CN117683711B - 干细胞或者转基因干细胞的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供干细胞或者转基因干细胞的应用，具体为在制备干细胞凝胶液或组织工程软骨上的应用。最终获得的干细胞凝胶液或组织工程软骨移植物表达的活性蛋白能够诱导宿主组织的干细胞向软骨细胞分化，加速干细胞凝胶液或组织工程软骨移植物与宿主组织的整合。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及干细胞或者转基因干细胞的应用。
背景技术
软骨损伤是骨科常见的临床疾病，常发生于关节扭伤、局部受到外力撞击等情况，其病理特征为关节软骨变性、破坏、软骨下骨硬化、关节边缘及软骨下骨反应性增生、骨赘形成。目前临床上对软骨损伤的治疗方法主要有以下7种，具体方法及其缺陷为：
1、姑息性治疗：也称关节清洗术，为临床常用方法，主要是将损坏的软骨剔除，不替换损伤的软骨。其缺陷为：仅是清除损伤软骨碎片和剔除赘肉，改善运动能力缓解症状，减轻痛苦，属于保守治疗，对软骨损伤没有修复作用，疗效很差。
2、修复性治疗：也称微骨折技术，为临床常用方法，对缺损区软骨进行清理，在软骨下骨上钻孔致使血液形成血凝块，诱发来源于骨髓的干细胞自发性修复。其缺陷为：仅是用纤维组织填充损伤部位并未修复软骨，疗效较差。
3、人工关节置换手术：为临床常用方法，人造金属或非金属关节手术置换。其缺陷为：与人关节差距较大，移植后人工关节置与人体接合部位难以整合好，依然存在不同程度的疼痛问题，患者依然比较痛苦，而且假体感染、松动、折断、脱位风险较大。
4、自体软骨细胞移植（ACI）：临床效果不尽如人意，是取自体软骨组织移植到损伤部位。其缺陷为：需两次关节手术，是以伤治伤，需至少两次、两个关节部位手术；软骨细胞数量少，细胞易老化，细胞表型易改变；属于个体治疗，不能形成市售产品大面积推广。
5、自体软骨细胞体外培养的工程软骨移植：同样临床效果不尽如人意，如美国批准上市的MACI产品。其缺陷同“4”。
6、同种异体软骨移植（OCA）：很少用于临床，是取自其他人的软骨移植。其缺陷为：供体来源困难，几乎无法实现，以造成别人的伤治疗自己的伤。
7、异体脐带血间充质干细胞植入：由于较高的临床风险，很少用于临床，如韩国批准上市的Cartistem产品。其缺陷为：软骨损伤部位植入的是脐带血间充质干细胞，其在软骨损伤部位转化成软骨细胞的数量有限，虽然表现出了较好的软骨再生效果，但达不到完全修复的目的，并且还存在未知的异体反应。
上述7种方法中，治疗方法1～3属于国内外应用较多的传统治疗方法，对软骨损伤没有修复作用，治疗效果均不理想，属于保守性、改善性治疗，存在很多弊端。治疗方法4～7属于现代生物治疗方法，疗效比传统治疗方法有很大改进，能够部分修复损伤软骨，但也存在不良反应偏大、整合度低、不能完全修复软骨损伤、不能实现完全治疗等弊端。
此外，曲福军等利用转BMP7基因软骨细胞以胶原-纤维蛋白凝胶为三维支架材料，构建了转BMP7基因组织工程软骨（曲福军，侯宜，刘丽玲，等.应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨[J].中国组织工程研究，2006，10（13）：59-61），以及，应用转染BMP7基因组织工程软骨移植修复兔膝关节软骨缺损（曲福军，孙华，冯念苹，等.应用转染BMP7基因组织工程软骨修复兔膝关节软骨缺损观察[J].中国组织工程研究，2008，27（1）：48-52），该移植修复软骨损伤方法存在着组织工程软骨组织种子细胞来源受限，不适合较大面积的软骨损伤修复治疗，种子细胞无论是来源于自体还是异体都是以伤治伤，也不适合于较大规模的工厂化生产。因此，难于作为药品应用于临床。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供干细胞或者转基因干细胞在软骨损伤治疗方面的应用，以解决现有组织工程软骨的种子细胞来源不足、体外不能大量扩增和扩增后易老化、以及组织工程软骨移植物与宿主组织的整合等系列问题。本发明的技术方案为：
本发明提供干细胞或者转基因干细胞在制备干细胞凝胶液或组织工程软骨上的应用。
优选地，所述干细胞来自脐带血、脐带、胎盘、骨髓或者脂肪，进一步优选地，所述干细胞为脐带血间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
优选地，所述基因选自：骨形成蛋白（BMP）基因、TGFβ基因及SOX9基因中的至少一种；所述BMP基因优选为BMP7和/或BMP2。
优选地，应用干细胞制备干细胞凝胶液或者构建组织工程软骨的方法，包括：
步骤一，干细胞的分离与培养；
步骤二，采用活性蛋白诱导干细胞进行分化培养；
步骤三，将步骤二获得的干细胞制备干细胞凝胶液，或者将步骤二获得的干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨。
优选地，应用转基因干细胞制备干细胞凝胶液或者构建组织工程软骨的方法，包括：
步骤1，构建含有目的基因的重组质粒；
步骤2，干细胞的分离与培养；
步骤3，采用步骤1构建的重组质粒转染步骤2培养的干细胞，获得目的基因转染的干细胞；
步骤4，采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养；
步骤5，将步骤4获得的干细胞制备干细胞凝胶液，或者将步骤4获得的干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨。
优选地，所述步骤1中构建含有目的基因的重组质粒，包括：
步骤1-1，获取pBlue-目的基因质粒；
步骤1-2，将pBlue-目的基因质粒进行双酶切并提取纯化；
步骤1-3，将pcDNA3.1载体进行双酶切并提取纯化；
步骤1-4，将步骤1-2获得的酶切基因片段与步骤1-3获得的酶切DNA片段连接，得到pcDNA3.1-目的基因载体质粒；
步骤1-5，将pcDNA3.1-目的基因载体质粒转化至DH5a感受态细胞中，并进行扩增，扩增产物提取纯化，即得。
优选地，所述目的基因选自：骨形成蛋白（BMP）基因、TGFβ基因及SOX9基因中的至少一种；所述BMP基因优选为BMP7和/或BMP2。
优选地，所述步骤一或者所述步骤2中采用的干细胞来自脐带血、脐带、胎盘、骨髓或者脂肪，进一步优选地，所述干细胞为脐带血间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。
优选地，所述干细胞的分离与培养过程包括：
步骤2-1，将获得的干细胞来源组织加入DMEM培养液，混匀后离心；
步骤2-2，离心液去除脂肪层后与密度为1.073g/ml的percoll分离液按照体积比1︰2混匀后离心；
步骤2-3，将单核细胞分离出来后依次洗涤，加入干细胞培养液悬浮细胞，以5×106个/ml细胞密度接种于培养瓶中，接种体积3ml，置于5% CO2，37℃条件下培养3-4天后弃除未贴壁细胞，更换新鲜培养液继续培养7-10天；
步骤2-4，采用0.25%胰蛋白酶液消化培养瓶中的细胞，依次洗涤后，加入干细胞培养液悬浮细胞，以5×104个/ml密度接种于培养瓶中进行传代培养，传代培养2～5代备用，传代培养期间每传代一次更换干细胞培养液。
优选地，所述DMEM培养液和所述干细胞培养液中均含有终浓度为10%（v/v）的小牛血清（FBS）和150u/mL的肝素。
优选地，所述步骤二中活性蛋白诱导干细胞进行分化培养或者所述步骤4中活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养，包括：
向含有干细胞或者目的基因转染的干细胞的分化培养液中加入活性蛋白，于5%CO2、37℃条件下培养，培养3~5代备用，每培养一代更换相同的分化培养液。
