CN111826380A - 一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及环境污染物处理领域，具体涉及一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因的应用，所述基因应用于处理污染物TNT的处理中，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。将本发明的基因首先进行密码子优化，再构建表达载体，并让该基因在植物中过表达，可提高植物降解和清除TNT能力，并提高该植物对TNT胁迫的抗性和耐性。本方案可以用于解决植物处理环境污染物的效率有限的技术问题，本基因可以应用于环境修复和TNT处理的实践操作中。

Description

一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因的应用

技术领域

本发明涉及环境污染物处理领域，具体涉及一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因的应用。

背景技术

大规模生产和加工弹药产生的化合物TNT(2，4，6一三硝基甲苯)已经造成严重的环境 污染。TNT及其转化产物都是有毒的，TNT被美国环境保护局确认为潜在的致癌物(C类)，直 接接触，可导致贫血、肝功能紊乱、皮肤刺激或免疫系统的损害。因此，对TNT污染土壤和 污染水进行修复十分重要。在对TNT污染的环境的修复的探索和实践中，生物法利用具有潜 在修复能力的微生物和植物来清洁环境，逐渐成为是近年来新兴的修复方法。植物修复是生 物法修复污染环境的方法之一，植物修复是利用绿色植物来转移、容纳或转化污染物使其对 环境无害，植物修复的对象是重金属、有机物或放射性元素污染的土壤及水体。植物修复具 有成本低和适应性强的特点，并且其耐受TNT的能力要比微生物强(微生物修复是生物法修 复污染环境的另一方法)。因此，植物修复TNT土壤污染和水污染的效果更好。

虽然植物修复具有一定优势，且植物本身有降解TNT的能力，但是与微生物相比，植物 通常缺乏完全降解或者矿化TNT的代谢途径，这样会一定程度上限制植物对TNT的清除能力。 如果被污染环境TNT浓度过大，或者修复时间过长，都会对植物产生毒性作用从而抑制植物 对环境的修复作用。

发明内容

本发明意在提供一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因的应用，以解决植物处理环境污染物的 效率有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因在处理2,4,6-三硝基甲苯中的应用，所述基因的序列如 SEQ ID NO:1所示。

本方案的原理及优点是：发明人对克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)进行了 大量的基因筛选研究，发现序列如SEQ ID NO:1的基因具有促进环境中污染物降解和消除的 能力。经基因比对序列如SEQ ID NO:1的基因位于克雷伯氏肺炎菌基因组(Klebsiella pneumoniae strain A16KP0135 chromosome,complete genome，SequenceID:CP052562.1) 的3917442位至3918095位，长度为654bp，该基因的促进环境中污染物降解和消除的功能 尚未有文献报道。发明人研究发现了该基因的新功能，并将该基因应用于环境污染物的处理 的实践操作中。使植物表达该基因编码的蛋白，可以促进植物对环境中的污染物的降解和消 除能力(植物先吸收环境污染物，然后通过其代谢过程将环境污染物降解)，并且能够增加 植物在污染环境中的抗胁迫能力。

2,4,6-三硝基甲苯是一种有机污染物，有机污染物是指以碳水化合物、蛋白质、氨基酸 以及脂肪等形式存在的有机物组成的污染物。很大部分有机污染物在环境中难以降解，具有 高毒性、持久性、生物积累性、远距离迁移性等特点，会对生态环境和人体健康造成较为严 重的危害，因此需要采取必要手段使其降解，以缓解其带来的危害。2,4,6-三硝基甲苯(TNT) 难于降解，会在环境中持久存在，对生物产生负面影响，具有致毒、致癌、致畸变性等危害。 因此，对TNT污染土壤和污染水进行修复十分重要。本方案新发现的基因可以应用于TNT污 染土壤和污染水的修复中，缓解TNT造成的环境污染。

本方案的序列如SEQ ID NO:1的基因可以辅助实现环境的植物修复，缓解TNT对生态环 境带来的危害，并提高表达其蛋白的植物(通过转基因操作来实现植物表达该蛋白)的TNT 抗性。

进一步，所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

采用上述技术方案，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白具有促进环境中的TNT降解 和清除的能力。

进一步，使用所述基因处理2,4,6-三硝基甲苯的方法包括密码子优化步骤：对所述基因 进行密码子优化获得优化基因，所述优化基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

采用上述技术方案，序列如SEQ ID NO:3的优化基因(666bp)可翻译为序列如SEQID NO:2 的蛋白。优化基因是经过密码子优化的，可以在植物体中大量表达，克服了细菌中的基因在 植物中直接表达的效果不好的缺陷。

进一步，合成所述优化基因的引物包括序列如SEQ ID NO:4所示的第一引物、序列如SEQ ID NO:5所示的第二引物、序列如SEQ ID NO:6所示的第三引物、序列如SEQ ID NO:7所示 的第四引物、序列如SEQ ID NO:8所示的第五引物、序列如SEQ ID NO:9所示的第六引物、 序列如SEQ ID NO:10所示的第七引物、序列如SEQ ID NO:11所示的第八引物、序列如SEQ ID NO:12所示的第九引物、序列如SEQ ID NO:13所示的第十引物、序列如SEQ ID NO:14所示 的第十一引物、序列如SEQ ID NO:15所示的第十二引物。

