CN112402364B - 一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射用的含脐带间充质干细胞‑富含血小板血浆的复合修复凝胶。本发明通过采用间充质干细胞凝胶与富含血小板血浆凝胶混合组成一种注射用的复合修复凝胶，该复合修复凝胶能提高干细胞的存活率，延长生物活性分子在体内的作用时间，并实现局部用药；脐带间充质干细胞分泌的活性物质能够招募内源性干细胞，促进组织再生，对人面部皮肤皱纹和斑点具有巨大的改善作用。

Description

一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合 修复凝胶

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，更具体地，涉及一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶。

背景技术

面部皮肤质地的改变、皱纹和沟壑的出现，以及软骨和骨骼的流失是面部衰老的根本原因。因此，面部年轻化的重点在于恢复面部缺失的软组织量以及改善肤质，去除皱纹。

目前面部年轻化的治疗手段包括手术治疗和非手术治疗。手术治疗可以快速地解决上下眼睑皮松弛或因支持结构松弛而导致的皮下组织位移，但对于皮肤质地的改善无优势，且创伤较大，恢复时间较久，甚至还可能发生感染、遗留瘢痕等并发症。非手术治疗主要有光电治疗，光电治疗可以改善肤质、消除皱纹，但不能提升面部皮肤，也不能恢复缺失的软组织，且疗程较长，可能遗留色素沉着或减退、形成瘢痕以及多次治疗导致的肌肤敏感等并发症。除此之外，还有通过注射填充材料的方法使面部年轻化。注射填充材料包括注射A型肉毒素、透明质酸、胶原蛋白、脂肪组织等。其中注射A型肉毒素仅对于动态性皱纹有效果，作用较单一、局限；而透明质酸或胶原蛋白可以解决软组织的缺失，填充静态性皱纹，但会因注射物部分吸收而导致效果维持较短。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于中胚层，属于多能干细胞。MSCs可分泌多种生长因子及炎性因子，在抑制皮肤老化、美白肌肤、辅助脂肪移植、促进毛发再生等诸多抗衰老方面均有较显著的效果。通过注射方式将负载的间充质干细胞递送到需填充的部位，能够在体内持续维持负载的MSCs存活，MSCs能持续分泌血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞因子(bFGF)，这些因子具有对抗氧化应激、修复创伤、调节皮肤色素代谢等作用，对组织再生和再上皮化受阻的慢性创面具有良好的应用能力。因此，MSCs有再生作用，刺激成纤维细胞分泌胶原，不仅可以去除皱纹，而且还可以改善肤质，达到面部皮肤年轻化目的。

富含血小板血浆(PRP)中含有丰富的复合生长因子，而且各种生长因子的浓度和配比符合生理需求，能显著促进MSCs的增殖、分化和局部新生血管的形成。不过，富含血小板血浆激活后，超过90％预先合成的生长因子会在l小时内释放完毕，而生长因子半衰期短，体内容易被降解，无法在局部持续发挥促进血管生成的作用。皮肤修复过程的不同阶段需要不同种类的生长因子参与，而细胞在生长的不同阶段对各种生长因子种类和浓度的需求是不同的，因此单独应用富含血小板血浆或者干细胞均无法满足皮肤修复的全部条件，而目前对组织工程中生长因子的释放大多局限于单一种类和单一浓度，其结果往往差强人意，难以满足面部美容的需求。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有面部美容技术的不足，提供一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶。该复合修复凝胶能提高细胞的存活率，延长生物活性分子在体内的作用时间，并实现局部用药；脐带间充质干细胞分泌的活性物质能够招募内源性干细胞，促进组织再生，对人面部皮肤皱纹和斑点具有巨大的改善作用。

本发明的第一个目的是提供一种间充质干细胞凝胶。

本发明的第二个目的是提供一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶。

本发明的第三个目的是提供以上所述凝胶在制备促进组织再生产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供以上所述凝胶在制备促进皮肤修复产品中的应用。

本发明的第五个目的是提供以上所述凝胶在制备促进面部皮肤年轻化产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明通过采用脐带间充质干细胞与富含血小板血浆混合组成一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶。该复合修复凝胶能提高细胞的存活率，延长生物活性分子在体内的作用时间，并实现局部用药；脐带间充质干细胞分泌的活性物质能够招募内源性干细胞，促进组织再生，对人面部皮肤皱纹和斑点具有巨大的改善作用。

因此，本发明要求保护一种间充质干细胞凝胶，含有间充质干细胞、丝素蛋白和透明质酸。

优选地，其中丝素蛋白和透明质酸以丝素蛋白-透明质酸凝胶的形式添加。

优选地，所述间充质干细胞凝胶通过将丝素蛋白-透明质酸凝胶与间充质干细胞混合而成。

优选地，所述间充质干细胞凝胶的具体制备方法为：按每100μL丝素蛋白-透明质酸凝胶中含1×10⁵～1×10⁶个间充质干细胞的比例，用丝素蛋白-透明质酸凝胶包裹脐带间充质干细胞，即得间充质干细胞凝胶。

