CN112176079B

CN112176079B - 一种基于四重液滴数字pcr检测女性阴道微生物的引物探针组合及其应用

Info

Publication number: CN112176079B
Application number: CN202011164085.9A
Authority: CN
Inventors: 陈雯雯; 陈永欣; 王纪东; 郑佳莹; 黄炜塨; 刘晓蕾
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2020-10-27
Filing date: 2020-10-27
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2040-10-27
Also published as: CN112176079A

Abstract

本发明提供一种基于四重液滴数字PCR检测女性阴道微生物的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合包括：扩增及检测惰性乳杆菌的folE基因、詹式乳杆菌的gapR基因、卷曲乳杆菌的CbiQ1基因和格式乳杆菌的murQ基因的引物对和探针。其中，所述引物对具有较好的特异性，在扩增时能够避免引物扩增其他菌种，结合四重液滴数字PCR使用，对PCR扩增后的液滴进行分类和定量分析，能够确定样本中各乳杆菌的浓度，确定女性阴道的主导微生物，实现阴道微生物分型。

Description

一种基于四重液滴数字PCR检测女性阴道微生物的引物探针组合及其应用

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种基于四重液滴数字PCR检测女性阴道微生物的引物探针组合及其应用。

背景技术

人体内外存在着大量微生物，它们广泛参与了消化、新陈代谢、免疫防御等过程。女性阴道共生着许多微生物菌群，对病原体的侵入有自然防御功能，健康女性的阴道微生物通常由惰性乳杆菌(LI)、詹式乳杆菌(LJ)、卷曲乳杆菌(LC)和格式乳杆菌(LG)这四种乳杆菌的其中一种主导，这些乳杆菌通过产生乳酸、过氧化氢维持阴道的低pH环境，同时也产生细菌素和其他抗菌物质，从而阻止其他病原菌的繁殖，维持正常的阴道生态系统。

阴道微生物对维持女性阴道微生态健康、预防感染起着重要作用。当阴道的微生态失调，例如阴道中乳杆菌数目下降，而加德纳菌或其他厌氧菌的大量增加时，其阴道内的菌群紊乱，自然防御功能遭到破坏，病原体则易侵入。研究表明，阴道菌群失调与女性细菌性阴道炎、人乳头状瘤病毒(HPV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)感染等都密切相关；患有阴道炎的女性在怀孕时会影响精子的质量，甚至导致不孕；即使怀孕孕期也很容易引起宫内感染、产道感染等环节感染胎儿，造成流产、早产、先天发育畸形、智力低下等严重后果。

目前，用于阴道菌群分析的方法包括镜检、培养法和高通量测序等。然而，镜检虽然能够直接检查清洁度及有无滴虫和真菌菌丝，成本低但主观性强；培养法操作繁琐、耗时长、重复性差，而且难以辨别相似菌落形态的菌种或菌株；同时，高通量测序方法，包括扩增子测序和宏基因组测序，可以对样品中菌种的种类和相对丰度进行分析，但是测序忽略了菌群绝对丰度信息，并且测序结果中许多菌种信息并不是研究关注的重点，大量的测序结果反而会导致结果分析变得复杂和困难。而测序深度的限制，其无法鉴定相对丰度＜0.1％的菌种，那么研究中感兴趣的菌种有可能因为相对丰度较低而无法通过测序鉴定出来；而且测序成本较高、所需周期长，使其不适合用于常规检测。

研究人员还开发了对于阴道分泌物样本中的真菌、厌氧菌和毛滴虫的荧光染色产品，例如CN110940646A公开了一种阴道微生物检测双重荧光染色液，所述的阴道微生物检测双重荧光染色液包括独立的双重荧光染色液A液和双重荧光染色液B液；所述的双重荧光染色液A液由荧光染色剂、辅助染色剂、染色液缓冲试剂、抑菌剂和水组成，双重荧光染色液B液由染色液缓冲试剂、碱性调节试剂、抗淬灭剂、抑菌剂和水组成。但该方法制片和染色复杂，需要在玻片上进行涂片以及染色，而且观察过程中还需要切换不同的显微镜光源，操作中比较繁琐。

