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CN111788484A - 稳定样本中所含蛋白质的方法、用于稳定样本中所含蛋白质的溶液 - Google Patents

稳定样本中所含蛋白质的方法、用于稳定样本中所含蛋白质的溶液 Download PDF

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CN111788484A CN201980016412.5A CN201980016412A CN111788484A CN 111788484 A CN111788484 A CN 111788484A CN 201980016412 A CN201980016412 A CN 201980016412A CN 111788484 A CN111788484 A CN 111788484A
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Abstract

本发明提供一种稳定蛋白质的方法，包括使源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤，源自活体的样本中所含蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白‑结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。根据本发明，能够稳定源自活体的样本中所含血液蛋白质等蛋白质。本发明还提供用于稳定源自活体的样本中所含蛋白质的稳定溶液，以及用于检测源自活体的样本中所含蛋白质的方法以及试剂盒。

Description

稳定样本中所含蛋白质的方法、用于稳定样本中所含蛋白质 的溶液
技术领域
本发明涉及稳定源自活体的样本中所含蛋白质的方法、用于稳定源自活体的样本中所含蛋白质的稳定溶液、以及用于检测源自活体的样本中所含蛋白质的方法及试剂盒。
背景技术
对粪便、尿、唾液等样本中所含蛋白质的检测用于多种疾病的诊断。例如，通过检测粪便样本中血液的粪便隐血检查，能够得到以大肠癌为主的消化器官疾病诊断中的重要信息。关于检测粪便等样本中所含的血红蛋白、结合珠蛋白、血红蛋白-结合珠蛋白复合物等血液蛋白质等的方法，已知有使用针对这些蛋白质的抗体进行检测的免疫学测定方法。
通常，用于隐血检查的样本由受检者自己采集到存入了保存溶液的保存容器中，并运送至医院等的检查机构。多数情况下，运送含有样本的保存溶液(试样)需要数日，在运送中的温度管理一般较为困难，因此多被置于不利于保存的温度条件下。若样本中所含的血液蛋白质等蛋白质因运送时的温度条件等而改性、或被样本中的细菌或酶分解或修饰，表位或者其附近的结构发生变化，则抗体会无法识别这些粪便中所含的蛋白质，而无法通过免疫学测定法进行准确的测定。尤其是血红蛋白在溶液中是不稳定的，高温条件下特别容易改性或分解。
作为稳定保存溶液中血红蛋白的技术，提出了多种方法，例如：添加硫柳汞、洗必泰等抗菌剂的方法(例如，专利文献1)；添加蛋白酶抑制剂的方法(例如，专利文献2)；添加糖苷酶型裂解酶的方法(例如，专利文献3)；添加血红蛋白的酶降解产物的方法(例如，专利文献4)；添加苹果酸等有机酸的方法(例如，专利文献5)；添加氨基羧酸的方法(例如，专利文献6)；以及添加卤代烷磺酸的方法(例如，专利文献7)等。
而且，为了稳定血红蛋白，已知还有添加结合珠蛋白的方法(例如，专利文献8)。已知的是，结合珠蛋白存在于多种动物的血液中，可与血红蛋白快速结合而形成稳定的血红蛋白-结合珠蛋白复合物(Hb-Hp复合物)。通过在保存粪便等样本的保存溶液等中预先添加结合珠蛋白，在加入粪便等样本时，能够将源自活体的样本中所含的血红蛋白转化成稳定的血红蛋白-结合珠蛋白复合物。
然而，因为血红蛋白非常不稳定，即使是这些血红蛋白的稳定方法，也未能充分防止其改性或分解。因此，虽然作为检测便隐血的方法已知有测定比血红蛋白稳定性更好的转铁蛋白的方法(例如，专利文献9)，然而血液中的转铁蛋白只有血红蛋白的1/60左右，因此存在敏感度低的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开昭63-271160号公报
