CN111801109A

CN111801109A - 能够改善认知功能的肽

Info

Publication number: CN111801109A
Application number: CN201980016736.9A
Authority: CN
Inventors: 大日向耕作; 永井研迅; 小堤大介
Original assignee: Common Law
Current assignee: Common Law
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2019-03-01
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2039-03-01
Also published as: WO2019168149A9; JPWO2019168149A1; JP2023116763A; JP7503179B2; WO2019168149A1; US11464824B2; US20200390846A1; CN111801109B; JP7301810B2

Abstract

本发明解决的课题是提供：具有优异的抑制认知功能劣化并改善认知功能的效果的肽；和所述肽的用途。在本发明中，由式：Tyr‑Leu‑Gly表示的三肽用作认知功能改善用组合物或海马中脑源性神经营养因子表达增强用组合物的活性成分。这些组合物包括食品组合物、食品添加用组合物和药物组合物。

Description

能够改善认知功能的肽

技术领域

本发明涉及抑制认知功能劣化并改善认知功能的肽。本发明还涉及含有所述肽的组合物及其制造方法。

背景技术

2012年，日本厚生劳动省报道，估计在日本有462万人患有痴呆并且400万人患有轻度认知损害(MCI)。数值预计逐年增加(非专利文献(NPL)1)。痴呆是日常生活活动(activities of daily living，ADL)中失能的主要原因，所述日常生活活动是日常生活所必需的基本活动(例如，进食、更衣、移动、排泄、梳理、和洗浴等)(非专利文献2)，并且显著劣化老年人以及例如照顾老年人的家庭等看护者的生活质量。因此，预防痴呆的发展是重要的社会问题。

尽管大规模流行病学研究显示，乳或乳制品的摄入是痴呆的保护因素(非专利文献3)，其机制尚不清楚。另一方面，已报道来自乳蛋白的特定肽可增强记忆和学习功能、和/或认知功能(专利文献(PTL)1至4)。然而，尽管通过用酶消化作为乳蛋白的αs-酪蛋白来获得的由Tyr-Leu-Gly表示的三肽已报道具有抗焦虑的效果(非专利文献4)，尚未阐明其对情景记忆、空间记忆、和脑源性神经营养因子(BDNF)的影响。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2017-008104号公报

专利文献2：日本专利特开2012-012358号公报

专利文献3：日本专利特开2015-154773号公报

专利文献4：日本专利特开2012-031139号公报

非专利文献

非专利文献1：Takashi ASADA等人，2013，城市地区中痴呆的患病率及痴呆的日常生活损害的对策(Prevalence of Dementia in Urban Areas and Measures for Daily-living Impairment in Dementia)，厚生劳动科学研究补助金(Health and LaborScience Research Grants)，痴呆对策综合研究项目(Comprehensive Research Projecton Measures for Dementia)，2011-2012年度综合研究报告(Comprehensive ResearchReport 2011-2012)

非专利文献2：Yoshida D等人2012,J Epidemiol.22:222-229.

非专利文献3：Ozawa M等人,2014,J Am Geriatr Soc.,62:1224-1230.

非专利文献4：Mizushige T,Sawashi Y,Yamada A,Kanamoto R,Ohinata K,Characterization of Tyr-Leu-Gly,a novel anxiolytic-like peptide released frombovineαS-casein,FASEB J.,2013Jul；27(7):2911-7.doi:10.1096/fj.12-225474.Epub2013Apr 11.

非专利文献5：Lais S.S.Ferreira等人,Insulin Resistance in Alzheimer’sDisease,Frontiers In Neuroscience,November 2018,Vol.12,Article 830,1-11

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供具有优异的抑制脑功能、特别是认知功能劣化并改善认知功能的效果的肽，并且提供其用途。更具体地，本发明的目的是提供含有所述肽作为活性成分的认知功能改善用组合物、特别是食品组合物和药物组合物，并且提供所述组合物的制造方法。

用于解决问题的方案

为了解决上述问题，本发明人使用具有由高脂肪饮食诱导的认知功能劣化的小鼠进行了广泛研究，并且确证向所述小鼠口服给予由Tyr-Leu-Gly表示的三肽(下文中也称作“YLG肽”或简称为“YLG”)抑制由高脂肪饮食诱导的情景和空间记忆的降低并改善情节和空间记忆。本发明人还确证向相同的小鼠口服给予YLG肽抑制由高脂肪饮食诱导的海马神经发生的降低并改善海马神经发生。由于向相同的小鼠口服给予YLG肽促进并改善有助于促进神经发生的脑源性神经营养因子(以下也简称为“BDNF”)在海马中的基因表达，YLG肽抑制海马神经发生降低的一个原因也被认为是海马中的BDNT基因(mRNA)表达被促进。基于这些发现，本发明人总结YLG肽摄入可改善由例如痴呆等疾病或老龄而劣化的认知功能，并完成本发明。已基于这些发现完成本发明并且包含以下实施方案。