因此，提供一种能够快速分辨出女性阴道微生物主导菌群、判断女性阴道微生物菌群是否紊乱的检测方法对本领域而言具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于四重液滴数字PCR检测女性阴道微生物的引物探针组合及其应用。所述引物探针组合能够特异性地扩增女性阴道微生物中的乳杆菌，进而确定女性阴道的主导微生物，实现阴道微生物分型。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种基于四重液滴数字PCR(ddPCR)检测女性阴道微生物的引物探针组合，包括：

扩增及检测惰性乳杆菌(LI)的folE基因、詹式乳杆菌(LJ)的gapR基因、卷曲乳杆菌(LC)的CbiQ1基因和格式乳杆菌(LG)的murQ基因的引物对和探针。

本发明中，针对女性阴道微生物的四种常见主导菌落，包括惰性乳杆菌、詹式乳杆菌、卷曲乳杆菌和格式乳杆菌，设计了相应的用于扩增其特异基因的引物对，所述特异基因仅为其中一种菌种所特有的，而另外三种菌种以及其他阴道微生物中均无此基因。所述引物对具有较好的特异性，在扩增时能够避免引物扩增其他菌种，因此，所述引物对能够很好的将四种乳杆菌种区分开，再通过对应的荧光探针发出的荧光判断对应菌种的浓度，进而判断阴道微生物由以上四种菌株中的哪一种主导，若四种菌株的荧光强度都较低，则表明阴道微生物菌群紊乱。

作为本发明优选的技术方案，扩增所述folE基因的引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.1～2所示。

优选地，扩增所述gapR基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。

优选地，扩增所述CbiQ1基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示。

优选地，扩增所述murQ基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示。

优选地，所述探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。

优选地，所述发光的报告荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种。

优选地，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1(Blackhole Quencher 1)、BHQ2或BHQ3中的任意一种。

作为本发明优选的技术方案，检测所述folE基因的探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示。

优选地，检测所述gapR基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

优选地，检测所述CbiQ1基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

优选地，检测所述murQ基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选地，检测所述folE基因的探针的工作浓度为100～400nM，例如可以是120nM、150nM、160nM、180nM、200nM、220nM、250nM、300nM、320nM、350nM或380nM等，优选为200nM。

优选地，检测所述gapR基因的探针的工作浓度为200～500nM，例如可以是220nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM、400nM、420nM、450nM或480nM等，优选为300nM。

优选地，检测所述CbiQ1基因的探针的工作浓度为100～400nM，例如可以是120nM、150nM、160nM、180nM、200nM、220nM、250nM、300nM、320nM、350nM或380nM等，优选为200nM。

优选地，检测所述murQ基因的探针的工作浓度为200～500nM，例如可以是220nM、250nM、280nM、300nM、320nM、350nM、380nM、400nM、420nM、450nM或480nM等，优选为300nM。

本发明中，所述探针的工作浓度会影响ddPCR的二维图结果，探针浓度的变化会使液滴具有不同的荧光强度，分布在不同位置。本发明中所述的工作浓度能够使ddPCR的二维图结果更加清晰，液滴分布更加均匀且不会相互影响。

具体序列如下表1所示：

表1

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合在制备女性阴道微生物分型检测试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供一种女性阴道微生物分型检测试剂盒，包括第一方面所述的引物探针组合。

第四方面，本发明还提供一种如第三方面所述的女性阴道微生物分型检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

