CN106591335A - 一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用。本发明利用水稻优化密码子设计合成了LbCpf1基因。并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用改造的LbCpf1基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切。本发明实现了水稻基因打靶，这是因为经过密码子植物化改造的LbCpf1的适用于水稻的基因组剪切。

Description

一种密码子植物化改造的LbCpf1基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种密码子经过植物化改造的LbCpf1基因在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

CRISPR-核酸酶技术是近几年发展出的一种真核生物特异位点基因编辑技术。该技术所涉及的核酸酶目前发现的主要有两种：Cas9核酸酶和Cpf1核酸酶。CRISPR-Cas9技术自2012年发现以来，由于其操作简单、高效，已经被广泛应用于斑马鱼、小鼠、大鼠等动物和拟南芥、烟草、甜橙、玉米、水稻等植物的基因编辑中。CRISPR-Cpf1是近两年发现，并且已经成功应用于大鼠等动物的基因编辑。CRISPR-Cpf1相较于CRISPR-Cas9有以下优点：1、Cpf1不仅可以切割DNA，也能切割RNA；2、Cpf1能够独立的对pre-crRNA进行加工形成成熟的crRNA；3、Cpf1蛋白切割DNA双链后形成粘性末端，在一定程度上更有利于替换的发生或者造成大片段的缺失或插入；4、Cpf1为基因编辑提供更多的位点供选择。

但现在使用的LbCpf1是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，而原核生物和真核生物存在不同的密码子偏好和碱基组成。例如以水稻为代表的单子叶植物，其GC含量高，较细菌及双子叶植物等物种，密码子偏好性强。因此直接使用未经人工优化设计的LbCpf1，会影响其在真核细胞中的表达效率，从而影响其对DNA双链的切割效率。此外，由于LbCpf1来自于大肠杆菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

发明内容

针对上述问题，本发明希望对LbCpf1进行密码子植物化改造。本发明旨在将LbCpf1基因对密码子经过植物化改造，并整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种密码子植物化改造的LbCpf1基因，命名为plant LbCpf1，所述LbCpf1基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选地，该基因由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列构成。该序列是以模式作物水稻密码子为基础改造获得的，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，利用发明人从与水稻基因相关密码子中所筛选出的密码子替换原有密码子，得到植物化改造的plant LbCpf1序列，再经过化学合成而来。采用本发明的基因可以明显提高剪切效率。

在第二个方面，本发明提供一种含有所述plant LbCpf1基因的植物表达载体。该植物表达载体的构建方法是利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUN600载体并回收，由于合成的plant LbCpf1序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将plantLbCpf1连接到pHUN600载体，得到植物表达载体pHUN-plant LbCpf1(pHUN 611)。

另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的LbCpf1基因。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述密码子植物化改造的LbCpf1基因完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

在另一个方面，本发明提供一种利用pHUN-plantLbCpf1(pHUN 611)表达载体(其含有所述密码子植物化改造的LbCpf1基因)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUN 611-BEL)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带plantLbCpf1的打靶载体(pHUN 611-BEL)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述plant LbCpf1标记基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：