(I)认知功能改善用组合物和BDNF表达促进用组合物

(I-1)一种认知功能改善用组合物，所述组合物含有YLG肽。

(I-2)一种海马中BDNT表达促进用组合物，所述组合物含有YLG肽。

(I-3)根据(I-1)或(I-2)所述的组合物，其为食品组合物、食品添加用组合物、或药物组合物。

(I-4)根据(I-1)或(I-2)所述的组合物，其为健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品、或患者用食品。

(II)认知功能改善用组合物的制造方法

(II-1)用于抑制认知功能劣化并改善认知功能的组合物的制造方法，所述方法包括向用于抑制认知功能劣化并改善认知功能的组合物添加YLG肽。所述组合物包括BDNT表达促进用组合物。即，所述组合物包括通过促进BDNT表达来抑制认知功能劣化并改善认知功能的组合物。

(II-2)根据(II-1)所述的制造方法，其中所述YLG肽是通过水解食品或食品材料中所含有的蛋白质来获得的肽。

(II-3)根据(II-2)所述的制造方法，其中所述蛋白质是乳蛋白。

(II-4)根据(II-2)所述的制造方法，其中所述YLG肽是通过用源自微生物的酶剂酶处理乳蛋白、或含有乳蛋白的食品或食品材料来获得的。

(II-5)根据(II-1)至(II-4)任一项所述的制造方法，其中所述认知功能改善用组合物是食品组合物、食品添加用组合物、或药物组合物。

(II-6)根据(II-5)所述的制造方法，其中所述食品组合物是健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品、或患者用食品。

(III)YLG肽的用途

(III-1)YLG肽在认知功能改善用组合物的制造中的用途。

(III-2)YLG肽在促进海马中BDNF表达的组合物的制造中的用途。

(III-3)根据(III-1)或(III-2)所述的YLG肽的用途，其中所述组合物是食品组合物、食品添加用组合物、或药物组合物。

(III-4)根据(III-3)所述的YLG肽的用途，其中所述食品组合物是健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品、或患者用食品。

(IV)YLG肽或含有YLG肽的组合物

(IV-1)用于抑制认知功能劣化并改善认知功能的YLG肽或含有YLG肽的组合物。所述YLG肽或含有YLG肽的组合物包括用于抑制或改善由认知功能劣化导致的疾病或症状例如诸如痴呆(脑血管性痴呆，阿尔茨海默症)和健忘(记忆力减退)等记忆损害的YLG肽或含有YLG肽的组合物。

(IV-2)用于促进海马中BDNF表达的YLG肽或含有YLG肽的组合物。

(IV-3)根据(IV-1)或(IV-2)所述的YLG肽或含有YLG肽的组合物，其中所述组合物是食品组合物、食品添加用组合物、或药物组合物。

(IV-4)根据(IV-3)所述的YLG肽或含有YLG肽的组合物，其中所述食品组合物是健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品、或患者用食品。

(V)认知功能的改善方法

(V-1)用于在患有认知功能劣化的受试者或具有认知功能劣化的征兆的受试者中抑制认知功能劣化并改善认知功能的方法，所述方法包括向所述受试者给予YLG肽或含有YLG肽的组合物。

(V-2)根据(V-1)所述的方法，其通过促进BDNF表达来抑制认知功能劣化并改善认知功能。

(V-3)根据(V-1)或(V-2)所述的方法，其中所述组合物是食品组合物、食品添加用组合物、或药物组合物。

(V-4)根据(V-3)所述的方法，其中所述食品组合物是健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品、或患者用食品。

发明的效果

本发明可提供具有优异的改善认知功能的效果的肽并提供其用途。具体地，本发明可提供适用于抑制认知功能劣化并维持或改善认知功能的组合物，特别是，食品组合物、食品添加用组合物、和药品组合物。本发明的认知功能改善用组合物有效抑制认知功能劣化并改善认知功能，具体地，涉及情景记忆的认知功能和/或涉及空间记忆的认知功能。

此外，本发明可提供适用于抑制海马神经发生的降低并维持或促进海马神经发生的组合物，特别地，食品组合物、食品添加用组合物、和药物组合物。本发明可进一步提供适用于抑制海马中脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达的降低并维持或促进BDNF表达的组合物，特别地，食品组合物、食品添加用组合物、和药物组合物。海马中BDNF表达的增加抑制海马神经发生降低并且抑制认知功能劣化，合适地实现认知功能的维持或改善。

