CN112458098A - 一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S及其应用 - Google Patents

Abstract

一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S及其应用，利用基因合成法将源于葡萄的Vvmrp1基因进行了改造，得到了核苷酸序列如SEQ ID No1所示的Vvmrp1S基因，并构建了重组表达载体，将耐镉基因Vvmrp1S成功导入拟南芥中，得到的转基因拟南芥植株都具有很强的抗和富集镉能力。经5mM以内镉溶液处理后，转基因株系的生物量比对照株系多，且转基因株系中的镉含量是对照株系的3‑5倍，表明本发明改造合成的Vvmrp1S基因具有提高植物抗和富集镉的能力，可用于培育富集镉植物。

Description

一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S及其应用

技术领域

本发明属于培育富集镉植物技术领域，具体涉及一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S及其应用。

背景技术

镉(Cd)是生物毒性最强的重金属元素，在环境中的化学活性强，移动性大，毒性持久，容易通过食物链的富集作用危及人类健康，对人体具有致病、致癌、致突变作用，能诱发肾衰变、关节炎、癌症等病。

镉易通过农作物途径进入人体造成毒害。世界卫生组织(2003)和美国环保局(1994)规定人体Cd的最大允许摄入量(ADI值)均为1μg·kg^－1·d^－1。镉是一种积累性的剧毒元素，人体某些器官中的镉含量随着年龄的增长而增加，对镉的环境行为、污染防治等方面的研究一直受到广泛关注。

随着中国城市化进程不断加快，现阶段中国对采矿、制革、冶炼、电镀、烧碱制造、垃圾焚烧、污水灌溉等行业大力发展，但由于在此过程中存在的管理制度不完善，技术相对比较落后，高效循环利用效率低等状况，从而导致了大量的重金属如铅、汞、镉、钴等一大批重金属污染物进入大气、水、土壤，引起了严重的环境污染问题。

重金属污染不仅会导致土壤生产能力的下降，而且还可以通过根部的吸收，迁移转化到农作物根茎叶及果实中去，经过食物链最后累积到人的体内，从而危害到人的身体健康。自20世纪70年代中期，我国开始有关农田土壤镉污染的调查工作，目前，我国农田重金属的含量明显增加，土壤镉污染状况越来越严重，我国镉污染的土壤面积已达20万平方千米，占我国耕地总面积的1/6，受镉污染的土壤涉及11个省和25个地区，致使每年我国粮食减产1000万吨，经济损失达200亿元，在大田作物中，农产品的主要污染物为重金属类，尤其以镉最为突出。

土壤镉污染造成我国水稻、蔬菜农产品品质下降。2000年，农业部环境监测系统对14个省会城市2110个样品的检测表明，蔬菜中重金属镉等污染超标率达到23.5％，南京郊区18个检测点青菜叶样分析表明，镉含量超过食品卫生标准，最多超17倍。

如何降低土壤环境中镉含量，减少对农作物产品的污染，保障生态系统尤其是人类健康已成为土壤植物营养与生态环境交叉领域的国际研究前沿热点和难点。

由于土壤中重金属元素不能为土壤中微生物所降解，给污染治理增加了很大的困难，因此，如何有效的将土壤中重金属元素彻底的清除将是研究的难点。常规的土壤重金属污染治理方法，如物理方法、化学方法，由于其对技术的要求比较苛刻，另外，其经济成本也比较高，而且容易造成对土壤的二次污染，修复的过程当中可能会对土壤的结构造成破坏，种种不利因素限制了其大规模的推广应用。

植物修复因其修复成本低廉、易操作、不会破坏土壤结构等众多的优点，现已发展为目前土壤重金属修复最有发展前景的技术，为土壤修复开辟了新的途径。

ABC转运蛋白又称腺苷三磷酸结合盒转运蛋白(ATP-binding cassettetransporters)，该蛋白家族是目前已知最大、最古老的蛋白家族之一。由于这种蛋白的结构中都含有一个腺苷三磷酸(ATP)的结合盒，且具有转运物质的功能，因而被称作ABC转运蛋白。

所有ABC转运蛋白的结构都含有一个高度保守的ATP结合结构域(nucleotide-binding fold，NBF)和跨膜结构域(transmembrane domains,TMDs)，因此，ABC转运蛋白是作为一种膜整合蛋白来行使其转运功能的。其转运的底物主要包括肽、糖、脂、重金属螯合物、多糖、生物碱、类固醇、无机离子和谷胱甘肽结合物等。

ABC转运蛋白广泛存在于真核和原核生物中，其中，目前生物中发现的MRP(15个成员)属于ABC全分子转运蛋白，拟南芥中的AtMRP1与AtMRP2都具有谷胱甘肽共轭转运活性，可将胞质中的谷胱甘肽化合物转运入液泡中。

