CN108866164A

CN108866164A - B族链球菌的检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN108866164A
Application number: CN201810730292.2A
Authority: CN
Inventors: 宁云山; 林彦青; 李妍; 罗美群
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明提供了一种B族链球菌的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样本的DNA并测定DNA浓度；(2)稀释后，使用ddPCR检测目的基因cfb的拷贝数；所述使用ddPCR检测目的基因cfb的拷贝数，引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3，所述探针标记有荧光。本发明所述的B组链球菌的检测方法检测时间短，具有特异性好、检出率高、假阳性少、可进行绝对定量分析的优点。

Description

B族链球菌的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种非诊断目的的B族链球菌的检测方法及试剂盒。

背景技术

B族链球菌(group B Streptococcus，GBS)学名无乳链球菌，是兼性厌氧革兰阳性球菌，在1938年首次被发现，严重危害畜牧业，在早期被畜牧业重视。其还可寄生于人类下消化道及泌尿生殖道。国内文献报道我国孕妇B族链球菌带菌率10.1％～32.4％，近年来在育龄妇女和新生儿中有逐年上升的趋势，GBS携带率与孕妇年龄、产史、民族无关，发达地区孕妇比欠发达地区孕妇GBS携带率低。

GBS感染将增加早产、产后出血、胎膜早破、胎儿窘迫、剖宫产、宫内感染、产褥感染及新生儿感染等的发生率，高达83％血培养或脑脊液培养阳性的新生儿为隐匿性感染，但一但发病将造成新生儿出现严重的肺炎、化脓性脑膜炎和败血症等临床症状。与未感染GBS的同龄新生儿相比，确诊败血症者的新生儿罹患脑瘫的风险增加3倍，神经发育损害风险增加2倍，死亡率约为6.8％。因此，围产期GBS检测，为预防新生儿严重肺部感染、败血症、化脓性脑膜炎提供可能。针对上述现状，有必要开展对于GBS的研究，建立GBS的新一代检测技术是急需解决的问题之一。

目前对于GBS的检测主要依赖微生物培养法和荧光定量PCR(qPCR)法。微生物培养鉴定是GBS检测的金标准。但微生物培养的假阴性率可高达50％，因此美国疾病控制中心(CDC)、美国妇产科协会以及美国儿科协会推荐用使用增菌肉汤培养基提高检测方法的敏感性。另外，近几年已采用选择性培养基结合CAMP实验和触酶实验应用于GBS的检测。但该方法存在培养周期长，漏检率高，培养结果易受外界环境影响。以Granada选择性培养基为例，其原理是GBS在厌氧条件下，使含淀粉的培养基产生类胡萝卜色素,出现橙红色菌落，但该培养基稳定性较差，久置容易出现假阴性结果，并且不能检测非溶血的GBS菌株，漏检率高；同时，该方法检出阴性结果需要72h，阳性结果至少需要48h,所以急需快速检测GBS方法来弥补这一缺憾。尽管相比微生物培养法，qPCR检测时间明显缩短，但因qPCR中样本的原始Ct值必须依赖外部参照，建立标准曲线，因此标准品的可靠性和重复性严重影响未知样品的定量结果的重复性和可靠性，例如，标准品可因为不同制备流程或储存的过程中发生降解而导致待检样品浓度发生严重偏离；另外，由于qPCR检测未知样品时需借助标准曲线才能对进行定量分析，当模板浓度极低时，qPCR的扩增效率会因为qPCR反应中引物和探针与聚合酶在与模板的目标序列的结合概率的减少而降低，因此商品化的qPCR临床检测试剂盒均以Ct≤30(约1000copies/20μl反应体系)作为阳性结果，极大的降低了病原菌的检出率；同时样本或检测体系的胆红素、盐类等杂质可影响检测结果。

