TW202304946A - 藉由混合模式層析純化抗體 - Google Patents
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Abstract
本文報導了一種使用混合模式層析材料生產或純化抗體的方法，該混合模式層析材料包含在流通模式下操作之離子交換官能基及疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX)，其中該抗體為親水性抗體，且該抗體係在包含該抗體及抗離液鹽的溶液中施加至 MM HIC/IEX 層析材料。
Description
本發明處於抗體純化的領域。特別地，本發明涉及用於生產或純化親水性抗體的方法，其中使用具有離子交換和疏水性交互作用功能的混合模式即（多模式）層析材料以流通模式處理抗體。特別地，該方法涉及在施加至混合模式層析材料的溶液中使用抗離液鹽。
單株抗體已被證明是一類非常成功的治療產品。為了使這些重組生物醫藥蛋白能夠被投予人類患者，重要的是從最終的生物產物中去除製造和純化過程中產生的雜質以及與產物相關的雜質。工藝成分包括培養基蛋白、免疫球蛋白親和配體、病毒、內毒素、DNA 和宿主細胞蛋白 (HCP)。與產物相關的其他雜質包括低分子量 (LMW) 雜質，如不完全組裝的抗體或片段。此外，高分子量 (HMW) 雜質如二聚體、三聚體、多聚體或一般聚集體也可能出現在醫藥抗體的生產中。
蛋白聚集現象是一個常見問題，它影響抗體的質量、安全性和功效，並且可能發生在製造過程的不同步驟中。在評估分子的質量屬性時，原料藥和最終藥物產物中的聚集位準是一個關鍵因素，因為聚集可能影響生物醫藥的生物活性。與單體蛋白的活性相比，聚集體的生物活性的差異可顯著削弱基於蛋白的藥物的效力。
在純化期間，層析法通常為主要有助於去除聚集體或 HMW 的步驟。應在與整個工藝純化系列的適合性和兼容性以及生產率、產量和產品質量的適當平衡的指導下選擇特定層析材料和操作模式。蛋白 A 親和層析法通常用作製造治療抗體的第一個純化步驟。該純化步驟通常不能或幾乎不能去除聚集體，因為產物聚集體可能與層析配體以及單體形式的產物相結合。已證明使用離子（陰離子和陽離子）交換層析法在生產規模上可用於從二聚體和 LMW 物質中分離抗體單體。WO 99/62936 報導了藉由使用離子交換層析法從聚集體中分離單體。可以藉由疏水性交互作用層析法 (HIC) 基於疏水性的差異來從聚集體中分離抗體單體，該 HIC 主要用於去除聚集體和雜質兩者，諸如 HCP（Lu, Y. et 等人, 2009, 《Curr Pharm Biotechnol 》 10(4):427-433）。抗體的疏水性隨著聚集而增加，這一事實具有重要的理論和實踐意義（Suda, E.J. 等人, 2009, 《J Chromatogr A》 1216(27):5256-5264）。此外，混合模式或多模式層析法已廣泛用於抗體純化和聚集體去除。例如 Gagnon 等人（2009, 《Curr Pharm Biotechnol》 10(4):434-439） 報告了藉由帶電疏水性混合模式層析法去除聚集體。還有 Gao 等人（2013, 《Journal of Chromatography A》, 1294 70-75）描述了使用混合模式層析法從相關聯聚集體中分離抗體單體。
除了減少與產物相關的雜質（如 HMW 或聚集體）之外，還需要在純化期間去除與工藝相關的雜質，如 HCP 或病毒顆粒。病毒污染係使用源自哺乳動物細胞株的生物技術產物的潛在風險。因此，為了保證這些產物在潛在病毒污染方面的安全性，監管機構要求進行病毒清除研究，以評估純化工藝清除內源性病毒和外源性病毒的能力。為了去除病毒污染，通常使用病毒過濾器和低 pH 滅活，但也可以使用層析工藝，如陰離子交換層析法（Ajayi 等人，2022, 《Current Research in Biotechnology》 4:190–202）。
儘管總體上並且特別是從 HMW 雜質中純化抗體單體以及藉由不同的層析材料去除病毒方面取得了這些進展，為實現更高純度和質量的抗體，仍有針對提高純化設置的需要和空間。
本文報導了一種在抗離液鹽的存在下使用包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基的混合模式/多模式層析材料來純化或生產親水性抗體的方法。
本發明至少部分基於出人意料的發現，即當在至少一種抗離液鹽的存在下，以流通液 (FT) 模式藉由包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式層析材料來純化包含親水性抗體和 HMW 的負載溶液時，可以成功減少抗體相關的高分子量雜質 (HMW)。在本發明的一個較佳實施例中，抗離液鹽存在於用於平衡層析材料、負載溶液和視情況的沖洗/漂洗溶液的平衡液（緩衝液）中。已經發現，可以在抗離液鹽的存在下對親水性抗體進行生產及/或純化，即 HMW 的減少，但是對於疏水性抗體或在離液鹽的存在下未能實現該效果。
此外，本發明至少部分基於出人意料的發現，即當在至少一種抗離液鹽的存在下，以流通液 (FT) 模式藉由包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式層析材料來純化包含親水性抗體和病毒雜質的負載溶液時，也可以成功減少病毒或病毒樣顆粒（例如 RVLP）的污染（即病毒雜質含量）。在本發明的一個較佳實施例中，抗離液鹽存在於用於平衡層析材料、負載溶液和視情況的沖洗/漂洗溶液的平衡液（緩衝液）中。已經發現，可以在抗離液鹽的存在下對親水性抗體進行生產及/或純化，即病毒雜質含量的減少，但是針對疏水性抗體，不存在該效果。
因此，本發明的一個態樣是一種使用（/利用）包含以流通模式操作的離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式/多模式層析材料來生產抗體的方法，其中
a) 抗體為親水性抗體，且
b) 在包含抗體和抗離液鹽的溶液中將抗體施加到 MM HIC/IEX。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，該方法進一步包括以下步驟：
c) 視情況地施加沖洗液，
d) 在 b) 的流通液中或視情況地在 b) 及 c) 的流通液中回收抗體，
及由此使用在流通模式下操作的 MM HIC/IEX 生產抗體。
本發明之另一個態樣是一種使用（利用）包含以流通模式操作的離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式/多模式層析材料來純化抗體的方法，其中
a) 該抗體為親水性抗體，且
b) 在包含抗體和抗離液鹽的溶液中將抗體施加到 MM HIC/IEX，
並且從而純化抗體。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX已用包含（相同）抗離液鹽的緩衝液來調整/平衡。在一個較佳實施例中，用於調適/平衡 MM HIC/IEX 的緩衝液也係步驟 b) 之溶液的緩衝液。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中
- 該方法係用於生產具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量及/或具有降低之病毒雜質含量的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種抗體相關 HMW 雜質及/或至少一種病毒雜質以及抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量及/或具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量及/或具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中
- 該方法係用於生產具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量和具有降低之病毒雜質含量的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種抗體相關 HMW 雜質和至少一種病毒雜質以及抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量和具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量和具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中
- 該方法係用於生產具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種抗體相關 HMW 雜質和抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量的抗體組成物。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，與在步驟 b) 中被施加到 MM HIC/IEX 的溶液相比，抗體相關 (HMW) 雜質含量降低。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，與基本上不含抗離液鹽的溶液相比及/或與包含疏水性抗體的溶液相比，抗體相關 (HMW) 雜質含量降低。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中
- 該方法用於生產具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種病毒雜質和抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，與在步驟 b) 中被施加到 MM HIC/IEX 的溶液相比，抗體病毒雜質含量降低。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，與基本上不含抗離液鹽的溶液相比及/或與包含疏水性抗體的溶液相比，病毒雜質含量降低。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，親水性抗體為在疏水性交互作用層析 (HIC) 材料上的滯留時間等於或小於利妥昔單抗 (rituximab)（在相同操作條件下在相同的 HIC 材料上）的滯留時間的抗體。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有作為配體之聚醚基（乙醚基）。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有具有以下結構 (-(OCH
2CH
2)
nOH) 的作為配體之聚醚基。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有聚甲基丙烯酸酯基材/基質。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有作為配體之聚醚基（乙醚基），具有 100 nm 的平均孔徑和 10 μm 的粒徑。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料為 TSKgel
®Ether-5PW 層析材料。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，使用（任一個其他實施例之） HIC 層析材料，在 75mm 的管柱長度、7.5mm 的內徑和流速為 8.8ml/min 的洗提緩衝液梯度下，對在 HIC 層析材料上的滯留時間進行測定，並且其中將抗體以 1mg/ml 的濃度施加到層析材料。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽具有範圍在 1.285 至 4.183 x 10E3 dyn*g*cm
-1*mol
-1（且包括端值）的莫耳表面張力增量。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物、硫酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或氟化物。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽為鈣鹽、鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽為鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：(NH
4)
2SO
4、Na
2SO
4、K
2SO
4、NaCl 和 KCl。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽的溶液具有（並且包括）0.5 至 120 mS/cm 的導電率。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，在包含抗體和抗離液鹽的溶液中，該抗離液鹽具有從（並且包括）10 mM 至 900 mM 的濃度。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，到 MM HIC/IEX 的負載量為每升層析材料 10 g 蛋白 (10 g/L) 或更高。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，到 MM HIC/IEX 的負載量為從（並且包括）每升層析材料 10g 蛋白 (10g/L) 至每升層析材料 650g 蛋白 (650 g/L)。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，到 MM HIC/IEX 的負載量為從（並且包括）每升層析材料 15g 蛋白 (15g/L) 至每升層析材料 350g 蛋白 (350 g/L)。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括）4.0 至 9.0 的 pH 值。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，HMW 雜質為具有 285 kDa 或更大的分子量的雜質。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，HMW 雜質為至少為抗體之二聚體、或三聚體或任何多聚體的雜質。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含陰離子交換官能基或陽離子交換官能基。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含強陰離子交換官能基。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 為 Capto
TMAdhere ImpRes、Capto
TMAdhere 或 Nuvia aPrime4A。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含弱陽離子交換官能基。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 為 Capto
TMMMC 或 Capto
TMMMC ImpRes。
本文報導了一種利用包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基的混合模式/多模式層析材料並使用負載溶液（本文中也表示為「負載」）中的抗離液鹽來純化或生產親水性抗體的方法。
本發明至少部分基於出人意料之發現，即當以流通液 (FT) 模式藉由
包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式層析材料來純化包含親水性抗體和高分子量雜質 (HMW) 的負載並且在層析法開始之前負載溶液中存在至少一種抗離液鹽時，可以成功減少
抗體相關 HMW。
更詳細且令人驚訝地發現，當所欲純化之抗體為親水性抗體且存在抗離液鹽時，HMW 之含量可顯著降低更多。相反，當純化疏水性抗體時，未觀察到添加抗離液鹽對於 HMW 減少的顯著影響。
本發明進一步至少部分基於以下發現，即該影響不能歸因於鹽莫耳濃度本身之增加。再者，隨著抗離液鹽的鹽莫耳濃度的增加，可以觀察到針對親水性抗體的積極效果，而針對疏水性抗體則無法觀察到該效果。
本發明進一步至少部分基於以下發現，即對於離液鹽無法顯示改善的 HMW 減少。
在第一組實驗（第 I 部分）中，顯示了在恆定導電率下抗體疏水性對 HMW 雜質減少之影響。
流通液 (FT) 運行是在機器人系統上利用 Capto
TMadhere ImpRes Robocolumns
TM(RC) 進行的。使用了五種抗離液 (ac) 鹽：Na
2SO
4、NaCl、(NH
4)
2SO
4、KCl 和 K
2SO
4。這些鹽與七種不同形式和特異性之單株抗體 (mab) 結合使用。收集 FT 並藉由 SE-HPLC 分析純度。將藉由向負載中添加抗離液鹽實現的 HMW 減少與利用相同緩衝液（即在相同的導電率下，但不含抗離液鹽）實現的 HMW 減少進行比較。已發現，僅對於親水性 mab（即依材料與方法項目 10 (MM-10) 在 HIC 層析中測定的滯留時間小於利妥昔單抗的滯留時間（滯留時間
mab≤ 滯留時間
利妥昔單抗）的mab，與在不存在抗離液鹽的情況下具有相同導電率的負載相比，藉由向負載中添加抗離液鹽來實現改善之 HMW 去除。與此相反，已發現對於疏水性 mab（滯留時間
mab＞ 滯留時間
利妥昔單抗），在添加抗離液鹽時未觀察到有利效果。
對於多種親水性抗體，已發現與在相同導電率下不含抗離液鹽的 Tris/Acetate 緩衝液中的負載溶液相比，當將抗離液鹽添加到負載溶液中時，HMW 減少值得到增加（參見圖 1 至 4；黑色實心圓）。已發現負載中抗離液鹽的存在導致針對 MM HIC/IEX 上的親水性 mab，HMW 減少有所改善。
與此相反，對於含有抗離液鹽的負載和不含抗離液鹽的負載，疏水性抗體之 HMW 減少值未增加（參見圖 5 至 7）。
為了計算池之 HMW 去除率，引入了趨勢線。針對示例性親水性 mab（圖 8A；mab2）和示例性疏水性 mab（圖 8B；mab7）示出了 FT 池之 HMW 去除率。針對 mab2，當將硫酸銨添加到負載時，總載量為 150 g/L 下的池 HMW 去除值從 35% 增加到 89%（參見圖 9A）。對於 550 g/L 之總載量，利用在負載中添加 (NH
4)
2SO
4，池 HMW 去除值從 17% 增加到 47%。與此相反，在具有和不具有抗離液鹽的情況下，mab7 之池 HMW 值相似。對於該疏水性 mab，池 HMW 去除值未藉由添加抗離液鹽而顯著提高（參見圖 9B）。
在不同的 pH 值（實例 1：pH 8；實例 2：pH 6）下可以看到相同的效果。已發現，當將抗離液鹽添加到負載溶液中時，親水性 mab 之 HMW 減少值顯著增加（參見圖 10 至 13）。與此相反，對於含有抗離液鹽的負載和不含抗離液鹽的負載，疏水性 mab 的 HMW 減少值是相當的（參見圖 14 至 16）。
在不同的導電率（實例 1/2：20 mS/cm；實例 3：10 mS/cm）下，可以看到相同的效果，參見圖 17（A 和 B）以及 18（A 和 B）。已發現，針對親水性 mab 的抗離液鹽的存在增加了 FT 餾份中 HMW 之減少值。對於疏水性 mab，當將抗離液鹽添加到負載中時，未觀察到 HMW 減少值之增加。已發現，藉由向負載中添加抗離液鹽來改善親水性 mab 之 HMW 減少的效果隨著 pH 值之增加而更加顯著。
在第二組實驗中，已顯示了抗離液鹽莫耳濃度對 HMW 去除率的影響。
進行了 RC 實驗和 Kp（分配係數）篩選以示出不同莫耳濃度的抗離液鹽對 HMW 減少之影響。已使用莫耳濃度高達 500 mM 之鹽。在 pH 8.0 下，測試了不同的鹽（Na
2SO
4、NaCl、(NH
4)
2SO
4、KCl 和 K
2SO
4）。已發現，鹽莫耳濃度的增加可以提高親水性抗體製劑的 FT 餾份中 HMW 的去除率（參見圖 19 至 23）。
進一步地，Kp 篩選示出了寬範圍的 pH 值和鹽莫耳濃度下，鹽莫耳濃度對 HMW 減少的影響（參見使用 Capto
TMadhere ImpRes 樹脂/層析材料的實例 5 和 6）。使用了三種 mab，即兩種親水性 mab 和一種疏水性 mab。研究的 pH 範圍為 pH 5.5 至 8.0 並且莫耳濃度範圍為 10 至 800 mM。Kp 篩選證實了關於 HMW 減少之 RC 資料。已發現，對於親水性 mab，增加的鹽莫耳濃度導致 HMW 減少值的增加，而疏水性 mab 的 HMW 減少值並未藉由增加抗離液鹽莫耳濃度而增加（參見圖 24 和 25）。如所預期，使用離液鹽並未示出隨著鹽莫耳濃度的增加而增加之 HMW 減少值（參見圖 26 和 27）。
進一步地，在 pH 4 至 9 的 pH 範圍和高達約 900 mM 的鹽莫耳濃度下進行了 Kp 篩選（參見實例 6）。在這些 Kp 篩選中，比較了兩組緩衝液：一种緩衝液含有抗離液鹽 Na
2SO
4，以及一種緩衝液不含抗離液鹽的（參見圖 28）。
更詳細地，利用親水性 mab 對五種抗離液鹽在 pH 8 下測試了增加鹽莫耳濃度（和導電率）的效果（實例 4；mab2）。抗離液鹽為硫酸鈉（結果參見圖 19）、氯化鈉（結果參見圖 20）、硫酸銨（結果參見圖 21）、氯化鉀（結果參見圖 22）和硫酸鉀（結果參見圖 23）。相對於增加的總負載量，對每個 FT 餾份之所獲得之 HMW 去除值繪圖。一般而言，觀察到了 HMW 去除值隨總負載量之增加而增加。已發現，藉由向親水性 mab 添加抗離液鹽，可以實現 FT 餾份的 HMW 位準的降低。對於所有測試的抗離液鹽，發現 HMW 減少值有所增加。
此外，使用 Kp 篩選在 5.5 至 8.0 的 pH 範圍和高達 800 mM 的鹽莫耳濃度下，針對三種（親水性和疏水性）mab 和四種鹽（(NH
4)
2SO
4、KCl、Gua/HCl 和脲）驗證了增加鹽莫耳濃度的效果（參見實例 5）。選擇了離液鹽（Gua/HCl 和脲）以在疏水性交互作用減弱時示出 HMW 減少。
根據 mab 之疏水性，看出了 HMW 減少率之差異。已發現，對於親水性 mab（mab2；A 和 mab4；B），添加抗離液鹽（硫酸銨，圖 24A 和 圖 24B，以及 KCl，圖 25A 和 圖 25B）實現了高達 70% 至 80% 的 HMW 減少值。對於疏水性 mab（mab6；C），在硫酸銨存在下 HMW 的減少值幾乎不受莫耳濃度的影響。利用 KCl，疏水性 mab6 的 HMW 減少值甚至隨著 KCl 莫耳濃度的增加而降低。圖 24C 和 圖 25C 示出：對於疏水性 mab6，HMW 去除率未藉由增加抗離液鹽的莫耳濃度而得到提高。
Gua/HCl（參見圖 26）和脲（參見圖 27）被用於測定離液鹽對 HMW 減少值的影響。對於親水性和疏水性 mab，隨著鹽莫耳濃度的增加，未觀察到 HMW 減少值之增加。
總的來說，已發現當將抗離液鹽添加到負載溶液中時，親水性 mab 的 HMW 減少值得到增加。對於疏水性 mab，未觀察到藉由添加抗離液鹽而增加的 HMW 減少值。此外，在添加離液鹽的情況下未能獲得增加的 HMW 減少值。
實例 6 的結果表明添加抗離液鹽提高了親水性 mab (mab2) 的 FT 餾份中 HMW 的減少率。增加的 Na
2SO
4莫耳濃度（參見圖 28A）示出了高達 80% 的 HMW 減少值。mab2 與 Na
2SO
4之曲線圖類似於 mab2 與硫酸銨之曲線圖（參見圖 24A）。與此相反，Tris/Acetate 莫耳濃度的增加（參見圖 28B）對 HMW 減少值沒有顯著影響。在不添加抗離液鹽的情況下，隨著莫耳濃度的增加，未觀察到增加的 HMW 減少值。
在第三組實驗（第三部分）中，使用了不同的層析樹脂。
在實例 7 中，研究了在 5.5 至 8.0 的 pH 範圍和 10 至 800mM 的鹽莫耳濃度下包含親水性 mab (mab2) 的負載中 HMW 的減少值。使用了三種不同的混合模式陰離子交換 (MMAEX) 樹脂：Capto
TMadhere ImpRes、Capto