采用上述技术方案，上述的十二条引物可以合成序列如SEQ ID NO:3的优化基因，该基 因可表达序列如SEQ ID NO:2的蛋白。

进一步，在所述密码子优化步骤之后包括转基因步骤，将优化基因转化进入植物，获得 含有优化基因的转基因植物。

采用上述技术方案，通过将优化基因转化进入植物中，使得转基因植物能够表达该基因 所编码的蛋白，该蛋白可以增强植物清除生长环境中的TNT的能力，并且增加该植物抗TNT 胁迫的能力。

进一步，所述植物为拟南芥、烟草、番茄和水稻中的一种。

采用上述技术方案，上述植物较为常见，易于获取且成本较低。特别是拟南芥是模式物 种，适合于应用在对目的基因的基础研究的过程。

进一步，使用农杆菌介导法将优化基因转化进入植物。

采用上述技术方案，农杆菌介导法是稳定成熟的在植物中转入外源基因方法。农杆菌介 导法是指农杆菌接到的将目的基因转化进入植物的方法。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中 分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物 伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后 代。

进一步，所述农杆菌的菌株为EHA105，LBA4404，GV3101或AGL-1。

采用上述技术方案，上述菌株为农杆菌常见菌株，易于获取，并且用上述农杆菌制备转 基因农杆菌可以获得较高的农杆菌转染(植物)成功率和效率。

进一步，使用PCR法检测所述转基因植物中的所述优化基因。

采用上述技术方案，通过PCR法可验证转基因植物是否转基因成功，是否确实含有优化 基因。转基因成功的转基因植物才具有处理环境中的TNT的功能。

进一步，检测所述转基因植物中的所述优化基因时，使用PCR法扩增的片段的序列如SEQ ID NO:16所示。

采用上述技术方案，检测序列较基因全长短，可提升PCR反应的效率。

附图说明

图1为本发明实施例2的PCR阳性苗鉴定结果。

图2为本发明实施例3的PCR阳性苗鉴定结果。

图3为本发明实施例4的PCR阳性苗鉴定结果。

图4为本发明实施例5的PCR阳性苗鉴定结果。

图5为本发明实验例的转基因拟南芥和野生型拟南芥在含TNT的MS固体培养基中的培 养结果。

图6为本发明实验例的HPLC检测结果。

图7为本发明实验例的TNT相对吸收率的检测结果。

具体实施方式

实施例1：基因优化和克隆

对克雷伯氏肺炎菌进行基因筛选，获得序列如SEQ ID NO:1的基因，该基因编码的蛋白 具有降解环境污染物TNT的活性，将其命名为TNT降解基因。可将此基因通过构建转基因植 物，将含有该基因的转基因植物应用于植物修复被TNT污染环境的实践中。对序列如SEQ ID NO:1的源于克雷伯氏肺炎菌的基因按照植物密码子偏好进行改造，获得序列如SEQID NO:3 的优化基因(称为优化后的TNT降解基因)，基因SEQ ID NO:1和优化基因SEQ IDNO:3均 编码序列如SEQ ID NO:2的蛋白。采用化学合成的方法合成优化基因，在合成中使用的引物 如下所示：