本发明针对上述GBS检测方法的不足，建立微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)的GBS检测新方法(GBS-ddPCR)。该方法是新近发展起来的第三代PCR技术，其基本原理是在PCR扩增前将待测DNA样本随机分配至芯片的微反应器或微滴中，微反应器或微滴中或不含待测的核酸靶分子，或至少含有一个待测的核酸靶分子，且每个微反应器或微滴都是一个独立的PCR反应器。经过PCR扩增后，检测器对每个微反应器或微滴进行检测，有荧光信号的就判定为“1”，没有荧光信号的就判定为“0”，最终根据泊松分布原理和阳性微滴的比例，计算出待测样本中靶序列的拷贝数或浓度。该技术的最核心性能主要有两个方面：通过对样品的微滴化处理，可有效的避免杂质及非特异片段的检测干扰，从而实现了检测的高分辨率及高灵敏度；通过对成千上万个微滴进行检测，实现了无需依赖标准曲线的绝对定量检测。因此，可达到对核酸的高准确性、高分辨率及高灵敏度检测。ddPCR主要应用于分子生物学领域，包括病原微生物检测、病原微生物分型鉴定、稀有变异检测、拷贝数变异、基因表达量差异研究、点突变(SNP)研究和甲基化含量鉴定等。在病原微生物检测方面，微滴式数字PCR技术可以对10个拷贝以下的微生物核酸进行准确定量，因此具有极高的灵敏度。

发明内容

针对上述问题，本发明的其中一个目的在于提供一种特异性好、检出率高、假阳性少、可进行定量分析的B族链球菌的检测方法。

基于上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种非诊断目的的B族链球菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样本中的DNA并测定其浓度；

(2)使用ddPCR检测样本中B族链球菌cfb基因的拷贝数；

所述ddPCR中，引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3，所述探针用荧光基团标记。

在其中一些实施例中，所述ddPCR的退火温度为52～53.9℃。

在其中一些实施例中，所述ddPCR的退火温度为53℃。

在其中一些实施例中，所述探针在ddPCR的反应体系中，终浓度为0.2～0.3mmol/L。

在其中一些实施例中，所述探针在ddPCR的反应体系中，终浓度为0.25mmol/L。

在其中一些实施例中，所述引物中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在ddPCR的反应体系中的终浓度分别为0.8～1.2mmol/L。

在其中一些实施例中，所述引物中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在ddPCR的反应体系中的终浓度分别为1mmol/L。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述的样本包括阴道肛周分泌物、血液、脑脊液和尿液。

本发明的另一个目的还在于提供一种ddPCR检测的引物与探针在制备B族链球菌的检测试剂盒中的应用，具体技术方案如下：

上述检测方法中ddPCR检测的引物与探针在制备B族链球菌的检测试剂盒中的应用。

本发明的另一个目的在于，提供一种B族链球菌的检测试剂盒，具体技术方案如下：

一种B族链球菌的检测试剂盒，包括针对cfb基因的引物和探针，所述引物为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3，所述探针标记有荧光。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过发明人大量劳动，针对B族链球菌中的保守的cfb基因，设计获得引物及探针序列，用于ddPCR方法以特异性检测样本中的B族链球菌，其检测下限可达1copies/20μL，与微生物培养法相比，检测时间明显缩短，适用于多种类型样本的检测。

本发明所述的B族链球菌的检测试剂盒，不受标准品和检测样本中杂质的影响，与qPCR法相比，显著提高了检测方法的重复性，该检测产品在临床中应用前景大。

附图说明

图1为ddPCR检测GBS的探针与引物设计优化图；

图2为ddPCR检测GBS的探针与引物的特异性检测结果图，其中(a)为ddPCR退火温度优化散点图，(b)为ddPCR检测GBS的特异性结果图；

图3为GBS DNA的ddPCR检测结果线性回归分析；

图4为GBS DNA的qPCR检测结果线性回归分析；

图5为ddPCR检测低拷贝数GBS DNA；

图6为ddPCR法检测临床样本ROC曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种B族链球菌的检测方法。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明所述的ddPCR为微滴式数字PCR系统(droplet digital PCR System)的缩写形式。

实施例1

1.1材料

1.1.1实验材料

B族链球菌COH1(group B streptococcus,GBS)，购自美国菌种保藏中心(ATCC)；A族链球菌、溶血葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、李斯特菌、白色念珠菌和光滑假丝酵母菌由深圳市妇幼保健院新生儿科提供。

1.1.2仪器

NanoDrop Lite紫外分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司，美国)；QX200微滴式数字PCR系统(包括PCR仪、QX200Droplet Generator、PX1Plate Sealer和QX200DropletReader)(Bio-rad,美国)；7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)。