TMadhere 和 Nuvia aPrime。已發現，當將抗離液鹽添加到包含親水性 mab 的負載溶液中時，所有三種層析材料都顯示出增加的 HMW 減少值。
實例 8 總結了利用親水性和疏水性 mab 對 MMAEX 樹脂、陰離子交換 (AEX) 樹脂、HIC 樹脂和混合模式陽離子交換 (MMCEX) 樹脂進行的 Kp 篩選。使用的 pH 範圍為 pH 4.0 至 9.0 並且使用的鹽濃度為 5 至 850 mM。已發現，對於兩種離子混合模式樹脂（MMAEX 和 MMCEX），親水性 mab 的流通液樣品示出隨著鹽莫耳濃度的增加而增加的 HMW 減少值。與此相反，對於疏水性 mab，MMAEX 樹脂上的 HMW 減少與鹽莫耳濃度無關。對於 MMCEX 樹脂，疏水性 mab 的 HMW 減少值並未藉由將鹽莫耳濃度增加到 500 mM Na
2SO
4以下而得到增加。利用單模式樹脂 Q Sepharose FF (AEX) ，對於親水性和疏水性 mab，均未觀察到對 HMW 減少的有利影響。對於 Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (HIC)，已發現對於親水性 mab（與混合模式樹脂相比）以及疏水性 mab，增加鹽莫耳濃度對 HMW 減少值有積極影響。
更詳細地，mab2 在實例 7 中與不同的混合模式樹脂一起使用。使用了三種具有陰離子交換和疏水性交互作用的混合模式樹脂。圖 29A 至 圖 32A（A 系列）中示出了 Capto
TMadhere ImpRes 流通液等值線圖，圖 29B 至 圖 32B（B 系列）中示出了 Capto
TMadhere 的等值線圖，並且圖 29C 至 圖 32C（C 系列） 中示出了 Nuvia aPrime 的等值線圖。測試了兩種抗離液鹽（(NH
4)
2SO
4（參見圖 29）和 KCl（參見圖 30），以及兩種離液鹽（Gua/HCl（參見圖 31）和脲（參見圖 32））。
一般而言，已發現對於所有鹽，Capto
TMadhere、Nuvia aPrime 和 Capto
TMadhere ImpRes 的等值線圖顯都示出了相當的結果。隨著 (NH
4)
2SO
4和 KCl 莫耳濃度的增加，所有三種混合模式樹脂均示出了增加的 HMW 減少值。所有等值線圖均示出了良好的可比性。對於離液鹽，在添加相應的鹽的情況下未觀察到增加的 HMW 減少值。
總的來說，利用不同的 MMAEX 樹脂可以實現增加的 HMW 減少值。
在實例 8 中，一種親水性 mab (mab2) 和一種疏水性 mab (mab6) 與不同的樹脂類型組合使用：混合模式陰離子交換樹脂 (Capto
TMattach ImpRes)、陰離子交換樹脂 (Q Sepharose FF)、疏水性樹脂（Phenyl Sepharose 6 FF）和混合模式陽離子交換樹脂（Capto
TMMMC ImpRes）。
對於 AEX 樹脂 Q Sepharose FF，未觀察到抗離液鹽對 HMW 減少之影響（參見圖 34）。對於樹脂 Phenyl Sepharose 6FF (high sub)，親水性和疏水性 mab 都示出了隨著 Na
2SO
4莫耳濃度的增加而增加的 HMW 減少值（參見圖 35）。因此，對於單模式樹脂 Q Sepharose FF 和 Phenyl Sepharose 6FF (high sub)，親水性和疏水性 mab 之可實現的 HMW 減少值是相當的。
與此相反，對於混合模式樹脂，親水性和疏水性 mab 之 HMW 減少值是不同的。當將抗離液鹽添加到負載中時，MMAEX 樹脂針對於親水性 mab2（參見圖 33A）示出了提高的 HMW 去除率。對於疏水性 mab6，HMW 去除率在測試的 pH 和莫耳濃度範圍內幾乎是恆定的（參見圖 33B）。因此，已發現僅對於親水性 mab，HMW 減少值已藉由增加混合模式陰離子交換樹脂上的鹽莫耳濃度來增加。圖 36 示出了針對 Capto
TMMMC ImpRes 樹脂的 HMW 去除值。對於親水性 mab，隨著在 0 至 800 mM 範圍內的 Na
2SO
4莫耳濃度的增加，HMW 減少值從 20% 增加到了 80%。與此相反，疏水性 mab 的 HMW 減少不受將鹽莫耳濃度增加到 500 mM 的影響。對於 mab6，僅在莫耳濃度高於 500 mM 時觀察到 FT 樣品中 HMW 減少值的增加。低於 500 mM 時，HMW 減少值較小 (＜10%)，並且與鹽莫耳濃度無關。
不受該理論之束縛，實例 8 示出藉由添加抗離液鹽而增加之親水性 mab 的 HMW 減少值可歸因於離子和疏水性交互作用的組合（但不僅針對疏水性交互作用）。對於兩種離子混合模式樹脂，Capto
TMadhere ImpRes（帶有陰離子和疏水性部分）和 Capto
TMMMC ImpRes（帶有陽離子和疏水性部分），隨著鹽莫耳濃度的增加，HMW 減少值得到增加，但僅針對親水性 mab）。
該方法還可以自由擴展（第 IV 部分；參見實例 9 和 10）。
擴展結果證實了在第 II 部分和第 III 部分中使用較小體積系統所實現之結果。
更詳細地，在實例 9 中，製備了具有相同導電率 (9 mS/cm) 但具有不同莫耳濃度的 Na
2SO
4（40 mM 和 20mM）的兩種 mab 2 負載。與具有較低 Na
2SO
4莫耳濃度的負載相比，具有較高 Na
2SO
4莫耳濃度的負載之 FT 餾份導致較高的主尖峰值（參見圖 37）。這表明在負載導電率相同時，較高的 Na
2SO
4莫耳濃度（而不是導電率）增強了 HMW 去除。
實例 10 示出了 Na
2SO
4莫耳濃度對 pH 7 和 pH 8 下 HMW 減少值的影響。在 pH 7（參見圖 39）和 pH 8（參見圖 38）下，FT 餾份之主尖峰值隨著 Na
2SO
4莫耳濃度之增加而增加。在 pH 8 下使用了餾份之平均主尖峰值來計算 FT 池（參見圖 40）。對於 pH 8，主尖峰值從 96.96%（不含 Na
2SO
4，導電率為 5mS/cm）增加到高達 99.09%，其中負載含有 60 mM Na
2SO
4（導電率 12 mS/cm）。
在第五組實驗中，已顯示了抗離液鹽莫耳濃度對病毒去除/RVLP 去除的影響。
進行了 Kp（分配係數）篩選以示出不同莫耳濃度的抗離液鹽對病毒污染物減少的影響。在 pH 5.0 至 8.0 的 pH 範圍內，利用兩種親水性和兩種疏水性 mab 示出了 mab 疏水性和抗離液鹽的存在的影響。在實例 11 中，研究了鹽莫耳濃度高達 400 mM 的抗離液鹽，硫酸鈉。在實例 12 中，使用了具有增加的 Tris 莫耳濃度和增加的導電率但缺少抗離液鹽的 Tris/Acetate 緩衝液。
根據 mab 之疏水性和抗離液鹽的存在，測量了不同的 RNA 減少值（表示 RVLP 減少，這又是病毒污染物減少之替代測量）。
總的來說，已發現當將抗離液鹽添加到負載溶液中時，親水性 mab 的病毒污染物減少值得到增加。對於疏水性 mab，未觀察到藉由添加抗離液鹽而增加的病毒污染物減少值。
因此，本發明至少部分基於出人意料的發現，即當以流過 (FT) 模式藉由
包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式層析材料來純化包含親水性抗體和高分子量雜質 (HMW) 的負載溶液並且在層析法開始之前負載溶液中存在至少一種抗離液鹽時，可以成功減少
抗體相關 HMW。
此外，本發明至少部分基於出人意料的發現，即當以流通液 (FT) 模式藉由
包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式層析材料來純化包含親水性抗體和
病毒污染物的負載並且在層析法開始之前負載溶液中存在至少一種抗離液鹽時，可以成功減少
病毒污染物。
更詳細且令人驚訝地發現，當所欲純化之抗體為親水性抗體且存在抗離液鹽時，
病毒污染物的含量可顯著降低更多。相反，當純化疏水性抗體時，沒有觀察到添加抗離液鹽對減少
病毒污染物的顯著影響。
本發明進一步至少部分基於以下發現，即該影響不能歸因於鹽莫耳濃度本身之增加。同樣，對於親水性抗體可以觀察到抗離液鹽的某些鹽莫耳濃度的積極作用，而針對疏水性抗體則不能觀察到該作用。
因此，根據本發明的一個態樣為一種使用（/以）混合模式/多模式層析材料生產抗體的方法，該混合模式/多模式層析材料包含以流通模式操作的離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX)，其中
a) 該抗體為親水性抗體，且
b) 在包含抗體和抗離液鹽的溶液中將抗體施加到 MM HIC/IEX 層析材料。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，該方法進一步包括以下步驟：
c) 視情況地施加沖洗液，
d) 在 b) 的流通液中或視情況地在 b) 及 c) 的流通液中回收該抗體，
及由此使用在流通模式下操作的 MM HIC/IEX 生產該抗體。
本發明之另一個態樣是一種使用（利用）包含以流通模式操作的離子交換官能基和疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX) 的混合模式/多模式層析材料來純化抗體的方法，其中
a) 該抗體為親水性抗體，且
b) 在包含抗體和抗離液鹽的溶液中將抗體施加到 MM HIC/IEX 層析材料，
並且從而純化抗體。
定義和實施例
本文中的術語「抗體」以最廣義使用並且具體涵蓋單株抗體、多株抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體（例如雙特異性抗體）。只要抗體片段以及融合多肽確實具有 Fc 區，即包含在該定義之範圍內。術語「免疫球蛋白」(Ig) 在本文中與抗體可互換使用。
抗體為天然存在的免疫球蛋白分子，其具有不同的結構，均基於免疫球蛋白摺疊。例如，IgG 抗體具有兩條「重」鏈和兩條「輕」鏈，它們藉由雙硫鍵結合以形成功能性抗體。每條重鏈和輕鏈本身都包含一個「恆定」(C) 區和一個「可變」(V) 區。V 區決定抗體的抗原結合特異性，而 C 區提供結構支持並在與免疫效應子之非抗原特異性交互作用中起作用。抗體或抗體之抗原結合片段的抗原結合特異性為抗體與特定抗原特異性結合之能力。
抗體之抗原結合特異性由 V 區的結構特性決定。可變性並非在可變域的 110 個胺基酸之範圍內均勻分佈。相反地，V 區由 15~30 個胺基酸的相對不變的鏈段組成 (稱為骨架區 (Fr))，這些鏈段被稱為「高度可變區」的極度變異的較短區隔開，每個區各自長 9~12 個胺基酸。天然重鏈和輕鏈之可變域各自包含四個 FR，主要採用 β-摺疊組態，藉由三個高度可變區連接，其形成連接 β-摺疊結構之環並在一些情況下形成 β-摺疊結構之一部分。各鏈中之高度可變區藉由 FR 緊密地結合在一起，且與另一鏈之高度可變區一起，有助於形成抗體之抗原結合位點（參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，而是呈現多種效應子功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性作用 (ADCC)。
每個 V 區通常包含三個互補決定區（「CDR」，每個互補決定區都含有「高度可變環」）和四個骨架區。抗體結合位點（即以顯著親和力結合特期望之抗原所需之最小結構單元）因此通常包括三個 CDR 以及至少三個（較佳的是四個）散佈在它們之間的骨架區，從而以適當的構形保持和呈現 CDR。典型的四鏈抗體具有由 VH 域和 VL 域共同定義的抗原結合位點。某些抗體（諸如駱駝抗體和鯊魚抗體，缺乏輕鏈，且僅依賴於重鏈形成的結合位點。
術語「可變」係指如下事實：可變域之某些部分在抗體當中在序列方面廣泛地不同，且用於各特定抗體對於其特定抗原之結合及特異性。然而，可變性並非均勻分佈於抗體之整個可變域中。其集中在輕鏈及重鏈可變域中之三個稱作高度可變區的片段中。可變域中保守性較高之部分稱為骨架區 (FR)。天然重鏈和輕鏈之可變域各自包含四個 FR，主要採用 β-摺疊組態，藉由三個高度可變區連接，其形成連接 β-摺疊結構之環並在一些情況下形成 β-摺疊結構之一部分。各鏈中之高度可變區藉由 FR 緊密地結合在一起，且與另一鏈之高度可變區一起，有助於形成抗體之抗原結合位點（參見 Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，而是呈現多種效應子功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性作用 (ADCC)。
本文所用之術語「高度可變區」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高度可變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基（例如約為 VL 中之殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2) 及 89-97 (L3) 以及約為 VH 之 31-35B (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3)；Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda, Md. (1991)）及/或來自「高度可變環」之彼等殘基（例如 VL 中之殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2) 及 91-96 (L3) 以及 VH 中之 26-32 (H1)、52A-55 (H2) 及 96-101 (H3)；Chothia 及 Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。
「骨架」或「FR」殘基係除如本文所定義高度可變區殘基外之彼等可變域殘基。
抗體或半抗體上下文中的「鉸鏈區」通常定義為從人 IgG1 的 Glu216 延伸到 Pro230（Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)）。藉由將形成重鏈間 S-S 鍵的第一個和最後一個半胱胺酸殘基放置在相同位置，可以將其他 IgG 同型的鉸鏈區與 IgG1 序列對齊。
Fc 區的「下部鉸鏈區」通常定義為緊接在鉸鏈區 C 端的殘基延伸，即，Fc 區的殘基 233 至 239。在本申請之前，FcγR 結合通常歸因於 IgG Fc 區之下部鉸鏈區中之胺基酸殘基。
人 IgG Fc 區之「CH2 域」通常從 IgG 之約 231 位殘基延伸至約 340 位。CH2 域的獨特之處在於其沒有與另一域緊密配對。而是，兩個 N-連接的分支碳水化合物鏈插入完整的天然 IgG 分子的兩個 CH2 域之間。經推測，碳水化合物可提供該域-域配對的替代物，並有助於穩定 CH2 域。Burton, Molec. Immunol.22: 161-206 (1985)。
「CH3 域」包含 Fc 區中 CH2 域之 C 端殘基之延伸（亦即從 IgG 的約胺基酸殘基 341 到約胺基酸殘基 447）。
木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，和一個殘留的「Fc」片段，該名稱反映了容易結晶的能力。Fab 片段由完整的 L 鏈以及 H 鏈的可變區域 (VH) 和一個重鏈的第一恆定域 (CH1) 組成。胃蛋白酶對抗體的處理產生單一大的 F(ab')2 片段，該片段大致對應於兩個具有二價抗原結合活性並且仍能夠交聯抗原的雙硫鍵連接的 Fab 片段。Fab' 片段與 Fab 片段的不同之處在於，在 CH1 域的羧基末端具有額外的少數殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 是指恆定域之半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基的 Fab'。F(ab')2 抗體片段最初係以其間具有鉸鏈半胱胺酸之 Fab’ 片段對形式產生。抗體片段之其他化學耦聯也是已知的。
「Fv」為包含完整抗原識別與抗原結合位點之最小抗體片段。該區由一個重鏈和一個輕鏈可變域之二聚體緊密、非共價締合而成。在此組態中，各可變域之三個高度可以變區交互作用以界定 VH-VL 二聚體表面上之抗原結合位點。六個高度可以變區共同地賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單個可變域（或僅包含對抗原具有特異性之三個高度可以變區的 Fv 的一半）亦具有識別及結合抗原之能力，儘管其親和力低於整個結合位點。
Fab 片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab’ 片段與 Fab 片段不同之處在於，在重鏈 CH1 域之羧基端添加幾個殘基，包括來自抗體樞紐區之一個或多個半胱胺酸。Fab'-SH 係指恆定域之半胱胺酸殘基帶有至少一個游離硫醇基的 Fab'。F(ab')2 抗體片段最初作為成對 Fab’ 片段產生，其具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學耦聯也是已知的。
來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之「輕鏈」可基於其恆定域之胺基酸序列而分配至稱為 kappa (κ) 及 lambda (λ) 的兩種明顯不同類型中之一者。
端視重鏈恆定域之胺基酸序列，抗體可歸類為不同種類。存在以下五大類完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且該等種類中之若干者可進一步分成子類（同型），例如 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 及 IgA2。對應於不同種類之抗體的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。不同種類之免疫球蛋白的亞單元結構及三維組態已眾所周知。
如本文所用之術語「半抗體」係指單價抗原結合多肽。在某些實施例中，半抗體包含 VH/VL 單元和視情況地選用的至少一部分免疫球蛋白恆定域。在某些實施例中，半抗體包含與一個免疫球蛋白輕鏈締合之一個免疫球蛋白重鏈，或其抗原結合片段。在某些實施例中，半抗體為單特異性的，即結合單個抗原或抗原決定基。本領域技術人員將容易理解，半抗體可具有由單個可變域（例如，源自駱駝科）組成的抗原結合域。
術語「VH/VL 單元」係指抗體的抗原結合區，其包含至少一個 VH HVR 和至少一個 VL HVR。在某些實施例中，VH/VL 單元包含至少一個、至少兩個或所有三個 VH HVR 及至少一個、至少兩個或所有三個 VL HVR。在某些實施例中，VH/VL 單元進一步包含至少一部分骨架區 (FR)。在一些實施例中，VH/VL 單元包含三個 VH HVR 和三個 VL HVR。在一些此類實施例中，VH/VL 單元包含至少一個、至少兩個、至少三個或所有四個 VH FR 及至少一個、至少兩個、至少三個或所有四個 VL FR。
術語「多特異性抗體」用於最廣泛的意義並且具體涵蓋包含具有多抗原決定基特異性的抗原結合域的抗體（亦即，能夠特異性地結合至一種生物分子上的兩個或更多個不同抗原決定基或能夠特異性地結合至兩種或更多種不同生物分子上的抗原決定基）。在一些實施例中，多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）之抗原結合域包含兩個 VH/VL 單元，其中第一 VH/VL 單元與第一抗原決定基特異性地結合，且第二 VH/VL 單元與第二抗原決定基特異性地結合，其中每個 VH/VL 單元包含重鏈可變域 (VH) 及輕鏈可變域 (VL)。此類多特異性抗體包括但不限於全長抗體、具有兩個或更多個 VL 和 VH 域的抗體。進一步包含重鏈恆定區之至少一部分及/或輕鏈恆定區之至少一部分的 VH/VL 單元亦可稱為「半抗體」。在一些實施例中，半抗體包含單個重鏈可變區的至少一部分和單個輕鏈可變區的至少一部分。在一些此類實施例中，包含兩個半抗體並結合兩個抗原的雙特異性抗體包含結合第一抗原或第一抗原決定基但不結合第二抗原或第二抗原決定基之第一半抗體以及結合第二抗原或第二抗原決定基但不結合第一抗原或第一抗原決定基之第二半抗體。在一些實施例中，半抗體包含足夠部分的重鏈可變區以允許與第二半抗體形成分子內雙硫鍵。在一些實施例中，半抗體包含杵突變或臼突變，例如以允許與包含互補臼突變或杵突變的第二半抗體發生異二聚化。杵突變及臼突變如下文所進一步討論。
「雙特異性抗體」為包含能夠特異性地結合一種生物分子上的兩個不同抗原決定基或能夠特異性地結合兩種不同生物分子上的抗原決定基的抗原結合域的多特異性抗體。雙特異性抗體在本文中亦可稱為具有「雙重特異性」或為「雙特異性的」。除非另有說明，雙特異性抗體所結合之抗原在雙特異性抗體名稱中的排列次序為任意的。在一些實施例中，雙特異性抗體包含兩個半抗體，其中每個半抗體包含單個重鏈可變區和單個輕鏈可變區，並且其中第一半抗體結合第一抗原而不結合第二抗原，並且第二半抗體結合第二抗原而不是第一抗原。
如本文中所使用之術語「杵臼 (knob-into-hole)」或「KiH」技術是指藉由將突起（杵 (knob)）導入一個多肽並將腔體（臼 (hole)）在其等交互作用的界面處引入其他多肽，在體外或體內指導兩個多肽的配對在一起的技術。例如，KiH 已被導入抗體之 Fc:Fc 結合界面、CL:CH1 界面或 VH/VL 界面中（例如，參見，US 2011/0287009、US 2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431 及 Zhu 等人，1997, Protein Science 6:781-788）。在一些實施例中，在多特異性抗體的製造中，KiH 驅動兩個不同重鏈配對在一起。例如，在其 Fc 區中具有 KiH 的多特異性抗體可進一步包含與各 Fc 區連接的單個可變域，或進一步包含與相似或不同輕鏈可變域配對的不同重鏈可變域。KiH 技術亦可用於將兩個不同的受體胞外域或包含不同目標識別序列的任何其他多肽序列（例如，包括親和體、肽體、及其他 Fc 融合體）配對在一起。
如本文所使用的術語「杵突變」是指在多肽與另一多肽交互作用的界面處將突起（杵）引入該多肽的突變。在一些實施例中，另一個多肽具有臼突變（參見，例如，US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、US 7,695,936、US 8,216,805，其各自以引用方式以其全部內容併入本文）。
如本文所使用的術語「臼突變」是指在多肽與另一多肽交互作用的界面處將腔體（臼）引入該多肽的突變。在一些實施例中，另一個多肽具有杵突變（參見，例如，US 5,731,168、US 5,807,706、US 5,821,333、 US 7,695,936、US 8,216,805，其各自以引用方式以其全部內容併入本文）。
如本文所用之術語「單株抗體」指代獲自實質上同源抗體之群體的抗體，亦即，該群體中所包含之個別抗體為相同的及/或結合同一抗原決定基，但不包括可產生於單株抗體至產生期間的可能之變異體，此類變異體一般以少量存在。與通常包括針對不同決定体（抗原決定基）之不同抗體之多株抗體製劑相反，每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定体。除特異性以外，單株抗體之優勢在於它們不受其他免疫球蛋白污染。修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同源之抗體群體，並且不應解釋為需要藉由任何特定方法生產該抗體。例如，根據本文所提供之方法使用的單株抗體可藉由 Kohler 等人率先於 Nature, 256:495 (1975) 所描述的雜交瘤方法來製備，或可藉由重組 DNA 方法（參見例如, 美國專利號 4,816,567）來製備。亦可使用（例如）以下文獻中所述之技術從噬菌體抗體文庫中分離「單株抗體」：Clackson 等人 Nature 352:624-628 (1991) 及 Marks 等人 J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)。