目前，尚未见到将MRP基因用于植物耐镉方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S及其应用，可在拟南芥中高效表达，将该耐镉基因Vvmrp1S转化至拟南芥或水稻中，能提高转基因拟南芥和转基因水稻的抗镉能力，对于培育提高镉抗性和富集性植物品种有重要的理论意义和现实意义。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

含有所述耐镉基因Vvmrp1S的重组表达载体。

优选地，所述重组表达载体还包括有双35S启动子、GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。

本发明提供所述来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S在培育耐镉植物中的应用。

优选地，所述耐镉植物为拟南芥或水稻。

一种将所述来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S转入拟南芥中的方法，包括以下步骤：

1)扩增耐镉基因

按耐镉基因Vvmrp1S的序列，设计引物，内侧引物分别为1.5ng，外侧两个引物分别为30ng，进行PCR，扩增出Vvmrp1S片段；

2)构建重组表达载体

PCR扩增结束后，回收产物，与T/A克隆载体相连，得到DNA连接产物，高效转化DH5α感受态细胞中；

利用BamHI和SacI进行双酶切PCR产物后，回收Vvmrp1S基因片段，通过T4DNA连接酶将回收的Vvmrp1S基因与含有双35S启动子的植物表达载体1301连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因Vvmrp1S基因的重组质粒AH555，该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因；

3)转化拟南芥

利用电击法将上述重组质粒AH555导入根癌农杆菌LBA4404中，农杆菌蘸花法转化将构建好的含Vvmrp1S基因的农杆菌LBA4404转化到拟南芥中，利用潮霉素进行转化植株筛选，在潮霉素板上生长正常的小苗进行移苗，收种，进行阳性苗鉴定。

本发明的耐镉基因Vvmrp1S来源于葡萄MRP1基因，其编码的蛋白属于ABC转运蛋白，首次将来源于葡萄的MRP1基因改造后用于拟南芥中，进行植物耐镉研究，提高植物的耐镉性能，并验证了其在植物镉抗性和积累性方面的功能。

将本发明的Vvmrp1S基因转入拟南芥，自交纯合3代后，获得纯合转化株，收取种子播种后，用镉水溶液连续浇灌，在出现表型差异前，分别测定转基因株系和对照株系中镉含量，转基因株系中镉含量是对照株系的3-5倍，大大提高了拟南芥对镉的富集。连续浇灌三次后，转基因植株仍生长稳定，叶片大而绿，并能抽薹结种。但野生对照株系生长受到严重影响，结实明显推迟，表明转入本发明Vvmrp1S基因的转基因拟南芥对镉的抗性明显提高。

本发明至少具有如下有益效果：

本发明采用基因合成法合成了一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S，可成功转化到拟南芥中，并在拟南芥中高效表达，得到转基因拟南芥；转入Vvmrp1S基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株在镉抗性上有明显的差异，转基因拟南芥可耐受5mM以内镉水溶液的连续浇灌处理，以5mM镉水溶液连续浇灌3次后，转基因拟南芥对镉的富集能力是野生型拟南芥的3-5倍，转基因拟南芥叶大而绿，表型明显优于野生型拟南芥，表明Vvmrp1S基因的转入提高了拟南芥植株抗和富集镉的能力。

附图说明

图1为本发明含有目的基因的植物重组质粒AH555的构建示意图。

图2为本发明实施例4中转基因拟南芥阳性苗的PCR扩增结果图，其中，M为DNAmark，WT为野生型植株，555-2、555-4、555-5分别为转基因拟南芥的三个株系。

图3为本发明实施例5中浇灌镉后转Vvmrp1S基因拟南芥与野生型拟南芥的抗镉表型图，其中：WT为野生型拟南芥，555-2、555-4、555-5分别为转基因拟南芥的三个株系。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

本发明所用的试验材料及其来源包括：

野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)、生态型拟南芥Columbia，23℃人工气候室培养，16h光照培养；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存；克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司，所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买，ABI PRIAM Big-DyeTerminator DNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。

本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》(Molecular Cloning.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛－奥德里奇(Sigma－Aldrich)。

实施例1

基因合成法合成来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S

利用基因合成法(Xiong et al.，Nucl Acids Res，2004，32:e98)克隆来源于葡萄的ABC转运蛋白基因Vvmrp1S，在保持Vvmrp1基因的氨基酸序列不变的基础上，按照拟南芥偏爱密码重新合成编码葡萄的ABC转运蛋白基因Vvmrp1S。

基因合成设计原则包括：按拟南芥偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号；避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40～60％，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins，避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。

利用PCR进行扩增Vvmrp1S片段，在50μl反应体系中，内侧的引物分别为1.5ng，外侧的两个引物分别为30ng，1μl KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，5μl 10×PCR buffer，4μl dNTP，加无菌水定容至50μl；扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min，共25个循环。