atgtccaagctggagaagtttacaaactgttacagcctctccaaaaccctcaggtttaaagcgatcccggtgggcaagacccaggagaacatcgacaacaagaggctcctggtggaagacgagaagcgcgccgaagactacaagggcgtgaagaagctgctcgataggtactacctcagctttattaacgacgtgctgcacagcatcaaactcaagaatctcaacaactacatctccctcttccgcaaaaagacccgcaccgagaaggagaacaaggagctggagaacctggagatcaacctccgcaaggaaatcgccaaagcgttcaagggcaatgaagggtacaagagcctcttcaagaaagacatcatcgaaactatcctcccagagtttctcgatgacaaggacgagatcgcgctggtgaactcctttaacgggttcacaaccgcgtttaccggcttctttgataacagggaaaatatgttctccgaggaggccaagtccaccagcatcgccttcaggtgtatcaacgagaacctcacccgctacatttccaatatggacattttcgagaaggtggatgcgatcttcgataagcacgaggtgcaggagatcaaagagaagattctcaattccgattatgacgtcgaggatttcttcgaaggggagttctttaattttgtgctcacacaagagggcattgacgtgtacaacgcgattatcgggggcttcgtcacagagtccggggagaagattaaggggctgaatgagtacatcaatctgtacaatcagaagaccaagcagaaactgccgaaattcaagccgctctacaagcaagtcctgtccgatagggaaagcctctccttctacggcgagggctataccagcgacgaggaggtgctggaagtcttccgcaacacactgaataagaatagcgagattttctcctccatcaagaagctcgagaagctctttaagaactttgacgagtacagctccgccgggattttcgtgaagaacgggccggcgatcagcaccatctccaaggacatctttggcgagtggaacgtcatcagggacaagtggaacgccgagtacgacgacatccacctgaagaagaaggcggtggtgaccgagaagtatgaggacgatcgcaggaagtccttcaaaaaaatcggctccttcagcctcgaacagctccaggagtatgccgatgcggatctgtccgtcgtcgagaagctgaaggaaatcatcattcagaaggtcgacgagatctataaagtgtacgggtccagcgagaagctgttcgacgccgactttgtgctcgagaagtccctcaaaaagaatgacgccgtggtggccattatgaaagacctgctcgactccgtgaagtccttcgaaaattacattaaagcgttctttggggaggggaaggaaactaacagggatgagtccttctatggcgactttgtcctcgcgtacgacatcctgctgaaggtcgaccacatttacgacgcgatccgcaactacgtgacacagaagccgtactccaaagacaagttcaagctgtacttccagaacccgcaatttatggggggctgggacaaggataaagagacagactaccgcgcgacaattctccgctatggctccaaatactatctggccatcatggacaagaagtacgcgaagtgcctgcagaagatcgacaaagacgacgtcaatggcaactatgaaaagatcaactacaagctgctgccgggcccgaacaagatgctcccgaaggtgttcttcagcaagaagtggatggcctactacaatccaagcgaggatattcagaaaatctataaaaacgggaccttcaagaagggggacatgtttaacctcaacgactgccacaagctcattgatttcttcaaggatagcatttcccgctacccgaaatggtccaatgcgtacgattttaacttctccgagacagaaaagtacaaagacatcgcgggcttttacagggaggtggaggagcaagggtataaagtttcttttgaatccgcgagcaagaaggaagtcgacaagctcgtcgaggagggcaagctctacatgttccaaatttataacaaggacttttccgacaagagccatgggaccccaaacctccacaccatgtacttcaaactgctctttgacgagaacaaccacgggcaaatcaggctgagcggcggcgccgaattattcatgcgcagggcctccctcaagaaggaagagctggtcgtccatccagccaattccccgatcgcgaacaagaacccggacaatccgaaaaagaccaccaccctgtcctacgacgtctacaaggacaaacgcttcagcgaagaccagtacgaattacacatcccaattgcgattaataagtgcccaaagaatatcttcaaaattaatacagaggtcagggtgctgctcaaacacgacgacaatccgtatgtcatcggcattgacaggggcgagcgcaatctgctctatatcgtggtcgtggatgggaagggcaatattgtggagcagtactccctgaacgagattatcaacaacttcaatgggattaggattaagaccgactatcacagcctgctcgacaagaaagaaaaagagaggtttgaggcccgccaaaactggacctccattgagaatatcaaagaattaaaggccggctatatttcccaagtcgtccacaagatctgcgagctggtggagaaatatgacgccgtgattgcgctcgaagacttaaattctgggttcaagaactcccgcgtgaaggtggaaaaacaggtgtatcagaaattcgagaaaatgctgatcgacaaactcaattatatggtggataagaagtccaacccgtgtgccacagggggcgcgctgaagggctatcagatcaccaacaagttcgagagcttcaagagcatgagcacccagaacgggtttattttctacatcccggcgtggctcacctccaagattgacccgagcaccggcttcgtgaacctcctgaagacaaagtatacctccattgccgacagcaagaagtttatctcctccttcgaccgcattatgtatgtgccggaggaggacctcttcgagttcgccctcgactacaaaaacttcagccgcacagatgcggattacatcaagaagtggaagctgtactcctacgggaacaggatccgcatcttcaggaatccaaaaaaaaataacgtctttgactgggaggaagtgtgcctgacatccgcctacaaggaactgttcaataaatacggcatcaattaccagcagggcgacattcgcgccctcctctgtgagcagtccgacaaagcgttttactccagcttcatggccctcatgtccctgatgctccaaatgaggaatagcatcacagggcgcaccgacgtcgacttcctcatcagcccggtgaagaactccgacgggatcttttacgactcccgcaactatgaggcgcaagagaatgcgatcctcccgaagaacgccgatgcgaacggggcctataatatcgccaggaaagtgctctgggccatcgggcagttcaaaaaggcggaggatgagaagctcgacaaggtgaaaattgccatttccaacaaggagtggctggagtacgcgcagacctccgtgaagcacaaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatcctacccatacgatgttccagattacgcttatccctacgacgtgcctgattatgcatacccatatgatgtccccgactatgcctaa