本文之單株抗體具體包括「嵌合」抗體（免疫球蛋白），其中，重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體類別或亞型之抗體中之對應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞型之抗體以及此類抗體的片段中的對應序列相同或同源，只要它們展現出期望之生物學活性即可（美國專利號 4,816,567；Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）。本文之目標嵌合抗體包括「靈長類化」抗體，該等抗體包含衍生自非人靈長類動物（例如，舊大陸猴，諸如狒狒、獼猴或食蟹猴）的可變域抗原結合序列及人恆定區序列（美國專利號 5,693,780）。
非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。大部分人類化抗體為人類免疫球蛋白 (接受者抗體)，其中來自接受者的超變區的殘基由非人類物種 (提供者抗體) (例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物) 的超變區中具有期望特異性、親和力及能力的殘基代替。在一些情況下，人類免疫球蛋白的骨架區 (FR) 殘基被相應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包含不存在於受體抗體或供體抗體中之殘基。這些修飾是進行以進一步改善抗體效能。通常，人源化抗體將包括實質上所有至少一個（且通常兩個）可變域，其中，所有或實質上所有高度變異環對應於非人類免疫球蛋白之高度變異環，並且所有或實質上所有 FR 是人免疫球蛋白序列之 FR，除如上所述之 FR 取代基外 。人源化抗體亦視情況地將包含免疫球蛋白恆定區的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的恆定區。關於其他細節，參見 Jones 等人，Nature 321:522-525, 1986；Riechmann 等人，Nature 332:323-329, 1988；及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992。
在某些實施例中，雙特異性抗體選自由以下所組成之雙特異性抗體群組：
域交換 1+1 雙特異性抗體 (CrossMab)
（包含一對第一輕鏈和第一重鏈及一對第二輕鏈和第二重鏈之雙特異性全長 IgG 抗體，該一對第一輕鏈和第一重鏈包含第一 Fab 片段，該一對第二輕鏈和第二重鏈包含第二 Fab 片段，
其中在第一 Fab 片段中
a) 僅 CH1 和 CL 域被彼此替換（亦即， 第一 Fab 片段的輕鏈包含 VL 和 CH1 域，並且第一 Fab 片段的重鏈包含 VH 和 CL 域）；b) 僅 VH 和 VL 域被彼此替換（亦即，第一 Fab 片段的輕鏈包含 VH 和 CL 域，並且第一 Fab 片段的重鏈包含 VL 和 CH1 域）；或
c) CH1 和 CL 域及 VH 和 VL 域被彼此替換（亦即，第一 Fab 片段的輕鏈包含 VH 和 CH1 域，並且第一 Fab 片段的重鏈包含 VL 和 CL 域）；
其中，第二 Fab 片段包含包含 VL 和 CL 域的輕鏈，以及包含 VH和 CH1 域的重鏈；
其中第一重鏈和第二重鏈都包含 CH3 域，其中兩個 CH3 域藉由各自之胺基酸取代基以互補方式工程化，以支持第一重鏈和第二重鏈之異二聚化，（在一個較佳的實施例中，一個 CH3 域包含杵突變，並且相應的另一個 CH3 域包含臼突變）；
C 端融合 2+1 雙特異性抗體（2+1 C 格式）
（雙特異性全長 IgG 抗體，其包含
a) 一種全長抗體，其包含兩對，每一對包含一全長抗體輕鏈和一全長抗體重鏈，其中每一對全長重鏈和全長輕鏈所形成的結合位點特異性地結合至第一抗原；以及
b) 一種另外的結合域，例如受體配體，其中另外的結合域與全長抗體的一條重鏈的 C 端融合；
N 端 Fab 域插入 2+1 雙特異性抗體（2+1 N 格式；TCB）
（雙特異性全長抗體，其具有另外的重鏈 N 端結合位點和域交換，其包含
- 第一和第二 Fab 片段，其中第一和第二 Fab 片段的每個結合位點皆特異性地結合至第一抗原，
- 第三 Fab 片段，其中第三 Fab 片段的結合位點特異性地結合至第一抗原，並且其中第三 Fab 片段包含域交叉，使得可變輕鏈域 (VL) 與可變重鏈域 (VH) 彼此替換，以及
- Fc區包含第一 Fc 區域多肽和第二 Fc 區域多肽，
其中，第一和第二Fab片段各自包含重鏈片段和全長輕鏈，
其中，第一 Fab 片段之重鏈片段的 C 端與第一 Fc 區域多肽的 N 端融合，
其中第二 Fab 片段之重鏈片段的 C 端與第三 Fab 片段之可變輕鏈域的 N 端融合，並且第三 Fab 片段之 CH1 的 C 端與第二 Fc 區域多肽的 N 端融合）。
如本文所用，術語「域交叉」表示，在一對抗體重鏈 VH-CH1 片段及其相應同源抗體輕鏈中，亦即，在抗體 Fab（抗原結合片段）中，該域序列衍生自天然抗體中之序列，其中至少一個重鏈域被其相對應輕鏈域取代，反之亦然。存在三種一般類型之域交叉，(i) CH1 域與 CL 域之交叉，其藉由輕鏈中之域交叉導致 VL-CH1 域序列且藉由重鏈片段中之域交叉導致 VH-CL 域序列（或具有 VH-CL-鉸鏈-CH2-CH3 域序列之全長抗體重鏈），(ii) VH 域與 VL 域之交叉，其藉由輕鏈中之域交叉導致 VH-CL 域序列且藉由重鏈片段中之域交叉導致 VL-CH1 域序列，以及 (iii) 完全輕鏈 (VL-CL) 與完全 VH-CH1 重鏈片段之域交叉（「Fab 交叉」），其藉由域交叉導致具有 VH-CH1 域序列之輕鏈且藉由域交叉導致具有 VL-CL 域序列之重鏈片段（全部前述域序列皆以 N 端至 C 端方向指示）。
如本文所用，關於相對應之重鏈域與輕鏈域之術語「彼此替換」指代前述之域交叉。因此，當 CH1 域和 CL 域「彼此替換」時，其指代項目 (i) 下述及之域交叉以及所得重鏈及輕鏈域序列。據此，當 VH 和 VL 域「彼此替換」時，其指代項目 (ii) 下述及之域交叉；而當 CH1 域和 CL 域「彼此替換」且 VH 域和 VL 域「彼此替換」時，其指代項目 (iii) 下述及之域交叉。
在某些實施例中，含有 Fc 區的多肽或抗體係雙特異性抗體或 Fc 融合蛋白。
在根據本發明的方法中，已示出，僅對於親水性 mab（滯留時間
mab≤ 滯留時間
利妥昔單抗）來說，與在不存在抗離液鹽的情況下具有相同導電率的負載溶液相比，藉由向負載溶液中添加抗離液鹽實現了改善的 HMW 去除。與此相反，對於疏水性 mab（滯留時間
mab＞ 滯留時間
利妥昔單抗）來說，在添加抗離液鹽之情形下，未觀察到積極影響。
根據本發明之術語「親水性抗體」表示在疏水性交互作用層析 (HIC) 管柱上的滯留時間等於或小於利妥昔單抗在相同 HIC 管柱上和相同層析條件下的 HIC 滯留時間的抗體。同樣，根據本發明之「疏水性抗體」表示在疏水性交互作用層析 (HIC) 管柱上的滯留時間大於利妥昔單抗在相同 HIC 管柱上和相同層析條件下的 HIC 滯留時間的抗體。換言之，滯留時間 ≤ 滯留時間
利妥昔單抗，即與利妥昔單抗具有相同或更短的滯留時間的 mab 被定義為親水性的；滯留時間 ＞ 滯留時間
利妥昔單抗，即具有比利妥昔單抗更長的滯留時間的 mab 被定義為疏水性的。
材料與方法部分的第 10 點描述了測定滯留時間的方法。藉由該方法所測定之 mab 的滯留時間在 19 分鐘至 41 分鐘的範圍內。表 MM-1 中提供了 mab 滯留時間的概述。已發現，利妥昔單抗的滯留時間係定義親水性和疏水性 mab 的分界點。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，親水性抗體為在疏水性交互作用層析 (HIC) 材料上的滯留時間等於或小於利妥昔單抗 (rituximab)（在相同操作條件下在相同的 HIC 材料上）的滯留時間的抗體。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有作為配體之聚醚基（乙醚基）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有具有以下結構 (-(OCH
2CH
2)
nOH) 的作為配體之聚醚基。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有聚甲基丙烯酸酯基材/基質。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料含有作為配體之聚醚基（乙醚基），具有 100 nm 的平均孔徑和 10 μm 的粒徑。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，疏水性交互作用層析 (HIC) 材料為 TSKgel
®Ether-5PW 層析材料。在上述態樣的一個較佳實施例和其他實施例中，使用（其他五個上文實施例之任一個之）HIC 層析材料，在 75 mm 的管柱長度、7.5 mm 的內徑和流速為 8.8 ml/min 的洗提緩衝液梯度下，對在 HIC 層析材料上的滯留時間進行測定，並且其中將抗體以 1 mg/ml 的濃度施加到層析材料。
技術人員知悉如何測定用於洗提給定抗體的緩衝液梯度。在本文的材料與方法部分的第 10 點（滯留時間和疏水性的測定）中，特別是第 10.8. 點中，描述了合適的洗提緩衝液梯度。
在本文中可互換使用之術語「負載 (loading) 密度」或「負載 (loading) 容量」或「負載 (load) 密度」或「負載 (load) 容量」或「負載量」係指與一定體積（例如升）之層析材料接觸的抗體或蛋白質的量（例如克）。在一些實例中，負載密度以 g/L 表示。
在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料（即包含離子交換和疏水性交互作用官能基的混合模式層析材料）之負載量為 10 g/L 或更高，亦即，每升層析材料 10 g 蛋白 (10 g/L) 或更高。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料的負載量為 15 g/L 或更高。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料的負載量為 20 g/L 或更高。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料的負載量為 30 g/L 或更高。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料的負載量為 40 g/L 或更高。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料的負載量為 50 g/L 或更高。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料（即包含離子交換和疏水性交互作用官能基的混合模式層析材料）之負載量為（且包括）從 10 g/L 至 650 g/L，亦即，每升層析材料 10 g 蛋白 (10 g/L) 至每升層析材料 650 g 蛋白 (650 g/L)。在上述態樣的某些實施例和上述態樣的其他實施例以及其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料之負載量為從（且包括）30 g/L 至 600 g/L。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料之負載量為從（且包括）50 g/L 至 500 g/L。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料之負載量為從（且包括）50 g/L 至 400 g/L。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 層析材料之負載量為從（且包括）15 g/L 至 350 g/L。
亦必須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文中及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一」、「一種」及「該」包括複數個提及物。因此，例如，提及「一種鹽」包括複數種此類鹽，例如一種到三種，或一種到兩種。同樣，術語「一」 (或「一種」)、「一個或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。
術語「約」表示其後之值不是精確值，而是值的 +/- 10%、或值的 +/- 5%、或值的 +/- 2%、或值的 +/- 1%的範圍的中心點。如果該值是以百分比給出的相對值，則術語「約」也表示其後的值不是精確值，而是值的 +/- 10%、或值的 +/‑ 5%、或值的 +/- 2%、或值的 +/- 1% 的範圍的中心點，其中範圍的上限不能夠超過值 100%。
術語「細胞」或「宿主細胞」指核酸（編碼異源多肽）能夠被轉染或被轉染到其中的細胞。術語「細胞」包括原核細胞和真核細胞兩者，該原核細胞用於表達核酸和產生編碼的多肽，包括增殖質粒，並且該真核細胞用於表達核酸和產生編碼的多肽。在一個實施例中，該真核細胞係哺乳動物細胞。在一個實施例中，哺乳動物細胞為 CHO 細胞，視情況地選用的 CHO K1 細胞（ATCC CCL-61 或 DSM ACC 110）、或 CHO DG44 細胞（也稱為 CHO-DHFR[-], DSM ACC 126）、或CHO XL99 細胞（CHO-T 細胞（參見例如 Morgan, D. 等人，Biochemistry 26 (1987) 2959-2963））、或 CHO-S 細胞、或 Super-CHO 細胞（Pak、S.C.O., 等人 Cytotechnology 22 (1996) 139-146）。如果這些細胞不適應在無血清培養基或懸浮液中生長，則將在用於當前方法中之前進行適應。如本文所用，表述「細胞」包括個體細胞及其後代。因此，詞語「轉化子」和「轉化的細胞」包括原代個體細胞及從其衍生的培養物，而不考慮轉移或繼代培養的次數。亦應理解的是，由於蓄意的突變或無意的突變，所有子代的 DNA 含量可能並不完全相同。包括與在最初轉化的細胞中篩選出具有相同功能或生物活性的變異體子代。
術語「Fc 區」表示免疫球蛋白的不直接參與與免疫球蛋白的結合配偶體的結合，但表現出各種效應子功能的一部分。根據重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白分為以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。其中一些類別進一步分為亞類（同種），亦即 IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 中的 IgG，或 IgA1 和 IgA2 中的 IgA。依據免疫球蛋白所屬之類別，免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG) 和 μ (IgM)。
本文中所用的術語「Fc 區」，用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的 C 端區片段。該術語包括天然序列 Fc 區和變異 Fc 區。在一個實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc 區的 C 端賴氨酸 (Lys447) 或甘氨酸-賴氨酸二肽 (Gly446-Lys447) 分別可能存在也可能不存在。依據 Kabat 歐盟指數進行編號。
免疫球蛋白的「Fc 區」係技術人員眾所周知之術語，且由全長免疫球蛋白之木瓜酶切割為基礎來定義。
本文所述的抗體總是含有 Fc 區，因此本文報導的抗體係含有 Fc 區的多肽或抗體。
術語「（抗體之）恆定區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中不包括可變域的部分。
術語「抗體相關高分子量 (HMW) 雜質」指具有約二聚體（正被生產或純化的相同期望抗體/靶分子單體之）分子量或更高分子量的雜質。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗體相關高分子量 (HMW) 雜質具有約 250 kDa 或更大的分子量。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，抗體相關高分子量 (HMW) 雜質具有約 285 kDa 或更大的分子量。在某些實施例中，抗體相關高分子量 (HMW) 雜質具有約 300 kDa 或更大的分子量。在較佳實施例中，抗體相關高分子量 (HMW) 雜質至少為期望抗體/靶分子的二聚體、三聚體或任何多聚體。因此，在某些實施例中，抗體相關高分子量 (HMW) 雜質係具有約相同抗體的二聚體的分子量或更高分子量的雜質。進一步地，其也可以包括期望抗體/靶分子之片段（如半抗體）。例如，抗體相關高分子量 (HMW) 雜質為二聚體或三聚體加上靶抗體的片段。
測量 HMW 雜質的方法在本領域中為已知的並且在例如 WO 2011/150110 中進行描述。此類方法包括，例如，尺寸排阻層析法、毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉 (CE-SDS) 和液相色譜-質譜法 (LC-MS)。
HMW 雜質可以如實例部分中所述來測定。
術語「病毒雜質」或「病毒雜質含量」指病毒或病毒顆粒之雜質。出於實際和安全原因，病毒雜質污染利用逆轉錄病毒樣顆粒 (RVLP) 作為實際病毒/病毒雜質的替代物而進行分析。反過來，RVLP 可以藉由測定 RNA 含量（例如，藉由定量逆轉錄酶 (RT) PCR）來測定。
在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中
- 該方法係用於生產抗體組成物，該抗體組成物具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量及/或具有降低之病毒雜質含量，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種抗體相關 HMW 雜質及/或至少一種病毒雜質以及抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量及/或具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量及/或具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物。
在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中
- 該方法係用於生產具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量和具有降低之病毒雜質含量的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種抗體相關 HMW 雜質和至少一種病毒雜質以及抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量和具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量和具有降低的病毒雜質含量的抗體組成物。
在各態樣的較佳實施例和其他實施例中
- 該方法係用於生產具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種抗體相關 HMW 雜質和抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的抗體相關 HMW 雜質含量的抗體組成物。
在各態樣的某些實施例和其他實施例中，與在步驟 b) 中被施加到 MM HIC/IEX 的溶液相比，抗體相關 (HMW) 雜質含量降低。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，與基本上不含抗離液鹽的溶液相比及/或與包含疏水性抗體的溶液相比，抗體相關 (HMW) 雜質含量降低。
在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中
- 該方法用於生產具有降低的病毒雜質含量/病毒雜質的抗體組成物，
- 將抗體施加到包含抗體、至少一種病毒雜質和抗離液鹽的溶液中的 MM HIC/IEX，
- 從流通液中回收具有降低的病毒雜質含量/病毒雜質的抗體組成物，並且
- 從而產生具有降低的病毒雜質含量/病毒雜質的抗體組成物。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，與在步驟 b) 中被施加到 MM HIC/IEX 的溶液相比，抗體病毒雜質含量/病毒雜質降低。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，與基本上不含抗離液鹽的溶液相比及/或與包含疏水性抗體的溶液相比，病毒雜質含量/病毒雜質降低。
如本文所用，術語「混合模式層析」或「混合模式層析材料」或「MM HIC/IEX」指包含疏水性交互作用 (HIC) 功能/部分和離子交換 (IEX) 功能/部分的混合模式或多模式 (MM) 層析材料（術語「混合模式」和「多模式」可互換使用）。換言之，混合模式層析材料包含離子交換官能基和疏水性交互作用官能基。因此，其在一種層析材料中結合至少兩種功能。MMIEX 層析材料另外可以包括其他功能，例如氫結合交互作用。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含陰離子交換官能基或陽離子交換官能基（作為離子交換官能基）；除了疏水性交互作用官能基之外。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含陰離子交換官能基（作為離子交換官能基）。然後該材料主要結合陰離子交換 (AEX) 和疏水性交互作用功能 (HIC)。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含強陰離子交換官能基（作為離子交換官能基）（亦即，其係多峰強陰離子交換層析材料）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含帶電氮原子和環結構（作為官能基）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含季胺（作為離子交換官能基）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含季胺（作為離子交換官能基）和高度交聯的瓊脂糖（作為基質）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含N-芐基-N-甲基乙醇胺（作為官能基）和高度交聯的瓊脂糖（作為基質）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 為 Capto
TMAdhere ImpRes、Capto
TMAdhere 或 Nuvia aPrime4A。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 為 Capto
TMadhere ImpRes 或 Capto
TMAdhere。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含陽離子交換官能基（作為離子交換官能基）。該材料主要結合陽離子交換 (CEX) 和疏水性交互作用 (HIC) 功能。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含弱陽離子交換官能基（作為離子交換官能基）（亦即，其係多峰弱陽離子交換層析材料）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含弱陽離子交換官能基（作為離子交換官能基）和高度交聯的瓊脂糖（作為基質）。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 包含N-苯甲醯基高半胱（作為離子交換官能基）和高度交聯的瓊脂糖（作為基質）。在上述態樣的一個較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 為 Capto