附图说明

图1是说明实验例1(1)中进行的行为试验(物体识别试验(object recognitiontest,ORT))的详情(习惯化(Habituation)测试、获得测试(试验1(Trial1))、和试验测试(试验2(Trial 2)))的图。

图2显示ORT的结果。图中，“CD”表示正常饮食组，“HFD”表示高脂肪饮食组，“HFD+YLG”表示给予高脂肪饮食和YLG的组(同样适用于图4至6)。结果以新物体的接近时间对置于正方形旷场中的两个物体的总接近时间的比例(％)(纵轴)表示。

图3是说明实验例1(2)中进行的行为试验(物体定位试验(object locationtest,OLT))的详情(习惯化(Habituation)测试、获得测试(试验1)、和试验测试(试验2))的图。

图4显示OLT的结果。结果以置于新位置的物体的接近时间对置于正方形旷场中的两个物体的总接近时间的比例(％)(纵轴)表示。

图5是显示实验例1(3)中使用脱氧尿苷溴化物(deoxyuridine bromide)进行的海马神经发生评价试验的结果的图。结果以海马的齿状回中的BrdU-阳性细胞的数量表示。

图6是显示实验例1(4)中进行的脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达水平的测定试验的结果的图。结果以海马中BDNF mRNA表达水平表示。

具体实施方式

(I)本发明的组合物

本发明的认知功能改善用组合物和本发明的BDNF表达促进用组合物的特征在于含有YLG肽作为活性成分。

本发明中所使用的术语“认知功能”是指涉及，至少根据情景记忆评价试验(物体识别试验(object recognition test,ORT))评价的情景记忆和/或根据空间记忆评价试验(物体定位试验(object location test,OLT))评价的空间记忆，这两种试验被认为是检验哺乳动物的认知功能的行为试验。“改善认知功能”的表达是指抑制认知功能劣化并改善认知功能，特别是与记忆、即情景记忆和/或空间记忆相关的脑功能。在本发明中，术语“抑制”包括预防和防止的含义。术语“改善”包括维持和改进的含义。因此，在本发明中，短语“改善认知功能”包括以下的至少一种：抑制认知功能劣化，通过抑制认知功能劣化来维持认知功能，和改进认知功能来抑制认知功能的劣化(或维持认知功能)。短语“改善认知功能”还包括，例如已劣化的认知能力的恢复、以及从已显示劣化征兆的症状恢复。

本发明所针对的“认知功能”在不脱离上述内容的情况下包括记忆和学习功能。在该情况下，“改善认知功能”包括抑制随着老年人等衰老发生的记忆和学习能力降低，并改善记忆和学习能力。

如以下实验例1中所示，YLG肽的作用机制被认为如下。具体地，海马中BDNF mRNA表达的降低被抑制、或BDNF mRNA表达被促进或改进，其因此导致认知功能的增强，例如抑制认知功能的劣化或改进认知功能。作为抑制BDNF mRNA表达的降低、或促进或改进BDNFmRNA表达的结果，还预期认知功能的增强，包括记忆和学习功能的改进，例如抑制由衰老导致的记忆降低。从这个意义上来说，本发明的认知功能改善用组合物可被称为“促进海马中BDNF表达的组合物”(BDNF表达促进用组合物)。

在本发明中，“促进BDNF表达”的表述是指抑制哺乳动物的海马中BDNF mRNA表达的降低，并且包括以下中的至少一种：抑制BDNF表达的降低，通过抑制BDNF表达的降低来维持海马中BDNF水平，和促进或改进BDNF表达来抑制BDNF水平的降低(或维持BDNF水平)。

如以下实验例1中所示，抑制海马神经发生的降低被认为由此导致抑制认知功能的劣化并改善认知功能。此外，抑制海马神经发生的降低还被预期由此导致认知功能的增强，包括改善记忆和学习功能，例如抑制由衰老导致的记忆降低。

此外，如以下实验例2中所示，YLG肽具有改善由高脂肪饮食的摄取诱导的胰岛素抵抗的效果(糖尿病改善效果)。作为痴呆的一种的阿尔兹海默症也被称为“脑中的胰岛素抵抗”；胰岛素敏感性和阿尔兹海默症被认为彼此紧密相关(非专利文献5)。因此，YLG肽被认为作为改善胰岛素抵抗的结果，还抑制认知功能的劣化并改善认知功能。