附图说明

图1-1至图1-4为经过密码子植物化改造的plantLbCpf1与原始LbCpf1核苷酸序列比对。其中Optimized为优化后的plantLbCpf1的核苷酸序列，Original为原始LbCpf1的核苷酸序列。

图2为经过密码子植物化改造的plantLbCpf1与原始LbCpf1基因编码蛋白的氨基酸序列比对。Optimized为优化后plantLbCpf1基因编码的氨基酸序列，Original为原始LbCpf1编码的氨基酸序列。

图3为PHUN611(LbCpf1)载体质粒示意图。

图4为转基因植株的PCR检测电泳图。扩增片段为LbCpf1基因的部分，片段大小为496bp。M为DL2kbmarker；PC为阳性对照；NC为阴性对照；1-8为随机挑选的转基因植株。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and DavidRussell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；CharlesNeal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,PlantTransformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——LbCpf1基因的密码子植物化改造

本申请的发明人根据GENBANK数据库中的信息，收集水稻92188条CDS序列，共计34132283个密码子，在网站http://www.kazusa.or.jp/codon/，分析这些密码子在水稻中的使用情况。同一物种同一氨基酸，不同密码子被使用的情况有所不同，发明人根据在水稻中各密码子的使用情况，利用自行设计的密码子的组合替换原有密码子，对来自大肠杆菌的LbCpf1基因进行植物化改造，获得一条新的DNA序列，并给这个DNA序列末端加上水稻偏好的终止密码子TGA，形成一个新基因，该基因被命名为plantLbCpf1，序列如SEQ ID NO:1所示，与LbCpf1序列比对见图1。

进一步分析其碱基组成，结果见表2。由表2知：plantLbCpf1的GC含量高达53.06％，明显高于LbCpf1的50.30％。这样基因结构更加稳定，因为GC间可形成3个氢键，而AT间2个。

表2plant LbCpf1和LbCpf1的基因碱基组成分析。

分析plant LbCpf1和LbCpf1基因所编码的蛋白氨基酸序列，比对结果见图2。从图2可看出，二者氨基酸序列完全一致。

将设计好的plantLbCpf1基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-plant LbCpf1载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

实施例2——含有plant LbCpf1基因植物打靶载体的构建

从上面含有PUC57-AMP-plant LbCpf1载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收plantLbCpf1片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUN600进行线性化处理，回收pHUN600，将上述的plantLbCpf1片段和pHUN600片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN600-plant LbCpf1(图3)，命名为pHUN 611。

选择水稻BEL基因(LOC_Os03g55240)中第2463-2487位的核苷酸序列TTTGGAAGAGAGTGACTGCGCTAGCAATC，(下划线部分为所述5’TTTN-(N)X-3’结构中TTTG部分)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUN611融合形成pHUN611-BEL。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例3——以pHUN611-BEL为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUN611-BEL载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增密码子植物化改造的plantLbCpf1的PCR引物为5’-TTCACAACCGCGTTTACC-3’及5’-TCACCACCGCCTTCTTCT-3’，产生长度为492bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。随机挑选8棵转基因植株，经鉴定，均为阳性，阳性率达到100％(见图4)。

对转基因所得的34棵植株全部进行叶片DNA提取，将所得基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增BEL基因片段的PCR引物为5’-GTGGAGGTCGACATGACTGAAG-3’及5’-TTGCACATTCATACAAATTGGT-3’，产生长度为416bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对。在所测的34株转基因植株中有14株发生了点突变；突变效率为41.2％。说明经改造的Lbcpf1可以对水稻基因组进行剪切，并且具有很高的突变效率。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种密码子植物化改造的 LbCpf1 基因及其应用