第一引物：5’-GGATCCATGGACATCGTCTCTGTTGCTCTGAAGCGTTACTCTACCAAGGCTTTCGA-3’(SEQ ID NO:4)；

第二引物：5’-TGCAACCAAGAAGCTGACTGCTGGTGAAGCTGAACAGCTGAAGACCCTGCTTCAGT-3’ (SEQ ID NO:5)；

第三引物：5’-ACTCTCCATCTTCCACTAACTCTCAACCTTGGCACTTCATTGTTGCATCCACTGAT-3’ (SEQ ID NO:6)；

第四引物：5’-GAAGGTAAGGCTCGTGTTGCTAAGGCTGCATCTGGTACTTATGTCTTCAACGAACG-3’(SEQ ID NO:7)；

第五引物：5’-TAAGATCCTGGATGCTTCTCATGTCGTCGTCTTCTGTGCTAAGACTGCTATGGATG-3’ (SEQ ID NO:8)；

第六引物：5’-ATGCTTGGCTTCAGCGTGTTGTTGATCAGGAAGAGGCTGATGGTCGTTTCGCAACT-3’ (SEQ ID NO:9)；

第七引物：5’-CCTGACGCAAAGGCTGCTAACCACAAGGGTCGTACCTTCTTCGCTGACATGCATCG-3’ (SEQ ID NO:10)；

第八引物：5’-TAAGGAGCTGAAAGATGACGATCAGTGGATGGCAAAGCAGGTCTACCTGAACGTTG-3’ (SEQ ID NO:11)；

第九引物：5’-GTAACTTCCTGCTTGGTGTTGCTGCAATGGGTCTTGATGCTGTTCCAATCGAAGGT-3’ (SEQ ID NO:12)；

第十引物：5’-GTTGACTTCGCAATCCTGGATGAGGAGTTCGACCTGAAGGCACAGGGTTACACTTC-3’ (SEQ ID NO:13)；

第十一引物：5’-TCTTGTTGTTGTTCCTGTTGGTCATCATTCTGTTGAGGACTTCAACGCTACTCTTC-3’ (SEQ ID NO:14)；

第十二引物：5’-CTAAGTCTCGTCTTCCACAGTCTACTACCATCACTGAAATCTAAGAGCTC-3’(SEQ ID NO:15)。

使用第一引物至第十二引物对，利用PCR扩增合成序列如SEQ ID NO:3的优化基因(化 学合成法)，使用50μL PCR反应体系，第一引物和第十二引物为外引物(反应体系中的含 量为30pmol)，其他为内引物(反应体系中的含量为1.5pmol).扩增方法为：先94℃预热1min；然后进行25个循环，即94℃,30s,50℃,30s,72℃,1min。通过凝胶电泳回收 PCR扩增后的产物(电泳取666bp片段部分)，获得回收产物。取10μL回收产物直接与T/A 克隆载体(T载)相连，4℃连接过夜，获得DNA连接产物，将DNA连接产物转化到DH5α感 受态细胞中。经测序，确认合成获得的基因序列为SEQ ID No:3所表示的序列。

接下来使用DNA连接产物构建表达载体，对DNA连接产物进行双酶切(BamHI和SacI) 回收酶切DNA片段(含有666bp优化基因)，并将酶切DNA片段连接到双35S启动子的pCAMBIA-1301载体上，获得重组质粒(命名为SBSV)。该表达载体还包含GUS报告基因和 带内含子卡那霉素抗性标记基因。

实施例2：转基因拟南芥制备

选用根癌农杆菌LBA4404菌株，采用电击法将SBSV转入该菌株中。除LBA4404菌株外， 还可以使用LBA4404，GV3101或AGL-1中的一种菌株。制备农杆菌感受态细胞的方法为现有 技术中的常规方法，具体为：先扩大培养农杆菌，挑取LBA4404菌株单菌落到25mL YEB培 养基(培养基中均含有50mg/L利发霉素)培养过夜，然后取培养过夜的5mL菌液转接到100ml YEB培养基中进行扩大培养(OD₆₀₀达到0.8后结束培养)。菌液冰上放置10min，使 农杆菌停止生长，然后离心收集菌体(4℃，5000rpm)，并使用无菌双蒸水清洗收集的菌 体两次。再使用500μL 10％甘油悬浮菌体，得到农杆菌感受态细胞。取100μL感受态细胞， 向其加入1μL重组质粒SBSV，混匀后再转到电击杯中进行电击(200Ω，1.7KV，2.5F)。 电击后立即将菌液加入800μl SOC培养液修复。培养1h后，取80μL至抗性板上进行涂抹并 28℃培养过夜，以筛选出成功导入重组质粒SBSV的菌株，获得含有666bp优化基因的农杆 菌(称为转基因农杆菌)。

接下来使用现有技术中的粘花法转化拟南芥(农杆菌粘花法转化植物)，获得转基因拟 南芥。转基因农杆菌的单菌落接菌在LB培养基(含卡那霉素)中，进行扩大培养，然后离心 收集菌体。用菌体等体积5％的新鲜蔗糖溶液悬浮菌体，再加入300ml 0.02％的Silwet-77混 匀，得到转化菌液。将拟南芥(哥伦比亚型)倒置后浸入转化菌液中10s，用保鲜膜将转化 植株圈好，平放24h。培养转化后的拟南芥并收集种子。利用50μg/mL潮霉素进行转化植株 (种子)筛选，最后选取在潮霉素板上生长正常的小苗，进行阳性苗鉴定，获得转基因拟南 芥第一代。

阳性苗鉴定的方法如下：收取转基因拟南芥第一代阳性株系种子，并播种于土钵中，待 其生根、发芽，长成株系，取一片叶片浸入含有X-GLUC的染色液中，选取叶片变蓝的拟南 芥植株进行分子检测。提取该植株叶片的总RNA,252bp核苷酸序列(SEQ ID NO:16)首尾片 段为引物进行PCR扩增，扩增条件为先94℃预热1min；然后进行25个循环，即94℃，30s， 60℃，30s，72℃，4min。将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳检测，实验结果见图1。在图1中从左往右依次为M：DNA marker；1、2、3：转基因拟南芥；WT：野生型拟南芥。由图1 可知目的基因已经导入成功。