(1)采集阴道拭子样本并提取所述阴道拭子样本中的细菌gDNA；

(2)将细菌gDNA与所述试剂盒中的引物探针组合混合，制备得到液滴数字PCR反应液；

(3)将所述液滴数字PCR反应液加入液滴发生器样品孔中，得到微滴后进行PCR扩增；

(4)对所述微滴进行计数和分类，同时检测荧光信号，分析得到惰性乳杆菌、詹式乳杆菌、卷曲乳杆菌和格式乳杆菌的浓度。

本发明中，利用引物探针组合和液滴数字PCR技术对样本进行扩增，所述引物探针组合包含扩增四种特异基因的引物对和探针，通过液滴数字PCR技术将反应体系分隔成微滴，能够在微滴中独立地进行PCR扩增，将所述引物探针组合混合后加入反应体系当中，各引物之间不会相互影响，仍然能够较好地实现特异性扩增，再经由微滴计数等仪器进行计数以及荧光信号检测设备检测荧光后，能够对液滴进行分类和定量分析，从而确定样本中各乳杆菌的浓度。根据四重ddPCR对每种菌的定量结果，浓度最高(明显高于其他)的乳杆菌则认为该乳杆菌为该样本阴道主导菌。若四种乳杆菌的浓度都比较低，则表示该样本的乳杆菌数量较低，可能阴道菌群处于亚健康或紊乱状态，需要进行进一步的检查。

步骤(3)所述PCR扩增中退火温度为55～63℃，优选为61℃。

优选地，步骤(3)所述PCR扩增的反应条件为：先在94～98℃预变性8～12min，而后以94～95℃30～40s和55～63℃60～90s的条件进行35～40个循环。其中，退火和延伸步骤在同一温度下进行。

优选地，步骤(3)所述PCR扩增的反应条件为：先在95℃预变性10min，而后以94℃30s和61℃1min的条件进行40个循环。

优选地，步骤(3)中所述PCR扩增前还包括对所得微滴进行封膜的步骤。

作为本发明优选的技术方案，所述使用方法包括如下步骤：

(1)采集阴道拭子样本，提取所述阴道拭子样本中的细菌gDNA；

其中，所述引物探针组合中引物对的序列如SEQ ID NO.1～8所示，所述引物探针组合中探针的序列如SEQ ID NO.9～12所示；

(3)将所述液滴数字PCR反应液加入液滴发生器的样品孔中，并在所述液滴发生器的油孔中加入微滴生成油，覆盖垫圈，制备得到微滴，再将所述微滴转移至96孔PCR板，封膜后进行PCR扩增；

(4)完成所述PCR扩增后，对微滴进行计数和分类，同时检测荧光信号，分析得到惰性乳杆菌、詹式乳杆菌、卷曲乳杆菌和格式乳杆菌的浓度。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供了一种能够利用四重液滴数字PCR对女性阴道拭子样本中的惰性乳杆菌、詹式乳杆菌、卷曲乳杆菌、格式乳杆菌进行扩增和定量分析的引物探针组合，所述引物探针组合包括四对引物对和相应的四条探针，分别特异性地扩增和检测惰性乳杆菌的folE基因、詹式乳杆菌的gapR基因、卷曲乳杆菌的CbiQ1基因和格式乳杆菌的murQ基因；所述引物对具有较好的特异性，在扩增时能够避免引物扩增其他菌种，通过对特异性基因的扩增将四种乳杆菌种区分开，再通过对应的荧光探针发出的荧光判断对应菌种的浓度；

(2)本发明中提供的利用所述引物探针组合进行女性阴道微生物分型检测的试剂盒，其结合液滴数字PCR使用，各引物对之间不会相互影响，仍然能够较好地实现特异性扩增，再经由微滴计数等仪器进行计数以及荧光信号检测设备检测荧光后，能够对液滴进行分类和定量分析；同时，通过调整探针的比例和反应退火温度，使各类阳性液滴的团簇尽量分开，提高定量结果的准确性，本发明提供的检测试剂盒及其使用方法能够确定样本中各乳杆菌的浓度，确定女性阴道的主导微生物，实现阴道微生物分型。

附图说明

图1为实施例2中四重ddPCR后检测得到的液滴分布图。

图2(A)为实施例3中格式乳杆菌和詹式乳杆菌经荧光定量PCR后得到的荧光强度曲线图。

图2(B)为实施例3中惰性乳杆菌和卷曲乳杆菌经荧光定量PCR后得到的荧光强度曲线图。

图3为实施例4中四重ddPCR后检测得到的液滴分布图。

图4为实施例5中四重ddPCR后检测得到的液滴分布图。

图5为实施例6中四重ddPCR后检测得到的液滴分布图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，若无特殊说明，所用的试剂均可购自本领域常规的厂商；所用的实验方法均为本领域技术人员熟知的实验方法。