PCR结束后，用1％琼脂糖凝胶回收，取10μl回收产物直接与pMD-18-Simple T克隆载体相连，4℃连接过夜，得到DNA连接产物，高效转化到DH5α感受态细胞中。

从DH5α转化子细胞中抽提质粒，以抽提质粒为模板进行PCR扩增，得到了一个4875bp的片段，经测序和BLAST比对，表明PCR法合成的基因与Vvmrp1基因的氨基酸序列完全一致，该基因即为本发明来源于葡萄的Vvmrp1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。

实施例2构建含源于葡萄的ABC转运蛋白Vvmrp1S基因的重组表达载体

分别用BamHI和SacI进行双酶切PCR产物，用1％琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4DNA连接酶将实施例1中回收的Vvmrp1S基因片段与含有双35S启动子1301质粒连接，经酶切鉴定和序列分析测定，获得含有甘氨酸氧化酶基因Vvmrp1S基因的重组表达载体AH555，该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，如图1所示。

实施例3转化至拟南芥

将实施例2获得的上述重组表达载体经电击法导入农杆菌中。

1.制备感受态细胞

挑取根癌农杆菌LBA4404单菌到25mL YEB培养基(50mg/L利福平)培养过夜，取5mL菌液转接到100mL YEB培养基(50mg/L利福平)，培养至OD600＝0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100mL无菌双蒸水清洗两次；加入4mL10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃；收集菌体，加入500μL10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管，得到农杆菌感受态细胞。

2.电击转化

取70μL上述置备好的农杆菌感受态细胞，加入1μL重组表达载体AH555用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μL SOC培养液(参见《分子克隆实验指南》，Sambrook and Russell,2001)。

培养1小时后，取100μL涂抗性板筛选转化子，28℃培养，筛选出成功导入重组表达载体AH555的菌株。

实施例4拟南芥蘸花法转化

含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5mL含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天，将5mL菌液转到500mL的液体LB培养基中28℃培养16-24小时(OD＝1.5-2.0)，液体可以在4℃保存30天，室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟；用等体积5％的新鲜蔗糖溶液悬浮，加入0.02％的Silwet-77混匀后转移到烧杯中，即得转化菌液。

将野生型拟南芥倒置后浸入转化菌液中10秒钟，莲座和花序都要侵染，每个菌株用300毫升转化，转2-3钵，隔7天后再转化1次，侵染后将转基因拟南芥植株菌液空干3-5秒，用保鲜膜将转基因拟南芥植株圈好，平放16-24小时；转化后不要放置在高温和强光下，揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月后收种子，利用50μg/mL潮霉素进行转化植株筛选，在潮霉素板上生长正常的小苗进行移苗，收种，进行阳性苗鉴定。

待苗生长至3周左右，对不同株系的拟南芥叶片抽提RNA，反转录为CDNA，利用PCR扩增Vvmrp1S片段，在50μl反应体系中，特异性引物2μg，1μl KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，5μl 10×PCR buffer，4μl dNTP，加无菌水定容至50μl，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，50℃，30s，72℃，1min，共30个循环，结果如图2所示，以拟南芥Actin基因为内参。

从图2中可知，转入Vvmrp1S基因的转基因植株中都有很亮的长度为280bp的特异条带，野生型植株中未扩增出长度为280bp的目的基因片段，而证明这些转基因植物都是阳性苗，说明目的基因已成功导入拟南芥并在转录水平表达。

实施例5合成的Vvmrp1S基因转化植物后对草甘膦的抗性鉴定

将上述已成功转入Vvmrp1S基因的转基因拟南芥自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，22℃生长3周，同时培养非转基因拟南芥(即野生型拟南芥WT)作为对照实验，将野生型、转基因株系555-2、转基因株系555-4和转基因株系555-5分别套袋灌溉5mM镉水溶液，每10天浇灌一次，浇灌三次观察转基因拟南芥和非转基因拟南芥对镉的抗性作用。

在第一次浇灌5mM镉水溶液1周后，在出现表型差异之前进行镉含量测定，发现镉在转基因株系中的含量明显高于野生型株系，如表1所示。

表1浇灌镉后转Vvmrp1S基因拟南芥与野生型拟南芥的镉含量

编号	镉含量(mg/kg)
		WT	32.84
555-2	156.74
		555-4	100.47
555-5	126.68

第二次浇灌5mM镉水溶液后，转基因株系与野生型株系之间开始出现表型差异。

第三次浇灌5mM镉水溶液10天后，统计野生型拟南芥与转基因拟南芥性状，野生型拟南芥叶小而黄，而转基因的三个株系叶大而绿，如图3所示。

实验结果表明，野生型和转基因型拟南芥对镉的抗性差异明显，转基因拟南芥对镉抗性明显提高，说明本发明合成的Vvmrp1基因可提高植物抗和富集镉的性能。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S及其应用

<130> 2011239

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4875

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera L.)