实施例3：转基因烟草的制备

使用重组质粒SBSV对烟草(K326)进行转基因操作，方法为现有技术的农杆菌共转染 法。先将烟草种子进行消毒处理(依次使用75％酒精和次氯酸钠溶液消毒)，然后将种子铺 在MS培养基上(28℃培养温度)，待发芽后剪下烟草幼叶，放入含有1μg/mLNAA和4μg/mLBA 的MS培养基中，22℃培养1天。取实施例1制备的转基因农杆菌扩大培养至OD值为1.0，离心收菌体，并用无菌水清洗菌体，用MS培养液(菌体等体积)悬浮菌体，并使用菌体的 悬浮液侵泡烟草幼叶8min，然后将烟草幼叶取出，将液体用滤纸吸干，并将烟草幼叶放于1 μg/mLNAA和4μg/mLBA的MS培养基中，22℃共培养3天。然后使用筛选培养基培养(含 0.1μg/mL IAA、2μg/mL ZT、500μg/mL头孢Cb、50μg/mL卡那霉素Km的MS培养基) 烟草幼叶3周。再将烟草幼叶转入分化培养基(含0.1μg/mL IAA、2μg/mL ZT、500μg/mL Cb、100μg/mL Km的MS培养基)，培养2周。最后再转入生根培养基(含0.1μg/mL IAA的 1/2MS培养基)，培养两周。将获得的植株进行阳性苗鉴定，鉴定方法同实施例2，鉴定结 果如图2所示，在图2中从左往右依次为M：DNA marker；1、2、3：转基因烟草；WT：野生 型烟草。由图2可知目的基因已经导入成功。

实施例4：转基因番茄的制备

转基因番茄的制备方法同转基因烟草的制作方法，使用的番茄品种为沪番1429，使用含 有目的基因的农杆菌转染番茄幼叶。将获得的植株进行阳性苗鉴定，鉴定结果如图3所示， 在图3中从左往右依次为1、2：转基因番茄；M：DNA marker；3：转基因番茄；WT：野生型 番茄。由图3可知目的基因已经导入成功。

实施例5：转基因水稻的制备

取水稻授粉后15天的幼胚，经消毒后进行愈伤组织的诱导，诱导培养基为含有500mg/L 水解乳蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2,4-D，2.5g/L植物凝胶的N6培养基(pH5.8)。培养7 天后获得水稻愈伤组织，再进行农杆菌的侵染。取实施例1制备的转基因农杆菌扩大培养至 OD值为1.0，离心收菌体，并用无菌水清洗菌体，用MS培养液(菌体等体积)悬浮菌体， 并使用菌体的悬浮液侵泡水稻愈伤组织8min，然后将水稻愈伤组织取出，将液体用滤纸吸干。然后将愈伤组织置于1μg/mLNAA和4μg/mLBA的MS培养基中，22℃共培养3天。然后转入 筛选培养基(含有1μg/mL IAA、4μg/mL BA、500μg/mL Cb、50μg/mL潮霉素HAT的MS 培养基)，培养3代(继代周期为25天)。然后转入分化培养基(含1μg/mL IAA、4μg/mL BA、2μg/mL KT、500μg/mL Cb、50μg/mL HAT的MS培养基)中，至幼芽长至2mm。最后 在转入生根培养基(含有0.5mg/L的IBA的1/2MS培养基)中，培养3代，获得转基因水 稻植株。将获得的植株进行阳性苗鉴定，鉴定方法同实施例2，鉴定结果如图4所示，在图 4中从左往右依次为M：DNAmarker；1、2、3、4、5：转基因水稻；WT：野生型水稻。由图 4可知目的基因已经导入成功。

实验例：转基因植物对TNT的降解能力检测

将实施例2-实施例5中的转基因植物进行育种，获得第三代自交纯合植株。取第三代自 交纯合植株的种子，并将种子播撒到含有0.15mM TNT的MS固体培养基进行培养(转基因烟 草、番茄、水稻和拟南芥)，并同时培养非转基因植物作为对照实验，胁迫处理后观察植物 的发芽、生长及鲜重情况。具体实验情况以及结果如下：

(1)针对转基因烟草、番茄和水稻：

将30可实施例3中制备的转基因烟草的第三代自交纯合植株的种子，种植在0.15mM TNT 的MS培养基(固体)上，将30颗野生型烟草(种子)种植在0.15mM TNT的MS培养基(固 体)上，胁迫处理7天后进行发芽率的检测。转基因烟草在含有TNT的培养皿上，其种子的 发芽率比非转基因植物提高4.1倍(计算方法：转基因植物发芽率除以野生型植物发芽率， 发芽率指测试种子发芽数占测试种子总数的百分比)。紧接着发芽率实验，继续进行胁迫处 理2周，对各植株进行根长和鲜重的测量。转基因烟草的根长比非转基因植物提高68％(计 算方法：(转基因植物平均根长-野生型植物平均根长)/野生型植物平均根长×100％)，转 基因烟草的鲜重比非转基因植物提高53％(计算方法：(转基因植物平均鲜重-野生型植物平 均鲜重)/野生型植物平均鲜重×100％)。