专利文献2：日本特开平3-279859号公报
专利文献3：日本特开昭63-246667号公报
专利文献4：日本特开平11-218533号公报
专利文献5：日本特开2003-14768号公报
专利文献6：日本特开2009-097956号公报
专利文献7：日本特开2016-191580号公报
专利文献8：日本特开平10-132824号公报
专利文献9：日本特开昭63-246668号公报
发明内容
发明要解决的问题
由于在粪便、尿、唾液等源自活体的样本、尤其是粪便中，多存在引起血红蛋白等蛋白质分解或修饰的细菌或酶，因此，即使是血红蛋白-结合珠蛋白复合物这样稳定性较高的蛋白质，有时也会被分解或修饰。
因此，本发明的目的在于，提供一种即使在源自活体的样本中所含的蛋白质容易发生分解或改性等的不利温度条件下也能够提高稳定性的方法。
解决问题的手段
(1)一种稳定源自活体的样本中所含蛋白质的方法，包括使所述源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤，
所述源自活体的样本中所含蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
(2)根据(1)所述的方法，芳基硼酸是选自由苯基硼酸及其衍生物组成的组中的至少一种。
(3)根据(1)(2)所述的方法，芳基硼酸是选自由苯基硼酸、羟基苯基硼酸、羧基苯基硼酸、氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种。
(4)根据(1)-(3)所述的方法，所述步骤是将所述源自活体的样本中所含蛋白质分散在含有所述芳基硼酸的溶液中的步骤，
所述溶液中所述芳基硼酸的浓度为0.1mmol/L以上。
(5)根据(1)-(4)所述的方法，所述步骤是使所述源自活体的样本中所含蛋白质与所述芳基硼酸以及糖共存的步骤。
(6)根据(5)所述的方法，所述糖是选自由糖醇、单糖和二糖组成的组中的至少一种。
(7)根据(5)(6)所述的方法，所述糖是选自由山梨糖醇、葡萄糖、甘露醇、果糖、木糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、和麦芽糖组成的组中的至少一种。
(8)根据(5)-(7)所述的方法，所述步骤是将所述源自活体的样本中所含蛋白质分散在含有所述芳基硼酸和所述糖的溶液中的步骤，
所述溶液中所述糖的浓度为5mmol/L以上。
(9)根据(1)-(8)所述的方法，所述源自活体的样本至少包括血红蛋白，
所述方法包括使该血红蛋白与结合珠蛋白接触而形成血红蛋白与结合珠蛋白的复合物的步骤。
(10)根据(1)-(9)所述的方法，所述源自活体的样本是粪便、唾液、或尿。
(11)一种用于稳定源自活体的样本中所含蛋白质的稳定溶液，
其含有芳基硼酸，
所述源自活体的样本中所含蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
(12)根据(11)所述的稳定溶液，所述芳基硼酸是选自由苯基硼酸及其衍生物组成的组中的至少一种。
(13)根据(11)(12)所述的稳定溶液，所述芳基硼酸是选自由苯基硼酸、羟基苯基硼酸、羧基苯基硼酸、氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种。
(14)根据(11)-(13)所述的稳定溶液，其含有糖。
(15)根据(14)所述的稳定溶液，糖是选自由山梨糖醇、葡萄糖、甘露醇、果糖、木糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、和麦芽糖组成的组中的至少一种。
(16)根据(11)-(15)所述的稳定溶液，其含有结合珠蛋白。
(17)根据(11)-(16)所述的稳定溶液，所述样本是粪便、唾液、或尿。
(18)根据(11)-(17)所述的稳定溶液，所述稳定溶液是用于保存所述源自活体的样本的溶液。
(19)一种检测源自活体的样本中的蛋白质的方法，包括：
在(11)-(18)所述的稳定溶液中添加所述源自活体的样本而得到含有该样本的试样的步骤；和
通过免疫学测定方法检测试样中的所述蛋白质的步骤，