TMMMC 或 Capto
TMMMC ImpRes。在上述態樣的一個較佳實施例和其他實施例中，MM HIC/IEX 為 Capto
TMMMC ImpRes。
術語「抗離液鹽」（或親液鹽）指能夠使蛋白質構形較不溶於水的化合物。抗離液劑藉由乾擾由有助於水-水交互作用的穩定性和結構的非共價力介導之分子內交互作用來降低系統的熵。抗離液鹽通常會導致水分子有利地交互作用，這也穩定了大分子中之分子間交互作用。抗離液鹽可以為離子的及/或非離子的。此類抗離液劑的實例包括但不限於 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 等。
在上述態樣的某些實施例和本文報道之其他實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物、硫酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或氟化物。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物、硫酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或乙酸鹽。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物或硫酸鹽。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物、硫酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽或氟化物，其包含鈣 (Ca)、鈉 (Na)、銨 (NH4) 或鉀 (K)。在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽為鈣鹽、鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。
在一個較佳實施例中，抗離液鹽為鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物、硫酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽或乙酸鹽，其包含鈣 (Ca)、鈉 (Na)、銨 (NH4) 或鉀 (K)。在一個實施例中，抗離液鹽為鈣鹽、鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。在一個較佳實施例中，抗離液鹽為鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物或硫酸鹽，其包含鈣 (Ca)、鈉 (Na)、銨 (NH4) 或鉀 (K)。在一個實施例中，抗離液鹽為鈣鹽、鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。在一個較佳實施例中，抗離液鹽為鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：氯化物或硫酸鹽，其包含鈉 (Na)、銨 (NH4) 或鉀 (K)。在一個較佳實施例中，抗離液鹽為鈉鹽、銨鹽或鉀鹽。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：(NH
4)
2SO
4、Na
2SO
4、K
2SO
4、NaCl、KCl 和 CaCl
2。在上述態樣的較佳實施例和其他實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：(NH
4)
2SO
4、Na
2SO
4、K
2SO
4、NaCl 和 KCl 。在一個實施例中，抗離液鹽選自由以下所組成之群組：(NH
4)
2SO
4、Na
2SO
4和 K
2SO
4。在一個較佳實施例中，抗離液鹽為 Na
2SO
4。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，抗離液鹽具有範圍在 1.285 至 4.183 x 10E3 dyn*g*cm
-1*mol
-1（且包括端值）的莫耳表面張力增量。在較佳實施例中，抗離液鹽具有範圍在 1.3 至 3.0 x 10E3 dyn*g*cm
-1*mol
-1（且包括端值）的莫耳表面張力增量。在進一步之較佳實施例中，抗離液鹽具有範圍在 1.46 至 2.86 x 10E3 dyn*g*cm
-1*mol
-1（且包括端值）的莫耳表面張力增量。
本領域技術人員知悉如何測定莫耳表面張力增量。可以在如下找到這方面的資訊，例如 Laurel M. Pegram 和 M. Thomas Record, Jr., J. Phys. Chem. B 2007, 111, 5411-5417 以及 Jan-Christer Janson；疏水性交互作用層析法，第 170 頁，表 6.2
術語「流通液」、「流通模式」、「以流通模式操作」或類似表述指進行或操作層析法的方式，使得層析法的條件（例如 pH、緩衝液含量和濃度、導電率等）之選擇的方式為目標蛋白或抗體不會顯著結合層析材料。相反，目標蛋白或抗體會流過層析材料。由於基本上不發生結合，因此也不必進行洗提以從層析材料中釋放目標蛋白或抗體（在結合和洗提操作模式中也這樣）。可能有益的是，在利用包含目標蛋白質或抗體的溶液完全負載（即施加目標蛋白）層析材料之後，（例如，用平衡緩衝液或類似溶液）進行沖洗層析材料的附加步驟來回收仍在層析管柱中的殘留目標蛋白或抗體。因此，如果層析材料「以流通模式操作」，則這包括以下步驟：施加待純化或生產的包含目標抗體/蛋白質的溶液的步驟；使目標抗體/蛋白質流過層析材料（從而藉由將目標抗體/蛋白質與雜質分離來純化目標抗體/蛋白質）；以及在流通液（餾份）中回收目標抗體/蛋白質。視情況地可以進行沖洗步驟。
技術人員知悉必須如何選擇層析條件才能在流通模式下操作。例如，為了實現流通液條件，技術人員理解必須以如下方式選擇 pH：根據分子的 pI（等電點），目標分子不會顯著結合層析材料。如果 pH 低於分子的 pI，則分子帶正電並且不會顯著結合具有陰離子交換官能基的混合模式層析材料。另一方面，如果 pH 值高於分子的 pI，則該分子帶負電並且不會顯著結合具有陽離子交換官能基的混合模式層析材料。
技術人員知悉層析條件會受到 pH 值的影響。如上所述，pH 值的選擇很大程度上取決於分子的 pI 和要實現的條件。
在所有態樣的一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 4.0 或更高的 pH值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 4.5 或更高的 pH 值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 5.0 或更高的 pH 值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 5.5 或更高的 pH 值。在一個較佳實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 6.0 或更高的 pH 值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 7.0 或更高的 pH 值。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 3.5 至 9.5 的 pH 值。在一個較佳實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 4.0 至 9.0 的 pH 值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 5.0 至 8.5 的 pH 值。在一個較佳實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 5.5 至 8.5 的 pH 值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 5.5 至 8.0 的 pH 值。在一個實施例中，包含抗體和（步驟 b 之）抗離液鹽之溶液具有 5.0 至 8.0 的 pH 值。
技術人員知悉層析條件會受到導電率條件的影響。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有 0.5 mS/cm 或更高的導電率。在一個較佳實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 0.5 至 120 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 0.5 至 100 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 0.5 至 80 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 0.5 至 60 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 0.5 至 50 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 0.5 至 30 mS/cm 的導電率。在一個較佳實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 4 至 25 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 10 至 20 mS/cm 的導電率。特別關於病毒雜質的去除，在一個較佳實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 5 至 25 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 8 至 22 mS/cm 的導電率。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽的溶液具有從（並且包括） 10 至 20 mS/cm 的導電率。
在上述態樣的某些實施例和其他實施例中，在包含抗體和抗離液鹽之溶液中，該抗離液鹽具有 5 mM 或更高的抗離液鹽莫耳濃度。在一個較佳實施例中，在包含抗體和抗離液鹽之溶液中，該抗離液鹽具有 10 mM 或更高的抗離液鹽莫耳濃度。在一個實施例中，在包含抗體和抗離液鹽之溶液中，該抗離液鹽具有 20 mM 或更高的抗離液鹽莫耳濃度。在一個實施例中，在包含抗體和抗離液鹽之溶液中，該抗離液鹽之抗離液鹽莫耳濃度為從（並且包括）5 mM 至 1000 mM。在一個較佳實施例中，在包含抗體和抗離液鹽之溶液中，抗離液鹽之抗離液鹽莫耳濃度為從（並且包括）10 mM 至 900 mM。在一個實施例中，在包含抗體和抗離液鹽之溶液中，該抗離液鹽具有從 15 mM 至 850 mM 的抗離液鹽莫耳濃度。特別關於病毒雜質的去除，在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽之溶液具有從（並且包括）50 mM 至 400 mM 的抗離液鹽莫耳濃度。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽之溶液的抗離液鹽莫耳濃度為從（並且包括）50 mM 至 300 mM。在一個實施例中，包含抗體和抗離液鹽之溶液的抗離液鹽莫耳濃度為從（並且包括）50 mM 至 250 mM。
應當理解，抗離液鹽可以添加到負載到 MM HIC/IEX 上的溶液中並且/或者其可以存在於來自在 MM HIC/IEX 之前進行的方法步驟的負載到 MM HIC/IEX 上的溶液中。例如，抗離液鹽可能在早期層析步驟中已存在於溶液中。
提供以下實例及圖式以幫助理解本發明，但本發明之真實範圍在所附申請專利範圍中闡明。應當理解的是，在不脫離本發明之精神的前提下，可以對所提出的步驟進行修改。
實驗部分
材料與方法
1.
蛋白
本文使用的分子係於中國倉鼠卵巢細胞中產生的人源化 IgG1 單株抗體 (mab)。用於負載混合模式層析管柱的起始材料係親和層析管柱洗提液（表示為「親和管柱池」）。這些分子涵蓋標準的 IgG 樣 mab 和復雜抗體形式，例如雙特異性 CrossMab 形式、含有結合配體的 mab（2+1 C 形式）和 T 細胞結合 mab（2+1 N 形式；TCB）。分子的 pI 在 8.0 至 9.4 的範圍內。
對於 RVLP 去除研究，用於負載混合模式層析管柱的起始材料係第二管柱層析洗提液（亦即親和層析法和隨後的第二次層析運行後的洗提液；表示為「第二管柱池」）。例如，可以在陽離子交換層析材料（對於 mab9 也是如此）、陰離子交換層析材料或混合模式層析材料（諸如混合模式陰離子交換層析材料，對於 mab1、mab2 或 mab7 也是如此））上進行第二次層析運行。
測定滯留時間的方法在下文材料與方法項目 10 中進行了描述。以該方法所測定之 mab 的滯留時間在 19 分鐘至 41 分鐘的範圍內。表 1 中提供了 mab 滯留時間的概述。已發現，利妥昔單抗的滯留時間係定義親水性和疏水性 mab 的分界點。滯留時間 ≤ 滯留時間
利妥昔單抗的 mab（即與利妥昔單抗具有相同或具有更短的滯留時間的 mab）被定義為親水性的，滯留時間 ＞ 滯留時間
利妥昔單抗的 mab（即具有更長的滯留時間）被定義為疏水性的。
表 MM-1:mab 和滯留時間
| mab | 表示為 | 滯留時間 [min] |
| 特異性結合抗原 1 的二價單特異性全長 IgG1 抗體 | mab1 | 19.4 |
| 特異性結合抗原 2 的二價單特異性全長 IgG1 抗體 | mab2 | 21.7 |
| 特異性結合抗原 3 和 4 的 2+1 N 形式的抗體 | mab4 | 29.5 |
| 特異性結合抗原 5 的二價單特異性全長 IgG1 抗體 | mab5 | 29.6 |
| 利妥昔單抗 | 分界點 | 32.0 |
| 特異性結合抗原 6 和 7、變體 1 的 CrossMab 形式之二價雙特異性全長 IgG1 抗體 | mab6 | 35.8 |
| 特異性結合抗原 6 和 7、變體 2 的 CrossMab 形式之二價雙特異性全長 IgG1 抗體 | mab7 | 35.8 |
| 特異性結合抗原 8 和 9 的 2+1 C 形式之抗體 | mab8 | 41.2 |
| 特異性結合抗原 4 和 8 的 2+1 N 形式的抗體 | mab9 | 41.2 |
2.
化學品
以下化學品是從下面列出的製造商購買的，並依製造商所提供之方式使用：K
2HPO
4、KH
2PO
4、KCl、Na
2HPO
4x 2H
2O、NaH
2PO
4x H
2O、乙醇、三(羟甲基)氨基甲烷、乙酸、檸檬酸、硫酸鈉、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀、胍/鹽酸鹽、脲、NaOH。
默克公司：K
2HPO
4、KH
2PO
4、KCl、Na
2HPO
4x 2H
2O、NaH
2PO
4x H
2O、乙醇、乙酸、檸檬酸、硫酸鈉、硫酸銨、氯化鈉、氯化鉀、氯化胍、脲、NaOH
安格斯化學有限公司：三(羥甲基)-氨基甲烷
西格瑪奧德裡奇公司和默克公司：硫酸銨
賽默飛世爾公司：硫酸鉀
3.Robocolumns(RC)
Robocolumns
TM(RC) 購自 Repligen GmbH （德國拉芬斯堡）：
- Capto™ adhere ImpRes; PN 01100408R; 200 µL
4.
層析樹脂
本文使用了以下層析樹脂：
- Capto™ adhere ImpRes（瑞典烏普沙拉之思拓凡公司（前身為 GE Healthcare））
- Capto™ adhere（思拓凡公司（前身為 GE Healthcare）
- Nuvia aPrime 4A（美國伯樂生命醫學產品公司）
- Q Sepharose FF（思拓凡公司（前身為 GE Healthcare））
- Phenyl Sepharose 6 FF (high sub)（思拓凡公司（前身為 GE Healthcare））
- Capto
TMMMC ImpRes（思拓凡公司（前身為 GE Healthcare））
5. 機器人實驗室器皿- 濾板：PALL; AcroPrep Advance 96 Well, 1 mL, 0.45 µm, REF 8184
- MTP 紫外線板：紫外微量滴定板，賽默飛世爾公司
6. 負載製備材料- 離心機：Heraeus Multifige 3 S-R; Rotor：75006445
- Amicon Ultra 離心式過濾器 (Merck Millipore, Ultracel – 30K)
- Slide-A-Lyzer 透析盒（賽默飛世爾公司，20 000 - 30 000 MWCO）
- Minisart 注射器過濾器（賽多利斯公司 Minisart High Flow，0.22 µm）
7.
機器人系統
7.1.Tecan Freedom EVO 150
Tecan Freedom EVO 150（德國克賴爾斯海姆的 Tecan Deutschland GmbH） 液體處理系統 (LHS) 用於進行 RC 運行。EVO 150 配備了一個液體處理臂 (LiHa) 和一個偏心夾持器、用於 RC 的環礁橋和 Infinite M200 NanoQuant 讀板器（德國克賴爾斯海姆的 Tecan Deutschland GmbH）。LHS 藉由軟體 Freedom EVOware（德國克賴爾斯海姆的 Tecan Deutschland GmbH）控制。用於控制讀板器的軟體為Magellan（德國克賴爾斯海姆的 Tecan Deutschland GmbH）。該平台另外配備了用於存儲 96 孔收集板（微量滴定板）之 Te-Stack
TM和用於板運輸和餾份收集之 Te-Slide
TM。LiHa 能夠處理 10 µL 到 1000 µL 的體積，並配備 1000 µL 稀釋注射器。LiHa 由八個單獨可控的通道組成，配備八個固定的不銹鋼針。所有 RC 運行均藉由 Capto
TMadhere ImpRes 樹脂進行。層析管柱尺寸：1 cm 的長度 × 0.5 cm 的直徑以及 200 µL 的床體積。
7.2.Hamilton Microlab STARlet
Hamilton Microlab STARlet 機器人用於製備本文所用之濾板。該機器人配備了 8 個 1000 µL 移液通道和振盪器。製備 50% 水中樹脂漿 (v/v)，並將其放置在振盪器上的玻璃小瓶中。LiHa 配備了 1000 µL 大口徑吸頭（切割開）以用於將樹脂從振盪器轉移到濾板。製備了每孔含有 50 µL 樹脂之濾板。儲存溶液為水。
7.3.Tecan Freedom EVO 200
Tecan Freedom EVO 200（德國克賴爾斯海姆的 Tecan Deutschland GmbH）液體處理系統用於製備本文所用的負載板和緩衝板並進行運行。Tecan Freedom EVO 200 配備了一個液體處理臂 (LiHa)、一個偏心夾持器、Te-Shake
TM、用於儲存微孔板之 Te-Stack
TM、用於板運輸之 Te-Slide
TM和 Infinite M200 讀板器（德國克賴爾斯海姆的 Tecan Deutschland GmbH）。另外，將離心機（德國的 Hettich 之Rotanta 46RSC）集成到工作台中以在孵育後去除上清液。LiHa 能夠處理 10 µL 到 1000 µL 的體積並且配備了 1000 µL 稀釋注射器且由八個單獨可控的通道組成，配備八個固定的不銹鋼移液器吸頭。Tecan 機器人藉由軟體 Evoware 控制。用於控制讀板器之軟體係 Magellan。
8.
蛋白純度測定
使用 HPLC 系統 (Thermo Fisher) 藉由尺寸排阻高效液相層析法 (SE-HPLC) 來測定單體含量和高分子量物質方面之蛋白純度。在 TSK-Gel G3000SWXL (7.8 x 300 mm; 5 µm) 層析管柱 (TOSOH Bioscience, P/N 08541) 上使用 0.2 M K
2HPO
4/KH
2PO
4、0.25 M KCl (pH 7.0)作為沖提劑以 0.5 至1.0 ml/min 的流速進行蛋白分離。
使用以下條件：
波長：280 nm
等度的：30 分鐘
管柱溫度：25°C
樣品溫度：10°C
施加量：150 µg 蛋白質
9.
蛋白濃度測定
9.1.
使用比色皿進行測定
使用 Spectramax Plus（德國慕尼黑之 Molecular Devices ）藉由紫外光譜法來測定蛋白濃度。在比色皿中進行測量。在水中稀釋蛋白樣品。依據源自朗伯-比爾定律 (Lambert-Beer law) 的以下等式 1 確定濃度：
(1)
吸光度、蛋白濃度 [mg/ml]、ε 消光係數 [ml/(mg*cm)]、路徑長度 [cm]。
9.2.
使用微孔板進行測定
使用 Infinite 讀板器（德國克賴爾斯海姆之 Tecan Deutschland GmbH ）藉由紫外光譜法來測定蛋白濃度。在微孔板中進行測量。在水中稀釋蛋白樣品。依據等式 (1) 確定濃度。
使用以下公式 2 計算路徑長度 d：
(2)
A
水= 0.159 OD/cm（對應於施用說明 TECAN；文件號 N129013 02）。
10.
滯留時間和疏水性的測定
10.1. 設備- 具有集成資料採集系統的 HPLC 裝置；Dionex（現在為 Thermo Fisher Scientific）
- 0.2 μm 膜過濾器；例如 Pall Life Sciences Supor®-200，目錄號 60301
- Tosoh Bioscience，TSKgel
®Ether-5PW HPLC 管柱，10 μm，7.5 mm x 75 mm，目錄號 0008641，亦即內徑 2 mm、管柱長度 75 mm、粒徑 10 μm 之疏水性交互作用層析管柱。該管柱具有聚甲基丙烯酸酯基材（基質），該基材含有作為配體之聚醚基（乙醚基）。
10.2. 工作溶液：- 沖提劑 A： 包含 1.5 M (NH
4)
2SO
4的 25 mM 磷酸鈉緩衝液，pH 調整至 7.0
- 沖提劑 B： 25 mM 磷酸鈉緩衝液，pH 調整至 7.0
10.3.
疏水性交互作用層析
(HIC)
標準品
對於標準品製備，利妥昔單抗用合適的稀釋緩衝液稀釋至 1 mg/ml。注入 20 μl (= 20 μg) 的 HIC 標準品。利妥昔單抗的尖峰將在接近 32 分鐘的運行時間出現，即具有接近 32 分鐘的滯留時間。
10.4.
樣品
將樣品稀釋至 1 mg/ml 的濃度。如果樣品之濃度已達到 1 mg/ml，則無需稀釋。注入 20 μl (= 20 μg) 的 1 mg/ml 溶液。
10.5.
空白試樣
注入 20 μl 的稀釋緩衝液。
10.6.
新管柱之調適化
在超純水中提供管柱。在第一次運行之前，按如下方式準備新管柱：
1) 在環境溫度下將管柱轉移至沖提劑 B：在最少 40 分鐘內，流速從 0.0 ml/min 緩慢增加到 0.8 ml/min；之後用沖提劑 B 以 0.8 ml/min 的速度洗滌管柱，直到達到穩定的基線（通常在 60 分鐘後）。
2) 梯度運行：以 20 分鐘內從 0% 沖提劑 A 到 100% 沖提劑 A 的線性梯度運行。之後，用沖提劑 A 洗滌管柱，直到達到穩定的基線（通常在 60 分鐘後）。
3) 飽和度：依 10.8.所述注入和處理可用的標準品多次，直到三個連續的層析圖在尖峰形、高度和麵積方面相同；此後使用該管柱。
10.7.
使用過的管柱之調適化
安裝後，在環境溫度下用超純水洗滌管柱。在最少 40 分鐘內，流速從 0.0 ml/min 緩慢增加到 0.8 ml/min。此後，用沖提劑 A 以 0.8 ml/min 的流速洗滌管柱，直到達到穩定的基線。此後使用該管柱。
10.8.