将20颗实施例4中制备的转基因番茄的第三代自交纯合植株的种子种植在0.15mMTNT 的MS培养基(固体)上，将20颗野生型番茄(种子)种植在0.15mM TNT的MS培养基(固体)上，胁迫处理10天，然后进行发芽率的检测。转基因番茄在含有TNT的平板上，其种 子的发芽率比非转基因植物提高3.6倍。

将50颗实施例5中制备的转基因水稻的第三代自交纯合植株的种子种植在0.15mMTNT 的MS培养基(固体)上，将50颗野生型水稻(种子)种植在0.15mM TNT的MS培养基(固体)上，胁迫处理4天，然后进行发芽率的检测。转基因水稻在含有TNT的平板上，其种子 的发芽率比非转基因植物提高3.7倍。

(2)针对转基因拟南芥：

将实施例2中制备的转基因拟南芥的第三代自交纯合植株的种子种植在0.15mMTNT的 MS培养基(固体)上，将野生型拟南芥(种子)种植在0.15mM TNT的MS培养基(固体)上， 胁迫处理144h，转基因拟南芥生长情况明显优于非转基因拟南芥(野生型拟南芥)，鲜重比 非转基因植物提高75％，如图5所示(1、2、3均代表实施例2制备的转基因拟南芥，取第三代自交纯合植株的种子进行实验)。

紧接着进行了液体培养基的种植试验，设置TNT浓度梯度。将转基因拟南芥植株和野生 型拟南芥植株培养在含有0.05mM、0.1mM或0.15mM的TNT的MS液体培养基中。使用实施例2制备的转基因拟南芥，取第三代自交纯合植株的种子种植在普通MS培养基上，然后再取生长两周的植株进行实验(称为转基因待测植株，样本量20×3株)。取野生型拟南芥种子种植在普通MS培养基上，然后再取生长两周的植株进行实验(称为野生型待测植株，样本量20×3株)。将转基因待测植株和野生型待测植株分别种植在含有TNT的MS液体培养 基中，胁迫处理144h，然后再进行各项参数的检测。每个TNT浓度种植20株转基因待测植 株和20株野生型待测植株，并且每株植株使用单独的培养皿，每株植株的液体培养基不混 合。转基因拟南芥的鲜重较非转基因拟南芥提高了82％(0.05mM TNT)、87％(0.1mM TNT) 和79％(0.15mM TNT)。鲜重提高率的计算方法为转基因植物平均鲜重-野生型植物平均鲜重)/野生型植物平均鲜重×100％。

培养结束之后，取培养基(0.15mM TNT组)进行TNT含量检测(包括野生型拟南芥的培 养基和转基因拟南芥的培养基)，取一株转基因待测植株的培养基和取一株野生型待测植株 的培养基进行检测，检测方法为常规HPLC，以TNT溶液(0.15mM，培养基为溶剂)为对照， 检测结果如图6所示。结果显示，转基因拟南芥的培养基中未检出TNT(被拟南芥吸收后， 通过拟南芥的代谢过程分解)，而野生型拟南芥的培养基中还存在TNT，说明转基因拟南芥 具有较好的降解TNT的能力。

除此之外，本方案还将本方案的基因/蛋白(SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2)与其他的已知 的具有TNT降解功能的基因/蛋白进行了比较。作为对比的基因/蛋白来自于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄素氧化还原酶基因(LcNFSA基因)，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黄素氧化还原酶基因(EcNFSA基因)。按照现有技术的方法，将嗜酸乳杆菌NFSA基因和阴沟 肠杆菌的NFSA基因按照植物遗传密码子偏好进行密码子优化并构建重组质粒，并按照本方案实施例2的方法转化拟南芥，获得两种作为对比的转基因拟南芥(分别称为LcNFSA转基因拟南芥(含优化后的基因，序列为SEQ ID NO:17)和EcNFSA转基因拟南芥(含优化后的 基因，序列为SEQ ID NO:18))。获得LcNFSA转基因拟南芥和EcNFSA转基因拟南芥第三代 自交纯合植株的种子，并将本方案(实施例2制备)的转基因拟南芥的种子、LcNFSA转基因 拟南芥的种子和EcNFSA转基因拟南芥的种子(均为第三代自交纯合植株的种子)分别播撒 到含有0.15mM的TNT的MS固体培养基进行培养(培养持续144h，检测发芽率)，每个浓度 每种种子播撒50颗。在0.15mM TNT组中，实施例2制备的转基因拟南芥的发芽率比LCNFSA 转基因拟南芥和EcNFSA转基因拟南芥分别高出25％和30％(计算方法为：转基因植物发芽率 减去野生型植物发芽率)。说明实施例2制备的转基因拟南芥在抗TNT胁迫的能力上强于 LcNFSA转基因拟南芥和EcNFSA转基因拟南芥，说明本方案的基因在辅助拟南芥抗TNT胁迫 的功效上强于LcNFSA基因和EcNFSA基因。