实施例1

本实施例中提供一种引物探针组合及利用其进行阴道微生物检测的方法。

(1)引物设计

为了能将待检测的四种乳杆菌种(LI、LJ、LC、LG)区分开，本实施例中分别选择四种乳杆菌种特有的基因来设计引物和探针，从而保证引物的特异性，避免引物扩增其他菌种。

其中，特异性基因分别为惰性乳杆菌(LI)的folE基因、詹式乳杆菌(LJ)的gapR基因、卷曲乳杆菌(LC)的CbiQ1基因和格式乳杆菌(LG)的murQ基因。引物的序列如下所示：

LI folE正向引物(SEQ ID NO:1)：

5′-GTGGCAGTAGGTGAAGATCC-3′；

LI folE反向引物(SEQ ID NO:2)：

5′-TGGTCGATGATTGAGTGACG-3′；

LJ gapR正向引物(SEQ ID NO:3)：

5′-GCGAATTGGAGTTTGTTCCG-3′；

LJ gapR反向引物(SEQ ID NO:4)：

5′-TTACCTCCGGTAGCTTTTGC-3′；

LC CbiQ1正向引物(SEQ ID NO:5)：

5′-GGAATTTGTCAACGCGTATCT-3′；

LC CbiQ1反向引物(SEQ ID NO:6)：

5′-GATCGGGCAAAGTCTGTAGC-3′；

LG murQ正向引物(SEQ ID NO:7)：

5′-GGAAATTAAAAACTTAACTACGGAGC-3′；

LG murQ反向引物(SEQ ID NO:8)：

5′-GTTTTGACCATGTCGATAGTTGAC-3′；

在使用时，将上述引物以等摩尔量混合，制备得到引物混合物。

(2)探针设计

为了节约成本，在LI和LJ探针上修饰FAM基团，在LC和LG探针上修饰HEX基团，则可以在同一荧光通道上检测两种靶标。探针的序列如下所示：

LI folE探针(SEQ ID NO:9)：

5′-FAM-TCGCAGTGGATTAGTAGAAACACC-MGB-3′；

LJ gapR探针(SEQ ID NO:10)：

5′-FAM-TCGTGGTGCGTTAGGTGAAAGCGTGGA-BHQ1-3′；

LC CbiQ1探针(SEQ ID NO:11)：

5′-HEX-ACCTTGACGATTGCCTGCGTGACACGT-BHQ1-3′；

LG murQ探针(SEQ ID NO:12)：

5′-HEX-AACCCCGCGACTATGCACAT-MGB-3′；

(3)提取阴道拭子样本gDNA

采集阴道侧壁上1/3的分泌物及子宫颈分泌物：采集子宫颈分泌物前，先用无菌棉拭子将子宫颈表面的黏液及附着物拭去，再将新的无菌棉拭子伸入颈管，顺时针旋转3周；

将拭子置于2mL离心管内，加入500μL PBS和50U变溶菌酶，37℃孵育30min；利用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)提取细菌gDNA，最终用100μL Buffer AE洗脱。

(4)ddPCR反应体系的制备，具体反应体系如下表2所示：

表2

组分	体积
		ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad)	10μL
引物混合物	1.8μL
		LI folE探针	0.4μL
LC CbiQ1探针	0.4μL
		LJ gapR探针	0.6μL
LG murQ探针	0.6μL
		待测样本	2μL
无菌水	4.2μL
		总体积	20μL

其中，反应体系配制完成后，各引物的浓度为900nM；

LI folE探针的浓度为200nM，LC CbiQ1探针的浓度为200nM，LJ gapR探针的浓度为300nM，LG murQ探针的浓度为300nM。

(5)液滴生成

将配制好的ddPCR扩增体系混匀后，加入液滴发生器QX200 Droplet Generator(与Bio-rad ddPCR系统配套使用)的样品孔中，并在油孔中加入70μL微滴生成油，覆盖垫圈，放入液滴发生器中制备微滴；