1.1.3试剂

胰蛋白胨大豆肉汤、血液琼脂基础购自海博生物；无菌脱纤维绵羊血购自益康生物；λ-HindⅢdigest、DL 200DNA marker、限制性内切酶、Premix Taq^TMHot Start Version、Takara MiniBEST Plasmid Purification Kit、Takara Agarose Gel DNA PurificationKit等购自日本TaKaRa公司；临床样本DNA提取试剂盒 DNA Mini Kit购自德国Qiagen公司；q-PCR试剂盒iTaq^TMUniversal Probes Supermix、ddPCR试剂盒2×ddPCRSupermix、微滴生成油；微滴发生卡；96孔PCR板；密封垫购自美国Bio-Rad公司；基因测序由广州艾基生物技术有限公司完成。

1.2方法

1.2.1GBS细菌悬液制备

B族链球菌(COH1菌株)在含5％脱纤维绵羊血的血琼脂平板上划线活化24小时。可见菌落外围形成明显的溶血表现。从血琼脂平板上挑一带溶血环单菌落，置于6mL的增菌肉汤培养基中，随后振荡培养18h(28℃，200r/min)。

采用平板菌落计数法，选取在30～300CFU有效范围内的平板并计数其菌落数，根据以下公式计算菌液的原始浓度：

细菌原始浓度(CFUs/mL)＝(平均菌落数CFUs×稀释倍数)/0.1mL

1.2.2GBS COH1菌株DNA的提取和鉴定

菌液收集后提取全基因组DNA。

1.2.3GBS-ddPCR方法的建立

根据GBS保守基因cfb核苷酸序列(GeneBank ID:NP_689028.1)，设计获得分别可扩增cfb1和cfb2的特异性引物及探针，引物及探针的核苷酸序列如表1。通过ddPCR方法检测结果显示(图1)：采用cfb2序列设计的引物及探针的特异性优于cfb1，因此，本发明建立的GBS-ddPCR方法中采用的引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3，所述探针用荧光基团标记。

表1 cfb引物和探针序列

ddPCR反应条件为95℃ 5min；98℃ 10sec，55℃ 30sec、72℃ 10sec，45个循环；72℃ 10min。1％琼脂糖凝胶电泳PCR产物并测序鉴定。

20μL ddPCR扩增体系(20μL)：

2×ddPCR Supermix(10μL)；

10mmol/L引物混合液(各2μL)；

10mmol/L探针(0.5μL)；

GBS COH1菌株DNA(5μL)；

灭菌去离子水(0.5μL)。

1.2.4GBS-ddPCR扩增条件优化

退火温度影响PCR特异性，是PCR反应条件的重要参数，退火温度过高会降低反应的灵敏度，退火温度太低可能引起非特异性扩增。通过优化退火温度确定ddPCR反应程序。

反应程序设置为：

每个温度都需设定升降温速度为2℃/s。

退火温度梯度分别为60℃，59.4℃，58.3℃，56.3℃，53.9℃，52℃，50.7℃，50℃ 8个梯度，用GBS DNA作为模板进行实验，确定最佳的退火温度。

20μL ddPCR扩增体系(20μL)：

2×ddPCR Supermix(10μL)

10mmol/L引物混合液(各2μL)；

10mmol/L探针(0.5μL)；

GBS COH1菌株DNA(5μL)

灭菌去离子水(0.5μL)

1.2.5ddPCR和qPCR检测GBS COH1菌株cfb的拷贝数

根据菌落计数法确保每次提取DNA的菌液浓度基本一致，提取DNA后通过紫外分光光度计测定浓度。根据以下公式将预估浓度后进行10倍稀释后进行ddPCR检测，每次3个副孔，每个副孔检测的模板量为5μl，重复三次实验。

C₂＝(N_A×C₁×10^-9)/(L×660)

C₁为预估浓度，C₂为通过分光光度计检测的DNA浓度(copies/μL)，L为基因组长度(GBS基因组全长约2mb)。

1.2.6GBS-ddPCR的检测下限

将100copies/μL GBS DNA分别用无酶水和含正常人阴道肛周分泌物的DNA中(已通过平板培养和dPCR验证无GBS感染)稀释至10copies/μL、5copies/μL和1copies/μL，评价GBS-ddPCR的检测下限。