使用实施例2制备的转基因拟南芥，取第三代自交纯合植株的种子种植在普通MS培养 基上，然后再取生长两周的植株进行实验(称为本方案待测植株，样本量20×3株)；取EcNFSA 转基因拟南芥第三代自交纯合植株的种子种植在普通MS培养基上，然后再取生长两周的植 株进行实验(称为EcNFSA待测植株，样本量20×3株)。将上述两种待测植株分别种植在 含有TNT的MS液体培养基中，胁迫处理144h，然后再进行各项参数的检测。含有TNT的MS 液体培养基有三种，分别为TNT的浓度为0.05mM、0.1mM和0.15mM的MS培养基，每种浓度 分别种植20株本方案待测植株和EcNFSA待测植株。实验结果显示，在0.05mM TNT处理中， 本发明的转基因拟南芥(本方案待测植株)的鲜重较EcNFSA转基因拟南芥(EcNFSA待测植 株)提高了15.33％；在0.1mM TNT处理中，本发明的转基因拟南芥(本方案待测植株)的鲜 重较EcNFSA转基因拟南芥(EcNFSA待测植株)提高了21.36％；在0.15mM TNT处理中，本发明的转基因拟南芥(本方案待测植株)的鲜重较EcNFSA转基因拟南芥(EcNFSA待测植株)提高了42.16％。鲜重提高率的计算方法为：(本方案待测植株平均鲜重-EcNFSA待测植株平均鲜重)/EcNFSA待测植株平均鲜重×100％。可见本发明的转基因拟南芥比LcNFSA转基因拟 南芥和EcNFSA转基因拟南芥，具有更为显著的耐受TNT胁迫的能力，本发明的基因表达的 蛋白比其他基因具有更强的促进拟南芥抗胁迫的性质。

早期抗TNT胁迫研究通常都是针对NFSA亚家族基因，而对其他具有抗TNT胁迫的基因 的研究较少。本发明首次发现了克雷伯氏肺炎菌中的新基因也具有抗TNT胁迫的能力，后续 进行了进一步的研究来探讨该基因功能。本实验例针对转基因拟南芥对在含0.10、0.05mM 和0.15mM TNT的MS培养基中的TNT相对吸收率进行了测量。使用实施例2制备的转基因拟 南芥，取第三代自交纯合植株的种子种植在普通MS培养基上，然后再取生长两周的植株进 行实验(称为本方案待测植株，样本量3×2株)。取野生型拟南芥种子种植在普通MS培养 基上，然后再取生长两周的植株进行实验(称为野生型待测植株，样本量3株)。将本方案 待测植株和野生型待测植株种植于含有0.10、0.05mM和0.15mM TNT的液体MS培养基中，每个浓度种植2株本方案待测植株和1株野生型待测植株，持续培养144h，定时取样测量培养基中的TNT含量，并计算TNT的相对吸收率。每个植株使用独立的培养瓶，以方便取样。 结果如图7所示，KPT-1代表实施例2制备的转基因拟南芥(重复1，每种浓度1株)、KPT-2 代表实施例2制备的转基因拟南芥(重复2，每种浓度1株)，均使用第三代自交纯合植株 的种子进行实验，WT为野生型拟南芥。TNT相对吸收率的计算方法为原MS培养基中的TNT 含量(0.10或0.05mM或0.15mM)减去对供试拟南芥进行培养后培养基中的TNT含量(定时 测量值)，上述差值除以原MS培养基中的TNT含量，最后乘以100％，获得TNT相对吸收率。 培养基中TNT的检测方法为常规HPLC，每隔24h取样进行检测，胁迫处理一共持续144h。 实验结果如图7所示，转基因拟南芥(KPT-1和KPT-2)的TNT吸收率远大于野生型拟南芥 (WT)，说明本发明的基因具有消除培养基中的TNT的作用(拟南芥先吸收培养基中的TNT， 再通过代谢过程降解)。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未 作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下， 还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实 施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中 的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆市农业科学院

<120> 一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因的应用

<130> 2020.7.23

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 1

atggatatcg tatcggtcgc tttgaagcgc tattccacca aggcctttga cgccacgaaa 60

aagctgactg ccggggaagc ggaacagctg aaaacgctgc tgcagtacag cccgtctagc 120

accaactccc agccgtggca ctttattgtc gccagcaccg atgaagggaa agctcgcgtg 180

gcgaaagccg ccagcggcac ctacgtgttc aacgaacgta aaattctcga cgcctcgcac 240

gtggtggtgt tctgcgcgaa aaccgcgatg gacgacgcct ggctgcagcg cgtggtggat 300

caggaagagg ccgatggccg tttcgccacc ccggacgcaa aagccgctaa ccacaagggt 360

cgcaccttct ttgccgatat gcaccgcaaa gagctgaaag atgacgatca gtggatggcg 420

aaacaggtgt atctcaacgt cggcaatttc ctgctgggcg tagcggcgat gggtctcgac 480

gccgtgccga ttgaaggggt cgattttgcg atcctcgatg aggaatttga cctgaaagcc 540

cagggctaca ccagcctggt ggtggtcccg gtcggccacc atagcgtgga ggatttcaac 600

gctaccctgc cgaagtcgcg tctgccgcag tcgacgacca ttaccgagat ttaa 654

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> Klebsiella pneumoniae

<400> 2

Met Asp Ile Val Ser Val Ala Leu Lys Arg Tyr Ser Thr Lys Ala Phe

1 5 10 15

Asp Ala Thr Lys Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ala Glu Gln Leu Lys Thr