工作條件和順序規劃
在任何順序 1x 之前，注入沖提劑 A，然後注入 20 μl 的 0.1 M NaOH，再注入沖提劑 A。
使用以下工作條件：
流速：0.8 ml/min
梯度：
最大壓力：22 bar
波長：214 nm（另外記錄 220 nm 和 280 nm）
注入蛋白：20 μg
管柱溫度：40°C ± 2℃
自動進樣器中的溫度：10°C ± 4°C
| 時間 [ 分鐘 ] | 沖提劑 A [%] | 沖提劑 B [%] |
| 0.0 | 100 | 0 |
| 2.0 | 100 | 0 |
| 3.0 | 87 | 13 |
| 5.0 | 87 | 13 |
| 57.0 | 0 | 100 |
| 62.0 | 0 | 100 |
| 63.0 | 100 | 0 |
| 65.0 | 100 | 0 |
HIC 標準品和樣品按以下順序測量：
1. 沖提劑 A
2. 20 μl 的 0.1 M NaOH
3. 沖提劑 A
4. HIC/對照
5. 空白（稀釋緩衝液）
6. 樣品 1 至 n
7+n 空白（稀釋緩衝液）
在最大尖峰值處確定滯留時間。
與利妥昔單抗同時或在其之前洗提的 mab（滯留時間較短）被發現係親水性的（滯留時間
mab≤ 滯留時間
利妥昔單抗），而在利妥昔單抗之後洗提的 mab（滯留時間較長）被發現係疏水性的（滯留時間
mab＞ 滯留時間
利妥昔單抗）。
11.RNA
濃度測定
為了測定 RVLP 的去除，將樣品中的 RNA 濃度確定為代表性測量結果值。
經由 FLOW PCR 設置系統（羅氏公司）進行自動化 RNA 分析。該系統由 3 個模塊組成：FLOW PCR SETUP 儀器（羅氏公司，訂單號 07101996001）、MagNA Pure 96 儀器（羅氏公司，訂單號 06541089001）和 LightCycler® 480 儀器（羅氏公司，訂單號 05015278001）。RNA 含量的測定係依製造商之操作手冊進行的。簡而言之，使用 MagNA Pure 96 儀器來分離 RNA。藉由 DNAse 處理後，探針在 LightCycler®480 儀器中進行測量，以藉由 PCR 技術（定量 RT PCR）對 RNA 進行定量。因此，RNA 首先藉由逆轉錄 (RT) 轉化為 cDNA。然後，在 PCR 反應中擴增 cDNA，並藉由與標準曲線進行比較來量化濃度。隨後將結果轉換為 RNA 含量。
實例
概述
實例部分可以細分為四個部分：
第
I
部分：
mab
疏水性對恆定導電率下高分子量
(HMW)
雜質減少的影響
流通液 (FT) 運行是在機器人系統 (Tecan Freedom 150) 上藉由 Capto
TMadhere ImpRes RC (Repligen) 進行的。選擇了多達 5 種抗離液 (ac) 鹽（Na
2SO
4、NaCl、(NH
4)
2SO
4、KCl、K
2SO
4）。收集 7 種 mab 之 FT 並藉由 SE-HPLC 分析純度。將藉由向負載中添加抗離液鹽實現的 HMW 減少與利用相同導電率的 Tris/乙酸鹽緩衝液 (pH 8) 和相應的 Tris/檸檬酸鹽緩衝液 (pH 6)（不包含抗離液鹽）來測定的 HMW 減少進行比較。表明，僅對於親水性 mab（滯留時間
mab≤ 滯留時間
利妥昔單抗來說，與在不存在抗離液鹽的情形下具有相同導電率的負載材料相比，藉由向負載材料中添加抗離液鹽來實現了改善的 HMW 減少。與此相反，對於疏水性 mab（滯留時間
mab＞ 滯留時間
利妥昔單抗）來說，在添加抗離液鹽的情形下，未觀察到積極影響。
表 MM-2 總結了第 I 部分的實例。
表 MM-2： 第 I 部分 - 實例
| 實例編號 | mab | pH | 導電率 [mS/cm] | 使用過的鹽 |
| 實例 1 | mab1、2， 4 - 8 | 8.0 | 20 | Na 2SO 4、NaCl、(NH 4) 2SO 4、KCl、K 2SO 4 |
| 實例 2 | mab1、2， 4 - 8 | 6.0 | 20 | Na 2SO 4、KCl |
| 實例 3 | mab2 & mab7 | 8.0 & 6.0 | 10 | Na 2SO 4、NaCl、(NH 4) 2SO 4、KCl、K 2SO 4 |
第
II
部分：抗離液鹽莫耳濃度對
HMW
去除的影響
在第2實驗部分中，進行了
RC 實驗和 Kp（分配係數）篩選以研究不同莫耳濃度的抗離液鹽對 HMW 減少的影響。在實例 4 中，將親水性 mab 負載到 Capto
TMadhere ImpRes RC 上，其中莫耳濃度範圍高達 500 mM。在 pH 8.0下，研究了不同的鹽（Na
2SO
4、NaCl、(NH
4)
2SO
4、KCl 和 K
2SO
4）。表明，鹽莫耳濃度的增加可以改善 FT 餾份中 HMW 的減少。
除了這些 RC 運行之外，還使用 Capto
TMadhere ImpRes 樹脂/層析材料（實例 5 和 6）來運行 Kp 篩選以顯示在更寬範圍的 pH 和莫耳濃度下鹽莫耳濃度對 HMW 減少的影響。對於實例 5，選擇了三種 mab，即兩種親水性 mab 和一種疏水性 mab。對於 Kp 篩選，所研究之 pH 範圍為 pH 5.5 至 8.0 並且莫耳濃度範圍為 10 至 800 mM。Kp 篩選 HMW 減少證實了 RC 資料。表明，對於親水性 mab，增加之鹽莫耳濃度導致 HMW 減少的改善，而疏水性 mab 之 HMW 減少並未藉由增加抗離液鹽莫耳濃度而改善。為了強調對抗離液鹽的需要，另外研究了離液鹽。使用離液鹽的等值線圖未顯示出隨著鹽莫耳濃度的增加而改善的 HMW 減少。
在實例 6 中，藉由 mab2 和 pH 4 至 9 的篩選範圍以及高達約 900 mM 的莫耳濃度來進行 Kp 篩選。在這些 Kp 篩選中，比較了兩組緩衝液：一种緩衝液含有抗離液鹽 Na
2SO
4，以及一種緩衝液不含抗離液鹽（僅 Tris/乙酸鹽緩衝液）。
表 MM-3 總結了第 II 部分的實例。
表 MM-3 ：第 II 部分 - 實例
| 實例編號 | 程序 | mab | pH | 鹽莫耳濃度 [mM] | 使用過的鹽 |
| 實例 4 | robocolumn | mab2 | 8.0 | 0 - 500 | Na 2SO 4、NaCl、(NH 4) 2SO 4、KCl、K 2SO 4 |
| 實例 5 | Kp 篩選 | mab2；mab4；mab7 | 5.5 - 8.0 | 10 - 800 | 抗離液：(NH 4) 2SO 4、KCl 離液：脲、Gua/HCl |
| 實例 6 | Kp 篩選 | mab2 | 4.0 - 9.0 | 10 - 約 900 | Na 2SO 4、Tris/乙酸鹽 |
第
III
部分：
HMW
去除與其他樹脂之比較
第3部分由兩個實例組成
：在實例 7 中，研究了在 5.5 至 8.0的 pH 範圍和 10 至 800 mM 的鹽莫耳濃度下親水性 mab 的 HMW 去除率。在該實例中，比較了以下混合模式陰離子交換 (MMAEX) 樹脂：Capto
TMadhere ImpRes、Capto
TMadhere 和 Nuvia aPrime。當將抗離液鹽添加到包含親水性 mab 的負載溶液中時，所有三種樹脂均顯示出改善的 HMW 減少。
實例 8 總結了利用一種親水性 mab 和一種疏水性 mab 對 MMAEX、陰離子交換 (AEX) 樹脂、HIC 樹脂和混合模式陽離子交換 (MMCEX) 樹脂進行的 Kp 篩選。研究的 pH 範圍係 pH 4.0 至 9.0 和 5 至 850 mM 的鹽。對於兩種離子混合模式樹脂（MMAEX 和 MMCEX），親水性 mab 的流通液樣品指示了隨著鹽莫耳濃度的增加而改善的 HMW 減少。與此相反，對於疏水性 mab，MMAEX 樹脂上的 HMW 減少在所研究的鹽莫耳濃度範圍內係恆定的。對於 MMCEX 樹脂，疏水性 mab 的 HMW 減少值並未藉由將鹽莫耳濃度增加到 500 mM Na
2SO
4以下而得到增加。利用單模式樹脂 Q Sepharose FF (AEX) ，對於親水性和疏水性 mab， 均未觀察到對 HMW 減少的積極影響。對於 Phenyl Sepharose 6 FF (high sub) (HIC)，針對親水性和疏水性 mab 測量了增加之鹽莫耳濃度對 HMW 減少的積極影響。
表 MM-4 示出了第 III 部分的實例。
表 MM-4 ：第 III 部分 - 實例
| 實例編號 | 樹脂 | mab | pH | 鹽莫耳濃度 [mM] | 使用過的鹽 |
| 實例 7 | Capto adhere ImpRes、Capto adhere、Nuvia aPrime | mab2 | 5.5 – 8.0 | 10 - 800 | 抗離液：(NH 4) 2SO 4、KCl 離液：脲、Gua/HCl |
| 實例 8 | Q Sepharose FF、Phenyl Sepharose 6FF (high sub)、Capto MMC ImpRes | mab2 & mab6 | 4.0-9.0 | 5 - 850 | (NH 4) 2SO 4、Na 2SO4 |
第
IV
部分：擴大
ÄKTA
管柱運行
對於第
4 部分，利用 Na
2SO
4和 mab2 在 ÄKTA 系統上進行放大運行。在此，使用 Capto
TMadhere ImpRes 樹脂完成了從 50 µL 的 Kp 篩選樹脂體積和 200 µL 的 RC 體積擴大到 6.8 mL 的管柱體積。實例 9 示出了在導電率相同但 Na
2SO
4莫耳濃度不同的兩次運行中，FT 餾份的主尖峰值。儘管兩種負載的導電率相等，但含有較高莫耳濃度的 Na
2SO
4的負載的 HMW 減少明顯更好。在實例 10 中，描述了在 pH 7 和 pH 8 下以不同的 Na
2SO
4莫耳濃度（和不同的導電率）進行的運行。隨著鹽莫耳濃度的增加，確定了改善的 HMW 減少。這些實驗室規模的結果證實了第 II 部分和第 III 部分中機器人系統所實現之結果。
表 MM-5 示出了第 IV 部分的實例。
表 MM-5 ：第 IV 部分 - 實例
| 實例編號 | 樹脂 | mab | pH | 導電率 [mS/cm] | 使用過的鹽 |
| 實例 9 | Capto adhere ImpRes | mab2 | 8 | 9（不同的莫耳濃度：20 & 40 mM） | Na 2SO 4 |
| 實例 10 | Capto adhere ImpRes | mab2 | 7 8 | 5 - 12 (0 - 60 mM) | Na 2SO 4 |
第
V
部分：去除
RVLP
（反轉錄病毒樣顆粒）
除了去除產品相關雜質（如 HMW）外，還研究了在 MM 層析樹脂上純化抗體時使用抗離液鹽是否確實也具有去除反轉錄病毒樣顆粒 (RVLP) 的效果。
在這方面，進行了兩次 Kp 篩選（實例 11 和實例 12）。
Kp
篩選：抗離液鹽和
mab
疏水性對
RVLP
去
除之影響
進行了 Kp（分配係數）篩選以研究抗離液鹽和 mab 疏水性對 RVLP 減少之影響。藉由定量 RT PCR 對 RNA 濃度的量化來測量了（含 RNA）RVLP 之濃度。在這些 Kp 篩選中，比較了兩組緩衝液：一种緩衝液含有抗離液鹽 Na
2SO
4（實例 11），以及一種緩衝液不含抗離液鹽（僅 Tris/乙酸鹽緩衝液）（實例 12）。另外，選擇了四種 mab，兩種親水性 mab（mab1 和 mab2）和兩種疏水性 mab（mab7 和 mab9）。層析樹脂為 Capto
TMadhere ImpRes。
對於實例 11，所研究之 pH 範圍為 pH 5.0 至 8.0，莫耳濃度範圍為 25 至 400 mM Na 2 Na
2SO
4（對應於 3 至 34 mS/cm 的導電率範圍）。與疏水性 mab（圖 41 和 圖 42）相比，針對親水性 mab 示出 RVLP 減少值提高。對於 mab 2，在高達 200 mM Na
2SO
4(17 mS/cm) 的鹽莫耳濃度下觀察到 5 個對數步驟之 RVLP 去除。為了突出使用抗離液鹽對親水性 mab 實現改進的 RVLP 去除，另外研究了不含抗離液鹽的 Tris/乙酸鹽緩衝液（實例 12）。對於實例 12，所研究之 pH 範圍為 pH 5.0 至 8.0，莫耳濃度範圍為 25 至 1100 mM Tris/乙酸鹽（對應於 1 至 19 mS/cm的導電率範圍）。缺少抗離液鹽的等值線圖未顯示出改善的 RVLP 減少——無論是對於親水性 mab 還是對於疏水性 mab（圖 43 和 圖 44）。
所使用術語之字彙： 僅對照/緩衝液：不包括任何抗離液鹽，但具有相同的導電率
負載：獨立於成分而負載之溶液
LF：RC 之負載餾份
總負載體積：施加 350 g
蛋白/L
樹脂所需之體積
總負載量：在所有施加之相應負載餾份中所施加之抗體量的總和
負載量：用於藉由最佳擬合線來計算 HMW 去除率
HMW 值：經過分析確定的流通液餾份中之 HMW 含量
HMW去除值：針對單個負載餾份而計算出的 HMW 去除率
HMW 去除率：基於最佳擬合線計算出的 HMW 去除率
池 HMW 去除值：針對施加於單個餾份中的總負載量而獲得之計算出的 HMW 去除率
單個池負載量：在相應計算出的池 HMW 去除值的單個餾份中負載之理論抗體量
FT：流通液餾份
RC：Robocolumn
TMRC運行：Robocolumn
TM運行
CV：管柱體積
實例
第
I
部分：
mab
疏水性對恆定導電率下高分子量
(HMW)
雜質減少的影響
實例
1
藉由在
pH 8
和
20 mS/cm
下之負載進行之
Robocolumn
TM
運行
在 pH 8 和 20 mS/cm 的導電率下，利用 4 種親水性和 3 種疏水性 mab 進行機器人運行。在運行間，藉由添加以下抗離液鹽來改變緩衝條件：氯化鈉、硫酸鈉、硫酸銨、氯化鉀和硫酸鉀。對於每次運行，平行研究了所有 7 種 mab。
緩衝液
各個平衡緩衝液的 pH 值和導電率總結在下表 X-1.1a 中。藉由添加緩衝液的相應酸（乙酸）分別調整 pH 值。將溶液的所有組分混合後測定導電率。緩衝液 1.5 M Tris/乙酸鹽 (pH 8) 係「對照」條件，即不包括任何抗離液鹽但具有相同的導電率（「僅緩衝液」）。
表 X-1.1a ：RC 運行的緩衝液條件為 pH 8 和 20 mS/cm。
| 緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 1.5 M Tris/乙酸鹽，pH 8（對照） | 8.09 | 18.71 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，125 mM Na 2SO 4，pH 8 | 8.03 | 20.70 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，200 mM NaCl，pH 8 | 7.97 | 21.80 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，100 mM (NH 4) 2SO 4，pH 8 | 7.90 | 20.20 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，150 mM KCl，pH 8 | 7.90 | 20.70 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，100 mM K 2SO 4，pH 8 | 7.98 | 21.50 |
起始材料的濃縮和抗體溶液的緩衝液交換
將抗體溶液 (mab) 調整至與相應緩衝液相當之 pH 值和導電率。為了實現這一點，將各個親和管柱洗提池進行緩衝液交換至相應緩衝液（例如，70 mM Tris/乙酸鹽，125 mM Na
2SO
4，pH 8；參見表 X-1.1a）並藉由使用 Amicon Ultra 離心式過濾器進行濃縮。離心後，將 mab 稀釋至約 20 g/L 的濃度，並測定 pH 值和導電率。待負載之溶液（「負載」）藉由 0.2 µm 無菌過濾器過濾並測定蛋白濃度。對所有 Robocolumn
TM運行（RC 運行）執行該程序。
負載
負載的 pH 值、導電率和抗體濃度總結在下表 X-1.1b 中。
表 X-1.1b ：在 pH 8 和 20 mS/cm 下 RC 運行之負載 pH、導電率和濃度。範圍基於包含不同抗體之負載。
| 負載 | 負載的 pH 範圍 | 負載的導電率範圍 [mS/cm] | 負載的濃度範圍 [g/L] |
| 1.5 M Tris/乙酸鹽，pH 8（對照） | 8.03-8.12 | 17.35-17.58 | 19.98-25.17 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽， 125 mM Na 2SO 4，pH 8 | 8.04-8.07 | 19.24-19.60 | 18.15-23.69 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽， 200 mM NaCl，pH 8 | 7.91-8.00 | 20.1-20.60 | 19.63-22.94 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽， 100 mM (NH 4) 2SO 4，pH 8 | 7.86-7.89 | 19.38-19.81 | 14.69-20.76 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽， 150 mM KCl，pH 8 | 7.89-7.93 | 19.22-19.59 | 18.20-25.02 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽， 100 mM K 2SO 4，pH 8 | 7.98-7.99 | 19.85-20.20 | 14.93-22.50 |
對於實例 1之所有實驗，負載之 pH 範圍在 pH 8.0 ± 0.2 的範圍內。負載之導電率與平衡緩衝液之導電率相差 ± 2.0 mS/cm。負載之蛋白濃度在 14.5 與 25.5 g/L 之間。
在下文中，提供了對示例性 RC 運行之描述。所有 RC 運行都進行了類似的操作，除了用於製備負載的緩衝液不同之外（參見上面的表 X-1.1a 和 X-1.1b）。例如，對於使用緩衝液（70 mM Tris/乙酸鹽，125 mM Na
2SO
4，pH 8）的負載，pH 範圍為 pH 8.04 至 8.07，這意味著在緩衝液交換和濃縮後平衡緩衝液中 7 種不同 mab 的負載在該 pH 範圍內。
下表 X-1.2 示出了流通模式下 70 mM Tris/乙酸鹽、125 mM Na
2SO
4（pH 8）、中不同抗體之 RC 運行的各個負載的特性：
表 X-1.2： 實例 1 - 70 mM Tris/乙酸鹽、125 mM Na
2SO
4（pH 8）中的負載。
| mab | pH | 導電率 [mS/cm] | 蛋白濃度 [mg/mL] |
| mab1 | 8.07 | 19.38 | 19.86 |
| mab2 | 8.06 | 19.25 | 22.89 |
| mab4 | 8.04 | 19.25 | 20.77 |
| mab5 | 8.05 | 19.34 | 23.69 |
| mab6 | 8.05 | 19.46 | 19.96 |
| mab7 | 8.05 | 19.24 | 19.15 |
| mab8 | 8.04 | 19.60 | 18.15 |
這些負載單獨地施加於不同的 Capto adhere ImpRes RC。
層析法
在 Tecan Freedom Evo 150 上進行 RC 運行。首先用 10 CV 的不含抗體的緩衝液（例如，pH 8 下之 70 mM Tris/乙酸鹽、125 mM Na
2SO
4）來平衡 RC（pH 和導電率調整）。此後，將每個 RC 逐步負載到 200 µL 負載餾份 (LF) 中，最高可達 350g
蛋白/L
樹脂，並將流通液收集在 200 µL 流通液餾份（FT 餾份）中。加入 350 g
蛋白/L
樹脂後，將 8 倍管柱體積 (CV) 的不含抗體的緩衝液施加到管柱中，以在再生前從管柱中清洗出殘留的未結合材料。未收集負載後之洗滌液。
所有 RC 運行的流速為 18 CV/hr，其對應停留時間 3.3 分鐘。洗滌之後係 RC 的再生和儲存。
表 X-1. 3 ：實例 1 – 示例性層析步驟。
| 步驟 | 緩衝液 | CV |
| 平衡 | 70 mM Tris/乙酸鹽，125 mM Na 2SO 4，pH 8 | 10 |
| 負載 | 參見表 X-1.2 | 14-20 |
| 洗滌 | 70 mM Tris/乙酸鹽，125 mM Na 2SO 4，pH 8 | 8 |
下表 X-1.4 總結了負載濃度和體積。
表 X-1.4 ：實例 1 – 在使用表 X-1.3 的方案的 RC 運行中使用的負載濃度和體積。
| mab | 負載濃度 [mg/mL] | 總負載體積 [µL] |
| mab1 | 19.86 | 3530 |
| mab2 | 22.89 | 3060 |
| mab4 | 20.77 | 3370 |
| mab5 | 23.69 | 2950 |
| mab6 | 19.95 | 3510 |
| mab7 | 19.15 | 3660 |
| mab8 | 18.15 | 3860 |
藉由 Tecan Freedom Evo 150 對負載餾份的移液以同時完成一次聯合 RC 運行的所有負載的模式進行。因此，施加負載的起點因負載中的抗體濃度而變化。具有較高濃度的負載，例如 mab5，導致所需的總負載體積較低（從而進行負載步驟），並導致負載步驟開始較晚。對於每個負載步驟，收集相應的流過餾份 (FT)。因此，對於每次運行，分別施加、收集和分析不同數量的 200 µL 餾份（對於 mab8，最多 20 個餾份）。
下表 X-1.5 示出了在每個負載步驟後增加的總負載量 [g/L]。在最多 20 個連續負載步驟後，每個 RC 上已施加總負載量 350 g
蛋白/L
樹脂。
表 X-1.5a ：實例 1 – 使用表 X-1.3 和 X-1.4 的方案的運行之基於負載步驟的總負載量 [g/L]。
| 負載步驟 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 1 0 | 1 1 | 1 2 | 1 3 | 1 4 | 1 5 | 1 6 | 1 7 | 1 8 | 1 9 | 2 0 |
| mab1 總負載量 [g/L] | 0 | 0 | 13 | 33 | 53 | 72 | 92 | 112 | 132 | 152 | 172 | 192 | 211 | 231 | 251 | 271 | 291 | 311 | 331 | 350 |
| mab2 總負載 [g/L] | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 30 | 53 | 76 | 98 | 121 | 144 | 167 | 190 | 213 | 236 | 259 | 282 | 304 | 327 | 350 |
| mab4 總負載量 [g/L] | 0 | 0 | 0 | 18 | 38 | 59 | 80 | 101 | 121 | 142 | 163 | 184 | 205 | 225 | 246 | 267 | 288 | 308 | 329 | 350 |
| mab5 總負載量 [g/L] | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 18 | 41 | 65 | 89 | 113 | 136 | 160 | 184 | 207 | 231 | 255 | 278 | 302 | 326 | 350 |
| mab6 總負載量 [g/L] | 0 | 0 | 11 | 31 | 51 | 71 | 91 | 111 | 131 | 151 | 171 | 191 | 211 | 230 | 250 | 270 | 290 | 310 | 330 | 350 |
| mab7 總負載量 [g/L] | 0 | 6 | 25 | 44 | 63 | 82 | 101 | 121 | 140 | 159 | 178 | 197 | 216 | 236 | 255 | 274 | 293 | 312 | 331 | 350 |
| mab8 總負載量 [g/L] | 5 | 24 | 42 | 60 | 78 | 96 | 114 | 132 | 151 | 169 | 187 | 205 | 223 | 241 | 260 | 278 | 296 | 314 | 332 | 350 |
分析
表 X-1.5b ：所選 FT 餾份之 SE-HPLC 分析。
| 負載步驟 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 1 0 | 1 1 | 1 2 | 1 3 | 1 4 | 1 5 | 1 6 | 1 7 | 1 8 | 1 9 | 2 0 | 負載 |
| mab1 HMW 值 [%] | 0.30 | 0.48 | 0.85 | 1.28 | 1.54 | 1.68 | 1.80 | 1.93 | 2.93 | ||||||||||||
| mab2 HMW 值 [%] | 1.66 | 3.60 | 4.77 | 5.51 | 6.12 | 6.54 | 9.97 | ||||||||||||||
| mab4 HMW 值 [%] | 0.58 | 0.84 | 1.04 | 1.17 | 1.27 | 1.44 | 1.54 | 2.52 | |||||||||||||
| mab5 HMW 值 [%] | 0.74 | 0.95 | 0.99 | 1.04 | 1.08 | 1.13 | 1.62 | ||||||||||||||
| mab6 HMW 值 [%] | 8.19 | 12.63 | 13.22 | 13.57 | 13.71 | 14.03 | 14.27 | 16.75 | |||||||||||||
| mab7 HMW 值 [%] | 4.56 | 5.55 | 6.07 | 6.45 | 6.89 | 6.89 | 7.13 | 9.62 | |||||||||||||
| mab8 HMW 值 [%] | 3.56 | 5.02 | 5.69 | 6.2 | 6.38 | 6.49 | 6.77 | 6.89 | 8.95 |
表 X-1.5c ：HMW 去除值。
| 負載步驟 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 1 0 | 1 1 | 1 2 | 1 3 | 1 4 | 1 5 | 1 6 | 1 7 | 1 8 | 1 9 | 2 0 |
| mab1 HMW 去除值 [%] | 89.76 | 83.62 | 70.99 | 56.31 | 47.44 | 42.66 | 38.57 | 34.13 | ||||||||||||
| mab2 HMW 去除值 [%] | 83.35 | 63.89 | 52.16 | 44.73 | 38.62 | 34.40 | ||||||||||||||
| mab4 HMW 去除值 [%] | 76.98 | 66.67 | 58.73 | 53.57 | 49.60 | 42.86 | 38.89 | |||||||||||||
| mab5 HMW 去除值 [%] | 54.32 | 41.36 | 38.89 | 35.80 | 33.33 | 30.25 | ||||||||||||||
| mab6 HMW 去除值 [%] | 51.10 | 24.60 | 21.07 | 18.99 | 18.15 | 16.24 | 14.81 | |||||||||||||
| mab7 HMW 去除值 [%] | 52.60 | 42.31 | 36.90 | 32.95 | 28.38 | 28.38 | 25.88 | |||||||||||||
| mab8 HMW 去除值 [%] | 60.22 | 43.91 | 36.42 | 30.73 | 28.72 | 27.49 | 24.36 | 23.02 |
HMW 去除值藉由以下公式 1 計算：