<400> 1

atggcttttg agcctttggt ttggtattgt caaccggtgg caaatggggt ttgggcaaaa 60

gcagcagaaa gtgcttttgg cccttacaca ccctgtgcag ttgactccat tgtggtttgc 120

atatctcatt tggttctttt gggtctgtgc tgttaccgaa tatggctgat taagatggat 180

ttcaaagtcc agaggttctg cttgcagtcg aattactaca attatatgtt gggactgttg 240

gcatgttatt gtactgcaga acctttattc aggttggtga tgggtgtttc gatttttgat 300

ttggatgaac agactgggct cgctccgtat gagatagttt ctttgatcat tgaagctgct 360

acttggtgct ccatgctggt tatgattggt gttgagacta aaatttacat tcggcagttt 420

cgatggtatg tccgatttgg agtcatttat ctcttggtag gggatgctgt gatgctcaat 480

ctcattcttt ctctgaagga ttcctacagt agatctgtac tctatccgcc aatcagctca 540

gtcctctgcc aggttctgtt tggaatttgc cttctcgtgc atgttcctaa tttaaatcct 600

tatgtgggtt acaccccgat gcaaagtgat tctctggaaa acaccaaata tgaagtgctt 660

cctggaggag accaaatttg tcctgagaag cacgcaaaca tgttttctag gatatatttt 720

gggtggatga ctccgctcat gcagcaaggc tataaaaaac ccatcactga aaaggatatt 780

tggaagctag atacatggga tcagactgaa acacttagca gaaggttcca gaaatgttgg 840

attgaagaat ctcaaaggtc caagccaaga cttctaagag cattaaattg tagtcttgga 900

ggaaggttct ggcggggagg cttcttcaag attggcaatg atctttctca gtttgtgggg 960

ccagtcttac tgaaccatct cttacagtcg atgcaacgag gtgatccagc ttggattggt 1020

tatatctatg cattctcaat ttttattggg gtgtcattgg gggtgctttg tgaagctcag 1080

tactttcaga atgttatgcg cgtcggtttt cggctaagat caactctggt ggctgctata 1140

ttccgcaaat ctttaagact aacccatgag ggtcgtaaga acttcccgtc tggaaagata 1200

acaaatatga tgacaacaga tgctaatgca cttcagcaaa tatgtcaaca actacatgct 1260

ttatggtctg ctccatttcg tatcatcatc gctatggttc ttctttatca gcaattaggg 1320

gttgcttccc tccttggttc attgatgcta cttctcatgc tcccgataca gacatttatc 1380

attagcaaaa tgcgaaaatt gtccaaggaa ggattgcaac gaactgacaa gagagtcagc 1440

ctcatgaatg aaattttggc tgccatggac actgtgaaat gttatgcatg ggaaaagagt 1500

ttccagtcta aagttcaaag catgcggaat gatgaattgt cttggtttcg taaagcacaa 1560

ctgctatcag cttgcaacag tttcatccta aatagcatcc cagttattgt gacggtaacc 1620

tcatttgggg cattcacttt gctcggtggt gacttaacac ctgcaagagc atttacgtca 1680

ctttctctgt ttgcggtgct gcggttccct ttaaacatgc tccccaattt aattactcag 1740

gttgtaactg cacatgtatc aatacaacgt ctagagcaac tgttcttaac tgaagagaga 1800

gttcttgcac caaatccaac tcttgaacca ggacttccag ccatctcaat caaggatgga 1860

tacttttctt gggattcaaa ggtagagaag cccactttat caaatatcaa tttggatata 1920

ccagttggta gcttagttgc agttgttggt ggcactggag aaggaaagac atctctcata 1980

tcagcaatgc ttggggagct gcctcctttg tcagatgcaa gtgttgttat cagagggact 2040

gttgcatatg ttcctcaaat ttcatggatt ttcaatgcca ctgtacgggg aaacatattg 2100

tttggttctg attttgagcc tgcacgatat tggaaggcta tagatgtaac tgagctgcag 2160

catgaccttg acttacttcc tggtcatgat cttacagaga tcggtgaaag gggggtgaat 2220

atcagcggtg ggcaaaagca aagagtttca atggctaggg ctgtatattc taattcagat 2280

gtatacatat tcgatgaccc tttaagtgct ctagatgctc atgtcgctca acaggttttc 2340

agcaactgta tcaaagaaga gttgaaaggg aagactagag tgcttgttac aaaccagcta 2400

cattttcttc ctcatgtaga tagaattata ctagtctctg atggtacagt gaaagaagac 2460