所述源自活体的样本中的蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
(20)根据(19)所述的方法，所述源自活体的样本至少包括血红蛋白，所述试样中的所述血红蛋白与结合珠蛋白形成复合物。
(21)根据(20)所述的方法，所述稳定溶液是(16)所述的稳定溶液。
(22)一种用于检测源自活体的样本中所含蛋白质的试剂盒，包括：
(11)-(18)所述的稳定溶液、和
含有识别所述蛋白质的抗体的试剂，
所述蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
发明效果
根据本发明，能够稳定源自活体的样本中所含血液蛋白质等蛋白质。换句话说，根据本发明，能够防止源自活体的样本中所含血液蛋白质等蛋白质的改性、分解或修饰。因此，根据本发明，能够通过免疫学测定方法准确地测定源自活体的样本中所含蛋白质。
具体实施方式
下面，对本发明优选的实施方式进行说明。
(稳定源自活体的样本中所含蛋白质的方法、蛋白质的稳定溶液)
本发明的一实施方式提供的稳定源自活体的样本中所含蛋白质的方法包括使源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤。在本实施方式中，源自活体的样本中所含蛋白质可以是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
通过使源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存，能够提高源自活体的样本中所含蛋白质的稳定性。含有蛋白质的源自活体的样本可以是粪便、唾液、或尿，也可以是粪便。
使源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的方法没有特别限定，例如可以列举将源自活体的样本中所含蛋白质分散在含有芳基硼酸的溶液中的方法。在此，“分散”包括溶解和悬浮。
作为含有芳基硼酸的溶液，可以列举：用于保存源自活体的样本的保存溶液、用于对将样本分散在了保存溶液中的试样进一步进行稀释的稀释溶液、和用于检测样本中的蛋白质的试剂盒等中的反应溶液等。尤其是，根据本实施方式，由于能够显著提高源自活体的样本中所含蛋白质的稳定性，因此可以优选使用样本的保存溶液。
芳基硼酸可以从已知的芳基硼酸中适当选择。芳基硼酸可以是选自由苯基硼酸及其衍生物组成的组中的至少一种，也可以是选自由苯基硼酸、羟基苯基硼酸、羧基苯基硼酸、氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种，还可以是选自由苯基硼酸、3-羟基苯基硼酸、2-羧基苯基硼酸、3-羧基苯基硼酸、4-羧基苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种，尤其可以是选自由苯基硼酸、3-羟基苯基硼酸、3-羧基苯基硼酸、3-氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种。
上述溶液中的芳基硼酸浓度的下限值优选为0.1mmol/L以上、0.2mmol/L以上、或0.5mmol/L以上。若芳基硼酸的浓度为上述下限值以上，则对源自活体的样本中所含蛋白质的稳定效果更优异。
另外，上述溶液中的芳基硼酸浓度的上限值优选为100mmol/L以下、50mmol/L以下、或30mmol/L以下。若芳基硼酸的浓度过高，则在通过免疫学测定法测定源自活体的样本中所含蛋白质时，表观回收率有时会降低。考虑这不是源自活体的样本中所含蛋白质的稳定效果下降，而是高浓度的芳基硼酸对免疫学测定造成了不利影响。但是，若芳基硼酸的浓度为上述上限值以下，则能够抑制对免疫学测定法的不利影响，能够更准确地进行测定。
但是，即使是在溶液中含有高浓度的芳基硼酸的情况下，在与后述的高浓度的糖共存时，通过芳基硼酸和糖形成复合物，也能够抑制高浓度的芳基硼酸对免疫学测定方法的不利影响。因此，在与高浓度的糖共存的情况下，即使芳基硼酸的浓度是50mmol/L左右，甚至是100mmol/L左右，也可以保证通过免疫学测定法进行准确的测定。