优选地，所述分化培养液为DMEM培养液。
优选地，所述活性蛋白为以下成分中的至少一种：TGFβ、富含血小板血浆、SOX9；进一步优选地，所述活性蛋白为以下成分中的至少两种：TGFβ、富含血小板血浆、SOX9。
进一步优选地，所述活性蛋白由TGFβ、富含血小板血浆、SOX9组成，各组分在分化培养体系中的终浓度为：TGFβ，4.0~16.0μg/L；富含血小板血浆，0.5~2.0%，v/v；SOX9，2.5~10μg/L；更为优选地，所述活性蛋白按照各组分在分化培养体系中的终浓度组成为：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v； SOX9，2.5μg/L。
优选地，所述步骤三或者所述步骤5中，干细胞制备干细胞凝胶液的过程包括：
将干细胞加入到生理盐水中制备成0.5×107~1×107个/ml的细胞悬液，再将透明质酸钠加入到质量浓度为1.5%~2.5%白蛋白生理盐水溶液中制备透明质酸钠凝胶液，将透明质酸钠凝胶液与细胞悬液按照体积比为1︰0.5~2混合，获得干细胞凝胶液。
优选地，所述步骤三或者所述步骤5中，干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨，包括：
将前一步骤获得的干细胞制备成含2.5×106~5×106个干细胞的Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架，加入含有所述活性蛋白的DMEM细胞培养液，于5% CO2、37℃条件下培养，每7天更换一次含活性蛋白的DMEM细胞培养液，连续培养20~24天，获得组织工程软骨。
优选地，所述含2.5×106~5×106个干细胞的Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架的制备方法为：将Ⅲ型胶原蛋白溶液和前一步骤获得的干细胞悬液混合，加入纤维蛋白蛋原溶液，再加入凝血酶，混合均匀后放置8~12h，再于5% CO2、37℃条件下培养14~21天，即得。
优选地，所述活性蛋白在DMEM细胞培养液中的终浓度组成为：TGFβ，4.0~16.0μg/L；富含血小板血浆，0.5~2.0%，v/v；SOX9，2.5~10μg/L；更为优选地，所述活性蛋白在DMEM细胞培养液中的终浓度组成为：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v；SOX9，2.5μg/L。
本发明进一步提供上述应用获得的干细胞凝胶液或组织工程软骨。
本发明还提供上述干细胞凝胶液或上述组织工程软骨在制备骨移植物上的应用。
本发明解决了干细胞凝胶液或组织工程软骨的种子细胞来源不足、体外不能大量扩增以及扩增后易老化等问题，具有重要的科学意义。所获得的干细胞凝胶液或组织工程软骨具有足够数量的功能正常的种子细胞，以及具有调节种子细胞增殖并维持其表型稳定的功能。
此外，本发明还解决了干细胞凝胶液或组织工程软骨移植物与宿主组织的整合问题。本发明的干细胞凝胶液或组织工程软骨移植物表达的活性蛋白能够诱导宿主组织的干细胞向软骨细胞分化，加速干细胞凝胶液或组织工程软骨移植物与宿主组织的整合。该技术有望在人体上进一步实施，目前正在开展临床前研究工作，取得临床研究批件后会开展临床研究。
附图说明
图1为本发明实施例1中pCDNA3.1质粒图及NotⅠ和KpnⅠ双酶切部位。
图2为本发明实施例1中脐带血间充质干细胞原代培养7天的细胞形态图。
图3为本发明实施例1中脐带血间充质干细胞传一代培养7天的细胞形态图。
图4为本发明实施例1中脐带血间充质干细胞传二代培养7天的细胞形态图。
图5为本发明实施例1中脐带血间充质干细胞传三代培养7天的细胞形态图。
图6为本发明实施例1中采用含G418的MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液连续筛选28天的细胞生长图，其中，图6-1为转染BMP7细胞组的细胞生长图，图6-2为未转染BMP7细胞组的细胞生长图。
图7为本发明实施例1中3D空白支架形态图。
图8为本发明实施例1中转BMP7基因但不加混合诱导因子的软骨形态图。
图9为本发明实施例1中未转BMP7基因但加混合诱导因子软骨形态图。
图10为本发明实施例1中转BMP7基因加混合诱导因子软骨形态图。
图11为本发明实施例2中兔膝关节软骨缺损模型图。
图12为本发明实施例2中模型组修复8周效果图。
图13为本发明实施例2中3D支架组修复8周效果图。
图14为本发明实施例2中转BMP7基因组修复8周效果图。
图15为本发明实施例2中转BMP7基因加混合诱导因子组修复8周效果图。
图16为本发明实施例3中兔膝关节软骨缺损模型图。
图17为本发明实施例3获得的组织工程软骨修复8周效果图。
图18为本发明实施例4中空白注射液形态图。
图19为本发明实施例4中转BMP7基因但不加混合诱导因子干细胞凝胶液形态图。
图20为本发明实施例4中转BMP7基因加混合诱导因子干细胞凝胶液形态图。
图21为本发明实施例4中兔膝关节软骨缺损模型图。
图22为本发明实施例4中模型组修复8周效果图。
图23为本发明实施例4中空白凝胶液组修复8周效果图。
图24为本发明实施例4中转BMP7基因干细胞凝胶液组修复8周效果图。
图25为本发明实施例4中转BMP7基因加混合诱导因子干细胞凝胶液组修复8周效果图。
图26为本发明实施例5中脐带血间充质干细胞加混合诱导因子干细胞凝胶液形态图。
图27为本发明实施例5中兔膝关节软骨缺损模型图。
图28为本发明实施例5中干细胞凝胶液组修复8周效果图。
图29为本发明实施例6中兔膝关节软骨缺损模型图。
图30为本发明实施例6获得的骨髓间充质干细胞凝胶液修复8周效果图。
图31为本发明实施例6获得的转染BMP7目的基因骨髓间充质干细胞细胞构建的组织工程软骨修复8周效果图。
具体实施方式
在本发明实施例中，pBlue-BMP7质粒购自ATCC 公司。
在本发明实施例中，pcDNA3.1载体购自上海博亚生物技术有限公司。
在本发明实施例中，干细胞培养液为MesenCult MSC Basal Medium培养液，购自上海华雅思创生物科技有限公司。该干细胞培养液适用于骨髓、脐带、脐带血、胎盘、脂肪干细胞培养。
此外，本发明采用的干细胞不限定动物来源，针对某类动物软骨损伤，优选采用同类动物体干细胞，比如，本发明实施例部分采用的实验动物为家兔，因此干细胞来源也为家兔。
在本发明实施例中，转染培养液为OPTI-MEMTM I Reduced Serum Medium，购自上海觅拓生物科技有限公司。
在本发明实施例中，TGFβ购自美国Promega 公司，富含血小板血浆购自上海沪峥生物科技有限公司，SOX9购自上海沪峥生物科技有限公司。
在本发明实施例中，Ⅲ型重组胶原蛋白购自山西南坝生物科技有限公司。
在本发明实施例中，透明质酸钠购自艾伟拓（上海）医药科技有限公司。
在本发明实施例中，软骨细胞的分离与体外培养方法为：2w龄的大耳纯白家兔，无菌条件下分离膝关节软骨，加入0.1％Ⅱ型胶原酶消化，消化液离心后弃去上清，加入含10％（v/v）小牛血清的DMEM培养液悬浮细胞，以5×104个/mL接种于培养瓶中培养7天，且细胞汇合率达80%～90%时，传代培养3代，约21天，备用。DMEM培养液购自黑龙江久丰生物工程有限公司。
在本发明实施例中，大耳纯白家兔和仔兔均购自哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了应用转基因干细胞制备干细胞凝胶液或构建组织工程软骨的方法，所述转基因干细胞含有用于诱导干细胞转化成软骨细胞的目的基因，这些目的基因可以为BMP7、BMP2、TGFβ及SOX9中的至少一种。优选为BMP7和/或BMP2。
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。此外，以下实施例仅是对本发明进行说明，而非对本发明的限制。