HMW 去除值 % = 100 – HMW
餾份/HMW
負載x 100% (1)
HMW
餾份= HMW 值 [%] （在流通液 (FT) 餾份中測定），
HMW
負載= HMW 值 [%]（在相應負載 [%] 中測定）。
在負載步驟 10 中計算 mab2 的 HMW 去除值的實例：
在負載步驟 10 中，相應 FT 餾份之測定 HMW 值為 1.66%。負載的 HMW 值為 9.97%。將此應用於公式 1
HMW 去除值 = 100 – 1.66 / 9.97 x 100% = 83.35%
得到：mab2 的負載餾份 10 之 HMW 去除值為 83.35%。
分析
相對於抗體的總負載量，對 HMW 值或主尖峰值或 HMW 去除值繪圖。
圖 1 至圖 7 示出了在 pH 8.0 和導電率為 20 mS/cm 時，用不同的抗離液鹽針對所研究之 mab 之 FT 餾份確定的 HMW 去除值。x 軸對應於總負載量，y 軸對應於針對相應的 FT 餾份所確定的 HMW 去除值。
表 X-1.5c 中的 HMV 去除值示出了在相應負載步驟中達成的實際 HMW 去除，即針對相應的負載餾份。然而，池 HMW 去除值更接近地反映了實際的大規模過程。該池 HMW 去除值係在單個餾份中施加時針對總負載量獲得之 HMW 去除。基於表 X-1.5c 中資料的對數最佳擬合線，針對單個池負載量 150 g/L、250 g/L、350 g/L、450 g/L 和 550 g/L 計算了池 HMW 去除值。
下面針對 mab2 示例性地說明該程序：
圖 2 示出了 mab2 的每個 FT 餾份之 HMW 去除值。針對表 X-1.1 的不同緩衝液所獲得之結果顯示在該圖中。為了計算 mab2 的單個池負載量的池 HMW 去除值，首先，確定每種緩衝液的 HMW 去除的對數最佳擬合線。mab2 的這些最佳擬合趨勢線的添加如圖 8A 所示。其次，使用兩個最佳擬合趨勢線方程式，對於 5 g/L 並且在 25 至 550 g/L 範圍內以 25 g/L 為增量之負載量，計算了 HMW 去除率。
例如，為了計算單個池負載量（例如 150 g/L）的池 HMW 去除值，基於負載量 ≤ 150 g/L 時每個計算出之 HMW 去除值的 HMW 去除率來計算平均值。對於小負載量（5 至 50 g/L），HMW 去除率設定為 100%，因為計算結果顯示非邏輯 HMW 去除率 ＞ 100%。表 X-1.6 示出了所計算之 HMW 去除率。
表 X-1.6 ：實例 1 - HMW 去除率和池 HMW 去除值的計算。
| mab2 | 70 mM Tris/乙酸鹽，100 mM (NH 4) 2SO 4，pH 8 | 1.5 M Tris 乙酸鹽，pH 8 | ||
| 負載量 [g/L] | 使用最佳擬合線的 HMW 去除率 [%] | 池 HMW 去除值 [%] | 使用最佳擬合線的 HMW 去除率 [%] | 池 HMW 去除值 [%] |
| 5 | 100 | 66 | ||
| 25 | 100 | 44 | ||
| 50 | 100 | 35 | ||
| 75 | 97 | 30 | ||
| 100 | 84 | 26 | ||
| 125 | 74 | 23 | ||
| 150 | 66 | 89 | 20 | 35 |
| 175 | 59 | 18 | ||
| 200 | 53 | 16 | ||
| 225 | 48 | 15 | ||
| 250 | 43 | 75 | 13 | 28 |
| 275 | 39 | 12 | ||
| 300 | 35 | 11 | ||
| 325 | 32 | 10 | ||
| 350 | 28 | 64 | 9 | 23 |
| 375 | 25 | 8 | ||
| 400 | 22 | 7 | ||
| 425 | 20 | 6 | ||
| 450 | 17 | 55 | 6 | 20 |
| 475 | 15 | 5 | ||
| 500 | 12 | 4 | ||
| 525 | 10 | 3 | ||
| 550 | 8 | 47 | 3 | 17 |
另外，這些計算是針對一種疏水性mab (mab7) 進行的。圖 8B 示出了 mab7 之各個最佳擬合線和方程式。
在圖 9A和 9B 中，針對 mab2（圖 9A）和 mab7（圖 9B）示出了單個池負載量之 HMW 去除率。
實例
1
總結：
對於親水性 mab（mab1、mab2、mab4、mab5），與在相同導電率下沒有抗離液鹽的負載相比，當向負載添加抗離液鹽時，HMW 值減少得更多。這在圖 1 至 圖 4 中進行了說明。負載的導電率相當（都約為 20 mS/cm）。負載中抗離液鹽之存在增強了親水性 mab 之 HMW 減少，而負載導電率未改變。
與此相反，對於疏水性 mab（mab6、mab7、mab8），含有抗離液鹽的負載和不含抗離液鹽的負載（參見圖 5 至 圖 7）的 HMW 值減小相似。對於疏水性 mab，與不含抗離液鹽的負載相比，添加抗離液鹽沒有顯示出在 HMW 值減小方面之有利效果。
為了計算 FT 池之 HMW 去除率，引入了趨勢線。在圖 8A和 8B 中，針對 mab2（圖 8A）和 mab7（圖 8B）示出了 FT 池之 HMW 去除率。例如，對於 mab2，可以看出當負載中存在硫酸銨時，負載量為 150 g/L 的 HMW 減少從 35% 增加到 89%（參見圖 9A）。對於 550 g/L 的負載量，在 (NH
4)
2SO
4的存在下，HMW 減少從 17% 增加到 47%。與此相反，令人驚訝的是，在抗離液鹽的存在和不存在的情形下，mab7 的 HMW 減少係相似的。因此，對於疏水性 mab7，HMW 減少並未藉由添加抗離液鹽而得到改善（參見圖 9B）。
實例
2
藉由在
pH 6
和
20 mS/cm
下之負載進行之
Robocolumn
TM
運行
在不存在和存在兩種抗離液鹽，即 Na
2SO
4和 KCl 的情形下，使用 Tris/乙酸鹽緩衝液在 pH 6 和導電率為 20 mS/cm 的情形下藉由 7 種 mab 進行RC運行。各自的對照為在 1.0 M Tris/乙酸鹽 (pH 6) 中之負載，其在不存在任何抗離液鹽的情形下具有相同的導電率。
圖 10 至 圖 16 示出了在 pH 6.0 和導電率為 20 mS/cm 的情形下，對於含有 Na
2SO
4和 KCl 的負載，每個 FT 餾份的 HMW 去除值。在 x 軸上顯示了總負載量。
實例
2
總結：
對於親水性 mab，當向負載中添加抗離液鹽時，與在相同導電率下不含抗離液鹽的相同緩衝液中的負載相比，HMW 減少顯著改善（參見圖 10 至 圖 13）。與此相反，令人驚訝的是，對於含有抗離液鹽的負載和不含抗離液鹽的負載，疏水性 mab 的 HMW 減少係相當的（參見圖 14 至 圖 16）。
實例
3
藉由在
pH 6
或
8
和
10 mS/cm
下之負載進行之
Robocolumn
TM
運行
在抗離液鹽存在和不存在（即不含）於緩衝液中之情形下，用一種親水性和一種疏水性 mab 進行 RC 運行。在這兩種情形下，負載的導電率相同 (10 mS/cm)。在 pH 6 以及在 pH 8 下進行這些實驗。RC 上負載了高達 350 g
蛋白/L
樹脂。分析了五種抗離液鹽的影響。具有包含 400 mM Tris/乙酸鹽（pH 8）的負載和包含 300 mM Tris/乙酸鹽（pH 6）但不含抗離液鹽的負載的運行分別為對照。
圖 17A 和圖 17B 示出了對於親水性 mab2（圖 17A）和對於疏水性 mab7（圖 17B），在 pH 6 和 10 mS/cm 的導電率時 FT 餾份之 HMW 去除值。圖 18 示出了在 pH 8 和導電率為 10 mS/cm 時 FT 餾份之 HMW 去除值。圖 18A 示出了親水性 mab2 的結果，圖 18B 示出了疏水性 mab7 的結果。
實例
3
總結：
圖 17 和圖 18 分別示出了在 pH 6 和 pH 8 在導電率為 10 mS/cm 時每個 FT 餾份的 HMW 去除值與 mab2 和 mab7 的總負載量相關。可以看出，與不含抗離液鹽的對照運行相比，在存在抗離液鹽的情形下，包含親水性 mab 的負載中的 HMW 減少在 FT 餾份中增加。對於疏水性 mab，在抗離液鹽的存在下未觀察到 HMW 減少的增加。
第
II
部分：抗離液鹽莫耳濃度對
HMW
減少的影響
實例
4
藉由在
pH 8
下之
mab2
進行之
Robocolumn
TM
運行
藉由含有在 pH 8 下以及抗離液鹽濃度範圍為 0 至 500 mM 的負載的 mab2 進行 RC 運行。所使用的 RC 運行的程序已在示例 1 中詳細概述。使用以下鹽：Na
2SO
4、NaCl、(NH
4)
2SO
4、KCl、K
2SO
4。收集和分析流通液 (FT) 餾份。
圖 19 至 圖 23 示出了對於不同抗離液鹽，在 pH 8 下的 mab2 的 FT 餾份的 HMW 值。
實例
4
總結：
在實例 4 中，針對具有親水性 mab2 的在 pH 8 下的五種抗離液鹽研究了增加的抗離液鹽莫耳濃度（和導電率）的影響。使用了以下抗離液鹽：硫酸鈉（參見圖 19）、氯化鈉（參見圖 20）、硫酸銨（參見圖 21）、氯化鉀（參見圖 22）和硫酸鉀（參見圖 23）。相對於總負載量，對每個 FT 餾份之 HMW 值 [%] 繪圖。藉由向包含親水性mab的負載添加抗離液鹽，實現了 FT 餾份中降低的 HMW 值。對於所有研究之抗離液鹽，發現 HMW 減少有所增加。
對於三種 mab（親水性和疏水性）和四種鹽 (NH
4)
2SO
4、KCl、Gua/HCl 和脲，使用 Kp 篩選（參見實例 5）也觀察到了增加的鹽莫耳濃度的效果。
實例
5
Kp
篩選（
pH 5.5
至
8.0
）
該實例中詳細描述了 Kp 篩選的方法。
Mab
溶液之製備
藉由 Amicon Ultra 離心式過濾器濃縮含有抗體的溶液，並藉由 Slide-A-Lyzer 透析盒將進行緩衝液交換至 10 mM Tris/乙酸鹽 (pH 6.5)。蛋白濃度範圍為 67 g/L 至 89 g/L。Kp 篩選的總負載量為 150 g/L。負載在 0.2 µm 下過濾並測定蛋白含量（OD 280 至 320）。
濾板之製備
藉由離心機在試管中製備 50% Capto
TMadhere ImpRes 樹脂在水中的漿以進行快速沉澱。然後將樹脂轉移到放置在 Hamilton Microlab STARlet 機器人上的振盪器中。在濾板的每孔中加入 50 µL 樹脂 Capto
TMadhere ImpRes。
緩衝液之製備
為了製備緩衝板和負載板，使用了以下材料：
- 高鹽緩衝液；
- 低鹽緩衝液；
- 10 mM Tris/乙酸鹽，pH 6.5 (0.6 mS/cm)；
- 適當濃度的 10 mM Tris/乙酸鹽 (pH 6.5) 中的蛋白儲備溶液；
- 剝離緩衝液。
對於 Kp 篩選，緩衝板和負載板由機器人系統 (Tecan Freedom EVO 200) 使用高鹽緩衝液和低鹽緩衝液來製備。藉由稱入 Tris 和所需量之鹽來製備高鹽和低鹽儲備溶液。然藉由乙酸調整 pH。
表 X-2.1 和 X-2.2 總結了用於製備平衡板和負載板的低鹽和高鹽緩衝液。
表 X-2.1 ：實例 5 - Kp 篩選的低鹽緩衝液
| 低鹽緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，pH 5.5 | 5.50 | 3.7 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，pH 7.0 | 7.07 | 3.4 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 8.08 | 2.0 |
表 X-2.2 ：實例 5 - Kp 篩選的高鹽緩衝液
| 高鹽緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M (NH 4) 2SO 4，pH 5.5 | 5.56 | 137.7 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M (NH 4) 2SO 4，pH 7.0 | 7.06 | 136.8 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M (NH 4) 2SO 4，pH 8.0 | 8.00 | 135.3 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M KCl，pH 5.5 | 5.42 | 111.4 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M KCl，pH 7.0 | 6.96 | 111.7 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M KCl，pH 8.0 | 7.94 | 111.2 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M 脲，pH 5.5 | 5.49 | 3.6 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M 脲，pH 7.0 | 6.93 | 3.5 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M 脲，pH 8.0 | 7.99 | 2.3 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M Gua/HCl，pH 5.5 | 5.56 | 83.1 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M Gua/HCl，pH 7.0 | 6.87 | 83.2 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，1 M Gua/HCl，pH 8.0 | 7.89 | 82.9 |
如表 X-2.3 所示，由機器人對負載板和平衡板進行移液。四種鹽的莫耳濃度在 10 mM 至約 800 mM 的範圍內。
表 X-2.3 ：實例 5 - Kp 篩選的板佈置
| (NH 4) 2SO 4 | KCl | 脲 | Gua/HCl | |||||||||||
| pH 5.5 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.5 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.5 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.5 | pH 7.0 | pH 8.0 | 鹽莫耳濃度 [mM] | ||
| A | 10 | |||||||||||||
| B | 75 | |||||||||||||
| C | 150 | |||||||||||||
| D | 225 | |||||||||||||
| E | 300 | |||||||||||||
| F | 450 | |||||||||||||
| G | 650 | |||||||||||||
| H | 約 800 | |||||||||||||
濃縮之蛋白儲備溶液由機器人移液到負載板中。為了忽略每個孔條件的 pH 值和導電率的變化，蛋白儲備溶液可以在 10 mM Tris/乙酸鹽 (pH 6.5) 中，並處於高蛋白濃度，以最大限度地減小移液體積。
Kp
篩選之執行
Kp 篩選的總負載量設定為 150 g/L，並分為兩個負載步驟，每個負載步驟 75 g/L。
Kp篩選法包括以下步驟：
- 去除儲存緩衝液；
- 平衡 1+2：轉移 300 µL 平衡緩衝液，在搖床 (1100 rpm) 上孵育 5 分鐘，並離心以去除平衡緩衝液 (2,500 rpm, 600 sec);
- 負載 1+2：轉移 300 µL 負載，在搖床 (1100 rpm) 上孵育 60 分鐘，並離心以在 FT 板上收集 FT (2,500 rpm, 600 sec)；
- 剝離 1+2：轉移 300 µL 剝離緩衝液，在搖床 (1100 rpm) 上孵育 5 分鐘，並離心以去除剝離緩衝液 (2,500 rpm, 600 sec)。
對 FT 板進行 SE-HPLC 分析。
HMW 去除率計算如下：
HMW 去除率 % = 100 –HMW
孔/ HMW
負載x 100%
HMW
孔為 FT 板的孔中測得之 HMW 值 [%]，HMW
負載為蛋白儲備溶液的 HMW 位準 [%]。
使用 Infinite M200 讀板器測定負載板和 FT 板的蛋白濃度。
圖 24 至 圖 27 示出了 FT 樣品針對三種 mab 和兩種抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4和 KCl，以及兩種離液鹽 Gua/HCl 和脲的 HMW 去除值 [%]。圖 24A、25A、26A 和 27A 針對親水性 mab2 示出了 HMW 去除值，圖 24B、25B、26B 和 27B 針對親水性 mab4 示出了 HMW 去除值。疏水性 mab6 的 HMW 去除值顯示在圖 24C、25C、26C 和 27C 中。
圖 24 中示出了 (NH
4)
2SO
4對 HMW 減少的影響並且圖 25 中示出了 KCl 的影響。圖 26（Gua/HCl）和圖 27（脲）中示出了兩種離液鹽對 HMW 減少的影響。
實例
5
總結：
使用 pH 範圍為 pH 5.5 至 8.0 和鹽莫耳濃度高達 800 mM 的兩種親水性和一種疏水性 mab 示出了四種鹽（兩種抗離液鹽和兩種離液鹽）的效果。選擇了離液鹽（Gua/HCl 和脲）以在疏水性交互作用減弱時測定 HMW 減少。
根據 mab 之疏水性，看出了 HMW 減少的差異。對於親水性 mab（mab2 和 mab4），添加抗離液鹽（硫酸銨，圖 24 以及 KCl，圖 25）使 HMW 減少值提高到 70-80%。對於疏水性 mab6，在硫酸銨的存在下之 HMW 減少在 70-80% 的範圍內，並且幾乎不受硫酸銨莫耳濃度之影響。利用 KCl，疏水性 mab6 的 HMW 減少隨著 KCl 莫耳濃度的增加而降低。圖 24C 和 圖 25C 示出了：對於疏水性 mab6，HMW 減少未藉由增加抗離液鹽的莫耳濃度而得到改善。
Gua/HCl（圖 26）和脲（圖 27）示出了，對於親水性或疏水性 mab 兩者，沒有觀察到隨著鹽莫耳濃度之增加而提高的 HMW 去除率。
總的來說，在抗離液鹽的存在下，親水性 mab 之 HMW 減小得到改善。對於疏水性 mab，在抗離液鹽的存在下可觀察到 HMW 減少的改善。此外，在離液鹽的存在下沒有獲得改善之 HMW 減少。
實例
6
藉由
mab2 (pH 4-9)
進行
Kp
篩選
對於具有一種親水性 mab (mab2) 和兩種緩衝系統 i) 包含 (10 至 850) mM Na
2SO
4的 25 mM Tris/乙酸鹽和 ii) (25 至 975) mM Tris/乙酸鹽的 Kp 篩選，製備了以下儲備溶液（參見表 X-2.4）：
表 X-2.4 ：實例 6 – Kp 篩選的低鹽和高鹽緩衝液
| 低鹽緩衝液 | 高鹽緩衝液 (Na 2SO 4) | 高鹽緩衝液 （ Tris/ 乙酸鹽） |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 4.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 4.0 | 1.4 M Tris 乙酸鹽，pH 4.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 5.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 5.0 | 1.4 M Tris 乙酸鹽，pH 5.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 6.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 6.0 | 1.4 M Tris 乙酸鹽，pH 6.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 7.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 7.0 | 1.4 M Tris 乙酸鹽，pH 7.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 8.0 | 1.4 M Tris 乙酸鹽，pH 8.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 9.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 9.0 | 1.4 M Tris 乙酸鹽，pH 9.0 |
總負載量為 150 g/L 並且分為兩個負載步驟。
緩衝條件：研究了 2 個緩衝系統，如表 X-2.5 所示：
- 25 mM Tris/乙酸鹽 +（10 至 850）mM Na
2SO
4（pH 4.0 至 9.0），Na
2SO
4莫耳濃度：10、75、150、225、300、450、650、850 mM
- 25 至 975 mM Tris/乙酸鹽（pH 4.0 至 9.0），Tris 莫耳濃度：25、100、175、250、350、500、750、975 mM
表 X-2.5 ：實例 6 – Kp 篩選的板佈置
| Na 2SO 4 | Tris/ 乙酸鹽 | ||||||||||||
| 莫耳濃度 Na 2SO 4 [mM] | pH 4.0 | pH 5.0 | pH 6.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 9.0 | pH 4.0 | pH 5.0 | pH 6.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 9.0 | 莫耳濃度 Tris/ 乙酸鹽 [mM] |
| 10 | 25 | ||||||||||||
| 75 | 100 | ||||||||||||
| 150 | 175 | ||||||||||||
| 225 | 250 | ||||||||||||
| 300 | 350 | ||||||||||||
| 450 | 500 | ||||||||||||
| 650 | 750 | ||||||||||||
| 850 | 975 |
圖 28 示出了在 Na
2SO
4（圖 28A）和 Tris/乙酸鹽（圖 28B）的存在下 mab2 的流通液的等值線圖。
實例
6
總結：
實例 6 示出了在抗離液鹽的存在下，含有 mab2 的負載之 HMW 減少增加。增加的 Na
2SO
4莫耳濃度（參見圖 28A）使得 HMW 減少值高達 80%。mab2 與 Na
2SO
4之曲線圖類似於 mab2 與硫酸銨之曲線圖（參見圖 24A）。與此相反，Tris/Acetate 莫耳濃度的增加（參見圖 28B）對 HMW 減少值沒有顯著影響。對於 Tris/乙酸鹽，HMW 的減少值對 pH 的變化更敏感。在不添加抗離液鹽的情況下，隨著莫耳濃度的增加，未觀察到增加的 HMW 減少值。
第
III
部分：
HMW
去除與其他樹脂
/
層析材料之
比較
實例
7
藉由混合模式
AEX
樹脂進行
Kp
篩選
測定了包含親水性 mab (mab2) 和以下混合模式 AEX 樹脂的負載的 HMW 減少值：Capto™ adhere ImpRes、Capto™ adhere 和 Nuvia aPrime 4A。這 3 種樹脂具有陰離子部分和疏水性部分。
對應實例 5 執行 Kp 篩選。
圖 29 至 圖 32 示出了三種混合模式樹脂和四種鹽（兩種抗離液，兩種離液）的等值線圖。
實例
7
總結：
在該示例中，比較了三種混合模式樹脂上的 HMW 減少值以及陰離子交換和疏水性交互作用。生成 Capto
TMadhere ImpRes 流通液等值線圖（圖 29A、30A、31A 和 32A）、Capto
TMadhere 流通液等值線圖（圖 29B、30B、31B 和 32B）以及 Nuvia aPrime 流通液等值線圖（圖 29C、30C、31C 和 32C）。研究了兩種抗離液鹽（(NH
4)
2SO
4（圖 29）和 KCl（圖 30），以及兩種離液鹽（Gua/HCl（圖 31）和脲（圖 32））。
一般而言，對於所有鹽，Capto
TMadhere、Nuvia aPrime 和 Capto
TMadhere ImpRes 的等值線圖顯都示出了相當的效果。隨著 (NH
4)
2SO
4和 KCl 莫耳濃度的增加，所有三種混合模式樹脂均示出了增加的 HMW 減少值。Capto
TMadhere、Nuvia aPrime 和 Capto
TMadhere ImpRes 等值線圖顯示出了良好的可比性。對於離液鹽，在 3 種樹脂的情形下，沒有觀察到 HMW 減少值的增加。
實例
8
藉由
MMAEX
、
AEX
、
HIC
、
MMCEX
樹脂進行
Kp
篩選
一種親水性 mab 和一種疏水性 mab 之等值線圖係用以下樹脂確定：
- 混合模式陰離子交換樹脂（Capto
TMadhere ImpRes）（MMAEX）；
- 陰離子交換樹脂 (Q Sepharose FF) (AEX)；
- 疏水性樹脂 (Phenyl Sepharose 6 FF (high sub)) (HIC)；
- 混合模式陽離子交換樹脂 (Capto
TMMMC ImpRes) (MMCEX)。
樹脂的總負載量為 150 g/L，但 Capto
TMMMC ImpRes 的總負載量為 75 g/L。
對應實例 5 執行 Kp 篩選。
對於 Q Sepharose FF、Phenyl Sepharose 6FF (high sub) 和 Capto
TMMMC ImpRes 的 Kp 篩選，使用了 Na
2SO
4緩衝系統：25 mM Tris/乙酸鹽 +（5 至 850）mM Na
2SO
4。製備了以下儲備溶液（參見 X-3.1）：
表 X-3.1 ：實例 8 - 低鹽和高鹽緩衝液
| 低鹽緩衝液 | 高鹽緩衝液 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 4.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 4.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 5.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 5.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 6.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 6.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 7.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 7.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 8.0 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 9.0 | 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4 M Na 2SO 4，pH 9.0 |
研究了以下含 Na
2SO
4之緩衝液，如表 X-3.2 所示：
- 25 mM Tris/乙酸鹽 +（5 至 850）mM Na
2SO
4（pH 4.0 至 9.0），Na
2SO
4莫耳濃度：10、75、150、225、300、450、650、850 mM
表 X-3.2 ：實例 8 – Kp 篩選的板佈置
| mab2 | mab6 | |||||||||||