优选地，所述间充质干细胞为离体的脐带间充质干细胞。

优选地，所述脐带间充质干细胞取自培养后的P3～P5代细胞。

最优选地，一种间充质干细胞凝胶，包含脐带间充质干细胞和丝素蛋白-透明质酸凝胶。

本发明还要求保护一种注射用的复合修复凝胶，所述复合修复凝胶含有间充质干细胞以及富含血小板血浆。

优选地，所述间充质干细胞以上所述间充质干细胞凝胶的形式添加，所述富含血小板血浆以富含血小板血浆凝胶的形式添加。

优选地，所述富含血小板血浆凝胶由富含血小板血浆和激活剂组成，两者的用量体积比为5～9：1。

更优选地，富含血小板血浆和激活剂两者的用量体积比为9：1。

优选地，所述复合修复凝胶由间充质干细胞凝胶与富含血小板血浆凝胶的用量体积比为1～4：1。

更优选地，所述复合修复凝胶由间充质干细胞凝胶与富含血小板血浆凝胶的用量体积比为4：1。

优选地，所述复合修复凝胶中，间充质干细胞凝胶的体积百分比为50％～80％，富含血小板血浆凝胶的体积百分比为20％～50％。

更优选地，所述复合修复凝胶中，间充质干细胞凝胶的体积百分比为80％，富含血小板血浆凝胶的体积百分比为20％。

最优选地，一种注射用的含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶，包含间充质干细胞凝胶和富含血小板血浆凝胶，所述间充质干细胞凝胶通过丝素蛋白-透明质酸凝胶与间充质干细胞混合而成，富含血小板血浆凝胶由富含血小板血浆和激活剂组成。

因此，以下应用也应在本发明的保护范围之内：

以上任一所述凝胶在制备促进组织再生产品中的应用。

以上任一所述凝胶在制备促进皮肤修复产品中的应用。

以上任一所述凝胶在制备促进面部皮肤年轻化产品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的含间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶可作为细胞移植的载体，提高移植细胞的滞留，并能为移植的细胞提供合适的三维立体生长环境，防止细胞的失巢凋亡，提高细胞的存活率；

(2)复合修复凝胶还可作为蛋白或者生长因子的控制释放载体，防止这些生物活性分子被体内的酶降解，阻止其一过性释放，延长生物活性分子在体内的作用时间，并实现局部用药；

(3)复合修复凝胶满足皮肤修复的全部条件，其性能优良的水凝胶能为内源性修复创造条件，为干细胞植入提供附着支架；而富含血小板血浆可以促进MSCs的增殖、分化和局部新生血管的形成；脐带间充质干细胞分泌的活性物质能够招募内源性干细胞，促进组织再生。

附图说明

图1为脐带间充质干细胞形态。

图2为分离的脐带间充质干细胞表达的间充质干细胞的表面标记，图A～D分别为对照组CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺表面标记的表达以及CD45⁺、CD34⁺、CD11b⁺、CD19⁺和HLA-DR⁺的阴性表达；图E～H分别为实验组CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺表面标记的表达以及CD45⁺、CD34⁺、CD11b⁺、CD19⁺和HLA-DR⁺的阴性表达。

图3为复合修复凝胶中富含血小板血浆对脐带间充质干细胞增殖的影响

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1脐带间充质干细胞的培养和检测

一、实验步骤

1、脐带间充质干细胞培养

取15～20cm长的新生儿脐带，要求妇产科健康足月剖腹产的胎儿，孕妇HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。新生儿脐带采集时置于脐带保护液中，从采集至脐带进行制备需在6h内，无菌条件下用PBS洗涤至无血迹，纵向剖开，去除血管后剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块，将0.5ml脐带组织悬液加入到75cm²培养瓶中，同时加入10ml无血清完全培养基，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。第3天半量换液，第7天全量换液，于倒置显微镜下观察，待细胞生长至80％融合时，以0.05％胰蛋酶消化，按1：5传代，取生长状态良好的P3～P5代细胞。

2、脐带间充质干细胞检测

(1)胰酶，消化3～5min；待显微镜下观察细胞大部分收缩变圆时，加入2mL含血清的培养基终止消化，吹打细胞并转移至15mL离心管中进行800rpm离心，离心时间为5min；

(2)细胞准备：弃掉上清，加入2mL PBS悬浮沉淀，计数细胞；按照每管1×10⁵个密度，将细胞悬液均匀分配至1.5mL的Ep管中，800rpm离心5min；弃上清，沉淀中加入100μL的PBS悬浮；

