包含精氨酸的洗涤溶液在大于8.0的pH洗涤AC基质，其中所述洗涤在没有非缓冲盐的情况下进行，且所述方法还包括从AC基质洗脱感兴趣的蛋白，所述AC基质在洗脱感兴趣的蛋白前被平衡，所述AC基质是蛋白A柱，且其中所述感兴趣的蛋白是抗体、包含Fc区的抗体片段或Fc融合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含：

(a)将包含感兴趣的蛋白的混合物加样到AC基质上；

(b)用包含所述精氨酸的洗涤溶液在大于8.0的pH洗涤AC基质；和

(c)从AC基质洗脱感兴趣的蛋白，

其中所述洗涤在没有非缓冲盐的情况下进行，并且所述AC基质在洗脱感兴趣的蛋白前被平衡。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在加样蛋白A柱和/或从蛋白A柱洗脱抗体、抗体片段、或Fc融合蛋白前用平衡缓冲液平衡蛋白A柱。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH大于8.5。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH为8.5-9.5。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH为8.9-9.0。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述pH为9.0。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述精氨酸的浓度范围为0.1-0.5M。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述精氨酸浓度为0.25M。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤溶液包含精氨酸-HCl。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤溶液移除的杂质选自高分子量(HMW)物质、宿主细胞蛋白(HCP)和低分子量(LMW)物质。

12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤溶液包含一种或多种缓冲盐。