ggaacctttg atgatctctc taaaaacagc aagttattcc aaaaactaat ggaaaatgct 2520

gggaaaatgg aagagcaagt ggaagaaaat gagtgcagag aaaatctaag taacaataaa 2580

tcaaagccca ctactaatgg tgaagtgaat gagctgccaa aaaatgcaat ccattcaaat 2640

aaagggaaag aaggcaaatc tgtccttatc aagcaggaag aacgagaaac aggcattgtt 2700

agttggaagg ttttgatgag gtataaagat gcattagggg gcctatgggt agttacacta 2760

ctttttgcat gctatgtgtt gactgaagtt cttcgagttt taagtagcac ctggttaagc 2820

gtctggacgg atcaaagcat gtcaaaggat tatagacctg gttactacaa tttgatttac 2880

gcacttctat catttggtca ggtaatggtg acattgggaa actcattttg gttgatcact 2940

tcaagtcttc atgcagccaa aatattgcac aatgtcatgt taaactctat tttaagagct 3000

ccaatggtat tcttccacac caaccctatt ggacggataa tcaataggtt tgcaaaggat 3060

cttggcgata tagatcgcaa tgttgccccg tctgctaata tgtttctggg tcaagtgtgg 3120

cagctccttt ccacttttgt actgattgcc attgtcagca ccatatccct gtgggccata 3180

atgccacttc tgatattgtt ttatgcagcc tatctatatt accagagcac atcccgtgaa 3240

gtcaaacgtt tggattccat caccagatct cctgtatatg cccaatttgg agaagcatta 3300

aatggtttat caaccattcg agcatataaa gcatacgatc ggatggcaag tataaatggg 3360

aaatccatgg ataataatat cagattcacc cttgctaaca ttagctcaaa tcgatggctc 3420

accataaggc tggaaacatt aggaggcctc atgatttgtt tgacagcaac ctttgctgtc 3480

atggagaaca gcagagaaga aaacccggca gcatttgcat ctacaatggg tctactcctt 3540

agttatactt taaatatcac gagcctgtta agtggtgttc ttagacaagc cagcagggct 3600

gaaaatagtt ttaatgctgt tgagcgtgtt ggcacctatg ttgatttgcc ttctgaggct 3660

ccaactatta tagagagcaa ccgtccccca cctggttggc cttcatcagg atctatcagg 3720

tttgaggatg ttgttctgcg ttacaggcct gaacttcctc cagttttgca tggaatatca 3780

tttaaaattt ctccaagtga gaagctaggc atagttggaa gaactggtgc agggaaatct 3840

agcatgatca atgctctatt tcggattgta gaactagaaa gaggaagaat atggatagat 3900

gagtatgaca ttgcaaaatt tggactcaca gatctgcgta aagttttaag cattatacca 3960

caatctccag ttcttttctc tggaactgta agatttaatc ttgatccttt caatgaacac 4020

aatgacgctg acctttggga ggctttagag agggcacatc tcaaggatgt catcaggaga 4080

aattcttttg gtctggatgc tgaggttgcg gagggagggg agaatttcag tgttgggcag 4140

agacaattat taagtcttgc tcgagcattg ctgcgaagat caaagattct tgttcttgat 4200

gaagcaactg cagcagttga tgttagaact gatgctctta ttcaaaagac tatccgagaa 4260

gaattcaaaa catgcaccat gcttgttatt gctcacagac taaataccat cattgattgt 4320

gatcggattc ttgtccttga tgctggtcag gtggtagagt atgatactcc agaagaactg 4380

cttcaagacg aaggaagctc tttctctaga atggtccgaa gtacaggggc tgcaaatgcc 4440

cagtacttac gcagcttagt atttggagag gatggacaga aaaaatcagg cagagaagag 4500

gccaagcaat tggataggca gaaaagatgg cttgcttctt cccgctgggc tgctgctacg 4560

cagtttgcac tttctattag cctgacatct tcacagaatg gccttcaatt tttggacgtt 4620

gaagacgaga tgaatatcct caagaaaaca aatgatgcag tacttactct gcggggagtt 4680

ctggagggaa cacatgatga agtcattgaa gagatgctaa aggaatacca ggttcctaga 4740

gataggtggt ggtcagctct ctacaaaatg gttgaaggtc ttgcagtgat gaatcggttg 4800

gctcgccaca ggtttcaaca gtcagaacat gattttgaag acacaacact tgattgggac 4860

cttactgaaa tgtaa 4875

<210> 2

<211> 1624

<212> PRT

<213> 葡萄(Vitis vinifera L.)