(3)抗体孵育：每管加入对应的流式抗体1μL，避光孵育40min，孵育结束后PBS清洗，离心，最终加入300μL PBS悬浮细胞，以不加任何抗体的人脐带间充质干细胞作为阴性对照，上机操作。

二、脐带间充质干细胞检测结果

脐带间充质干细胞形态如图1所示，从脐带中分离的干细胞为多角形或梭型，细胞折光性强。脐带间充质干细胞检测结果如图2所示，经流式鉴定，图A～D分别为对照组CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺表面标记的表达以及CD45⁺、CD34⁺、CD11b⁺、CD19⁺和HLA-DR⁺的阴性表达；图E～H为实验组，分离的细胞强表达间充质干细胞的表面标记CD73⁺、CD90⁺、CD105⁺以及CD45⁺、CD34⁺、CD11b⁺、CD19⁺和HLA-DR⁺的阴性表达，具有间充质干细胞的特征，证实从脐带中分离的细胞为脐带间充质干细胞。

实施例2脐带间充质干细胞凝胶的制备

1、丝素蛋白-透明质酸凝胶的制备

(1)桑蚕丝纤维脱胶：将200g桑蚕生丝置于5L用去离子水溶解的质量分数为0.6％的碳酸钠溶液中，98～100℃下煮三次，每次30～45min，每次处理完再用去离子水漂洗以脱去生丝中的丝胶，然后将脱胶之后的蚕丝扯松放于60℃的烘箱中烘干，即可得到丝素纤维。

(2)再生丝素蛋白溶液的制备：配制CaCl₂、C₂H₅OH、H₂O(摩尔比为1：2：8)的三元溶液。将烘干后的丝素纤维按照浴比1:10(g：mL)在72℃的三元溶液中缓慢搅拌溶解，可事先将丝素纤维剪碎，溶解时间为1小时，得到丝素和三元溶液的混合溶液。待混合溶液冷却后装入透析袋，然后在流动的自来水中透析2天，之后换用去离子水透析，去离子水每隔一小时换一次，持续时间为2天。将透析过的再生丝素蛋白溶液经8层无菌纱布过滤后装入试剂瓶中，并保存于4℃冰箱备用。

(3)透明质酸溶液的配制：将分子量为1～10万的透明质酸粉末溶解于去离子水中，常温下在磁力搅拌器中不停的搅拌3h，使其分散均匀，配制成浓度为1～10％的透明质酸水溶液，然后将其放入4℃的冰箱中备用。

(4)丝素蛋白-透明质酸凝胶的制备：将丝素蛋白溶液与透明质酸溶液以5：5的质量比例共混，配制成总浓度为2.5％的共混溶液。分别向丝素蛋白-透明质酸共混溶液中加入溶质质量为10～20％的交联剂碳化二亚胺盐(EDC)和10％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的复合溶液，将配制好的丝素蛋白-透明质酸交联共混溶液搅拌充分，随后将共混溶液放入循环水式真空泵中抽真空，消除搅拌过程中产生的气泡。然后室温静置20～60min，获得丝素蛋白-透明质酸凝胶。

2、间充质干细胞凝胶的制备

按100μL丝素蛋白-透明质酸凝胶溶1×10⁶个脐带间充质干细胞的比例，包裹脐带间充质干细胞，形成间充质干细胞凝胶。

实施例3富含血小板血浆(PRP)凝胶的制备

取自体静脉采血10ml全血平分置入含1ml复方枸橼酸钠的2个10mL抗凝管中摇匀，以200g的离心力离心10min，吸取全部上清液至交界面下2mm转移至另一离心管内，待溶液平衡后再以以200g的离心力离心10min，吸去3/4的上清液弃去，剩余部分即为富含血小板血浆。将富含血小板血浆与激活剂(由1mL 10％氯化钙与1000U凝血酶混合而成)以9：1的比例混合摇匀，静置约2min，形成富含血小板血浆凝胶。

实施例4含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶的配制

由实施例2制备的间充质干细胞凝胶和实施例3制备的富含血小板血浆凝胶组成，其中间充质干细胞凝胶的体积百分比为80％，富含血小板血浆凝胶的体积百分比为20％。

制备方法为：将间充质干细胞凝胶与富含血小板血浆凝胶按用量体积比为4：1的比例进行混合，制备得到含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶。

实施例5复合修复凝胶中富含血小板血浆对脐带间充质干细胞增殖的影响

以实施例4制备的含间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶作为实验组，以实施例2制备的未加富含血小板血浆的间充质干细胞凝胶作为对照组，两组分别接种于96孔培养板中，每组设6个孔，每孔分别在0d、1d、3d、7d、14d、21d后加入CCK-8试剂，继续培养2h，以全自动酶标仪测定450nm波长下各孔吸光度(opticaldensity，OD)，计算各组细胞在相应时间的相对增殖率，以0d时对照组相对增值率100％；计算公式为：相对增殖率(％)＝药物处理组OD值/0d时对照组OD值×100％。