| 莫耳濃度 Na 2SO 4 [mM] | pH 4.0 | pH 5.0 | pH 6.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 9.0 | pH 4.0 | pH 5.0 | pH 6.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 9.0 |
| 5 | ||||||||||||
| 75 | ||||||||||||
| 150 | ||||||||||||
| 225 | ||||||||||||
| 300 | ||||||||||||
| 450 | ||||||||||||
| 650 | ||||||||||||
| 850 |
圖 33 至 圖 36 示出了四種樹脂的親水性 mab 2（圖「A」）和疏水性 mab 6（圖「B」）的等值線圖。圖 33 和 圖 36 示出了混合模式樹脂 Capto
TMadhere ImpRes（圖 33）和 Capto
TMMMC ImpRes（圖 36）的 HMW 減少；圖 34 和 35 示出了單模樹脂 Q Sepharose 6FF、陰離子交換樹脂）（圖 34）以及 Phenyl Sepharose 6 FF (high sub)（疏水性樹脂）（圖 35）之 HMW 減少值。
實例
8
總結：
藉由一種親水性 mab (mab2) 和一種疏水性 mab (mab6) 測定了以下樹脂的流通液中的 HMW 減少值：混合模式陰離子交換樹脂 (Capto
TMadhere ImpRes)、陰離子交換樹脂 (Q Sepharose FF)、疏水性樹脂 (Phenyl Sepharose 6 FF) 和混合模式陽離子交換樹脂 (Capto
TMMMC ImpRes)。
對於 AEX 樹脂 Q Sepharose FF，針對兩種 mab，均未觀察到抗離液鹽對 HMW 減少值的影響（圖 34）。在圖 35 中，示出了樹脂 Phenyl Sepharose 6FF (high sub) 的等值線圖。隨著 Na
2SO
4莫耳濃度的增加，親水性和疏水性 mab 均示出了增加的 HMW 減少值。關於單模式樹脂 Q Sepharose FF 和 Phenyl Sepharose 6FF (high sub)，親水性和疏水性 mab 之 HMW 減少值係相當的。
與此相反，對於混合模式樹脂，親水性和疏水性 mab 之 HMW 減少值不同。在抗離液鹽的存在下，MMAEX 樹脂示出了 mab2 的增加的 HMW 減少值（圖 33A）。對於 mab6，HMW 減少值在所研究之 pH 和莫耳濃度範圍內相當恆定（圖 33B）。僅對於親水性 mab，HMW 減少根據混合模式陰離子交換樹脂上的鹽莫耳濃度而增加。圖 36 示出了在 Capto
TMMMC ImpRes 樹脂上獲得的 HMW 減少值。對於親水性 mab，隨著在 0 至 800 mM 範圍內的 Na
2SO
4莫耳濃度的增加，HMW 減少值從 20% 增加到了 80%。與此相反，疏水性 mab 的 HMW 減少值幾乎不受將鹽莫耳濃度增加到 500 mM 的影響。對於 mab6，觀察到 FT 樣品中 HMW 減少值有所增加，但僅限於 500 mM 或更高的莫耳濃度下。低於 500 mM 時，HMW 減少值較小 (＜10%)，並且幾乎與鹽莫耳濃度無關。
已表明，藉由添加抗離液鹽，親水性 mab 的 HMW 減少值的增加可歸因於離子和疏水性交互作用的組合。對於兩種離子混合模式樹脂，Capto
TMadhere ImpRes（帶有陰離子和疏水性部分）和 Capto
TMMMC ImpRes（帶有陽離子和疏水性部分），隨著鹽莫耳濃度的增加，HMW 減少值得到增加，但僅針對親水性 mab）。
第
IV
部分：
ÄKTA
管柱運行
實例
9
在相同導電率和不同
Na
2SO
4
莫耳濃度下之運行
製備了具有導電率相同但 Na
2SO
4莫耳濃度不同的兩種負載。
負載 1 和負載 2 使用 mab2 之相同親和層析池（管柱 1 池）來製備。
負載 1： 藉由 1.5 M Tris 鹼基將 mab2 之管柱 1 池調整至 pH 8.0，進行深度過濾，然後使用 1 M Na
2SO
4溶液將導電率調整至 9 mS/cm。然後將負載施加到 Capto
TMadhere ImpRes 管柱。負載 1 的導電率為 9 mS/cm，Na
2SO
4莫耳濃度為 39 mM。
負載 2： 藉由 1.5 M Tris 鹼基將 mab2 之管柱 1 池調整至 pH 8.0，進行深度過濾，然後藉由乙酸將 pH 調整至 pH 5.6，然後藉由 1.5 M Tris 將 pH 重新調整至 8.0。此後，藉由 1 M Na
2SO
4溶液將導電率調整至 9 mS/cm，並將溶液施加到管柱上。負載 2 的導電率為 9 mS/cm，Na
2SO
4莫耳濃度為 19 mM。
表 X-4.1 總結了負載調整。
表 X-4.1 ：實例 9 – 負載調整
| 負載 1 （含約 40 mM Na 2SO 4 | 負載 2 （含約 20 mM Na 2SO 4 ） |
| 1. 藉由 1.5 M Tris 將 pH 值調整到 8.0 | 1. 藉由 1.5 M Tris 將 pH 值調整到 8.0 |
| 2. 深度過濾 | 2. 深度過濾 |
| 3. 導電率調整到 9 mS/cm | 3. 反滴定至 pH 5.6 |
| 4. 施加至 Capto adhere ImpRes 管柱 | 4. 再次調整至 pH 8.0 |
| 5. 使用 1M Na 2SO 4將導電率調整至 9 mS/cm | |
| 6. 施加至 Capto adhere ImpRes 管柱 | |
| 負載 1 屬性 | 負載 2 屬性 |
| 莫耳濃度 Na 2SO 4：39 mM | 莫耳濃度 Na 2SO 4：19 mM |
| 負載濃度：20.34 g/L | 負載濃度：18.73 g/L |
| 負載 pH：8.08 | 負載 pH：8.00 |
| 負載導電率：9.02 mS/cm | 負載導電率：9.10 mS/cm |
實例 9 中使用的緩衝液列於表 X-4.2 中：
表 X-4.2 ：實例 9 – 緩衝液
| 緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，40 mM Na 2SO 4，pH 8 | 7.96 | 8.73 |
| 1.5M Tris | 11.02 | 0.196 |
| 1 M Na 2SO 4 | 5.88 | 93.8 |
Capto
TMadhere ImpRes 管柱的管柱體積為 6.84 mL，管柱直徑為 0.66 cm。在藉由 70 mM Tris/乙酸鹽、40 mM Na
2SO
4(pH 8) 平衡管柱後，將負載施加到管柱上。負載容量為約 150 g/l 並且流速為 150 cm/h。對 Capto
TMadhere ImpRes FT 進行分餾。測量餾份的蛋白濃度並進行 SE-HPLC。
圖 37 示出了 Na
2SO
4莫耳濃度對 9 mS/cm 導電率下 FT 餾份的主尖峰值的影響。
實例
9
總結：
製備了具有相同導電率（9 mS/cm）但具有不同莫耳濃度的 Na
2SO
4（約 40 mM 和 約20mM）的兩種 mab2 負載。與具有更低 Na
2SO
4莫耳濃度的負載相比，具有更高 Na
2SO
4莫耳濃度的負載之 FT 餾份具有更高的主尖峰值（參見圖 37）。這表明在負載導電率相等時，更高的 Na
2SO
4莫耳濃度提高了 HMW 去除率。
實例
10
在不同
Na
2SO
4
莫耳濃度和導電率下進行之運行
藉由 mab2 測定增加鹽莫耳濃度（和導電率）的影響。在 pH 7 和 pH 8 以及不同 Na
2SO
4莫耳濃度及導電率下，在 Capto
TMadhere ImpRes 管柱（管柱體積 = 6.84 mL，d = 0.66 cm）上進行管柱運行。對 FT 進行分餾並且負載容量約為 150 g/L。
層析條件示出在表 X-4.3 中：
表 X-4.3 ：實例 10 - 層析步驟
| 步驟 | 緩衝液 | CV | 流速 [cm/h] |
| 平衡 | 70 mM Tris/乙酸鹽，x mM Na 2SO 4，（pH 7 / pH 8） | 7 | 150 |
| 負載 | 約 150 g/L | 150 |
表 X-4.4 ：實例 10 - 緩衝液
| 緩衝液 | pH | 緩衝液導電率 [mS/cm] |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 7.96 | 2.4 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，20 mM Na 2SO 4，pH 8.0 | 8.04 | 5.7 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，40 mM Na 2SO 4，pH 8.0 | 8.00 | 8.9 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，60 mM Na 2SO 4，pH 8.0 | 8.00 | 11.8 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，40 mM Na 2SO 4，pH 7.0 | 6.92 | 9.8 |
| 70 mM Tris/乙酸鹽，60 mM Na 2SO 4，pH 7.0 | 6.95 | 12.5 |
| 1.5M Tris | 11.02 | 0.2 |
| 1 M Na 2SO 4 | 5.88 | 93.8 |
藉由 1.5 M Tris 和 1 M Na
2SO
4進行調整後獲得以下負載（參見表 X-4.5）：
表 X-4.5 ：實例 10 – 負載條件
| 運行 1 | 運行 2 | 運行 3 | 運行 4 | 運行 5 | 運行 6 | |
| 負載 pH | 8.0 | 8.0 | 8.1 | 8.1 | 7.1 | 7.1 |
| 負載導電率 [mS/cm] | 4.9 | 6.2 | 9.2 | 12.3 | 9.2 | 12.1 |
| 負載濃度 [mg/mL] | 10.7 | 24.5 | 23.3 | 21.8 | 23.6 | 23.5 |
| 負載 Na 2SO 4莫耳濃度 [mM] | 0 | 10 | 35 | 60 | 34 | 55 |
圖 38 示出了在 pH 8 下每個餾份的主尖峰值以及增進的總負載量。隨著 Na
2SO
4莫耳濃度從 0 mM 增加到 60 mM，FT 餾份的主尖峰值得到改善。
圖 39 示出了在 pH 7 下每個餾份的主尖峰值以及增進的總負載量。在 pH 7 下的曲線表明，即使 Na
2SO
4莫耳濃度從 34 mM (9 mS/cm) 小幅增加至 55 mM (12 mS/cm) 也會對 FT 餾份的主尖峰值產生積極影響。對應於 Kp 篩選和 RC 資料，與 pH 8 相比，在 pH 7 下 FT 餾份中的主尖峰值較低。
池按以下方式進行計算：
使用餾份的平均主尖峰值計算池的主尖峰值。洗滌餾份（在負載步驟之後）未包括在 FT 池中。表 X-4.6 總結了運行條件和主尖峰值。
表 X-4.6 ：實例 10 – FT 池的運行條件和主尖峰值
| pH | 導電率負載 [mS/cm] | 負載莫耳濃度 Na 2SO 4[mM] | 負載量 [g/L] | 主尖峰 （ FT 池） [%] |
| 8.0 | 5 | 0 | 159 | 96.96 |
| 8.0 | 6 | 10 | 157 | 97.67 |
| 8.0 | 9 | 35 | 163 | 98.69 |
| 8.0 | 12 | 60 | 153 | 99.09 |
| 7.0 | 9 | 34 | 166 | 96.87 |
| 7.0 | 12 | 55 | 165 | 97.41 |
圖 40 示出了 FT 池之計算出的主尖峰。藉由向負載中添加 60 mM Na
2SO
4，主尖峰值從約 97%（不含 Na
2SO
4）增加到約 99%。
實例
10
總結：
已示出了 Na
2SO
4莫耳濃度對 pH 7 和 pH 8 下 HMW 去除率的影響。這些資料支持使用機器人系統獲得的資料。在 pH 7（參見圖 39）和 pH 8（參見圖 38）下，FT 餾份之主尖峰值隨著 Na
2SO
4莫耳濃度的增加而升高。在 pH 8 下使用了餾份之平均主尖峰值來計算 FT 池（參見圖 40）。對於 pH 8，主尖峰值從 96.96%（不含 Na
2SO
4，導電率為 5mS/cm）增加到高達 99.09%，其中負載含有 60 mM Na
2SO
4（導電率為 12 mS/cm）。
實例
11
及
12
Kp
篩選：
抗離液鹽和 mab 疏水性對 RVLP 去
除之影響
Kp
篩選
（
pH 5.0
至
8.0
）
該實例中結合 RVLP 去除率詳細描述了 Kp 篩選的方法。
Mab
溶液之製備
藉由 Amicon Ultra 離心式過濾器濃縮含有抗體的溶液（管柱 2 池）並進行緩衝液交換至 10 mM Tris/Acetate (pH 6.5) ，然後藉由 Amicon Ultra 離心式過濾器進行濃縮。蛋白濃度範圍為 61 g/L 至 72 g/L。Kp 篩選的總負載量為 150 g/L。負載在 0.2 µm 下過濾並測定蛋白含量（OD 280 至 320）。
濾板之製備
藉由離心機在試管中製備 50% Capto
TMadhere ImpRes 樹脂在水中的漿以進行快速沉澱。然後將樹脂轉移到放置在 Hamilton Microlab STARlet 機器人上的振盪器中。在濾板的每孔中加入 50 µL 樹脂 Capto
TMadhere ImpRes。
緩衝液之製備
為了製備緩衝板和負載板，使用了以下材料：
- 高鹽緩衝液；
- 低鹽緩衝液；
- 10 mM Tris/乙酸鹽，pH 6.5 (0.6 mS/cm)；
- 適當濃度的 10 mM Tris/乙酸鹽 (pH 6.5) 中的蛋白儲備溶液；
- 剝離緩衝液。
對於 Kp 篩選，緩衝板和負載板由機器人系統 (Tecan Freedom EVO 200) 使用高鹽緩衝液和低鹽緩衝液來製備。藉由稱入 Tris 和所需量之鹽來製備高鹽和低鹽儲備溶液。然藉由乙酸調整 pH。
表 X-5.1
和 X-5.2 總結了用於製備實例 11 之平衡板和負載板的低鹽和高鹽緩衝液。
表 X-5.1 ：實例 11 - Kp 篩選的低鹽緩衝液
| 低鹽緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 5.0 | 5.01 | 1.52 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 7.0 | 7.02 | 1.42 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 8.01 | 0.83 |
表 X-5.2 ：實例 11 - Kp 篩選的高鹽緩衝液
| 高鹽緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4M Na 2SO 4，pH 5.0 | 5.01 | 111.6 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4M Na 2SO 4，pH 7.0 | 6.96 | 116.7 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，1.4M Na 2SO 4，pH 8.0 | 8.00 | 111.1 |
表 X-5.3 和 X-5.4 總結了用於製備實例 12 之平衡板和負載板的低鹽和高鹽緩衝液。
表 X-5.3 ：實例 12 - Kp 篩選的低鹽緩衝液
| 低鹽緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 5.0 | 5.01 | 1.52 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 7.0 | 7.02 | 1.42 |
| 25 mM Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 8.01 | 0.83 |
表 X-5.4 ：實例 12 - Kp 篩選的高鹽緩衝液
| 高鹽緩衝液 | pH | 導電率 [mS/cm] |
| 1.4M Tris/乙酸鹽，pH 5.0 | 5.02 | 111.6 |
| 1.4M Tris/乙酸鹽，pH 7.0 | 7.03 | 116.7 |
| 1.4M Tris/乙酸鹽，pH 8.0 | 8.04 | 111.1 |
在移取高鹽和低鹽緩衝液之前，實例 11 和 12 之機器人將 10 µl RVLP 儲備溶液移到負載板的每個孔中。如表 X-5.5 所示，由機器人對負載板和平衡板進行移液。對於實例 11 ，硫酸鈉的莫耳濃度在 25 mM 至 400 mM 的範圍內。
表 X-5.5 ：實例 11 - Kp 篩選的板佈置
| mab1 | mab2 | mab9 | mab7 | ||||||||||||
| pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | Na 2SO 4 莫耳濃度 [mM] | |||
| A | 25 | ||||||||||||||
| B | 40 | ||||||||||||||
| C | 50 | ||||||||||||||
| D | 75 | ||||||||||||||
| E | 100 | ||||||||||||||
| F | 200 | ||||||||||||||
| G | 300 | ||||||||||||||
| H | 400 | ||||||||||||||
對於實例 12，如表 X-5.6 所示，由機器人對負載板和平衡板進行移液。對於實例 12 ，Tris 的莫耳濃度在 25 mM 至 1100 mM 的範圍內。
表 X-5.6 ：實例 12 - Kp 篩選的板佈置
| mab1 | mab2 | mab9 | mab7 | |||||||||||
| pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | pH 5.0 | pH 7.0 | pH 8.0 | Tris 莫耳濃度 [mM] | ||
| A | 25 | |||||||||||||
| B | 100 | |||||||||||||
| C | 200 | |||||||||||||
| D | 400 | |||||||||||||
| E | 600 | |||||||||||||
| F | 800 | |||||||||||||
| G | 1000 | |||||||||||||
| H | 1100 | |||||||||||||
對於實例 11 和 12，濃縮之蛋白儲備溶液由機器人移液到負載板中。為了忽略每個孔條件的 pH 值和導電率的變化，蛋白儲備溶液可以在 10 mM Tris/乙酸鹽 (pH 6.5) 中，並處於高蛋白濃度，以最大限度地減小移液體積。
Kp
篩選之執行
Kp 篩選的總負載量設定為 150 g/L，並分為兩個負載步驟，每個負載步驟 75 g/L。
Kp篩選法包括以下步驟：
- 去除儲存緩衝液；
- 平衡 1+2：轉移 300 µL 平衡緩衝液，在搖床 (1100 rpm) 上孵育 5 分鐘，並離心以去除平衡緩衝液 (2,500 rpm, 600 sec);
- 負載 1+2：轉移 300 µL 負載，在搖床 (1100 rpm) 上孵育 60 分鐘，並離心以在 FT 板上收集 FT (2,500 rpm, 600 sec)；
- 剝離 1+2：轉移 300 µL 剝離緩衝液，在搖床 (1100 rpm) 上孵育 5 分鐘，並離心以去除剝離緩衝液 (2,500 rpm, 600 sec)。
對 FT 板進行 RNA 分析。
藉由 RNA 濃度對 RVLP 去除率（RNA 對數減少值）進行如下計算：
RNA 對數減少值 = 對數（RNA 濃度
負載/RNA 濃度
孔）
RNA 濃度
負載係在負載板的選定孔中測量之平均 RNA 濃度 [拷貝/µL]。對於實例 11，負載孔的平均 RNA 濃度為 182357 [拷貝/μL]。對於實例 12，負載孔的平均 RNA 濃度為 84250 [拷貝/μL]。
RNA 濃度
孔係在實例 11 和實例 12 的 FT 板的每個孔中測量的 RNA 濃度 [拷貝/µL]。
圖 41A 至圖 41D 示出了四種 mab 的 FT 樣品的 RNA 對數減少值以及具有增加之硫酸鈉莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4。圖 41A 和圖 41B 示出了親水性 mab1（圖 41A）和 mab2（圖 41B）的 RNA 對數減少值。圖 41C 和圖 41D 示出了疏水性 mab7（圖 41C）和 mab9（圖 41D）的 RNA 對數減少值。
圖 42A 至圖 42D 示出了四種 mab 的 FT 樣品的 RNA 對數減少值以及具有增加之導電率的抗離液鹽 Na
2SO
4。圖 42A 和圖 42B 示出了親水性 mab1（圖 42A）和 mab2（圖 42B）的 RNA 對數減少值。圖 42C 和圖 42D 示出了疏水性 mab7（圖 42C）和 mab9（圖 42D）的 RNA 對數減少值。
圖 43A 至圖 43D 示出了隨著 Tris 莫耳濃度的增加，在不含抗離液鹽的 Tris/乙酸鹽緩衝液中四種 mab 的 FT 樣品的 RNA 對數減少值。圖 43A 和圖 43B 示出了親水性 mab1（圖 43A）和 mab2（圖 43B）的 RNA 對數減少值。圖 43C 和圖 43D 示出了疏水性 mab7（圖 43C）和 mab9（圖 43D）的 RNA 對數減少值。
圖 44A 至圖 44D 示出了隨著導電率的增加，在不含抗離液鹽的 Tris/乙酸鹽緩衝液中四種 mab 的 FT 樣品的 RNA 對數減少值。圖 44A 和圖 44B 示出了親水性 mab1（圖 44A）和 mab2（圖 44B）的 RNA 對數減少值。圖 44C 和圖 44D 示出了疏水性 mab7（圖 44C）和 mab9（圖 44D）的 RNA 對數減少值。
實例
11
和
12
總結：
在 pH 5.0 至 8.0 的 pH 範圍內，利用兩種親水性和兩種疏水性 mab 示出了 mab 疏水性和抗離液鹽的存在的影響。在實例 11（圖 41 和圖 42）中，研究了鹽莫耳濃度高達 400 mM 的抗離液鹽，硫酸鈉。在實例 12（圖 43 和圖 44）中，使用了具有增加的 Tris 莫耳濃度和增加的導電率但缺少抗離液鹽的 Tris/乙酸鹽緩衝液。
根據 mab 的疏水性和抗離液鹽的存在，測量了不同的 RNA 減少值。
對於實例 12（不含抗離液鹽），所研究之 mab 僅針對 ＜100 mM 的低 Tris/乙酸鹽莫耳濃度（對應於 ＜3mS/cm 的導電率）顯示出 4 至 5 的RNA 對數減少值範圍，而與 mab 疏水性無關（親水性和疏水性 mab 之間沒有顯著差異）。對於親水性 mab1 和 mab2，僅針對 ＜25 mM 的鹽莫耳濃度（導電率 ＜1.5 mS/cm）測得對數減少值 4 至 5。
與實例 12 相反，在 Na
2SO
4的存在下（實例 11），觀察到針對親水性 mab 之 RNA 減少值的增加。對於親水性 mab1，在 pH 5 下，在鹽莫耳濃度至多 100 mM Na
2SO
4的情形下，觀察到 RNA 對數減少值範圍為 4 至 5，對應於導電率 ＜9.4 mS/cm。對於 pH 8，針對莫耳濃度 ＜40 mM 測得對數減少值 4 至 5（對應於導電率 4 mS/cm）。對於親水性 mab2，在至多 225 mM 的鹽莫耳濃度的情形下，觀察到 RNA 對數減少值範圍為 4 至 5，對應於導電率 ＜19 mS/cm。對於疏水性 mab，在抗離液鹽的存在下，未觀察到 RNA 減少值的顯著增加。
圖 1與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab1 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 2與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab2 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 3與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab4 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 4與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab5 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 5與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab6 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 6與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab7 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 7與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 1.5 M Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab8 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 8A對於 1.5 M Tris/乙酸鹽、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，及 70 mM Tris/乙酸鹽、100 mM (NH
4)
2SO
4、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，將趨勢線導入圖 2 中，以計算 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上親水性 mab2 的流通液池的 HMW 去除率 [%]。
圖 8B對於 1.5 M Tris/乙酸鹽、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，及 70 mM Tris/乙酸鹽、100 mM (NH
4)
2SO
4、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，將趨勢線導入圖 6 中，以計算 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上疏水性 mab7 的流通液池的 HMW 去除率 [%]。
圖 9A對於 1.5 M Tris/乙酸鹽、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，及 70 mM Tris/乙酸鹽、100 mM (NH
4)
2SO
4、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，使用導入到圖 8A 中的趨勢線對親水性 mab2 的流通液池的計算出的 HMW 去除率 [%] 進行的比較。
圖 9B對於 1.5 M Tris/乙酸鹽、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，及 70 mM Tris/乙酸鹽、100 mM (NH
4)
2SO
4、pH 為 8、導電率為 20 mS/cm 之負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，使用導入到圖 8B 中的趨勢線對疏水性 mab7 的流通液池的計算出的 HMW 去除率 [%] 進行的比較。