<400> 2

Met Ala Phe Glu Pro Leu Val Trp Tyr Cys Gln Pro Val Ala Asn Gly

1 5 10 15

Val Trp Ala Lys Ala Ala Glu Ser Ala Phe Gly Pro Tyr Thr Pro Cys

20 25 30

Ala Val Asp Ser Ile Val Val Cys Ile Ser His Leu Val Leu Leu Gly

35 40 45

Leu Cys Cys Tyr Arg Ile Trp Leu Ile Lys Met Asp Phe Lys Val Gln

50 55 60

Arg Phe Cys Leu Gln Ser Asn Tyr Tyr Asn Tyr Met Leu Gly Leu Leu

65 70 75 80

Ala Cys Tyr Cys Thr Ala Glu Pro Leu Phe Arg Leu Val Met Gly Val

85 90 95

Ser Ile Phe Asp Leu Asp Glu Gln Thr Gly Leu Ala Pro Tyr Glu Ile

100 105 110

Val Ser Leu Ile Ile Glu Ala Ala Thr Trp Cys Ser Met Leu Val Met

115 120 125

Ile Gly Val Glu Thr Lys Ile Tyr Ile Arg Gln Phe Arg Trp Tyr Val

130 135 140

Arg Phe Gly Val Ile Tyr Leu Leu Val Gly Asp Ala Val Met Leu Asn

145 150 155 160

Leu Ile Leu Ser Leu Lys Asp Ser Tyr Ser Arg Ser Val Leu Tyr Pro

165 170 175

Pro Ile Ser Ser Val Leu Cys Gln Val Leu Phe Gly Ile Cys Leu Leu

180 185 190

Val His Val Pro Asn Leu Asn Pro Tyr Val Gly Tyr Thr Pro Met Gln

195 200 205

Ser Asp Ser Leu Glu Asn Thr Lys Tyr Glu Val Leu Pro Gly Gly Asp

210 215 220

Gln Ile Cys Pro Glu Lys His Ala Asn Met Phe Ser Arg Ile Tyr Phe

225 230 235 240

Gly Trp Met Thr Pro Leu Met Gln Gln Gly Tyr Lys Lys Pro Ile Thr

245 250 255

Glu Lys Asp Ile Trp Lys Leu Asp Thr Trp Asp Gln Thr Glu Thr Leu

260 265 270

Ser Arg Arg Phe Gln Lys Cys Trp Ile Glu Glu Ser Gln Arg Ser Lys

275 280 285

Pro Arg Leu Leu Arg Ala Leu Asn Cys Ser Leu Gly Gly Arg Phe Trp

290 295 300

Arg Gly Gly Phe Phe Lys Ile Gly Asn Asp Leu Ser Gln Phe Val Gly

305 310 315 320

Pro Val Leu Leu Asn His Leu Leu Gln Ser Met Gln Arg Gly Asp Pro

325 330 335

Ala Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Phe Ile Gly Val Ser

340 345 350

Leu Gly Val Leu Cys Glu Ala Gln Tyr Phe Gln Asn Val Met Arg Val

355 360 365

Gly Phe Arg Leu Arg Ser Thr Leu Val Ala Ala Ile Phe Arg Lys Ser

370 375 380

Leu Arg Leu Thr His Glu Gly Arg Lys Asn Phe Pro Ser Gly Lys Ile

385 390 395 400

Thr Asn Met Met Thr Thr Asp Ala Asn Ala Leu Gln Gln Ile Cys Gln

405 410 415

Gln Leu His Ala Leu Trp Ser Ala Pro Phe Arg Ile Ile Ile Ala Met

420 425 430

Val Leu Leu Tyr Gln Gln Leu Gly Val Ala Ser Leu Leu Gly Ser Leu

435 440 445

Met Leu Leu Leu Met Leu Pro Ile Gln Thr Phe Ile Ile Ser Lys Met

450 455 460

Arg Lys Leu Ser Lys Glu Gly Leu Gln Arg Thr Asp Lys Arg Val Ser

465 470 475 480

Leu Met Asn Glu Ile Leu Ala Ala Met Asp Thr Val Lys Cys Tyr Ala

485 490 495

Trp Glu Lys Ser Phe Gln Ser Lys Val Gln Ser Met Arg Asn Asp Glu

500 505 510

Leu Ser Trp Phe Arg Lys Ala Gln Leu Leu Ser Ala Cys Asn Ser Phe

515 520 525

Ile Leu Asn Ser Ile Pro Val Ile Val Thr Val Thr Ser Phe Gly Ala

530 535 540

Phe Thr Leu Leu Gly Gly Asp Leu Thr Pro Ala Arg Ala Phe Thr Ser

545 550 555 560

Leu Ser Leu Phe Ala Val Leu Arg Phe Pro Leu Asn Met Leu Pro Asn

565 570 575

Leu Ile Thr Gln Val Val Thr Ala His Val Ser Ile Gln Arg Leu Glu

580 585 590

Gln Leu Phe Leu Thr Glu Glu Arg Val Leu Ala Pro Asn Pro Thr Leu

595 600 605

Glu Pro Gly Leu Pro Ala Ile Ser Ile Lys Asp Gly Tyr Phe Ser Trp

610 615 620

Asp Ser Lys Val Glu Lys Pro Thr Leu Ser Asn Ile Asn Leu Asp Ile

625 630 635 640

Pro Val Gly Ser Leu Val Ala Val Val Gly Gly Thr Gly Glu Gly Lys

645 650 655

Thr Ser Leu Ile Ser Ala Met Leu Gly Glu Leu Pro Pro Leu Ser Asp

660 665 670

Ala Ser Val Val Ile Arg Gly Thr Val Ala Tyr Val Pro Gln Ile Ser

675 680 685

Trp Ile Phe Asn Ala Thr Val Arg Gly Asn Ile Leu Phe Gly Ser Asp

690 695 700

Phe Glu Pro Ala Arg Tyr Trp Lys Ala Ile Asp Val Thr Glu Leu Gln

705 710 715 720

His Asp Leu Asp Leu Leu Pro Gly His Asp Leu Thr Glu Ile Gly Glu

725 730 735

Arg Gly Val Asn Ile Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Val Ser Met Ala