本实施方式的更具体的一方面，可以使芳基硼酸包含在用于使源自活体的样本中所含蛋白质稳定的溶液(稳定溶液)中。例如，在稳定溶液不含后述的结合珠蛋白的情况下，稳定溶液中芳基硼酸浓度的下限值可以是0.1mmol/L以上、0.2mmol/L以上、或0.5mmol/L以上。另外，稳定溶液中芳基硼酸浓度的上限值可以是20mmol/L以下、10mmol/L以下、或5mmol/L以下。
上述步骤可以是使源自活体的样本中所含蛋白质与上述芳基硼酸一起，进而与糖共存的步骤。通过除芳基硼酸外进而与糖共存，能够进一步提高源自活体的样本中所含蛋白质的稳定性。使源自活体的样本中所含蛋白质与糖共存的方法例如可以列举在上述含有芳基硼酸的溶液中还含有糖。
糖可以从已知的糖中适当选择，例如，可以列举：山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇等糖醇；葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等单糖；蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等二糖；低聚糖等。
糖可以是选自由糖醇、单糖和二糖组成的组中的至少一种，可以是选自由山梨糖醇、葡萄糖、甘露醇、果糖、木糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、和麦芽糖组成的组中的至少一种，也可以是选自由山梨糖醇、甘露醇、果糖、和蔗糖组成的组中的至少一种。
但是，由于葡萄糖和果糖等在溶液中形成醛基或酮基的糖(还原糖)会与源自活体的样本中所含蛋白质或作为这些蛋白质的稳定剂添加到溶液中的白蛋白等进行反应(美拉德反应)，对蛋白质进行修饰而生成褐色物质(蛋白黑素)，因此优选为不与蛋白质发生反应的糖。若源自活体的样本中所含蛋白质的表位或其附近被还原糖修饰而结构发生变化，则有时通过抗体无法识别这些源自活体的样本中所含蛋白质，无法通过免疫学测定法进行准确的测定。因此，本实施方式更具体的一方面更优选使用不与蛋白质反应的非还原糖。非还原糖可以是选自由山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、海藻糖、蔗糖、和乳糖组成的组中的至少一种，可以是选自由山梨糖醇、甘露醇和蔗糖组成的组中的至少一种。
糖浓度的下限值优选为5mmol/L以上、10mmol/L以上、或25mmol/L以上。若糖的浓度为上述下限值以上，则与芳基硼酸协同作用，对源自活体的样本中所含蛋白质的稳定效果更为优异。
关于糖浓度的上限值，对于糖醇和单糖可以是1000mmol/L以下、500mmol/L以下、或100mmol/L以下，对于二糖可以是500mmol/L以下、250mmol/L以下、或100mmol/L以下。若糖的浓度为上述上限值以下，因为稳定溶液的粘度不会过高，所以难以对测定造成影响。
用于保存源自活体的样本中所含蛋白质的稳定溶液只要是pH保持在5-10的，优选保持在6-8的缓冲液即可，可以是包括2-吗啉乙磺酸(MES)、羟乙基哌嗪-2-乙磺酸(HEPES)、哌嗪双(2-乙磺酸)(PIPES)等包含古德缓冲液(Good’s buffer)的缓冲液，也可以是磷酸缓冲液、Tris缓冲液或甘氨酸缓冲液。
稳定溶液可以进一步含有抗菌剂、pH调节剂、用于调节离子强度的盐类、表面活性剂、聚集促进剂、保存蛋白质时使用的已知的稳定剂等添加剂。抗菌剂包括叠氮化钠、抗生素、溶菌酶。添加剂包括已知具有稳定蛋白质的作用的已知物质，例如组氨酸、赖氨酸等氨基酸、白蛋白、蛋白酶抑制剂、乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂等。
根据上述的稳定方法或稳定溶液，通过芳基硼酸的作用，或通过芳基硼酸与糖的协同作用，能够提高源自活体的样本中所含蛋白质的稳定性。换句话说，根据上述的稳定方法或稳定溶液，能够防止源自活体的样本中所含蛋白质的改性、分解或修饰，能够保持源自活体的样本中所含蛋白质的表位及其周围部位的结构。因此，在通过免疫学测定方法检测源自活体的样本中所含蛋白质的情况下，能够期待提高检测的准确性。