<130> HCI20160265

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> 骨干质粒载体

<400> 1:

atgtccaagc tggagaagtt tacaaactgt tacagcctct ccaaaaccct caggtttaaa 60

gcgatcccgg tgggcaagac ccaggagaac atcgacaaca agaggctcct ggtggaagac 120

gagaagcgcg ccgaagacta caagggcgtg aagaagctgc tcgataggta ctacctcagc 180

tttattaacg acgtgctgca cagcatcaaa ctcaagaatc tcaacaacta catctccctc 240

ttccgcaaaa agacccgcac cgagaaggag aacaaggagc tggagaacct ggagatcaac 300

ctccgcaagg aaatcgccaa agcgttcaag ggcaatgaag ggtacaagag cctcttcaag 360

aaagacatca tcgaaactat cctcccagag tttctcgatg acaaggacga gatcgcgctg 420

gtgaactcct ttaacgggtt cacaaccgcg tttaccggct tctttgataa cagggaaaat 480

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acccgctaca tttccaatat ggacattttc gagaaggtgg atgcgatctt cgataagcac 600

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aacagggatg agtccttcta tggcgacttt gtcctcgcgt acgacatcct gctgaaggtc 1500

gaccacattt acgacgcgat ccgcaactac gtgacacaga agccgtactc caaagacaag 1560

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atcaactaca agctgctgcc gggcccgaac aagatgctcc cgaaggtgtt cttcagcaag 1800

aagtggatgg cctactacaa tccaagcgag gatattcaga aaatctataa aaacgggacc 1860

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ggcgccgaat tattcatgcg cagggcctcc ctcaagaagg aagagctggt cgtccatcca 2280

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gcgattaata agtgcccaaa gaatatcttc aaaattaata cagaggtcag ggtgctgctc 2460

aaacacgacg acaatccgta tgtcatcggc attgacaggg gcgagcgcaa tctgctctat 2520

atcgtggtcg tggatgggaa gggcaatatt gtggagcagt actccctgaa cgagattatc 2580

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gagagcttca agagcatgag cacccagaac gggtttattt tctacatccc ggcgtggctc 3000

acctccaaga ttgacccgag caccggcttc gtgaacctcc tgaagacaaa gtatacctcc 3060

attgccgaca gcaagaagtt tatctcctcc ttcgaccgca ttatgtatgt gccggaggag 3120

gacctcttcg agttcgccct cgactacaaa aacttcagcc gcacagatgc ggattacatc 3180

aagaagtgga agctgtactc ctacgggaac aggatccgca tcttcaggaa tccaaaaaaa 3240

aataacgtct ttgactggga ggaagtgtgc ctgacatccg cctacaagga actgttcaat 3300

aaatacggca tcaattacca gcagggcgac attcgcgccc tcctctgtga gcagtccgac 3360

aaagcgtttt actccagctt catggccctc atgtccctga tgctccaaat gaggaatagc 3420

atcacagggc gcaccgacgt cgacttcctc atcagcccgg tgaagaactc cgacgggatc 3480

ttttacgact cccgcaacta tgaggcgcaa gagaatgcga tcctcccgaa gaacgccgat 3540

gcgaacgggg cctataatat cgccaggaaa gtgctctggg ccatcgggca gttcaaaaag 3600

gcggaggatg agaagctcga caaggtgaaa attgccattt ccaacaagga gtggctggag 3660

tacgcgcaga cctccgtgaa gcacaaaagg ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca 3720

aaaaagaaaa agggatccta cccatacgat gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg 3780

cctgattatg catacccata tgatgtcccc gactatgcct aa 3822

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物

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<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3:

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Claims (7)

1.一种密码子植物化改造的LbCpf1基因，其特征在于，所述LbCpf1基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种密码子植物化改造的LbCpf1基因，其特征在于，所述LbCpf1基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的LbCpf1基因。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的LbCpf1基因或权利要求2所述的表达盒。

5.一种权利要求1所述的基因、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述密码子植物化改造的LbCpf1基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

6.一种利用含有权利要求1中所述的密码子植物化改造的LbCpf1基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述打靶载体，所述打靶载体中携带所述密码子植物化改造的LbCpf1基因；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。

7.根据权利要求1所述的密码子植物化改造的LbCpf1基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻。