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CN114832015A - 一种基于prp与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备方法 - Google Patents

一种基于prp与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备方法 Download PDF

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CN114832015A
CN114832015A CN202210430252.2A CN202210430252A CN114832015A CN 114832015 A CN114832015 A CN 114832015A CN 202210430252 A CN202210430252 A CN 202210430252A CN 114832015 A CN114832015 A CN 114832015A
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rich plasma
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晁晓东
蔡敏
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Xi'an Chuyuan Saier Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1份富血小板血浆、3份干细胞外泌体、6份生理盐水，该基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂的制备方法，包括如下步骤：步骤一、制备富血小板血浆；步骤二、制备干细胞外泌体；步骤三、制备面部修复注射剂；该基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备方法，以提高其分泌量，用于皮肤抗衰、修复和疾病治疗。

Description

一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备 方法
技术领域
本发明属于干细胞应用技术领域，具体涉及一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备方法。
背景技术
随着富含血小板血浆(PRP)的研究越来越深入，自体PRP的应用领域也越来越广泛，如骨科、整形美容、眼科等方向。有研究发现自体PRP凝胶对肉芽的生长有着很强的促进作用，这种凝胶释放高浓度的生长因子，刺激细胞增殖和分化，封闭伤口，加速止血，修复受损组织。
干细胞的外泌体(exosomes，Exo)是负责干细胞物质交换的关键活性囊泡，直径40～150nm，密度约为1.13-1.19g/ml。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mrna，microrna和蛋白质成分。外泌体形成是通过多囊泡胞内体(mve)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microrna及mrna。当mve与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。因外泌体携带来源细胞的rna，microrna及蛋白成分，参与细胞与细胞间的信息传递，因此在干细胞治疗过程中，干细胞来源的外泌体在组织重建上起到了很重要的作用，尤其是外泌体内所包含的蛋白或rna成分与受损细胞进行信息交流的功能，可以对靶细胞进行生物学功能的调控，达到修复的目的，也因此外泌体在再生医学方面得到了广泛的实验研究。
唐建宏等研究发现，外泌体可通过激活转化生长因子信号通路、Wnt信号通路来调节上皮间质转化，减轻组织纤维化。间充质干细胞源性外泌体修复组织纤维化损伤疾病(肺纤维化、肝纤维化、心脏纤维化、肾纤维化)的研究进展，为进一步研究放射性唾液腺纤维化提供思路和展望。
祁放等研究发现，间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体可通过携带的蛋白或核酸等物质调节局部炎症反应、血管生成及免疫应答,从而为角膜外伤、干眼及免疫性眼病等的治疗提供了新思路。外泌体非细胞的特性避免了干细胞治疗中细胞存活、肿瘤发生及移植物排斥等问题,并且有成为治疗药物的生物载体的潜力。
李芳等研究发现，目前关于创面修复的研究较多,然而其机制仍不明确。越来越多的研究表明,间充质干细胞、外泌体和富血小板血浆可通过对创面修复的各个阶段起不同的重要作用,有效促进创面修复。
由此可见，干细胞外泌体的组织修复与再生作用使得其可以用于美容抗衰和皮肤修复，干细胞外泌体的药理活性使得其可以用于疾病治疗。然而现有干细胞外泌体存在分泌量不足，影响干细胞外泌体应用效果的缺陷，
发明内容