20 25 30

Leu Leu Gln Tyr Ser Pro Ser Ser Thr Asn Ser Gln Pro Trp His Phe

35 40 45

Ile Val Ala Ser Thr Asp Glu Gly Lys Ala Arg Val Ala Lys Ala Ala

50 55 60

Ser Gly Thr Tyr Val Phe Asn Glu Arg Lys Ile Leu Asp Ala Ser His

65 70 75 80

Val Val Val Phe Cys Ala Lys Thr Ala Met Asp Asp Ala Trp Leu Gln

85 90 95

Arg Val Val Asp Gln Glu Glu Ala Asp Gly Arg Phe Ala Thr Pro Asp

100 105 110

Ala Lys Ala Ala Asn His Lys Gly Arg Thr Phe Phe Ala Asp Met His

115 120 125

Arg Lys Glu Leu Lys Asp Asp Asp Gln Trp Met Ala Lys Gln Val Tyr

130 135 140

Leu Asn Val Gly Asn Phe Leu Leu Gly Val Ala Ala Met Gly Leu Asp

145 150 155 160

Ala Val Pro Ile Glu Gly Val Asp Phe Ala Ile Leu Asp Glu Glu Phe

165 170 175

Asp Leu Lys Ala Gln Gly Tyr Thr Ser Leu Val Val Val Pro Val Gly

180 185 190

His His Ser Val Glu Asp Phe Asn Ala Thr Leu Pro Lys Ser Arg Leu

195 200 205

Pro Gln Ser Thr Thr Ile Thr Glu Ile

210 215

<210> 3

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggatccatgg acatcgtctc tgttgctctg aagcgttact ctaccaaggc tttcgatgca 60

accaagaagc tgactgctgg tgaagctgaa cagctgaaga ccctgcttca gtactctcca 120

tcttccacta actctcaacc ttggcacttc attgttgcat ccactgatga aggtaaggct 180

cgtgttgcta aggctgcatc tggtacttat gtcttcaacg aacgtaagat cctggatgct 240

tctcatgtcg tcgtcttctg tgctaagact gctatggatg atgcttggct tcagcgtgtt 300

gttgatcagg aagaggctga tggtcgtttc gcaactcctg acgcaaaggc tgctaaccac 360

aagggtcgta ccttcttcgc tgacatgcat cgtaaggagc tgaaagatga cgatcagtgg 420

atggcaaagc aggtctacct gaacgttggt aacttcctgc ttggtgttgc tgcaatgggt 480

cttgatgctg ttccaatcga aggtgttgac ttcgcaatcc tggatgagga gttcgacctg 540

aaggcacagg gttacacttc tcttgttgtt gttcctgttg gtcatcattc tgttgaggac 600

ttcaacgcta ctcttcctaa gtctcgtctt ccacagtcta ctaccatcac tgaaatctaa 660

gagctc 666

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggatccatgg acatcgtctc tgttgctctg aagcgttact ctaccaaggc tttcga 56

<210> 5

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgcaaccaag aagctgactg ctggtgaagc tgaacagctg aagaccctgc ttcagt 56

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actctccatc ttccactaac tctcaacctt ggcacttcat tgttgcatcc actgat 56

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaggtaagg ctcgtgttgc taaggctgca tctggtactt atgtcttcaa cgaacg 56

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taagatcctg gatgcttctc atgtcgtcgt cttctgtgct aagactgcta tggatg 56

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgcttggct tcagcgtgtt gttgatcagg aagaggctga tggtcgtttc gcaact 56

<210> 10

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctgacgcaa aggctgctaa ccacaagggt cgtaccttct tcgctgacat gcatcg 56

<210> 11

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

taaggagctg aaagatgacg atcagtggat ggcaaagcag gtctacctga acgttg 56

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtaacttcct gcttggtgtt gctgcaatgg gtcttgatgc tgttccaatc gaaggt 56

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttgacttcg caatcctgga tgaggagttc gacctgaagg cacagggtta cacttc 56

<210> 14

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcttgttgtt gttcctgttg gtcatcattc tgttgaggac ttcaacgcta ctcttc 56

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ctaagtctcg tcttccacag tctactacca tcactgaaat ctaagagctc 50