1.2.7标本来源和采集方法

收集来自深圳市妇幼保健院产科门诊，取34～37周的孕妇生殖道和直肠分泌物标本182例，标本收集时间2017年2月～2017年10月。

用一次性无菌聚酯纤维拭子采集孕妇阴道和直肠分泌物标本。先擦去外阴过多的分泌物，小心将两个拭子同时插入孕妇阴道内旋转一周，采取阴道下1/3位置的分泌物，再将拭子小心插入肛门，在肛门括约肌上2～3cm处轻柔旋转留取直肠分泌物。将取样后的两份拭子分别加入生理盐水2ml(拭子头全部浸入液体中)送检。

1.2.8GBS-ddPCR检测孕妇阴道肛周分泌物中GBS拷贝数

收集的临床标本分为两份，一份拭子送至检验科细菌室进行培养鉴定(培养方法：Granada选择性培养平板，再放入37℃培养箱培养24～48h。如培养平板上形成橙红色菌落为可疑GBS感染，进一步通过触酶试验和CAMP试验确诊)；另一份拭子12000rpm离心5min后去上清，放置-80℃冻存，2周内根据已知培养结果分为分泌物培养阳性组和阴性组，分别提取上述两组的基因组DNA(纯度OD260/280：1.7～1.9，浓度10～25ng/μL)。采用ddPCR对上述样本进行检测。

1.2.9ddPCR和临床转归相关性分析

对微生物培养法和ddPCR确诊GBS感染的孕妇进行围产期随访。分析临床症状(表2)、胎盘组织病理与ddPCR拷贝数结果。

表2孕母与新生儿可疑感染的临床表现

1.2.9统计学分析

应用统计学分析软件SPSS 21.0进行数据分析。ddPCR和qPCR技术对比数据独立重复3次，检测值与预测值进行相关性分析。组内差异和组间差异通过比较变异系数。平板培养法和ddPCR方法在GBS检测中的敏感性和特异性采用卡方检验；确诊GBS感染的孕妇围产期内临床症状与GBS-ddPCR检测拷贝数的相关性采用Fish确切概率法或卡方检验比较，P＜0.05有统计学意义。

2结果与分析

2.1GBS-ddPCR检测特异性评价

为了确定本发明建立的GBS-ddPCR最适退火温度，将退火温度分别设置为60℃，59.4℃，58.3℃，56.3℃，53.9℃，52℃，50.7℃，50℃ 8个梯度。反应结果如图2(a)，最适合的退火温度范围是52～53.9℃，在该温度范围下，阳性荧光微滴与阴性微滴之间分隔得最开，选取53℃作为退火温度。

为了确定本发明建立的GBS-ddPCR特异性，选取围产期感染率较高的10种病原微生物(表3)和GBS COH1进行检测，将待试菌株的DNA作为检测的模板，检测结果表明只有GBS样本出现阳性微滴(图2(b))，其他病原微生物未出现阳性微滴，表明本发明建立的GBS-ddPCR具有高度的特异性。

表3 GBS-ddPCR检测目的基因的特异性

样本	菌种	ddPCR结果
			E01	A族链球菌	-
E02	溶血葡萄球菌	-
			E03	金黄色葡萄球菌	-
E04	大肠杆菌	-
			E05	肺炎克雷伯菌	-
E06	铜绿假单胞菌	-
			E07	鲍曼不动杆菌	-
E08	李斯特菌	-
			E09	白色念珠菌	-
E10	光滑假丝酵母菌	-
			F01	B族链球菌	+

2.2GBS-ddPCR与qPCR检测性能的比较

为了比较qPCR与ddPCR检测性能，将GBS COH1基因组DNA按10倍梯度稀释后进行ddPCR检测并对检测结果进行线性分析(图3)。结果显示：GBS-ddPCR在10～10⁵copies/20μL范围内R²＝0.9968。在相同GBS基因组DNA浓度梯度范围进行qPCR检测(图3)，R²＝0.9891。表明在10～10⁵copies/20μL的动态范围内，ddPCR和qPCR均有较好的线性关系。

ddPCR组内变异系数1.01～27.45％，qPCR的组内变异系数2.75～47.96％；ddPCR组间变异系数2.67～9.84％，qPCR的组间变异系数12.77～32.96％。以上结果提示ddPCR的重复性优于qPCR。尤其是对于低浓度样品，ddPCR的重复性明显优于qPCR。