实施例1
本实施例提供一种应用转基因脐带血间充质干细胞构建组织工程软骨的方法，具体包括：
步骤1，构建含有目的基因BMP7的重组质粒；具体包括：
步骤1-1，将pBlue- BMP7质粒进行双酶切并提取纯化；
取pBlue-BMP7原核表达载体质粒用NotⅠ和KpnⅠ双酶切，反应体系为：pBlue-BMP75μl、NotⅠ0.5μl、KpnⅠ0.5μl、10×Buffer 2μl，蒸馏水12μl，反应总体积20μl。反应条件为：37℃，水浴2小时。酶切反应产物20μl进行琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察分离的DNA片段。用手术刀切下紫外灯观察到的约1.3Kb DNA片段，按胶回收试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）说明书方法提取纯化BMP7基因DNA片段。-20℃冰箱保存。备用。
步骤1-2，将pcDNA3.1载体进行双酶切并提取纯化；
取pcDNA3.1（+）真核表达载体，用NotⅠ和KpnⅠ双酶切，反应体系为：pcDNA3.1（+）5μl（约500ng）、NotⅠ0.5μl、KpnⅠ0.5μl、10×Buffer 2μl、蒸馏水12μl，反应总体积20μl。反应条件为：37℃水浴2小时。反应结束后，取酶切产物20μl进行琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察分离的DNA片段。用手术刀切取紫外灯观察到的约5.4Kb的DNA片段，按胶提取纯化试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）说明书方法提取纯化pcDNA3.1真核表达载体DNA片段，-20℃冰箱保存，备用。酶切部位是912～970，如图1所示。
步骤1-3，将步骤1-2获得的酶切基因片段与步骤1-3获得的酶切DNA片段连接，得到pcDNA3.1- BMP7载体质粒；
取步骤1-2提取纯化的BMP7酶切基因和pcDNA3.1真核表达载体的DNA片段，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，反应体系为：BMP7 6μl、pcDNA3.1 2μl、10×Buffer 1μl、T4DNA连接酶0.5μl、蒸馏水0.5μl，反应体系总体积10μl。反应条件为：6℃水浴8小时。连接产物-20℃冰箱保存，备用。
步骤1-4，将pcDNA3.1- BMP7载体质粒转化至DH5a感受态细胞中，并进行扩增，按质粒提取试剂盒（上海博亚生物技术有限公司）说明书方法提取纯化pcDNA3.1- BMP7载体质粒，并进行pcDNA3.1-BMP7载体质粒中目的基因BMP7的测序鉴定。测序方法：以pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒为模板，用T3（5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’）和T7（5’-ATTAAC CCT CAC TAA AG-3’）测序引物进行2个PCR扩增反应，反应产物测序，利用计算机软件对以上两个反应的测序结果进行拼接（由上海博亚生物技术有限公司测定）。结果为：拼接得到的DNA序列与gene bank报道的基因的BMP7基因全长序列完全一致，无突变发生。
步骤2，干细胞的分离与培养；具体包括：
步骤2-1，仔兔出生后即刻采集脐带血，置于3.8%枸橼酸钠抗凝无菌管中，取脐带血2~3ml，移入含10ml DMEM培养液的50ml无菌离心管中，300g离心5min；DMEM培养液中还含有10％（v/v）的FBS和150u/ml的肝素；
步骤2-2，离心液吸去上层脂肪层及部分上清后，按1︰2的比例加在密度为1.073g/ml的percoll分离液上，900g离心30min；
步骤2-3，将中层单核细胞分离出来后依次洗涤，加入MesenCult MSC BasalMedium干细胞培养液悬浮细胞，以5×106个/ml细胞密度接种于培养瓶中，接种体积3ml，置于5% CO2，37℃培养箱中培养。培养3-4天后用 PBS液冲洗3次，弃除未贴壁细胞、更换MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液继续培养，约7天原代细胞铺满培养瓶底，结果如图2所示。
上述MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液中还含有终浓度分别为10%（v/v）的小牛血清（FBS）和150u/mL的肝素。
步骤2-4，采用0.25%的胰蛋白酶液消化培养液，并以5×104个/ml密度接种于MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液，接种细胞为一代（P1），继续培养传代，约7天传代1次，并依次标注为P2、P3代细胞。原代脐带血间充质干细胞接种12h后部分细胞开始贴壁，刚贴壁的细胞呈圆形并逐渐伸出伪足，形成细胞连接，细胞呈现纺锤形或梭形的成纤维细胞外观。细胞核居中，可出现2个核或多核。贴壁之后，细胞体积增大，克隆形成并有突起伸出，部分细胞呈三角或多角形，细胞反光性能好，立体感强。培养3天换液后，细胞形态以梭形多见，少量呈多角形，伪足形成细胞连接，构成克隆团样细胞群，细胞多呈细的长梭形，同心圆放射分布，无接触抑制现象，细胞平行排列或漩涡状生长。培养7天细胞融合率可达95%以上。P1代细胞可形成集落和原代培养形成的集落类似，P2代细胞较少形成集落，从P3带细胞开始不在形成集落。随着传代次数增多，贴壁能力增强，适应性提高，传代后很快贴壁、增殖，形态扁平，细胞反光性能和立体感减弱。结果如图3-5所示。
步骤3，采用步骤1构建的重组质粒转染步骤2培养后的干细胞，获得目的基因转染的干细胞（转染BMP7细胞组）；同时设定未转染BMP7细胞组，具体如下：
转染BMP7细胞组：取无菌A和B试管。A管：分别加入250μl转染培养液和 pcDNA3.1-BMP7质粒1.5μl，混匀；B管：分别加入250μl转染培养液和10μl LipofectaminTM 2000脂质体（购自Gibco），混匀。静置5分钟；DNA-脂质体复合物的形成：A和B试管所盛溶液合并，轻轻混匀，静止20min。弃去六孔板中处于P3指数增殖期的MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液，每孔加无血清的高糖DMEM培养液500μl和DNA-脂质体复合物500μl，轻轻混匀六孔板，放置于5% CO2，37℃培养箱中培养。6小时后弃去无血清的高糖DMEM培养液和DNA-脂质体复合物，加2ml的MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液培养。转染24小时后，更换含350μg/ml G418的MesenCult MSC Basal Medium干细胞培养液进行筛选，每4天换筛选液1次，于镜下观察细胞活性与生长状态。分别于筛选后7、14、28天取培养液适量用于BMP7表达的检测。
未转染BMP7细胞组：参照上述转染BMP7细胞组的方法，与转染BMP7细胞组不同的是：A管：分别加入250μl转染培养液和 pcDNA3.1质粒1.5μl，混匀；其他步骤与转染BMP7细胞组相同，分别于筛选后7、14、28天取培养液适量用于BMP7表达的检测。
所有试验组设定5个平行样，BMP7表达量取5个平行样测定值的均值。