<210> 16

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gagctgaaag atgacgatca gtggatggca aagcaggtct acctgaacgt tggtaacttc 60

ctgcttggtg ttgctgcaat gggtcttgat gctgttccaa tcgaaggtgt tgacttcgca 120

atcctggatg aggagttcga cctgaaggca cagggttaca cttctcttgt tgttgttcct 180

gttggtcatc attctgttga ggacttcaac gctactcttc ctaagtctcg tcttccacag 240

tctactacca tc 252

<210> 17

<211> 771

<212> DNA

<213> Lactobacillus acidophilus

<400> 17

ggatccatga tccacaacaa gactattgat gctcaactca atcacagatc catcagaaag 60

ttcaaggaca tcaccttgaa caaagaacaa cttgagacct tgtactctgt cttcgctcag 120

actccaacct ctatgttcat gcagaacgct tccttggttc acatcatcga tccagagcag 180

aagaagaaga tcagagaact ctgcaaccag aagtatgtcg gtgctgaagg tgatctcttc 240

atcttcgtcg ttgacttgta cagaaaccaa cagatcagaa agcaacttgg taaggatgat 300

ggcagagttc acaccatcga catcttcttc caagctatgg aagacaccct gcttgcttac 360

cagaacgttg ccaatgctgt cgaatctatg gatctgggtt acgttccact tggtactgtc 420

aacgatcatc cacttgagat gctcaagacc cttgacctgc cagaactgac ctttccagtc 480

cttggtatgc aagttggtgt tccagaccag aaaccacaac tgaagccaag acttccactc 540

aagttcatct gctttgaagg taagtatgac aaggacttca acgtcaagga cctgaaggac 600

tacgatcaag tcgtcaccac ctactacgac ctgagagact ccaacagaag aatcgactcc 660

ttcaccaagc agatcactgg tgctaagctc gacaaccatg agactgacag agacgaactt 720

ccagaggaac ttcacaagca aggcttgtgc ttggactgga aataagagct c 771

<210> 18

<211> 735

<212> DNA

<213> Enterobacter cloacae

<400> 18

ggatccatga ctccaactat tgatcttctt cgttctcacc gttctatccg tcacttcact 60

gatgaaccaa tcactgaggc acagcgtgag gctatcatcg attctgcttc tgctacttct 120

tcttcctcct tcctgcaatg ttcttccatc attcgtatca ctgacaaggc tatgcgtgaa 180

caacttgtta ctcttactgg tggtcagaag catgttgcac aggctgctga gttctgggtc 240

ttctgtgctg acttcaaccg tcatcttcaa atctgtcctg aagctgaact tggtcttgct 300

gaacagcttc tgcttggtgt tgttgacact gcactgatgg cacagaatgc attcactgct 360

gctgaatctc tgggtttggg tggtgtctac attggtggtc tgcgtaacaa catcgaatcc 420

gtcaccgaac tgctgaagct gcctaagcat gttctgcctc tgttcggtct gtgtcttggt 480

tggcctgctg acaatcctga tctgaagcca cgtctgcctg ctgcaatgct ggttcatgag 540

aaccactatc aacctgttga ccaggatgtt ctgaatcaat acgatgaaga gcttgcacac 600

tactacatga ctcgtggttc caacaatcgt cgtgatacct ggtctgatca tatccgtcgt 660

actatcatca aagagaatcg tccattcatc ctggactacc tgcacaaaca gggttgggca 720

actcgttaag agctc 735

Claims (10)

1.一种源于克雷伯氏肺炎菌的基因在处理2,4,6-三硝基甲苯中的应用，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1或2中所述的应用，其特征在于：使用所述基因处理2,4,6-三硝基甲苯的方法包括密码子优化步骤：对所述基因进行密码子优化获得优化基因，所述优化基因的序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：合成所述优化基因的引物包括序列如SEQID NO:4所示的第一引物、序列如SEQ ID NO:5所示的第二引物、序列如SEQ ID NO:6所示的第三引物、序列如SEQ ID NO:7所示的第四引物、序列如SEQ ID NO:8所示的第五引物、序列如SEQ ID NO:9所示的第六引物、序列如SEQ ID NO:10所示的第七引物、序列如SEQ ID NO:11所示的第八引物、序列如SEQ ID NO:12所示的第九引物、序列如SEQ ID NO:13所示的第十引物、序列如SEQ ID NO:14所示的第十一引物、序列如SEQ ID NO:15所示的第十二引物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在所述密码子优化步骤之后包括转基因步骤，将优化基因转化进入植物，获得含有优化基因的转基因植物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥、烟草、番茄和水稻中的一种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：使用农杆菌介导法将优化基因转化进入植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述农杆菌的菌株为EHA105，LBA4404，GV3101或AGL-1。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：使用PCR法检测所述转基因植物中的所述优化基因。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：检测所述转基因植物中的所述优化基因时，使用PCR法扩增的片段的序列如SEQ ID NO:16所示。

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