(6)PCR扩增

转移40μL微滴至96孔PCR板，封膜后于Bio-rad T100 PCR仪进行扩增，PCR反应条件为：95℃预变性10min，94℃30sec，61℃1min 40个循环；

(7)结果判读

扩增完成后，将PCR反应板转移至Bio-rad ddPCR系统配套QX200 DropletReader，按照仪器和软件操作说明进行微滴计数及荧光信号检测；

同时，利用QuantaSoft Analysis Pro version 1.0.596软件对液滴进行分类，并计算LI、LJ、LC、LG的浓度。

根据四重ddPCR对每种菌的定量结果，浓度最高的乳杆菌则认为该乳杆菌为该样本阴道主导菌。

若四种乳杆菌的浓度相似且与正常样本相比偏低，则表示该样本的乳杆菌数量较低，阴道菌群可能处于亚健康或紊乱状态，需要进行进一步的检查。

实施例2

本实施例中利用实施例1提供的引物探针组合及检测方法对惰性乳杆菌(LI)、詹式乳杆菌(LJ)、卷曲乳杆菌(LC)、格式乳杆菌(LG)的质粒混合物进行分型。

具体步骤如下：

(1)针对LI folE、LJ gapR、LC CbiQ1、LG murQ基因设计引物，利用引物分别从临床分离的LI、LJ、LC、LG菌株提取的gDNA扩增LI folE、LJ gapR、LC CbiQ1、LG murQ的基因片段，利用pEASY-Blunt Cloning Kit完成克隆、转化；

(2)利用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa)从E.coli中提取质粒；

(3)混合LI folE、LJ gapR、LC CbiQ1、LG murQ的质粒作为待测样本，其中各质粒的浓度均为2×10³拷贝/μL；其余检测步骤与参照实施例1中所述的步骤进行。

ddPCR结果如图1所示，图1中液滴的具体分类如下表3所示：

表3

结合表中菌落类型及ddPCR结果可知，利用混合质粒(包括LI folE、LJ gapR、LCCbiQ1、LG murQ)进行ddPCR分型，能够检测到阴性液滴、LI阳性(LI+)、LJ阳性(LJ+)、LC阳性(LC+)、LG阳性(LG+)四种单阳性液滴、双阳性液滴、三阳性液滴和四阳性液滴；所得液滴能够很好的区分开，不会互相影响，也未出现拖尾等影响结果判定的不良现象。

实施例3

与实施例2的区别在于，本实施例中不使用ddPCR进行扩增，仅使用一般的扩增方法进行扩增，即：将引物探针组合与样本混合后，直接制备得到PCR反应体系，并进行荧光定量PCR；

其中，荧光定量PCR采用20μL反应体系，包括检测LG和LJ的反应体系a和检测LC和LI的反应体系b。

反应体系a如下表4所示：

表4

其中，反应体系配制完成后，各引物的浓度为300nM；LJ gapR探针的浓度为200nM，LG murQ探针的浓度为200nM。

反应体系b如下表5所示：

表5

其中，反应体系配制完成后，各引物的浓度为300nM；LI folE探针的浓度为200nM，LC CbiQ1探针的浓度为200nM。

表中所述待测样品可用质粒DNA或样本DNA，本实施例中采用质粒DNA作为待测样本，每种菌对应的质粒浓度为2×10⁵拷贝/μL；

反应体系在50℃孵育2min后，在95℃预孵育20s，接着进行95℃3s、60℃30s共40个热循环。

使用荧光定量PCR仪，使用FAM通道和HEX通道检测。

所得结果如图2(A)和图2(B)所示，其中图2(A)为检测LG和LJ得到的荧光强度曲线，图2(B)为检测LI和LC得到的荧光强度曲线；在同样仅使用两种荧光基团的前提下，荧光定量PCR只能实现双重检测，而ddPCR只用两种荧光基团可以实现四重检测，并且能够提供绝对定量结果。