本发明的目的是提供一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备方法，以提高其分泌量，用于皮肤抗衰、修复和疾病治疗。
为达上述目的，本发明提供了一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1份富血小板血浆、2～5份干细胞外泌体、4～7份生理盐水。
进一步的，所述一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂按体积包括1mL富血小板血浆、3mL干细胞外泌体、6mL生理盐水。
进一步的，所述的一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、制备富血小板血浆；
步骤二、制备干细胞外泌体；
步骤三、制备面部修复注射剂。
进一步的，所述步骤一、制备富血小板血浆是采用离心法制备的，具体过程是：首先，抽外周血10mL，上下颠倒混匀；然后，转移至离心管离心，2500rpm离心10min；再然后，吸取上层血浆及prp层于离心管中再次离心，3200rpm，8min；最后，弃掉上层血浆及下层红细胞，剩余液体量，即为PRP，摇匀，备用。
进一步的，所述步骤二、制备干细胞外泌体的具体过程是：
(1)、培养脐带间充质干细胞；
(2)、收集脐带间充质干细胞的细胞上清液；
(3)、分离干细胞外泌体。
进一步的，所述步骤(1)、培养脐带间充质干细胞的集体过程是：于生物安全柜中取出脐带标本置于一次性培养皿中，用含有5％的青霉素-链霉素生理盐水充分洗涤，剔除动静脉血管，撕取华通胶，充分剪碎，接种于含有10％无血清添加物培养基的培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，当原代细胞达到70％-80％融合时，可继续传代培养或者冻存于液氮罐中。
进一步的，所述步骤(2)、收集脐带间充质干细胞的细胞上清液的集体过程是：选择步骤(1)培养的细胞增殖能力强、状态好的第2-5代脐带间充质干细胞，复苏后，换液1次，培养72h后，收集细胞上清液。
进一步的，所述步骤(3)、分离干细胞外泌体的集体过程是：取步骤(2)收集的细胞上清液，依次用1200rpm离心10min和1800rpm离心20min再次收集上清，使用0.22μm滤膜过滤，最后用超速离心机150000rpm离心1.5h，收集外泌体浓缩液进行定量，最优用0.22μm滤膜过滤，分装备用。
所述的基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1mL富血小板血浆、2mL干细胞外泌体、7mL生理盐水。
所述的基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1mL富血小板血浆、5mL干细胞外泌体、4mL生理盐水。
本发明的优点是：本发明提供这种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂有益效果在于：本发明的提供这种面部修复注射剂PRP与干细胞外泌体实现对皮肤免疫状态精准调节，从而消除老化细胞，修复岁月痕迹，使肌肤细胞年轻化。
由于外泌体及其微小，且与细胞培养组分类似，采用新型技术华龛生物生产的3D
Figure BDA0003609977080000041
三维贴壁细胞规模化培养工艺，3D
Figure BDA0003609977080000042
vivaEXO外泌体收获系统经过专用一次性管路耗材，可实现全封闭式收获外泌体产品，单批次可实现1013个外泌体收获，同时避免了人工操作增加染菌风险。外泌体高表达TSG101、CD81和CD63，电镜结果显示外泌体结构完整，为经典外泌体结构。该工艺操作简便，无需2D培养过程中消化、传代和接种等一系列繁琐操作，大幅降低时间、空间及人工成本。
本发明提供的制备方法在维持外泌体纯度(以外泌体特异性跨膜蛋白CD9和CD81的含量为指标)基本不变的前提下，可以显著提高干细胞外泌体的分泌量，可用于干细胞皮肤抗衰、修复或疾病治疗。
本发明的PRP与干细胞外泌体面部修复注射剂的制备方法工艺简单，即用即配、安全有效。
附图说明
图1是基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂修复穴位及位置示意图。
图2是基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂修复穴位及位置示意图。
图中：1、额头；2、眉弓；3、太阳穴；4、卧蚕；5、苹果肌；6、鼻部；7、唇部；8、下巴；9、额头皱纹；10、眉间皱纹；11、眼部皱纹；12、鱼尾纹；13、面颊凹陷；14、鼻唇沟；15、唇周皱纹；16、法令纹；17、颈部皱纹；18、唇珠点；19、颔唇沟；20、颔低；21、发际；22、眉间点；23、鼻下点。
具体实施方式
为进一步阐述本发明达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下实施例对本发明的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。
实施例1