740 745 750

Arg Ala Val Tyr Ser Asn Ser Asp Val Tyr Ile Phe Asp Asp Pro Leu

755 760 765

Ser Ala Leu Asp Ala His Val Ala Gln Gln Val Phe Ser Asn Cys Ile

770 775 780

Lys Glu Glu Leu Lys Gly Lys Thr Arg Val Leu Val Thr Asn Gln Leu

785 790 795 800

His Phe Leu Pro His Val Asp Arg Ile Ile Leu Val Ser Asp Gly Thr

805 810 815

Val Lys Glu Asp Gly Thr Phe Asp Asp Leu Ser Lys Asn Ser Lys Leu

820 825 830

Phe Gln Lys Leu Met Glu Asn Ala Gly Lys Met Glu Glu Gln Val Glu

835 840 845

Glu Asn Glu Cys Arg Glu Asn Leu Ser Asn Asn Lys Ser Lys Pro Thr

850 855 860

Thr Asn Gly Glu Val Asn Glu Leu Pro Lys Asn Ala Ile His Ser Asn

865 870 875 880

Lys Gly Lys Glu Gly Lys Ser Val Leu Ile Lys Gln Glu Glu Arg Glu

885 890 895

Thr Gly Ile Val Ser Trp Lys Val Leu Met Arg Tyr Lys Asp Ala Leu

900 905 910

Gly Gly Leu Trp Val Val Thr Leu Leu Phe Ala Cys Tyr Val Leu Thr

915 920 925

Glu Val Leu Arg Val Leu Ser Ser Thr Trp Leu Ser Val Trp Thr Asp

930 935 940

Gln Ser Met Ser Lys Asp Tyr Arg Pro Gly Tyr Tyr Asn Leu Ile Tyr

945 950 955 960

Ala Leu Leu Ser Phe Gly Gln Val Met Val Thr Leu Gly Asn Ser Phe

965 970 975

Trp Leu Ile Thr Ser Ser Leu His Ala Ala Lys Ile Leu His Asn Val

980 985 990

Met Leu Asn Ser Ile Leu Arg Ala Pro Met Val Phe Phe His Thr Asn

995 1000 1005

Pro Ile Gly Arg Ile Ile Asn Arg Phe Ala Lys Asp Leu Gly Asp Ile

1010 1015 1020

Asp Arg Asn Val Ala Pro Ser Ala Asn Met Phe Leu Gly Gln Val Trp

1025 1030 1035 1040

Gln Leu Leu Ser Thr Phe Val Leu Ile Ala Ile Val Ser Thr Ile Ser

1045 1050 1055

Leu Trp Ala Ile Met Pro Leu Leu Ile Leu Phe Tyr Ala Ala Tyr Leu

1060 1065 1070

Tyr Tyr Gln Ser Thr Ser Arg Glu Val Lys Arg Leu Asp Ser Ile Thr

1075 1080 1085

Arg Ser Pro Val Tyr Ala Gln Phe Gly Glu Ala Leu Asn Gly Leu Ser

1090 1095 1100

Thr Ile Arg Ala Tyr Lys Ala Tyr Asp Arg Met Ala Ser Ile Asn Gly

1105 1110 1115 1120

Lys Ser Met Asp Asn Asn Ile Arg Phe Thr Leu Ala Asn Ile Ser Ser

1125 1130 1135

Asn Arg Trp Leu Thr Ile Arg Leu Glu Thr Leu Gly Gly Leu Met Ile

1140 1145 1150

Cys Leu Thr Ala Thr Phe Ala Val Met Glu Asn Ser Arg Glu Glu Asn

1155 1160 1165

Pro Ala Ala Phe Ala Ser Thr Met Gly Leu Leu Leu Ser Tyr Thr Leu

1170 1175 1180

Asn Ile Thr Ser Leu Leu Ser Gly Val Leu Arg Gln Ala Ser Arg Ala

1185 1190 1195 1200

Glu Asn Ser Phe Asn Ala Val Glu Arg Val Gly Thr Tyr Val Asp Leu

1205 1210 1215

Pro Ser Glu Ala Pro Thr Ile Ile Glu Ser Asn Arg Pro Pro Pro Gly

1220 1225 1230

Trp Pro Ser Ser Gly Ser Ile Arg Phe Glu Asp Val Val Leu Arg Tyr

1235 1240 1245

Arg Pro Glu Leu Pro Pro Val Leu His Gly Ile Ser Phe Lys Ile Ser

1250 1255 1260

Pro Ser Glu Lys Leu Gly Ile Val Gly Arg Thr Gly Ala Gly Lys Ser

1265 1270 1275 1280

Ser Met Ile Asn Ala Leu Phe Arg Ile Val Glu Leu Glu Arg Gly Arg