实施例4

与实施例2的区别在于，本实施例中，将退火温度调节为63℃，其余步骤均与实施例2保持一致。

所得结果如图3所示，图中，相应位置代表的菌种与实施例2中保持一致。

实施例5

与实施例2的区别在于，本实施例中，将退火温度调节为56.5℃，其余步骤均与实施例2保持一致。

所得结果如图4所示，图中，相应位置代表的菌种与实施例2中保持一致。

由实施例2和实施例4、5比较可知，温度较低时，扩增效果更好，荧光值更高，液滴团簇分得更开，但是拖尾严重。温度较高时，特异性更强，非特异性扩增减少，拖尾变少但扩增效果变差。

因此，综合考虑特异性、扩增效率以及更好区分不同液滴团簇，本发明中选择了61℃作为退火温度。

实施例6

与实施例2的区别在于，本实施例中，LI folE探针、LC CbiQ1探针、LJ gapR探针和LG murQ探针的浓度均为200nM，其余步骤均与实施例2保持一致。

所得结果如图5所示，图中，相应位置代表的菌种与实施例2中保持一致。

由图可知，虽然LI和LJ的液滴团簇可以分开，但是LC和LG的液滴团簇不能分开，其检测结果较实施例2来说不清晰，无法较好的区分四种乳杆菌且获取其浓度。

综上所述，本发明提供的利用四重液滴数字PCR对女性阴道拭子样本的引物探针组合能够特异性地扩增和检测惰性乳杆菌的folE基因、詹式乳杆菌的gapR基因、卷曲乳杆菌的CbiQ1基因和格式乳杆菌的murQ基因，在扩增时能够避免引物扩增其他菌种，同时，结合四重液滴数字PCR技术，各引物对之间不会相互影响，仍然能够较好地实现特异性扩增，再经由微滴计数等仪器进行计数以及荧光信号检测设备检测荧光后，能够对液滴进行分类和定量分析，本发明提供的方法得到的定量结果准确性较高，能够快速准确的确定样本中各乳杆菌的浓度，确定女性阴道的主导微生物，实现阴道微生物分型。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 一种基于四重液滴数字PCR检测女性阴道微生物的引物探针组合

<130> 20201019

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtggcagtag gtgaagatcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tggtcgatga ttgagtgacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gcgaattgga gtttgttccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttacctccgg tagcttttgc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ggaatttgtc aacgcgtatc t 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gatcgggcaa agtctgtagc 20

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

ggaaattaaa aacttaacta cggagc 26

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gttttgacca tgtcgatagt tgac 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tcgcagtgga ttagtagaaa cacc 24

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tcgtggtgcg ttaggtgaaa gcgtgga 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

accttgacga ttgcctgcgt gacacgt 27

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

aaccccgcga ctatgcacat 20

Claims

1.一种基于四重液滴数字PCR检测女性阴道微生物的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合由扩增及检测惰性乳杆菌的folE基因、詹式乳杆菌的gapR基因、卷曲乳杆菌的CbiQ1基因和格式乳杆菌的murQ基因的引物对和探针组成；

扩增所述folE基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；

扩增所述gapR基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；

扩增所述CbiQ1基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示；

扩增所述murQ基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示；

检测所述folE基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

检测所述gapR基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

检测所述CbiQ1基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

检测所述murQ基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5′端修饰有发光的报告荧光基团，3′端修饰有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述发光的报告荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、CY3或CY5中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ2或BHQ3中的任意一种。

5.根据权利要求1～4任一项所述的引物探针组合，其特征在于，检测所述folE基因的探针的工作浓度为100～400nM；

检测所述gapR基因的探针的工作浓度为200～500nM；

检测所述CbiQ1基因的探针的工作浓度为100～400nM；

检测所述murQ基因的探针的工作浓度为200～500nM。

6.如权利要求1～5任一项所述的引物探针组合在制备女性阴道微生物分型检测试剂盒中的应用。

7.一种女性阴道微生物分型检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的引物探针组合。