本实施方式的更具体的一方面，可以包括通过使至少包括血红蛋白的源自活体的样本与结合珠蛋白接触而形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物的步骤。在该情况下，含有血红蛋白的源自活体的样本可以是粪便、唾液、或尿，也可以是粪便。在粪便中，因存在特别多引起血红蛋白的分解或修饰的细菌或酶，因此本实施方式的方法是特别有用的。
含有血红蛋白的源自活体的样本与结合珠蛋白可以任何方式接触，但优选为在含有结合珠蛋白的所述保存溶液中添加含有血红蛋白的源自活体的样本。源自活体的样本中所含血红蛋白与保存溶液中的结合珠蛋白发生快速反应，形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物。然后，通过直接保存添加了源自活体的样本的保存溶液，能够稳定地保存血红蛋白-结合珠蛋白复合物。此外，在血红蛋白与结合珠蛋白的复合物形成过程中，血红蛋白从α链和β链两两缔合的4聚体(α2β2)解离为两个2聚体(αβ)，该现象不等同于本说明书中的“分解”或“改性”。
本实施方式提供的用于稳定含有血红蛋白的源自活体的样本中所含蛋白质的稳定溶液优选为在含有芳基硼酸、或芳基硼酸和糖的上述稳定溶液中进一步添加了结合珠蛋白的溶液。稳定溶液中的结合珠蛋白的浓度取决于源自活体的样本的量，例如，为0.05单位/L-50单位/L、0.1单位/L-10单位/L、或0.2单位/L-2单位/L。在此，1单位表示与1mg的血红蛋白键合的结合珠蛋白的量。上述范围的结合珠蛋白浓度是足以将源自活体的样本中的所有血红蛋白转化为血红蛋白-结合珠蛋白复合物的浓度。
在此，在稳定溶液含有后述的结合珠蛋白的情况下，上述稳定溶液中芳基硼酸浓度的下限值可以是0.1mmol/L以上、0.2mmol/L以上、0.5mmol/L以上、1mmol/L以上、或5mmol/L以上。若芳基硼酸的浓度为上述下限值以上，则芳基硼酸对源自活体的样本中所含血红蛋白的稳定效果与结合珠蛋白对其的稳定效果结合，效果更为显著。
另外，稳定溶液中芳基硼酸浓度的上限值可以是100mmol/L以下、50mmol/L以下、或30mmol/L以下。若芳基硼酸的浓度在上述上限值以下，则能够抑制对免疫学测定法的不利影响，能够进行更准确的测定。
根据上述的一方面提供的稳定方法或稳定溶液，能够以血红蛋白-结合珠蛋白复合物的形式稳定地保存源自活体的样本中所含血红蛋白。换句话说，根据上述的稳定方法或稳定溶液，能够防止源自活体的样本中所含血红蛋白的改性、分解或修饰，能够保持血红蛋白的表位及其周围部位的结构。因此，在通过免疫学测定方法测定源自活体的样本中所含血红蛋白的情况下，能够期待提高检测的准确性。
(源自活体的样本中所含蛋白质的检测方法、检测试剂盒)
本发明的一实施方式提供的检测源自活体的样本中所含蛋白质的方法包括：在用于稳定该蛋白质的上述的稳定溶液中添加源自活体的样本，得到包括源自活体的样本的试样的步骤；和通过免疫学测定方法检测试样中的蛋白质的步骤。
另外，本发明的另一实施方式提供的用于检测源自活体的样本中所含蛋白质的试剂盒包括：上述的稳定溶液、和含有识别源自活体的样本中所含蛋白质的抗体的试剂。
在上述检测方法或检测试剂盒中，源自活体的样本中所含蛋白质可以是选自血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物中的至少一种。
作为本实施方式中使用的稳定溶液，可以列举：用于保存源自活体的样本的保存溶液、用于对将样本分散在了保存溶液中的试样进一步稀释的稀释溶液、和用于检测样本中的蛋白质的试剂盒等中的反应溶液等。作为试剂盒等中的反应溶液，除含有后述的免疫学测定方法中的抗体的溶液以外，还包括用于与试样混合而用于调节测定环境的溶液等。
免疫学测定方法是使用针对源自活体的样本中所含蛋白质的抗体的方法，可以使用已知的免疫学测定方法。免疫学测定方法例如可以是乳胶凝集法、金胶体凝集法等免疫凝集法、免疫层析法、或者ELISA法。
针对源自活体的样本中所含蛋白质的抗体没有限制，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体，还可以是能够识别源自活体的样本中所含蛋白质的、针对源自活体的样本中所含蛋白质的抗体的片段。