本实施例提供了一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂及其制备方法，以提高其分泌量，用于皮肤抗衰、修复和疾病治疗。
为达上述目的，本实施例提供了一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1份富血小板血浆、2～5份干细胞外泌体、4～7份生理盐水。
进一步的，所述基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂按体积包括1mL富血小板血浆、3mL干细胞外泌体、6mL生理盐水。
进一步的，所述的基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1mL富血小板血浆、2mL干细胞外泌体、7mL生理盐水。
进一步的，所述的基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，按体积包括1mL富血小板血浆、5mL干细胞外泌体、4mL生理盐水。
进一步的，所述的一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、制备富血小板血浆；
步骤二、制备干细胞外泌体；
步骤三、制备面部修复注射剂。
进一步的，所述步骤一、制备富血小板血浆是采用离心法制备的，具体过程是：首先，抽外周血10mL，上下颠倒混匀；然后，转移至离心管离心，2500rpm离心10min；再然后，吸取上层血浆及prp层于离心管中再次离心，3200rpm离心8min；最后，弃掉上层血浆及下层红细胞，剩余液体量，即为PRP，摇匀，备用。
进一步的，所述步骤二、制备干细胞外泌体的具体过程是：
(1)、培养脐带间充质干细胞；
(2)、收集脐带间充质干细胞的细胞上清液；
(3)、分离干细胞外泌体。
进一步的，所述步骤(1)、培养脐带间充质干细胞的集体过程是：于生物安全柜中取出脐带标本置于一次性培养皿中，用含有5％的青霉素-链霉素生理盐水充分洗涤，剔除动静脉血管，撕取华通胶，充分剪碎，接种于含有10％无血清添加物培养基的培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，当原代细胞达到70％-80％融合时，可继续传代培养或者冻存于气相液氮罐中。
进一步的，所述步骤(2)、收集脐带间充质干细胞的细胞上清液的集体过程是：选择步骤(1)培养的细胞增殖能力强、状态好的第2-5代脐带间充质干细胞，复苏后，换液1次，培养72h后，收集细胞上清液。
进一步的，所述步骤(3)、分离干细胞外泌体的集体过程是：取步骤(2)收集的细胞上清液，依次用1200rpm离心10min和1800rpm离心20min再次收集上清，使用0.22μm滤膜过滤，最后用超速离心机150000rpm离心1.5h，收集外泌体浓缩液进行定量，最优用0.22μm滤膜过滤，分装备用。
综上所述，本实施例提供这种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂有益效果在于：本实施例的提供这种面部修复注射剂PRP与干细胞外泌体实现对皮肤免疫状态精准调节，从而消除老化细胞，修复岁月痕迹，使肌肤细胞年轻化。
由于外泌体及其微小，且与细胞培养组分类似，采用新型技术华龛生物生产的3D
Figure BDA0003609977080000071
三维贴壁细胞规模化培养工艺，3D
Figure BDA0003609977080000072
vivaEXO外泌体收获系统经过专用一次性管路耗材，可实现全封闭式收获外泌体产品，单批次可实现1013个外泌体收获，同时避免了人工操作增加染菌风险。外泌体高表达TSG101、CD81和CD63，电镜结果显示外泌体结构完整，为经典外泌体结构。该工艺操作简便，无需2D培养过程中消化、传代和接种等一系列繁琐操作，大幅降低时间、空间及人工成本。
本实施例提供的制备方法在维持外泌体纯度(以外泌体特异性跨膜蛋白CD9和CD81的含量为指标)基本不变的前提下，可以显著提高干细胞外泌体的分泌量，可用于干细胞皮肤抗衰、修复或疾病治疗。
本实施例的PRP与干细胞外泌体面部修复注射剂的制备方法工艺简单，即用即配、安全有效。
实施例2
PRP与干细胞外泌体面部修复液制备。
1、配方
1mL富血小板血浆、3mL干细胞外泌体、6mL生理盐水。
2、制备方法
首先，取P3代生长状态良好的hUC-MSCs，用无血清培养基培养，收集细胞、洗涤，再使用无血清培养基重悬，收集上清，依次用1200rpm离心10min和1800rpm离心20min再次收集上清，使用0.22μm滤膜过滤，最后用超速速离心机150000rpm离心1.5h收集沉淀，将沉淀用适量生理盐水重悬。其次，同时抽外周血10mL，上下颠倒混匀。转移至离心管离心，2500rpm离心10min，吸取上层血浆及prp层于离心管中再次离心，3200rpm离心8min，弃掉上层血浆及下层红细胞，吸取prp层1mL与3mL干细胞外泌体混合进行面部修复注射；使用时用生理盐水将富血小板血浆与干细胞外泌体混合注射。按照以下比例中的一种进行注射：1)1mL富血小板血浆+2mL干细胞外泌体+7mL生理盐水；2)1mL富血小板血浆+3mL干细胞外泌体+6mL生理盐水；3)1mL富血小板血浆+5mL干细胞外泌体+4mL生理盐水。