ELISA方法检测培养7天、14天和28天BMP7的表达。结果为：转染BMP7细胞组和未转染BMP7细胞组连续筛选28天仍有细胞生长（见图6-1和图6-2），该细胞为转染pcDNA3.1-BMP7质粒细胞，转染BMP7基因细胞BMP7表达量明显增高（p<0.05）（见表1），由此判断该转染为稳定转染。
表1 BMP7表达的平均值（pg/ml，n=5）
步骤4，活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养；
本步骤还考察了不同活性蛋白诱导转染BMP7基因的干细胞向软骨细胞分化的试验结果，具体试验过程如下：
（1）本发明找寻了3种活性蛋白：TGFβ、富含血小板血浆及SOX9，并分别采用TGFβ、富含血小板血浆及SOX9单独诱导含转染BMP7基因干细胞向软骨细胞分化。
具体方法为：取96孔培养板，每孔分别加入1×105个/ml的含有转染pcDNA3.1-BMP7质粒的干细胞100μl，放置于5% CO2，37℃培养箱中培养，培养24小时后，弃去培养液。分别加入3种活性蛋白，并且每种活性蛋白都设定不同浓度，采用DMEM培养液稀释，具体为：TGFβ（4μg/l、10μg/l和16μg/l）DMEM培养液、富含血小板血浆（0.5%、1.0%和2.0%）的DMEM培养液及SOX9（2.5μg/l、5μg/l和10μg/l）的DMEM培养液，每个诱导因子的每个浓度均设3个复孔。另设软骨细胞对照孔（软骨细胞的分离与体外培养详见上文，不转染BMP7基因，也不加诱导因子，只加DMEM培养液）、干细胞对照孔（步骤2获得的干细胞，不转染BMP7基因，也不加诱导因子，只加DMEM培养液）、含转染BMP7基因干细胞对照孔（不加活性蛋白，只加DMEM培养液）、不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白孔（步骤2获得的干细胞，不转染BMP7基因，只加含活性蛋白的DMEM培养液）及空白对照孔（不加任何细胞，只加含活性蛋白的DMEM培养液）。将所有培养孔于培养箱中培养，分别于培养7天（P1代）、14天（P2代）及21天（P3代）取培养液测定胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖含量。胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖的测定方法均为ELISA法，该方法为本领域测定胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖的常规方法，这里不作详细解释。试验结果如表2和表3所示，表明：①TGFβ组、富含血小板血浆组及SOX9组均可使转染BMP7基因的干细胞分泌胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖的量增加，均明显高于不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组、干细胞对照组和含转染BMP7基因干细胞对照组。TGFβ组和SOX9组的中剂量作用达到平台（达到平台即中剂量组与高剂量组比较无差异），而富含血小板血浆组的高剂量作用最强；②不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌增加，明显高于含转染BMP7基因干细胞对照组及干细胞对照组；③含转染BMP7基因干细胞对照组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌增加，明显高于干细胞对照组；④不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组、干细胞对照组、含转染BMP7基因干细胞对照组、含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌水平均低于软骨细胞对照组。从上述结果判断本发明的转染BMP7基因干细胞表达的BMP7蛋白可诱导干细胞向软骨细胞分化，且在此基础上添加TGFβ、富含血小板血浆及SOX9诱导因子诱导干细胞向软骨细胞分化。TGFβ、富含血小板血浆及SOX9的最佳诱导浓度分别为10.0μg/l、2%和5.0μg/l。
表2 为各组胶原蛋白Ⅱ分泌的平均值（ng/ml）
表3 为各组糖胺多糖分泌水平的平均值（μg/ml）
（2）在（1）试验结果的基础上，进一步考察以TGFβ+富含血小板血浆、TGFβ+SOX9及富含血小板血浆+SOX9联合诱导含转染BMP7基因干细胞向软骨细胞分化的试验结果。
具体方法为：取96孔培养板，每孔分别加入1×105个/ml的含有转染pcDNA3.1-BMP7质粒的干细胞100μl，放置于5% CO2，37℃培养箱中培养，培养24小时后，弃去培养液。分别加入3种用DMEM培养液稀释的含有TGFβ和富含血小板血浆的混合培养液、含有TGFβ和SOX9的混合培养液及含有富含血小板血浆和SOX9的混合培养液。TGFβ和富含血小板血浆的混合培养液包括3种不同浓度组成，具体为：①混合培养液中TGFβ浓度为10.0μg/l，富含血小板血浆浓度为2%；②混合培养液中TGFβ浓度为10.0μg/l，富含血小板血浆的浓度为1%；③混合培养液中TGFβ浓度为4.0μg/l（由于中剂量组与高剂量组比较无差异，中剂量组作用达到平台，因此选择中剂量组以下的浓度进行筛选，下同），富含血小板血浆浓度为2%。TGFβ和SOX9的混合培养液包括3种不同浓度组成，具体为：①混合培养液中TGFβ浓度为10.0μg/l，SOX9浓度为5.0μg/l；②混合培养液中TGFβ浓度为10.0μg/l，SOX9浓度为2.5μg/l；③混合培养液中TGFβ的浓度为4.0μg/l，SOX9浓度为5.0μg/l。富含血小板血浆和SOX9的混合培养液包括3种不同浓度组成，具体为：①混合培养液中富含血小板血浆的浓度为2%，SOX9浓度为5.0μg/l；②混合培养液中富含血小板血浆浓度为2%，SOX9浓度为2.5μg/l；③混合培养液中中富含血小板血浆浓度为1%，SOX9浓度为5.0μg/l。每种混合培养液的每个组合均设3个复孔。另设软骨细胞对照孔（情况同（1））、干细胞对照孔（情况同（1））、含转染BMP7基因干细胞对照孔（情况同（1））、不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白孔（情况同（1））及空白对照孔（情况同（1））。将所有培养孔于培养箱中培养，分别于培养7天（P1代）、14天（P2代）及21天（P3代）取培养液测定胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖含量。胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖的测定方法均为ELISA法。结果如表4和表5所示，表明：①TGFβ+富含血小板血浆组、TGFβ+SOX9组及富含血小板血浆+SOX9组均可使转染BMP7基因的干细胞分泌胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖量进一步增加，均明显高于不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组、干细胞组和含转染BMP7基因干细胞组。混合培养液TGFβ（10.0μg/l）+富含血小板血浆（1%）及TGFβ（10.0μg/l）+SOX9（2.5μg/l）作用达到平台，而富含血小板血浆的浓度（2%）+SOX9（5.0μg/l）作用最强；②不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌增加，明显高于含转染BMP7基因干细胞对照组及干细胞对照组。混合培养液TGFβ（10.0μg/l）+富含血小板血浆（1%）及TGFβ（10.0μg/l）+SOX9（2.5μg/l）作用达到平台，而富含血小板血浆的浓度（2%）+SOX9（5.0μg/l）作用最强；③含转染BMP7基因干细胞对照组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌增加，明显高于干细胞对照组；④干细胞对照组、含转染BMP7基因干细胞对照组、不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组、含转染BMP7基因加活性蛋白组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌水平均低于软骨细胞组。从上述结果判断本发明的转染BMP7基因干细胞表达的BMP7蛋白可诱导干细胞向软骨细胞分化，且在此基础上添加混合诱导因子TGFβ+富含血小板血浆、TGFβ+SOX9及富含血小板血浆+SOX9均能诱导干细胞向软骨细胞分化。TGFβ和富含血小板血浆组合的最佳诱导浓度分别为10.0μg/l和1%；TGFβ和SOX9组合的最佳诱导浓度分别为10.0μg/l和2.5μg/l；富含血小板血浆和SOX9组合的最佳诱导浓度分别为2和5.0μg/l。