用于本发明的YLG肽可以是化学合成的肽。YLG肽还可以是通过化学或酶促水解来自乳、大豆、小麦、蛋、肉、鱼肉、和海鲜等的蛋白质、多肽原料等来获得的肽。具体地，由于YLG肽序列被包含在至少乳蛋白中、特别是乳的乳清中的αs-酪蛋白，所述YLG肽可以通过对含有αs-酪蛋白的食品或食品原料进行酸水解、用蛋白酶酶处理、或微生物发酵等来产生。作为本发明的组合物，所得制剂(含YLG肽的蛋白水解物)可以直接使用、或可在浓缩后使用、或在喷雾干燥、或冷冻干燥等后作为干燥粉末使用。根据需要，还可以在使用前对其进行纯化至任意程度，例如去除杂质、盐、酶等。

只要可以实现本发明的效果，构成YLG肽的氨基酸可以仅由L型氨基酸组成或仅由D型氨基酸组成。可选地，肽可以由L型氨基酸和D型氨基酸的混合物组成。此外，肽可以仅由天然存在的氨基酸组成、可以仅由添加了任选官能团的修饰氨基酸例如磷酸化或糖基化氨基酸等组成、或可以是其中这两种氨基酸混合的肽。当肽含有两种以上的不对称碳原子时，可使用对映异构体、非对映异构体、或对映异构体和非对映异构体的混合物。

此外，只要表现本发明的效果，YLG肽可以是其药学上可接受的盐或其溶剂化物的形式。在该情况下，在本发明中，术语“YLG肽”包括YLG肽的药学上可接受的盐和YLG肽的溶剂化物。此处使用的药学上可接受的盐包括酸加成盐、金属盐、铵盐、和有机胺加成盐。药学上可接受的酸加成盐的具体实例包括例如盐酸盐、硫酸盐、和磷酸盐等无机酸盐；例如乙酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、柠檬酸盐、和甲磺酸盐等有机酸盐；等。药学上可接受的金属盐的实例包括例如钠盐和钾盐等碱金属盐；例如镁盐和钙盐等碱土金属盐；锌盐；等。药学上可接受的铵盐的实例包括铵和四甲基铵等的盐。药学上可接受的有机胺加成盐的实例包括吗啉和哌啶等的加成盐。

YLG肽的使用形式没有特别限制，只要根据本发明的用途使用即可。例如，YLG肽可用作药物、添加至药物的添加物、食品、和添加至食品的添加物等。本文所使用的术语“食品”与食物和饮料同义，并且以包括饮料的广义使用。本发明中所使用的术语“食品”不仅包括人类用食品、还包括例如宠物和家畜等动物用食品(因此包括饲料和实验饲料)。

(A)食品、食品添加物、和药物的应用

如上所述，本发明的YLG肽或含有YLG肽的食品成分(例如，乳蛋白的水解物)具有改善认知功能、特别是情景记忆和/或空间记忆的效果，并且可用于抑制或改善由认知功能劣化引起的包括例如痴呆(脑血管痴呆、阿尔兹海默症等)等疾病或症状。还可在观察到健忘同时尚未发展上述疾病时使用本发明的YLG肽。健忘是指记忆减退，是一种记忆障碍。此外，本发明的YLG肽或含有YLG肽的食品成分(例如，乳蛋白的水解物)具有通过促进海马中BDNF表达来抑制BDNF表达或海马神经发生降低的效果。因此，本发明的YLG肽或含有YLG肽的食品成分可用于抑制记忆和学习能力的劣化并改善记忆和学习能力。

为了使YLG肽有效作用于人类或动物，本发明的组合物优选以0.00001至100质量％、更优选0.0001至100质量％、且最优选0.001至100质量％的量含有YLG肽。除了YLG肽，本发明的组合物可进一步包括一种以上的用于改善认知功能的其他活性成分。本发明的组合物可与除了YLG肽以外的一种以上的其他活性成分组合给予或摄取。例如，活性成分可以是已知具有例如维持或改进认知功能等效果的化合物或组合物。具体实例包括二十二碳六烯酸(DHA)、和银杏叶提取物(ginkgo biloba extract)等。降低淀粉样蛋白β的组分的实例包括抗淀粉样蛋白β抗体等。