表4 qPCR和ddPCR检测GBS COH1基因组DNA的重复性比较(a)组内变异性差异

(b)组间变异性分析

单位：copies/20μL

2.3GBS-ddPCR的临床样本检测下限的确定

模拟人临床标本，将100copies/μL GBS DNA分别稀释至10copies/μL、5copies/μL和1copies/μL。稀释液分别为无酶水和含正常人阴道肛周分泌物的DNA中(已通过平板培养和dPCR验证无GBS感染)，重复三次实验。结果见图5。含有人DNA的样本ddPCR的灵敏度为5copies/20μL，不含人DNA的样本检测下限可达1copy/20μL。

2.4GBS-ddPCR中引物与探针在制备临床诊断孕妇GBS感染的试剂盒中的应用

根据细菌培养法鉴定结果将收集于深圳市妇幼保健院产科的34～37周的孕妇阴道肛周分泌物标本分为GBS感染组(102例)和正常对照组(80例)，并对2组临床标本进行dd-PCR检测，结果见表5。

表5孕妇阴道肛周分泌物ddPCR检测结果

	ddPCR结果(copies/20μL)	计数(例)
			阳性样本	0	0
阳性样本	0～5	2
			阳性样本	5～10	4
阳性样本	>10	96
			阴性样本	0	69
阴性样本	0～5	5
			阴性样本	5～10	2
阴性样本	>10	4

根据GBS-ddPCR检测下限，选取ddPCR检测值＞5copies/20μL作为阳性检测结果。为了评价GBS-ddPCR和微生物培养法的一致性，对表5数据进行卡方检验，结果表明(表6)，GBS-ddPCR的检测敏感性为98.04％(93.10％～99.37％)，特异性为92.5％(84.39％～97.2％)。

表6培养法和ddPCR法检测结果的分析

将确诊的GBS感染孕妇ddPCR检测结果进行ROC曲线分析，以敏感性为纵坐标(即真阳性率)，特异性为横坐标(即假阳性率)绘制ROC曲线分析(见图6)，ddPCR检测的AUC值为0.9946(P<0.0001)，表示GBS-ddPCR检测的敏感性和特异性高。

结合GBS-ddPCR检测结果，对通过培养法确诊GBS感染的孕妇进行后期随访(随访至新生儿≥28天)。结果显示(表7)，阴道肛周分泌物中ddPCR检测出的GBS拷贝数与胎膜早破和新生儿感染成正相关关系。

表7拷贝数与GBS感染后围产期转归的相关性

上述研究结果显示：本发明建立的GBS-ddPCR检测方法的下限为1copies/20μL，不受样本中杂质的影响，保证了检测方法的敏感性和重复性。同时，本发明建立的GBS-ddPCR对阴道肛周分泌物检测结果的AUC值为0.9946(P<0.0001)，表示本检测方法的敏感性和特异性高。另外，本发明建立的GBS-ddPCR灵敏度和重复性优于qPCR，同微生物培养法相比，检测时间明显缩短，且适用于不同临床样本的检测。通过本发明建立的GBS-ddPCR对临床样本检测过程中发现，携带高拷贝数GBS的孕妇出现胎膜早破、新生儿感染机率增加，因此，本发明所述的ddPCR检测GBS试剂盒这一产品可为临床评估孕妇GBS感染提供新的帮助。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> B族链球菌的检测方法及试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaaacattg attgcccagc at 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggaagattt atcgcacctg aaat 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccgccccc cacgatactc ggcgg 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatttgggat aactaagct 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttacatcgtt aacttgagct 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcattttag atccatttgc ttc 23

Claims

1.一种非诊断目的的B族链球菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样本中的DNA并测定其浓度；

(2)使用ddPCR检测样本中B族链球菌cfb基因的拷贝数；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述ddPCR的退火温度为52～53.9℃。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述ddPCR的退火温度为53℃。

4.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述探针在ddPCR的反应体系中，终浓度为0.2～0.3mmol/L。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述探针在ddPCR的反应体系中，终浓度为0.25mmol/L。

6.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述引物中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在ddPCR的反应体系中的终浓度分别为0.8～1.2mmol/L。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述引物中SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2在ddPCR的反应体系中的终浓度分别为1mmol/L。

8.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的样本包括阴道肛周分泌物、血液、脑脊液和尿液。

9.如权利要求1～4任一项所述的检测方法中ddPCR检测的引物与探针在制备B族链球菌的检测试剂盒中的应用。

10.一种B族链球菌的检测试剂盒，其特征在于，包括引物和探针，所述引物为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3，所述探针用荧光基团标记。