结果如图3所示，对照组和实验组的相对增值率分别在0d、1d、3d没有显著差异，而在7d、14d、21d时，富含血小板血浆凝胶组的相对增殖率显著高于对照组的(差异显著用字母a表示)，证明富含血小板血浆在含间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶中有促进脐带间充质干细胞增殖的作用。

实施例6面部皮肤治疗测试效果

采用水光微针将实施例4制备的含间充质干细胞-富含血小板血浆复合凝胶导入表皮深层和真皮层，进行人面部皮肤的改善实验，具体实施步骤如下：

用75％的医用酒精消毒皮肤，将微针浸泡在75％的医用酒精消毒液中约15～30min，分别取实施例3的富含血小板血浆凝胶(A组)、实施例2的间充质干细胞凝胶(B组)和实施例4的含间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶(C组)注射在面部皮肤。

在分别使用后第7、30天用面部VISIA皮肤检测皮肤的斑点、皱纹和毛孔，并准确记录其特征计数，结果如下表所示。

表1三组治疗后面部VISIA皮肤斑点检测结果比较

表2三组治疗后面部VISIA皮肤皱纹检测结果比较

表3三组治疗后面部VISIA皮肤毛孔检测结果比较

结果显示：含间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶对面部皱纹和斑点的改善效果均比与单独使用富含血小板血浆凝胶和间充质干细胞凝胶的效果好，并且随时间呈持续改善的趋势。

实施例7感官评价

采用自拟调查问卷对医师和分别使用实施例6中三种凝胶3个月后的三组就医者进行满意度评价调查，由就医者根据自身情况回答问题，分数越高，满意度越高，总分为10分，结果如表4所示。

表3三组就医者和医师感官评价满意度的比较

结果显示：使用含间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶(C组)的就医者和医师满意度均显著高于其他两组。

综上，含间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶注射在面部进行年轻化治疗中效果显著，可显著改善就医者的皮肤老化症状，值得临床推广。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种注射用的复合修复凝胶，其特征在于，含有脐带间间充质干细胞、丝素蛋白、透明质酸和富含血小板血浆；其中丝素蛋白和透明质酸以丝素蛋白-透明质酸凝胶的形式添加，所述富含血小板血浆以富含血小板血浆凝胶的形式添加，所述富含血小板血浆凝胶由体积比为5～9：1的富含血小板血浆和激活剂组成；间充质干细胞凝胶与富含血小板血浆凝胶的用量体积比为1～4：1；

其中，所述注射用的复合修复凝胶的制备方法包括如下步骤：

S1. 丝素蛋白-透明质酸凝胶：

将丝素蛋白溶液与透明质酸溶液以5：5的质量比例共混，配制成总浓度为2.5%的丝素蛋白-透明质酸共混溶液；向丝素蛋白-透明质酸共混溶液中加入溶质质量为10～20%的交联剂碳化二亚胺盐和10%的N-羟基琥珀酰亚胺的复合溶液，将配制好的丝素蛋白-透明质酸交联共混溶液搅拌充分，抽真空，静置，获得丝素蛋白-透明质酸凝胶；

S2. 间充质干细胞凝胶：

按100 μL丝素蛋白-透明质酸凝胶溶1×10⁶个脐带间充质干细胞的比例，包裹脐带间充质干细胞，形成间充质干细胞凝胶；

S3. 富含血小板血浆凝胶：

取全血与复方枸橼酸钠混匀，离心，吸取全部上清液至交界面下2 mm，待溶液平衡后再离心，得到富含血小板血浆；将富含血小板血浆与激活剂以9：1的比例混合摇匀，静置，形成富含血小板血浆凝胶；

S4. 含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆复合修复凝胶：

将体积比为4：1的间充质干细胞凝胶与富含血小板血浆凝胶混合，制备得到含脐带间充质干细胞-富含血小板血浆的复合修复凝胶。

2.根据权利要求1所述注射用的复合修复凝胶，其特征在于，S1所述抽真空在循环水式真空泵中进行。

3. 根据权利要求1所述注射用的复合修复凝胶，其特征在于，S1所述静置的时间为20～60 min。

4.根据权利要求1所述注射用的复合修复凝胶，其特征在于，S3所述全血与复方枸橼酸钠的体积比为5：1。

5. 根据权利要求1所述注射用的复合修复凝胶，其特征在于，S3所述离心为以200g的离心力离心10 min。

6. 根据权利要求1所述注射用的复合修复凝胶，其特征在于，S3所述静置的时间为2min。

7.权利要求1～6任一所述注射用的复合修复凝胶在制备促进皮肤修复产品中的应用。