(A-1)食品和食品添加用组合物的应用

本发明的组合物的使用形式的实例包括食品组合物和食品添加用组合物。食品组合物和食品添加用组合物的形式没有特别限制，并且可以是液体、半液体(包括糊剂、凝胶、和溶胶)、或固体。还可以是饮料样形式。食品组合物包括健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、以及例如具有降低疾病风险表示的食品等保健功能食品(特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品)、和患者用食品。例如，可以是对例如乳等食品材料进行微生物发酵来获得的含有肽的乳制品例如酸奶或奶酪等、或麴发酵制品(koji-fermentedproduct)。补充剂可以是通过将YLG肽的干燥粉末与赋形剂、和粘结剂等捏合、然后压片混合物来制造的片剂形式。补充剂也可以是粉末(散剂)、丸剂、胶囊剂、凝胶、和颗粒剂等形式。除了YLG肽或含有YLG肽的蛋白水解物以外，本发明的食品组合物可适当地包括食品用组分(可食用组分)，例如碳水化合物、蛋白质、脂质、维生素类、矿物质类、糖类(例如葡萄糖)、天然或人工甜味剂、柠檬酸、碳酸水、果汁、稳定剂、防腐剂、粘结剂、增稠剂、和/或乳化剂。

当本发明的食品组合物为饮料时，非酒精饮料的实例包括但不限于矿泉水、近水饮料(near water)、运动饮料、茶饮料、乳饮料、咖啡饮料、含果汁饮料、含蔬菜汁饮料、果汁和蔬菜汁饮料、和碳酸饮料等。实例还包括例如无酒精啤酒等酒精含量小于1％的啤酒饮料。矿泉水可以是碳酸的或非碳酸的。

非酒精饮料中的茶饮料是指通过冲泡作为属于山茶属的常青树的茶树的叶(茶叶)或茶树以外的植物的叶、或通过冲泡谷物来饮用的饮料。茶饮料包括发酵茶、半发酵茶、和不发酵茶。茶饮料的具体实例包括日本茶(例如，绿茶和大麦茶)、红茶、花草茶(例如，茉莉花茶)、中国茶(例如，中国绿茶和乌龙茶)、和焙茶(烘烤的绿茶)等。乳饮料包括生乳和乳等，以及将通过使用生乳、乳等制造的食品用作主要原料来制造的饮料。除了通过使用乳等其自身获得的那些以外，乳饮料包括例如由例如营养强化乳、风味添加乳、和糖分解乳等加工乳制造的那些。

当本发明用作食品组合物时，其日摄入量转换为YLG肽的摄入量优选为每成人0.1mg至5g。日摄入量优选1mg至1g、更优选10mg至0.5g。当将本发明的食品组合物添加至各含有一日餐食(single meal)的容器中时，所述容器可各自含有食品组合物使得以转换为每一日餐食的YLG肽摄入量为例如0.1mg至5g的量含有YLG肽，优选1mg至1g、且更优选10mg至0.5g。

本发明的食品组合物可进一步含有被认为具有改善脑功能的效果的以下其他材料和化合物的组合。食品成分的实例包括，例如银杏叶提取物、花生四烯酸(ARA)、GABA、茶氨酸、神经酰胺、咖啡因、肉毒碱、α-甘油磷酰胆碱(α-GPC)、假马齿苋(Bacopa monniera)、DHA结合磷脂质、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、圣约翰草(St.John’s wort)、虾青素、烟酸、吡咯喹啉醌(PQQ)、和辅酶Q10(CoQ10)；例如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等不饱和脂肪酸；例如白藜芦醇等多酚类；绿原酸；和儿茶素；等。这些材料和化合物的待混入量在已确证其功效的已知范围内。

本发明的食品组合物，即抑制认知功能劣化并改善认知功能的食品组合物、以及用于抑制海马中BDNF表达的降低并改善或促进海马中BDNF表达的食品组合物，可通过将YLG肽或含YLG肽的组合物(食品添加用组合物添加至用于上述目的(用于改善认知功能并促进BDNF表达)的组合物中来制造。除了制造方法包括YLG肽或含YLG肽组合物的添加步骤以外，所述方法可根据各食品组合物的标准制造方法来进行。如上所述，YLG肽含有通过水解食品或食品材料中所含有的蛋白质、优选乳蛋白、且更优选酪蛋白来获得的YLG肽。

应用本发明的食品组合物的目标包括需要抑制认知功能劣化并改善认知功能的那些。具体地，本发明的食品组合物可应用于具有由认知功能劣化引发的症状(例如，记忆减退、学习能力减退)者、具有这些症状的征兆者、和潜在发展由认知功能劣化引发的疾病(例如，脑血管痴呆，例如阿尔兹海默症等痴呆，和例如健忘等记忆障碍)者。

(A-2)药物应用

本发明的组合物的使用形式实例包括药物组合物。例如，根据标准方法，通过添加YLG肽作为活性成分并且与例如载体、赋形剂、粘结剂、和稀释剂等药学上可接受的载体或添加物混合可制造药物组合物形式的组合物。药物组合物可口服或肠胃外给药。用于口服给药的形式的实例包括颗粒剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、和糖浆剂等。用于肠胃外给药的形式的实例包括注射剂、滴剂、鼻制剂、经肠给药(经管给药)、和外用制剂等。形式不限于这些。药物组合物优选用于口服给药。