表4 为各组胶原蛋白Ⅱ分泌的平均值（ng/ml）
表5 为各组糖胺多糖分泌水平的平均值（μg/ml）
（3）在（2）试验结果的基础上，进一步考察以TGFβ+富含血小板血浆+SOX9联合诱导含转染BMP7基因干细胞向软骨细胞分化。具体方法为：取96孔培养板，每孔分别加入1×105个/ml的含有转染pcDNA3.1-BMP7质粒的干细胞100μl，放置于5% CO2，37℃培养箱中培养，培养24小时后，弃去培养液。分别加入3种用DMEM培养液稀释的含有TGFβ、富含血小板血浆和SOX9不同浓度组成的混合培养液。混合培养液具体为：①混合培养液中TGFβ浓度为10.0μg/l，富含血小板血浆的浓度为2%，SOX9浓度为5.0μg/l；②混合培养液中TGFβ浓度为10.0μg/l，富含血小板血浆浓度为1%，SOX9浓度为2.5μg/l；③混合培养液中TGFβ浓度为4.0μg/l，富含血小板血浆的浓度为2%，SOX9浓度为5.0μg/l。混合培养液的每个组合均设3个复孔。另设软骨细胞对照孔（情况同（1））、干细胞对照孔（情况同（1））、含转染BMP7基因干细胞对照孔（情况同（1））、不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白孔（情况同（1））及空白对照孔（情况同（1））。将所有培养孔于培养箱中培养，分别于培养7天（P1代）、14天（P2代）及21天（P3代）取培养液测定胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖含量。胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖的测定方法均为ELISA法。结果如表6和表7所以，表明：①TGFβ+富含血小板血浆+SOX9混合培养可使转染BMP7基因的干细胞分泌胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖量显著增加，均明显高于不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组、干细胞组和含转染BMP7基因干细胞组。混合培养液TGFβ（10.0μg/l）+富含血小板血浆（1%）+SOX9（2.5μg/l）作用达到平台，与软骨细胞的分泌水平无差异，为最佳诱导组合；②不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌增加，明显高于含转染BMP7基因干细胞对照组及干细胞对照组。混合培养液TGFβ（10.0μg/l）+富含血小板血浆（1%）+SOX9（2.5μg/l）作用达到平台，略低于软骨细胞的分泌水平，为最佳诱导组合；③含转染BMP7基因干细胞对照组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌增加，明显高于干细胞组；④干细胞对照组、含转染BMP7基因干细胞对照组、不含转染BMP7基因干细胞加活性蛋白对照组、含转染BMP7基因加活性蛋白的TGFβ（4.0μg/l）+富含血小板血浆（2%）+SOX9（5.0μg/l）组的胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌水平均低于软骨细胞组。从上述结果判断本发明的转染BMP7基因干细胞表达的BMP7蛋白可诱导干细胞向软骨细胞分化，且在此基础上添加TGFβ+富含血小板血浆+SOX9混合诱导因子能显著诱导干细胞向软骨细胞分化。TGFβ+富含血小板血浆+SOX9组合最佳诱导浓度分别为10.0μg/l、1%和2.5μg/l。
表6 为各组胶原蛋白Ⅱ分泌的平均值（ng/ml）
表7 为各组糖胺多糖分泌水平的平均值（μg/ml）
因此，本发明活性蛋白按照各组分在分化培养体系中的终浓度组成为：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v；SOX9，2.5μg/L。
步骤5，将步骤4采用终浓度组成为：TGFβ，10.0μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v；SOX9，2.5μg/L的活性蛋白诱导获得的干细胞进行体外构建Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨（转染目的基因+诱导因子组和不转染目的基因+诱导因子组）。同时设定空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架组和转染目的基因组，具体包括：
转染目的基因+诱导因子组：将1×107个/ml转染目的基因且活性蛋白诱导的干细胞（步骤4获得）构建成约含2×106个细胞的Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架，于37℃，5%CO2培养箱中培养12小时，使细胞均匀分布于支架的空间内，并充分与支架材料结合。将含有干细胞的Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架从12孔培养板移入6孔培养板中，加入3ml含混合活性蛋白[终浓度组成为：TGFβ1（10.0μg/l）+富含血小板血浆（1%）+SOX9（2.5μg/l）]以及含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养，每3天更换一次培养液，分别于培养0、7、14天后进行外观观察及ELISA法测定胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌。
未转染目的基因+诱导因子组：与转染目的基因+诱导因子组区别在于所用细胞为1×107个/ml未转染目的基因且活性蛋白诱导的干细胞（步骤4获得）。
空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架组：将在12孔培养板中制备的不含细胞的空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架，移入放置在6孔培养板中，加入DMEM培养液，分别于培养0、7、14天后进行外观观察及ELISA法测定胶原蛋白Ⅱ和糖胺多糖分泌。
转染目的基因组：与转染目的基因+诱导因子组的区别在于无步骤4采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养的过程，直接采用步骤3获得的目的基因转染的干细胞进行步骤5，操作同转染目的基因+诱导因子组。