实施例3
面部美容修复注射剂促进面部皮肤改善应用。如图1、图2所示，可以选择在额头1、眉弓2、太阳穴3、卧蚕4、苹果肌5、鼻部6、唇部7、下巴8、额头皱纹9、眉间皱纹10、眼部皱纹11、鱼尾纹12、面颊凹陷13、鼻唇沟14、唇周皱纹15、法令纹16、颈部皱纹17、唇珠点18、颔唇沟19、颔低20、发际21、眉间点22、鼻下点23等部位，根据实际情况用显微针注射面部美容修复注射剂。
采用显微针将本发明的PRP与干细胞外泌体面部美容修复注射剂导入表皮深层和真皮层时，人面部皮肤改善实验，具体实施步骤如下：用75％的医用酒精消毒皮肤，采用一次性显微针，取适量的PRP与干细胞外泌体混悬液，分别取实施例1和实施例2美容制剂，用微针按照由上至下顺序，每个部位2-3次，结束后使用初源肌专用液体敷料面膜20min，无需清洗。注射后就可以看到效果，用后7天，30天用皮肤镜(CBS-807皮肤分析系统)检测皮肤弹性、毛孔大小、水分、皱纹和肤色。结果见下表1这些指标均有所改善。半年肉眼就可以看到明显效果。
表1 30人次使用PRP与干细胞外泌体面部修复注射液前后皮肤改善情况
Figure BDA0003609977080000091
由上表可知，采用水光微针将本发明PRP与干细胞外泌体面部修复注射剂导入表皮深层和真皮层，可以有效改善面部皮肤弹性、水分、皱纹、斑点和毛孔粗大等问题，对面部皮肤具有修复抗衰的作用。
采用PRP与干细胞外泌体面部修复注射剂就是将复原皮肤时起作用的血小板和皮肤生长因子浓缩后注入皮肤，刺激大量胶原蛋白、弹性纤维、胶质等的产生，促进皮肤多个组织的生长及重新排列，从而达到全面提升肌肤状态，延缓衰老。使用后明显改善皱纹额头纹、颈纹、面部皮肤松弛、粗糙、黄褐斑、毛孔粗大、毛细血管扩张、眼袋、黑眼圈有明显改善。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，其特征在于：按体积包括1份富血小板血浆、2～5份干细胞外泌体、4～7份生理盐水。
2.如权利要求1所述一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，其特征在于：按体积包括1mL富血小板血浆、3mL干细胞外泌体、6mL生理盐水。
3.如权利要求1或2所述的一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、制备富血小板血浆；
步骤二、制备干细胞外泌体；
步骤三、制备面部修复注射剂。
4.如权利要求3所述一种基于PRP的干细胞外泌体制备方法，其特征在于：所述步骤一、制备富血小板血浆是采用离心法制备的，具体过程是：首先，抽外周血10mL，上下颠倒混匀；然后，转移至离心管离心，2500rpm离心10min；再然后，吸取上层血浆及prp层于离心管中再次离心，3200rpm，8min；最后，弃掉上层血浆及下层红细胞，剩余液体量，即为PRP，摇匀，备用。
5.如权利要求3所述一种基于PRP的干细胞外泌体制备方法，其特征在于：所述步骤二、制备干细胞外泌体的具体过程是：
(1)、培养脐带间充质干细胞；
(2)、收集脐带间充质干细胞的细胞上清液；
(3)、分离干细胞外泌体。
6.如权利要求5所述一种基于PRP的干细胞外泌体制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、培养脐带间充质干细胞的集体过程是：于生物安全柜中取出脐带标本置于一次性培养皿中，用含有5％的青霉素-链霉素生理盐水充分洗涤，剔除动静脉血管，撕取华通胶，充分剪碎，接种于含有10％无血清添加物培养基的培养皿中，置于37℃5％CO2培养箱中培养，当原代细胞达到70％-80％融合时，可继续传代培养或者冻存于液氮罐中。
7.如权利要求5所述一种基于PRP的干细胞外泌体制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、收集脐带间充质干细胞的细胞上清液的集体过程是：选择步骤(1)培养的细胞增殖能力强、状态好的第2-5代脐带间充质干细胞，复苏后，换液1次，培养72h后，收集细胞上清液。
8.如权利要求5所述一种基于PRP的干细胞外泌体制备方法，其特征在于：所述步骤(3)、分离干细胞外泌体的集体过程是：取步骤(2)收集的细胞上清液，依次用1200rpm离心10min和1800rpm离心20min再次收集上清，使用0.22μm滤膜过滤，最后用超速离心机150000rpm离心1.5h，收集外泌体浓缩液进行定量，最后用0.22μm滤膜过滤，分装备用。
9.如权利要求1所述一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，其特征在于：按体积包括1mL富血小板血浆、2mL干细胞外泌体、7mL生理盐水。
10.如权利要求1所述一种基于PRP与干细胞外泌体的面部修复注射剂，其特征在于：按体积包括1mL富血小板血浆、5mL干细胞外泌体、4mL生理盐水。
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