药学上可接受的载体包括赋形剂和稀释剂。实例包括右旋糖酐、蔗糖、乳糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、明胶、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、黄蓍胶、丙烯酸系共聚物、乙醇、生理盐水、和林格氏溶液等。

除了载体以外，可以添加添加物，例如防腐剂、稳定剂、粘结剂、pH调节剂、缓冲液、增稠剂、胶凝剂、和抗氧化剂。这些添加物优选用于药物制造的那些。

本发明的药物组合物可与具有改善脑功能效果的其他药物组合使用。这样的药物的实例包括以下，并且优选市售药物：痴呆治疗剂，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、加兰他敏、卡巴拉汀、他克林等)、NMDA受体拮抗剂(例如，美金刚)等；和抗焦虑药，例如苯二氮平类抗焦虑药。这些药物可与本发明的药物组合物的给药同时、或在其之前、或之后给药。对于市售药物，剂量优选如药物制造商所指示的。

本发明的药物组合物的剂量根据给药形式、患者的年龄和体重、待治疗的症状的性质或严重程度等变化。用于通常口服给药的剂量转换为YLG肽的剂量优选为，例如每天每成人0.01mg至1g。剂量优选0.1mg至0.5g、且更优选1mg至100mg。可根据例如给药途径等各种条件适当地选择剂量。可以对各受试者以每天单一剂量或以每天多个分剂量进行给药。用于本说明书的受试者通常为人类。然而，受试者还包括除人类以外的哺乳动物，例如，宠物如狗。

适用疾病为由认知功能劣化引发的上述症状和疾病，例如痴呆(例如，脑血管痴呆和阿尔兹海默症)等。即，向其应用本发明的药物组合物的患者是患有上述疾病或症状的人。本发明的药物组合物还可应用于具有症状的征兆的患者、疑似患有疾病的患者、和潜在发展疾病的患者。

根据本发明的药物组合物，即，用于抑制认知功能劣化并改善认知功能的药物组合物、和用于抑制海马中BDNF表达的降低并改善或促进海马中BDNF表达的药物组合物，可通过向用于上述目的(改善认知功能或促进BDNF表达)的药物组合物添加YLG肽或含YLG肽的组合物来制造。除了制造方法包括YLG肽或含YLG肽的组合物的添加步骤以外，所述方法可根据各药物组合物的标准制造方法来进行。如上所述，YLG肽包括通过水解食品或食品材料中所含的蛋白质、优选乳蛋白、且更优选酪蛋白来获得的YLG肽。

实施例

以下将参考实验例来描述本发明。然而，本发明不限于这些实验例。

实验例1

将4周龄雄性dd Y小鼠分为3组(每组8只小鼠)。饲养小鼠1周使得以正常饮食(3.85kcal/g：蛋白质20kcal％，碳水化合物70kcal％，和脂质10kcal％)喂养组1、以60％高脂肪饮食(5.24kcal/g：蛋白质20kcal％，碳水化合物20kcal％，和脂质60kcal％)喂养组2和组3。在此期间，每天以10mg/kg/天的量向组3口服给予YLG三肽。

组1：正常饮食组(CD组)

组2：高脂肪饮食组(HFD组)

组3：高脂肪饮食+YLG给予组(HFD+YLG组)

在开始饲养后第6天和第7天，进行已知被认为是认知功能评价系统的两种行为试验(情景记忆评价试验：物体识别试验(ORT)，和空间记忆评价试验：物体定位试验(OLT))，并且使用脱氧尿苷溴化物(BrdU)进行海马神经发生评价试验。在第7天，摘出脑海马，并测定海马中的BDNF mRNA表达水平。

(1)情景记忆评价试验：物体识别试验(Object Recognition Test,ORT)：参见图1

(1-1)试验方法

ORT是评价作为认知功能的一部分的情景记忆的行为试验。如图1所示，试验包括3个测试，即习惯化(Habituation)测试、获得测试(试验1)、和试验测试(试验2)。首先，将小鼠置于正方形旷场中5分钟来习惯化。24小时后，进行获得测试(试验1)。在试验1中，将两个相同的物体置于正方形旷场中，并允许小鼠自由探索物体。当两个物体的总探索时间达到20秒时，将小鼠移出正方形旷场。1小时后，进行试验测试(试验2)。在试验2中，将置于正方形旷场中的两个物体中的一个用一个具有不同形状的新物体替代，并再次将小鼠置于正方形旷场中。在试验2中，测定小鼠对各个物体的接近时间。ORT是基于如果小鼠记住试验1中的物体的形状则小鼠将对试验2中替换的新物体花费更长的接近时间的事实来评价认知功能的实验系统。使用对新物体的接近时间与对两个物体的总接近时间的比例作为指标来评价小鼠的认知功能。在开始饲养后第6天进行习惯化测试，并在第7天进行试验1和试验2。

(1-2)试验结果

图2显示试验结果。如图2所示，评价情景记忆的物体识别试验(ORT)的结果表明，与正常饮食组(CD组)相比，高脂肪饮食组(HFD组)显示出减少的对新物体的接近时间(认知功能劣化)。然而，其中在喂养高脂肪饮食的同时每天口服给予YLG肽的高脂肪饮食和YLG(HFD+YLG组)显示出增加的接近时间，并且其水平恢复至与正常饮食组(CD组)相等的水平(认知功能改善)。这表明YLG肽的口服摄取改善由高脂肪饮食降低的情景记忆。

(2)空间记忆评价试验：物体定位试验(Object Location Test,OLT)：参见图3

(2-1)试验方法

OLT是评价作为认知功能的一部分的空间记忆的行为试验。如图3所示，与以上(1-1)中所述的ORT测试方法相同，该试验包括三个测试，即习惯化(Habituation)测试、获得测试(试验1)、和试验测试(试验2)。区别在于试验2中改变了仅一个物体的位置。OLT是基于如果小鼠记住试验1中物体的位置则小鼠对于试验2中改变位置的物体将花费更长的接近时间的事实来评价认知功能的实验系统。使用对置于新位置的物体的接近时间与对两个物体的总接近时间的比例作为指标来评价小鼠的认知功能。在开始饲养后第6天进行习惯化测试，并在第7天进行试验1和试验2。

(2-2)试验结果

图4显示试验结果。如图4所示，评价空间记忆的物体定位试验(OLT)的结果表明，与正常饮食组(CD组)相比，高脂肪饮食组(HFD组)显示出减少的对置于新位置的物体的接近时间(认知功能劣化)。然而，其中在喂养高脂肪饮食的同时每天口服给予YLG肽的高脂肪饮食和YLG(HFD+YLG组)显示出增加的接近时间，并且其水平恢复至与正常饮食组(CD组)相等的水平(认知功能改善)。这表明YLG肽的口服摄取改善由高脂肪饮食降低的空间记忆。

(3)使用脱氧尿苷溴化物的海马的神经发生评价试验

(3-1)试验方法

在饲养开始后第6天，向各组的小鼠(n＝4)腹腔内给予100mg/kg的脱氧尿苷溴化物(BrdU)，并且在24小时后(第7天)，使用4％多聚甲醛进行灌注固定。然后，提取全脑并冷冻以在冷冻切片机(cryostat)上制造冷冻切片。用抗-BrdU抗体(Abcam)免疫荧光染色制备的冷冻切片，然后在荧光显微镜下计数海马齿状回中BrdU-阳性细胞的数量来评价海马神经发生。在痴呆患者中，海马神经发生降低；然而，已知给予例如乙酰胆碱酯酶抑制剂等痴呆治疗剂增加海马神经发生。

(3-2)试验结果

图5显示试验结果。如图5中所示，与正常饮食组(CD组)相比，高脂肪饮食组(HFD组)显示出降低的BrdU阳性细胞数量，并且观察到海马神经发生降低(认知功能劣化)。然而，其中在喂养高脂肪饮食的同时每天口服给予YLG肽的给予高脂肪饮食和YLG的组(HFD+YLG组)显示出增加的BrdU阳性细胞数量，并且其水平恢复至与正常饮食组(CD组)相等的水平(认知功能改善)。这表明YLG肽的口服摄取促进和增加由高脂肪饮食降低的海马神经发生，并改善认知功能。

(4)脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达测定试验

(4-1)试验方法

在饲养开始后第7天，在麻醉下解剖各组的小鼠(n＝8)，并从脑摘出海马。将摘出的海马保存在RNA later中以进行RNA提取。根据标准方法从海马提取RNA，并合成cDNA。然后，根据标准方法通过RT-PCR测定海马中脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达水平。以类似的方式以海马中β-肌动蛋白mRNA表达水平标准化海马中BDNF mRNA表达水平。

(4-2)试验结果

图6显示试验结果。如图6中所示，结果表明，与正常饮食组(CD组)相比，高脂肪饮食组(HFD组)显示出降低的海马中BDNF mRNA表达水平。然而，其中在喂养高脂肪饮食的同时每天口服给予YLG肽的给予高脂肪饮食和YLG的组(HFD+YLG组)显示出增加的BDNF mRNA表达水平，并且其水平恢复至与正常饮食组(CD组)相等或甚至更高的水平。这表明YLG肽的给予增加涉及神经发生的BDNF表达。