1285 1290 1295

Ile Trp Ile Asp Glu Tyr Asp Ile Ala Lys Phe Gly Leu Thr Asp Leu

1300 1305 1310

Arg Lys Val Leu Ser Ile Ile Pro Gln Ser Pro Val Leu Phe Ser Gly

1315 1320 1325

Thr Val Arg Phe Asn Leu Asp Pro Phe Asn Glu His Asn Asp Ala Asp

1330 1335 1340

Leu Trp Glu Ala Leu Glu Arg Ala His Leu Lys Asp Val Ile Arg Arg

1345 1350 1355 1360

Asn Ser Phe Gly Leu Asp Ala Glu Val Ala Glu Gly Gly Glu Asn Phe

1365 1370 1375

Ser Val Gly Gln Arg Gln Leu Leu Ser Leu Ala Arg Ala Leu Leu Arg

1380 1385 1390

Arg Ser Lys Ile Leu Val Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Val Asp Val

1395 1400 1405

Arg Thr Asp Ala Leu Ile Gln Lys Thr Ile Arg Glu Glu Phe Lys Thr

1410 1415 1420

Cys Thr Met Leu Val Ile Ala His Arg Leu Asn Thr Ile Ile Asp Cys

1425 1430 1435 1440

Asp Arg Ile Leu Val Leu Asp Ala Gly Gln Val Val Glu Tyr Asp Thr

1445 1450 1455

Pro Glu Glu Leu Leu Gln Asp Glu Gly Ser Ser Phe Ser Arg Met Val

1460 1465 1470

Arg Ser Thr Gly Ala Ala Asn Ala Gln Tyr Leu Arg Ser Leu Val Phe

1475 1480 1485

Gly Glu Asp Gly Gln Lys Lys Ser Gly Arg Glu Glu Ala Lys Gln Leu

1490 1495 1500

Asp Arg Gln Lys Arg Trp Leu Ala Ser Ser Arg Trp Ala Ala Ala Thr

1505 1510 1515 1520

Gln Phe Ala Leu Ser Ile Ser Leu Thr Ser Ser Gln Asn Gly Leu Gln

1525 1530 1535

Phe Leu Asp Val Glu Asp Glu Met Asn Ile Leu Lys Lys Thr Asn Asp

1540 1545 1550

Ala Val Leu Thr Leu Arg Gly Val Leu Glu Gly Thr His Asp Glu Val

1555 1560 1565

Ile Glu Glu Met Leu Lys Glu Tyr Gln Val Pro Arg Asp Arg Trp Trp

1570 1575 1580

Ser Ala Leu Tyr Lys Met Val Glu Gly Leu Ala Val Met Asn Arg Leu

1585 1590 1595 1600

Ala Arg His Arg Phe Gln Gln Ser Glu His Asp Phe Glu Asp Thr Thr

1605 1610 1615

Leu Asp Trp Asp Leu Thr Glu Met

1620

Claims (6)

1.一种来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

2.含有权利要求1所述耐镉基因Vvmrp1S的重组表达载体。

3.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包括双35S启动子、GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因。

4.如权利要求1所述来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S在培育耐镉植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述耐镉植物为拟南芥。

6.一种将所述来源于葡萄的耐镉基因Vvmrp1S转入拟南芥中的方法，包括以下步骤：

1)扩增耐镉基因

按耐镉基因Vvmrp1S的序列，设计引物，内侧引物分别为1.5ng，外侧两个引物分别为30ng，进行PCR，扩增出Vvmrp1S片段；

2)构建重组表达载体

PCR扩增结束后，回收产物，与T/A克隆载体相连，得到DNA连接产物，转化DH5α感受态细胞中；

利用BamHI和SacI进行双酶切PCR产物后，回收Vvmrp1S片段，通过T4DNA连接酶将回收的Vvmrp1S基因与含有双35S启动子的植物表达载体1301连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因Vvmrp1S基因的重组表达载体，该表达载体还包含GUS报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因；

3)转化拟南芥

利用电击法将步骤2)的重组表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中，再以农杆菌蘸花法转化将构建好的含Vvmrp1S基因的农杆菌LBA4404转化到拟南芥中，利用潮霉素进行转化植株筛选，在潮霉素板上生长正常的小苗进行移苗，收种，进行阳性苗鉴定。

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