含2×106个干细胞的Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架的制备方法为：分别取200mg/mlⅢ型重组胶原蛋白溶液（溶剂为注射用生理盐水）1ml和约1×107个/ml干细胞悬液0.5ml置于12孔培养板中；分别缓慢滴入40mg/ml的纤维蛋白蛋原溶液0.8ml混合均匀，再滴入1000U/ml凝血酶0.2ml；摇床快速混合均匀；培养12h后移入6孔培养板中培养14天。最终得约含2×106个干细胞的Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架。空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架制法与上述方法基本相同，不同的是1×107个/ml干细胞悬液0.5ml用PBS溶液0.5ml替代。
实验结果为：空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架组为暗白色，无细胞填充（如图7所示），也无胶原蛋白Ⅱ和糖胺聚糖分泌；转BMP7基因组软骨为白色，呈现类软骨组织状（如图8所述），胶原蛋白Ⅱ和糖胺聚糖分泌明显增加；未转染目的基因加诱导因子组软骨为白色，呈现类软骨组织状（如图9所述），胶原蛋白Ⅱ和糖胺聚糖分泌水平明显高于转BMP7基因组；转染目的基因组加诱导因子组为白色，呈现类软骨组织状，结构较致密（如图10所示），胶原蛋白Ⅱ和糖胺聚糖分泌水平明显高于转染目的基因组和未转染目的基因加诱导因子组。胶原蛋白Ⅱ和糖胺聚糖分泌水平如表8和表9所示。因此，转染目的基因组加诱导因子为构建软骨组织的最佳方法。
表8 胶原蛋白Ⅱ分泌的平均值（ng/ml）
表9 各组糖胺聚糖分泌的平均值（μg/ml）
实施例2
利用实施例1中转染BMP7目的基因结合三种成分复配（TGFβ（10.0μg/L）+富含血小板血浆（1%，v/v）+SOX9（2.5μg/L）的活性蛋白诱导因子以及体外构建Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架的软骨组织的技术路线构建组织工程软骨构件（转BMP7基因加混合诱导因子组）。并设定模型组、空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架组、转BMP7基因组进行如下动物对比试验：
取健康大耳纯白家兔36只，体重20～2.5kg，雄性，随机分为4组，每组9只。实验分为模型组、空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架组、转BMP7基因组和转BMP7基因加混合诱导因子组。
软骨损伤模型制造方法为：用1%巴比妥钠，按30mg/kg体重兔耳缘静脉注射，麻醉后固定于操作台上。于髌骨内侧切口，将髌骨外侧离位，暴露股骨远端髌骨面的关节软骨，用骨科用手动钻孔器在关节软骨表面造成直径为5.0mm、深达软骨下骨板、有少量血渗出的全层软骨缺损，用生理盐水冲冼清除组织碎屑和血块，获得家兔软骨损伤模型（如图11所示）。
模型组：家兔软骨损伤模型部位不作任何处理；
空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架组：软骨损伤模型部位填充空白Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架；
转BMP7基因组：软骨损伤模型部位填充含转染BMP7基因经体外培养14天的软骨组织；含转染BMP7基因经体外培养14天的软骨组织的详细获得方法为：参照实施例1的步骤1-3构建重组质粒并转染步骤2的干细胞，获得转染BMP7的细胞，然后将该细胞直接构建成Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架，体外构建Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架同实施例1中步骤5的转染目的基因组，获得软骨组织。
转BMP7基因加混合诱导因子组：软骨损伤模型部位填充含转染BMP7基因+活性蛋白诱导因子经体外培养14天的软骨组织（即实施例1中转染目的基因+诱导因子组的体外培养方法获得的软骨组织）。
将各个实验组做各自处理后，将家兔髌骨复位，缝合膝关节和皮肤。术后将家兔送回饲养笼内饲养，术后不固定后肢，任其自由活动。于移植后8周，安乐死家兔，取出移植部位的关节，评价软骨损伤修复作用。术后8周结果如图12-15所示（每个试验组只给出其中1只的效果图，相同试验组的结果大同小异），表明：模型组中家兔软骨缺损底部呈深红色，创面凹陷，与正常组织界线分明，9只动物软骨损伤均未修复，造模成功（如图12所示）；3D支架组填充物与正常关节面比略低，移植物部位中间呈白色，周围呈深红色，与周边正常关节软骨界线清楚，9只动物软骨损伤均未修复，3D支架对软骨损伤无修复作用（如图13所示）；转BMP7基因组中家兔软骨缺损部位由乳白色移植物填充，与正常关节比颜色较浅，修复组织关节与关节面等高，无间隙和裂痕，与周围组织整合良好，9只动物软骨损伤均获得修复，转BMP7基因组对软骨损伤有明显的修复作用（如图14所示）；转BMP7基因加混合诱导因子组家兔软骨缺损部位由类软骨色移植物填充，与正常关节比颜色差别较小，修复组织关节与关节面等高，与周围正常关节软骨有界限，无间隙和裂痕，与周围组织完全整合，9只动物软骨损伤均获得修复，转BMP7基因加混合诱导因子组对软骨损伤有明显的修复作用，优于转BMP7基因（如图15所示）组。从上结果判断转BMP7基因加混合诱导因子组可完全修复家兔软骨缺损，优于其它各组。
实施例3
本实施例提供一种脐带血间充质干细胞构建组织工程软骨的方法，具体包括：
步骤1，干细胞的分离与培养；具体过程同实施例1中干细胞的分离与培养过程
步骤2，活性蛋白诱导的干细胞进行分化培养，具体过程如下：
步骤2-1，取6孔培养板，每孔分别加入1×105个/ml的第3代干细胞2ml，放置于5%CO2，37℃培养箱中培养，培养24小时后，弃去培养液。
步骤2-2，加入含有活性蛋白（终浓度组成：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v；SOX9，2.5μg/L）的DMEM培养液，于5% CO2、37℃条件下培养，培养3代备用，每培养一代更换相同的培养液。
步骤3，将步骤2培养3代的干细胞进行体外构建Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架，具体过程如下：同实施例1中Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架的构建过程
步骤3-1，构建含2×106个干细胞的Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架：具体构建过程同实施例1。
步骤3-2，将含有干细胞的Ⅲ型重组胶原蛋白3D支架从12孔培养板移入6孔培养板中，加入3ml含活性蛋白[终浓度组成为：TGFβ1（10.0μg/l）+富含血小板血浆（1%）+SOX9（2.5μg/l）]以及含10%胎牛血清的DMEM培养液，于37℃，5%CO2培养箱中培养，每3天更换一次培养液，获得组织工程软骨。
采用实施例2的方式获得软骨损伤模型（共9只家兔），结果如图16所示，然后在软骨损伤模型部位填充该组织工程软骨，然后将家兔髌骨复位，缝合膝关节和皮肤。术后将家兔送回饲养笼内饲养，术后不固定后肢，任其自由活动。于移植后8周，安乐死家兔，取出移植部位的关节，评价软骨损伤修复作用。
图17给出了本实施例获得的组织工程软骨修复8周的效果，可见，本发明成功地修复了兔关节软骨缺损，证明了干细胞直接加活性蛋白（TGFβ（10.0μg/L）+富含血小板血浆（1%，v/v）+SOX9（2.5μg/L）进行诱导构建组织工程软骨也能加速兔关节软骨缺损的修复，但效果比转染BMP7结合活性蛋白诱导获得的组织工程软骨的修复效果略差。
实施例4
利用实施例1中转染BMP7目的基因结合三种成分复配（TGFβ（10.0μg/L）+富含血小板血浆（1%，v/v）+SOX9（2.5μg/L））的活性蛋白诱导因子以及凝胶注射液的技术路线制备干细胞凝胶液（转BMP7基因加混合诱导因子组）。干细胞凝胶液的制备方法：将干细胞加入到生理盐水中制备成5×106个/ml的细胞悬液，再将透明质酸钠加入到2.0%白蛋白生理盐水溶液中制备透明质酸钠凝胶液，透明质酸钠和2%人血白蛋白生理盐水的投料比为：1:30（m／v），将细胞悬液与透明质酸钠凝胶液按照体积比为1︰1混合，获得干细胞凝胶液。并设定模型组、空白凝胶组、转BMP7基因组进行如下动物对比试验：
取健康大耳纯白家兔36只，体重20～2.5kg，雄性，随机分为4组，每组9只。实验分为模型组、空白凝胶组、转BMP7基因组和转BMP7基因加混合诱导因子组。
软骨损伤模型制造方法为：采用实施例2的方式获得软骨损伤模型，结果如图21所示。
模型组：家兔软骨损伤模型部位不作任何处理；
空白凝胶组：软骨损伤模型部位填充空白凝胶液（不含有干细胞，2.0%白蛋白生理盐水透明质酸钠液与等量的生理盐水混合）（如图18所示）。
转BMP7基因组：软骨损伤模型部位填充含转染BMP7基因经体外培养14天的干细胞凝胶液；含转染BMP7基因经体外培养14天的干细胞凝胶液的详细获得方法为：参照实施例1的步骤1-3构建重组质粒并转染步骤2的干细胞，获得转染BMP7的细胞，然后将该干细胞体外培养14天后，收集干细胞后用生理盐水悬浮细胞，然后与2.0%白蛋白生理盐水透明质酸钠液等量混合，获得干细胞凝胶液（如图19所示）。
转BMP7基因+混合诱导因子组：软骨损伤模型部位填充含转染BMP7基因+活性蛋白诱导因子经体外培养14天的干细胞凝胶液；含转染BMP7基因+活性蛋白诱导因子经体外培养14天的干细胞凝胶液的详细获得方法为：参照实施例1中转染目的基因+诱导因子组的体外培养方法，体外培养14天，收集细胞后用生理盐水悬浮细胞，然后与2.0%白蛋白生理盐水透明质酸钠液等量混合，获得干细胞凝胶液（如图20所示）。
将各个实验组做各自处理后，将家兔髌骨复位，缝合膝关节和皮肤。术后将家兔送回饲养笼内饲养，术后不固定后肢，任其自由活动。于移植后8周，安乐死家兔，取出移植部位的关节，评价软骨损伤修复作用。术后8周结果如图22-25所示（每个试验组只给出其中1只的效果图，相同试验组的结果无明显差异），表明：模型组中家兔软骨缺损底部呈深红色，创面凹陷，无组织填充，9只动物软骨损伤均未修复（如图22所示）；空白凝胶组填充物比正常关节面低，移植物部位中间呈白色，周围呈深红色，与周边正常关节软骨界线清楚，9只动物软骨损伤均未修复，空白凝胶组对软骨损伤无修复作用（如图23所示）；转BMP7基因组中家兔软骨缺损部位由乳白色移植物填充，与正常关节比颜色较浅，修复组织关节与关节面等高，无间隙和裂痕，与周围组织整合良好，9只动物软骨损伤均获得修复，转BMP7基因组对软骨损伤有明显的修复作用（如图24所示）；转BMP7基因加混合诱导因子组家兔软骨缺损部位由类软骨色移植物填充，与正常关节比颜色差别较小，修复组织关节与关节面等高，与周围正常关节软骨有界限，无间隙和裂痕，与周围组织完全整合，9只动物软骨损伤均获得修复，转BMP7基因加混合诱导因子组对软骨损伤有明显的修复作用，优于转BMP7基因组（如图25所示）。从上结果判断转BMP7基因加混合诱导因子组可完全修复家兔软骨缺损，优于其它各组。
实施例5
本实施例提供一种脐带血间充质干细胞制备干细胞凝胶液的制备方法，具体包括：
步骤1，依照实施例3方法进行干细胞的分离与培养；
步骤2，依照实施例3方法进行活性蛋白诱导的干细胞进行分化培养；
步骤3，将步骤2培养3代的干细胞进行体外制备干细胞凝胶液，具体方法为：用生理盐水制备5×106个/ml细胞悬液，另用2.0%白蛋白生理盐水溶液制备透明质酸钠凝胶液，透明质酸钠和2%人血白蛋白生理盐水的投料比为：1:30（m／v），将透明质酸钠凝胶液与细胞混悬液（按1︰1，v/v）混合制备干细胞凝胶液，最终得细胞数约为2.5×106个的干细胞凝胶液（如图26所示）。
采用实施例2的方式获得软骨损伤模型（共9只家兔），结果如图27所示，然后在软骨损伤模型部位填充该干细胞凝胶液，然后将家兔髌骨复位，缝合膝关节和皮肤。术后将家兔送回饲养笼内饲养，术后不固定后肢，任其自由活动。于移植后8周，安乐死家兔，取出移植部位的关节，评价软骨损伤修复作用。
图28给出了本实施例获得的组织工程软骨修复8周的效果，可见，本发明成功地修复了兔关节软骨缺损，证明了干细胞直接加活性蛋白（TGFβ（10.0μg/L）+富含血小板血浆（1%，v/v）+SOX9（2.5μg/L）进行诱导后，制备成干细胞凝胶液也能加速兔关节软骨缺损的修复，但效果比转染BMP7结合活性蛋白诱导获得的干细胞凝胶液的修复效果略差。
实施例6
本实施例提供一种应用骨髓来源的转染BMP7目的基因间充质干细胞制备干细胞凝胶液或构建组织工程软骨的方法，具体包括：
步骤1，构建含有目的基因BMP7的重组质粒；（同实施例1）
步骤2，骨髓间充质干细胞的分离与培养；具体包括：家兔股骨近端用骨髓穿刺针穿刺，取骨髓2-3ml进行骨髓间充质干细胞的分离与培养，方法同脐带血间充质干细胞的分离与培养。
步骤3，采用步骤1构建的重组质粒转染步骤2培养的干细胞，获得目的基因转染的干细胞；（同实施例1）
步骤4，采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养；（同实施例1，采用的活性蛋白按照各组分在分化培养体系中的终浓度组成为：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v； SOX9，2.5μg/L）；
步骤5，将步骤4获得的干细胞制备成干细胞凝胶液（同实施例5）。
步骤6，将步骤4获得的干细胞进行体外构建成Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨（同实施例1）。
采用实施例2的方式获得软骨损伤模型（共18只家兔），结果如图29所示；采用实施例4的方式在软骨损伤模型部位填充干细胞凝胶液（共9只家兔）；采用实施例2的方式在软骨损伤模型部位填充Ⅲ型重组胶原蛋白3D培养成的组织工程软骨（共9只家兔）。
图30给出了本实施例获得的干细胞凝胶液修复8周的效果，图31给出了本实施例获得的组织工程软骨修复8周的效果，可见，本实施例制备的干细胞凝胶液和构建的组织工程软骨均成功地修复了兔关节软骨缺损，因此，骨髓和脐带血来源的干细胞都可以用于本发明干细胞凝胶液的制备和组织工程软骨的构建。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (15)
1.干细胞制备干细胞凝胶液的方法，其特征在于：包括：
步骤一，干细胞的分离与培养；
步骤二，采用活性蛋白诱导干细胞进行分化培养；
步骤三，将步骤二获得的干细胞制备干细胞凝胶液；
所述步骤二中采用活性蛋白诱导干细胞进行分化培养，包括：
向含有干细胞的分化培养液中加入活性蛋白，于5% CO2、37℃条件下培养，培养3~5代备用，每培养一代更换相同的分化培养液；
所述活性蛋白由TGFβ、富含血小板血浆、SOX9组成，各组分在分化培养体系中的终浓度为：TGFβ，4.0~10.0μg/L；富含血小板血浆，1.0~2.0%，v/v；SOX9，2.5~5.0μg/L；
所述干细胞为脐带血间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤三中，干细胞制备干细胞凝胶液的过程包括：