使用通过喂养短期高脂肪饮食以降低海马依赖性记忆来获得的具有劣化的认知功能的模型动物的试验结果确证了：作为来自αs-酪蛋白(牛奶中的主要蛋白质)的三肽的YLG肽的口服摄取改善由高脂肪饮食降低的海马依赖性记忆。海马神经发生的促进和BDNF表达的增加被认为特别有助于该改善。

实验例2：葡萄糖和胰岛素耐受试验

(1)试验方法

(1-1)葡萄糖耐受试验

将十二周龄雄性dd Y小鼠分为3组(n＝8)。饲养小鼠1周使得以正常饮食(3.85kcal/g：蛋白质20kcal％，碳水化合物70kcal％，和脂质10kcal％)喂养组1、以60％高脂肪饮食(5.24kcal/g：蛋白质20kcal％，碳水化合物20kcal％，和脂质60kcal％)喂养组2和组3。在此期间，每天以10mg/kg/天的量向组3口服给予YLG肽。

组1：正常饮食组(CD组)

组2：高脂肪饮食组(HFD组)

组3：高脂肪饮食+YLG给予组(HFD+YLG组)

在饲养开始后第7天，在禁食5小时后给予葡萄糖(2g/kg/p.o.)。第7天的YLG肽的给予在葡萄糖给予前2小时进行。在葡萄糖给予前即刻、和给予后15分钟、30分钟、和60分钟从尾静脉採血以使用葡萄糖感受器(Nipro Corporation)来测定血糖值(blood glucoselevel)。

(1-2)胰岛素耐受试验

和葡萄糖耐受试验一样，将12周龄雄性dd Y小鼠分为3组(n＝6-7)，并且饲养小鼠1周使得以正常饮食喂养组1、以60％高脂肪饮食喂养组2和组3。在此期间，每天以10mg/kg/天的量向组3口服给予YLG肽。在饲养开始后第7天，在禁食5小时后给予胰岛素(0.5U/kg/i.p.)。第7天的YLG肽的给予在胰岛素给予前2小时进行。在胰岛素给予前即刻、和给予后15分钟、30分钟、和60分钟从尾静脉採血以使用葡萄糖感受器(Nipro Corporation)来测定血糖值。

(2)试验结果

表1和2分别显示葡萄糖耐受试验中血糖值的变化和胰岛素耐受试验中血糖值的变化。各表中显示的数值是以葡萄糖或胰岛素给予前即刻的血糖值作为100的相对值。

表1

*P<0.05vs HFD

如表1所示，高脂肪饮食的摄取导致血糖值的增加(HFD组)；然而，YLG肽的摄取抑制了血糖值的增加(HFD+YLG组)。

表2

*P<0.05vs HFD

如表2所示，高脂肪饮食的摄取略微诱导胰岛素抵抗(HFD组)；然而，YLG肽的摄取显示出改善(HFD+YLG组)。葡萄糖耐受试验和胰岛素耐受试验的整体结果确证了YLG肽的摄取改善由高脂肪饮食诱导的胰岛素抵抗。

实验例2的结果表明，YLG肽具有改善胰岛素抵抗并改善糖尿病的效果，因此适用作抗糖尿病用组合物的活性成分。因此，本发明可提供含有YLG肽的抗糖尿病用组合物。此外，本发明可提供YLG肽在抗糖尿病用组合物的制造中的用途，用于改善糖尿病的YLG肽或含YLG肽的组合物，用于在患有胰岛素抵抗的受试者中改善胰岛素抵抗的方法，所述方法包括向受试者给予YLG肽或含YLG肽的组合物，或糖尿病改善方法。

阿尔兹海默症也被称为脑胰岛素抵抗。已知胰岛素敏感性和阿尔兹海默症彼此紧密相关(非专利文献5)。上述结果说明YLG肽具有改善胰岛素抵抗的效果；因此，YLG肽可通过作用于胰岛素抵抗来改善劣化的认知功能。

Claims

1.一种认知功能改善用组合物，所述组合物含有由Tyr-Leu-Gly表示的三肽。

2.一种海马中脑源性神经营养因子表达促进用组合物，所述组合物含有由Tyr-Leu-Gly表示的三肽。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其为食品组合物、食品添加用组合物、或药物组合物。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其为健康食品、功能性食品、营养辅助食品、补充剂、保健功能食品、特定保健用食品、营养功能性食品、功能性表示食品、或患者用食品。