圖 10與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab1 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 11與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab2 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 12與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab4 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 13與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab5 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 14與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab6 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 15與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab7 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 16與含有抗離液鹽 Na
2SO
4或 KCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 1.0 M Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 20 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab8 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 17A與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 300 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 10 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab2 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 17B與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液相比，在 300 mM Tris/檸檬酸鹽緩衝液中，對於 pH 6 且負載導電率為 10 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab7 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 18A與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 400 mM Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且導電率為 10 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著親水性 mab2 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 18B與含有抗離液鹽 Na
2SO
4、KCl、(NH
4)
2SO
4、K
2SO
4或 NaCl 的 70 mM Tris/乙酸鹽緩衝液相比，在 400 mM Tris/乙酸鹽緩衝液中，對於 pH 8 且導電率為 10 mS/cm 的負載條件，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上之流通模式下，隨著疏水性 mab7 之總負載量 [mg
蛋白/mL
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 去除值 [%]。
圖 19在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4之負載條件下，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，隨著親水性 mab2 之總負載量 [g
蛋白/L
層析介質]的增加，流通液餾份之 HMW 值 [%] 。
圖 20在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 NaCl 的負載條件下，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，隨著親水性 mab2 之總負載量[g
蛋白/L
層析介質]的增加，流通液餾份之 HMW 值 [%]。
圖 21在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的負載條件下，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，隨著親水性 mab2 之總負載量 [g
蛋白/L
層析介質] 的增加，流通液餾份之 HMW 值 [%] 。
圖 22在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的負載條件下，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，隨著親水性 mab2 之總負載量[g
蛋白/L
層析介質]的增加，流通液餾份之 HMW 值 [%]。
圖 23在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 K
2SO
4之負載條件下，在 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 上，隨著親水性 mab2 之總負載量 [g
蛋白/L
層析介質]的增加，流通液餾份之 HMW 值 [%] 。
圖 24A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 24B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab4 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 24C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 650 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 25A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 25B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab4 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 25C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 26A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽 Gua/HCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 26B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽 Gua/HCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab4 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 26C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽 Gua/HCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 27A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽脲的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 27B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽脲的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab4 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 27C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽脲的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 28A在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的機器人濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 28B在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的機器人濾板實驗得出的，在具有高達 1000 mM 之增加的 Tris 莫耳濃度的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 29A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 29B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 29C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Nuvia aPrime 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 30A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 30B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 30C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Nuvia aPrime 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 KCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 31A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽 Gua/HCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 31B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽 Gua/HCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 31C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Nuvia aPrime 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽 Gua/HCl 的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 32A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽脲的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 32B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽脲的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 32C在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Nuvia aPrime 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的離液鹽脲的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 33A在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 33B在 pH 5.5 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 650 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 (NH
4)
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 34A在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 AEX 層析介質 Q Sepharose FF 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 34B在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 AEX 層析介質 Q Sepharose FF 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 450 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 35A在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 HIC 層析介質 Phenyl Sepharose 6 FF 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 650 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 35B在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 HIC 層析介質 Phenyl Sepharose 6 FF 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 650 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 36A在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 75 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMCEX Capto
TMMMC ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 800 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 36B在 pH 4.0 至 pH 9.0以及 75 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMCEX Capto
TMMMC ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 650 mM 之莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab6 之流通液樣品之 HMW 去除值 [%]。
圖 37在 pH 8 和 9 mS/cm 的導電率下，在兩種負載含有不同莫耳濃度的 Na
2SO
4（20 mM，與 40 mM Na
2SO
4相比）的情形下，在實驗室規模 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 管柱上，隨著親水性 mab2 之總負載量 [g
蛋白/L
層析介質]的增加
，流通液餾份之主尖峰值 [%]。
圖 38在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4之負載條件下，在實驗室規模 Capto
TMadhere ImpRes RC 管柱上，隨著親水性 mab2 之總負載量 [g
蛋白/L
層析介質]的增加，流通液餾份之主尖峰值 [%]。
圖 39在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 7、不同莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4之負載條件下，在實驗室規模 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes RC 管柱上，隨著親水性 mab2 之總負載量 [g
蛋白/L
層析介質]的增加，流通液餾份之主尖峰值 [%]。
圖 40在包含 70 mM Tris/乙酸鹽、pH 8、不同莫耳濃度的抗離液鹽 Na
2SO
4的負載條件下，在實驗室規模 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 管柱上，使用負載量為150 g
蛋白/L
層析介質的親水性 mab2 的餾份的平均主尖峰值來計算的池的主尖峰值。
圖 41A在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 400mM 之莫耳濃度的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab1 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 41B在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 400mM 之莫耳濃度的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 41C在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 400mM 之莫耳濃度的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab7 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 41D在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 400mM 之莫耳濃度的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab9 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 42A在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 34mS/cm 之導電率的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab1 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 42B在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 34mS/cm 之導電率的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 42C在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 34mS/cm 之導電率的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab7 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 42D在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在包含具有高達 34mS/cm 之導電率的抗離液鹽硫酸鈉的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab9 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 43A在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 1100mM 之增加的 Tris 莫耳濃度的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab1 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 43B在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 1100mM 之增加的 Tris 莫耳濃度的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 43C在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 1100mM 之增加的 Tris 莫耳濃度的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab7 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 43D在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 1100mM 之增加的 Tris 莫耳濃度的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab9 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 44A在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 19mS/cm 之增加的導電率的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab1 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 44B在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 19mS/cm 之增加的導電率的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，親水性 mab2 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 44C在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 19mS/cm 之增加的導電率的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab7 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
圖 44D在 pH 5.0 至 pH 8.0以及 150 g
蛋白/L
層析介質的負載容量下，使用藉由 MMAEX Capto
TMadhere ImpRes 進行的濾板實驗得出的，在具有高達 19mS/cm 之增加的導電率的 Tris/乙酸鹽緩衝液中，疏水性 mab9 之流通液樣品之 RNA 對數減少值。
Claims (15)
- 一種使用 (以) 混合模式層析材料產生抗體的方法，該混合模式層析材料包含在流通模式下操作的離子交換官能基及疏水性交互作用官能基 (MM HIC/IEX)，其中 a) 該抗體為親水性抗體，且 b) 該抗體係在包含該抗體及抗離液鹽的溶液中施加至該 MM HIC/IEX。
- 如請求項 1 之方法，其中該方法進一步包含以下步驟： c) 視情況地施加沖洗液， d) 在 b) 的流通液中或視情況地在 b) 及 c) 的流通液中回收該抗體， 及由此使用在流通模式下操作的 MM HIC/IEX 生產該抗體。
- 如請求項 1 至 2 中任一項之方法，其中 - 該方法係用於生產抗體組成物，該抗體組成物具有降低之抗體相關高分子量 (HMW) 雜質含量及/或具有降低之病毒雜質含量， - 該抗體係在包含該抗體、至少一種 HMW 雜質及/或至少一種病毒雜質及抗離液鹽的溶液中施加至該 MM HIC/IEX， - 自該流通液中回收該抗體組成物，該抗體組成物具有降低之 HMW 雜質含量及/或具有降低之病毒雜質含量，及 - 由此產生抗體組成物，該抗體組成物具有降低之 HMW 雜質含量 及/或具有降低之病毒雜質含量。
- 如請求項 3 之方法，其中相較於步驟 b) 中施加至該 MM HIC/IEX 的溶液，該 HMW 雜質含量及/或該病毒雜質含量係經降低。
- 如請求項 3 或 4 中任一項之方法，其中相較於基本上不含抗離液鹽的溶液，及/或相較於包含疏水性抗體的溶液，該 HMW 雜質含量及/或該病毒雜質含量係經降低。
- 如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該親水性抗體為在疏水性交互作用層析 (HIC) 材料上之滯留時間等於或小於利妥昔單抗 (rituximab) 之滯留時間的抗體。
- 如請求項 6 之方法，其中該 HIC 材料含有作為配體之聚醚基 (乙醚基)。
- 如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中該抗離液鹽具有在 1.285 x 10E3 至 4.183 x 10E3 dyn*g*cm -1*mol -1範圍內且含端值之莫耳表面張力增量。
- 如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中該抗離液鹽係選自由以下所組成之群組：(NH 4) 2SO 4、Na 2SO 4、K 2SO 4、NaCl 及 KCl。
- 如請求項 1 至 9 中任一項之方法，其中步驟 b 之包含該抗體及抗離液鹽之該溶液具有 0.5 mS/cm 至 120 mS/cm 的導電率。
- 如請求項 1 至 10 中任一項之方法，其中在包含該抗體及抗離液鹽的該溶液中，該抗離液鹽具有 10 mM 至 900 mM 的濃度。
- 如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其中該 MM HIC/IEX 的負載量為每公升層析材料 15 g 蛋白質 (15 g/L) 至每公升層析材料 350 g 蛋白質 (350 g/L)。
- 如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中包含該抗體及抗離液鹽的溶液具有 4.0 至 9.0 的 pH 值。
- 如請求項 1 至 13 中任一項之方法，其中該 HMW 雜質為具有 285 kDa 或更高之分子量的雜質。
- 如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該 MM HIC/IEX 包含 i) 陰離子交換官能基或陽離子交換官能基，或 ii) 強陰離子交換官能基，或 iii) 弱陽離子交換官能基。
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