将干细胞加入到生理盐水中制备成0.5×107~1×107个/ml的细胞悬液，再将透明质酸钠加入到质量浓度为1.5%~2.5%白蛋白生理盐水溶液中制备透明质酸钠凝胶液，将透明质酸钠凝胶液与细胞悬液按照体积比为1︰0.5~2混合，获得干细胞凝胶液。
3.干细胞构建组织工程软骨的方法，其特征在于：包括：
步骤一，干细胞的分离与培养；
步骤二，采用活性蛋白诱导干细胞进行分化培养；
步骤三，将步骤二获得的干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨；
所述步骤二中采用活性蛋白诱导干细胞进行分化培养，包括：
向含有干细胞的分化培养液中加入活性蛋白，于5% CO2、37℃条件下培养，培养3~5代备用，每培养一代更换相同的分化培养液；
所述步骤三中，干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨，包括：
将步骤二获得的干细胞制备成含2.5×106~5×106个干细胞的Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架，加入含有所述活性蛋白的DMEM细胞培养液，于5% CO2、37℃条件下培养，每7天更换一次含活性蛋白的DMEM细胞培养液，连续培养20~24天，获得组织工程软骨；
所述活性蛋白由TGFβ、富含血小板血浆、SOX9组成，各组分在分化培养体系中的终浓度为：TGFβ，4.0~10.0μg/L；富含血小板血浆，1.0~2.0%，v/v；SOX9，2.5~5.0μg/L；
所述干细胞为脐带血间充质干细胞。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含2.5×106~5×106个干细胞的Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架的制备方法为：将Ⅲ型胶原蛋白溶液和前一步骤获得的干细胞悬液混合，加入纤维蛋白蛋原溶液，再加入凝血酶，混合均匀后放置8~12h，再于5% CO2、37℃条件下培养14~21天，即得。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述活性蛋白在DMEM细胞培养液中的终浓度组成为：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v；SOX9，2.5μg/L。
6.转基因干细胞制备干细胞凝胶液的方法，其特征在于：包括：
步骤1，构建含有目的基因的重组质粒；
步骤2，干细胞的分离与培养；
步骤3，采用步骤1构建的重组质粒转染步骤2培养的干细胞，获得目的基因转染的干细胞；
步骤4，采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养；
步骤5，将步骤4获得的干细胞制备干细胞凝胶液；
所述步骤1中构建含有目的基因的重组质粒，包括：
步骤1-1，获取pBlue- BMP7质粒；
步骤1-2，将pBlue- BMP7质粒进行双酶切并提取纯化；
步骤1-3，将pcDNA3.1载体进行双酶切并提取纯化；
步骤1-4，将步骤1-2获得的酶切基因片段与步骤1-3获得的酶切DNA片段连接，得到pcDNA3.1- BMP7载体质粒；
步骤1-5，将pcDNA3.1- BMP7载体质粒转化至DH5a感受态细胞中，并进行扩增，扩增产物提取纯化；
所述步骤4中采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养，包括：
向含有目的基因转染的干细胞的分化培养液中加入活性蛋白，于5% CO2、37℃条件下培养，培养3~5代备用，每培养一代更换相同的分化培养液；
所述活性蛋白由TGFβ、富含血小板血浆、SOX9组成，各组分在分化培养体系中的终浓度为：TGFβ，4.0~10.0μg/L；富含血小板血浆，1.0~2.0%，v/v；SOX9，2.5~5.0μg/L；
所述干细胞为脐带血间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤5中，干细胞制备干细胞凝胶液的过程包括：
将干细胞加入到生理盐水中制备成0.5×107~1×107个/ml的细胞悬液，再将透明质酸钠加入到质量浓度为1.5%~2.5%白蛋白生理盐水溶液中制备透明质酸钠凝胶液，将透明质酸钠凝胶液与细胞悬液按照体积比为1︰0.5~2混合，获得干细胞凝胶液。
8.转基因干细胞构建组织工程软骨的方法，其特征在于：包括：
步骤1，构建含有目的基因的重组质粒；
步骤2，干细胞的分离与培养；
步骤3，采用步骤1构建的重组质粒转染步骤2培养的干细胞，获得目的基因转染的干细胞；
步骤4，采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养；
步骤5，将步骤4获得的干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨；
所述步骤1中构建含有目的基因的重组质粒，包括：
步骤1-1，获取pBlue- BMP7质粒；
步骤1-2，将pBlue- BMP7质粒进行双酶切并提取纯化；
步骤1-3，将pcDNA3.1载体进行双酶切并提取纯化；
步骤1-4，将步骤1-2获得的酶切基因片段与步骤1-3获得的酶切DNA片段连接，得到pcDNA3.1- BMP7载体质粒；
步骤1-5，将pcDNA3.1- BMP7载体质粒转化至DH5a感受态细胞中，并进行扩增，扩增产物提取纯化；
所述步骤4中采用活性蛋白诱导目的基因转染的干细胞进行分化培养，包括：
向含有干细胞或者目的基因转染的干细胞的分化培养液中加入活性蛋白，于5% CO2、37℃条件下培养，培养3~5代备用，每培养一代更换相同的分化培养液；
所述步骤5中，干细胞体外构建Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架直至形成组织工程软骨，包括：
将步骤4获得的干细胞制备成含2.5×106~5×106个干细胞的Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架，加入含有所述活性蛋白的DMEM细胞培养液，于5% CO2、37℃条件下培养，每7天更换一次含活性蛋白的DMEM细胞培养液，连续培养20~24天，获得组织工程软骨；
所述活性蛋白由TGFβ、富含血小板血浆、SOX9组成，各组分在分化培养体系中的终浓度为：TGFβ，4.0~10.0μg/L；富含血小板血浆，1.0~2.0%，v/v；SOX9，2.5~5.0μg/L；
所述干细胞为脐带血间充质干细胞。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述含2.5×106~5×106个干细胞的Ⅲ型胶原蛋白3D培养支架的制备方法为：将Ⅲ型胶原蛋白溶液和前一步骤获得的干细胞悬液混合，加入纤维蛋白蛋原溶液，再加入凝血酶，混合均匀后放置8~12h，再于5% CO2、37℃条件下培养14~21天，即得。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述活性蛋白在DMEM细胞培养液中的终浓度组成为：TGFβ，10μg/L；富含血小板血浆，1%，v/v；SOX9，2.5μg/L。
11.权利要求1或2所述的方法获得的干细胞凝胶液。
12.权利要求3~5任一项所述的方法获得的组织工程软骨。
13.权利要求6或7所述的方法获得的转基因干细胞凝胶液。
14.权利要求8~10任一项所述的方法获得的组织工程软骨。
15.权利要求11或者13所述的干细胞凝胶液或者权利要求12或者权利要求14所述的组织工程软骨在制备骨移植物上的应用。
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