针对源自活体的样本中所含蛋白质的抗体只要是能够识别成为测定目标的蛋白质的抗体即可，可以是抗血红蛋白抗体、抗结合珠蛋白抗体、抗血红蛋白-结合珠蛋白复合物抗体。这些抗体可以通过常规方法进行制造。
作为检测源自活体的样本中所含蛋白质、例如血红蛋白的一例，可以如下进行。首先，在存入了保存溶液的容器中添加样本，作为试样。可以将样本在容器内保存任意时间，也可以过滤含有样本的保存溶液作为试样。接着，通过免疫学测定方法、例如乳胶凝集法检测试样中的血红蛋白。更具体地，将含有表面负载了抗血红蛋白抗体的乳胶颗粒的试剂加入试样中。在加入含有乳胶颗粒的试剂之前，可以用稀释液将试样稀释，也可以添加反应溶液。在本方面中，含有芳基硼酸的上述的稳定溶液可以是保存溶液、稀释液、反应溶液中的任一种。在保存溶液为上述的稳定溶液时，特别优选，在该情况下，稀释液及/或反应溶液可以含有芳基硼酸，也可以不含有芳基硼酸。
在源自活体的样本中，血红蛋白可与样本中的结合珠蛋白形成复合物，也可作为游离的血红蛋白存在。因此，优选的是，用于血红蛋白的检测的抗血红蛋白抗体能够识别游离的血红蛋白的表位，还能够识别血红蛋白-结合珠蛋白复合物中的血红蛋白的表位，且不引起与结合珠蛋白的交叉反应。
在试样中存在血红蛋白的情况下，抗血红蛋白抗体识别血红蛋白，负载抗体的乳胶颗粒聚集。测定因聚集而引起的浑浊度的变化，通过使用含有已知浓度的血红蛋白的校准物而作成的校正曲线，求得试样中的血红蛋白浓度。另外，还可以通过根据校准物的血红蛋白的浓度作成的校正曲线，求得试样中的血红蛋白的浓度。
在上述稳定溶液含有结合珠蛋白的情况下，血红蛋白的检测例如可以如下进行。首先，在存入了保存溶液的容器中添加样本，作为试样。可以将样本在容器内保存任意时间，也可以过滤含有样本的保存溶液作为试样。接着，通过免疫学测定方法、例如乳胶凝集法检测试样中的血红蛋白。更具体地，将含有表面负载了抗血红蛋白抗体的乳胶颗粒的试剂加入试样中。在加入含有乳胶颗粒的试剂之前，可以用稀释液将试样稀释，也可以添加反应溶液。
在本方面中，含有芳基硼酸和结合珠蛋白的稳定溶液可以是保存溶液、稀释液、和反应溶液中的任一种。
若保存溶液是含有芳基硼酸和结合珠蛋白的稳定溶液，则特别优选，在该情况下，稀释液及/或反应溶液可以含有结合珠蛋白，也可以不含有结合珠蛋白，进一步地，可以含有芳基硼酸，也可以不含有芳基硼酸。
在本方面中，在样本中存在血红蛋白的情况下，血红蛋白与稳定溶液中所含结合珠蛋白发生反应，形成血红蛋白-结合珠蛋白复合物。不需要样本中的所有血红蛋白都形成复合物，在含有样本的稳定溶液(试样)中可以存在没有与结合珠蛋白形成复合物的血红蛋白，但优选为样本中的所有血红蛋白都与结合珠蛋白形成了复合物。
优选的是，抗血红蛋白抗体能够识别血红蛋白-结合珠蛋白复合物中的血红蛋白的表位，且不引起与结合珠蛋白的交叉反应。
在试样中存在血红蛋白的情况下，抗血红蛋白抗体识别血红蛋白(包括与结合珠蛋白形成了复合物的血红蛋白)，负载抗体的乳胶颗粒聚集。测定因聚集而引起的浑浊度的变化，通过使用含有已知浓度的血红蛋白的血红蛋白-结合珠蛋白复合物的校准物作成的校正曲线，求得试样中的血红蛋白浓度。另外，还可以通过根据校准物的血红蛋白-结合珠蛋白复合物的浓度作成的校正曲线，求得试样中的血红蛋白-结合珠蛋白复合物的浓度。
以上描述的实施方式是了便于理解本发明，并不用于对本发明进行限定。因此，上述实施方式中公开的各元素旨在包括属于本发明技术范围的所有设计变化以及等同物。
实施例
实施例1
制备添加了40mmol/L的HEPES(pH6.8)、0.1％的BSA、0.1％的NaN3、1单位/L的结合珠蛋白、和0-100mmol/L的苯基硼酸的保存溶液。将添加了血红蛋白的粪便样本添加于保存溶液中而使粪便浓度成为0.5％的试样，在37℃下保存0、7、14以及21天。此外，在粪便样本中以使试样中的血红蛋白浓度成为约300μg/L的量的方式添加血红蛋白。代替添加了血红蛋白的粪便样本，将血红蛋白添加于保存溶液，同样地保存使试样中的血红蛋白浓度成为300μg/L的、不含粪便样本的试样。使用乳胶凝集法测定保存的试样中的血红蛋白(Hb)浓度(μg/L)。
使用“OC-Hemodia(注册商标)autoⅢ‘荣研’”(日本荣研化学株式会社制)作为测定试剂，使用“OC-sensor DIANA”(日本荣研化学株式会社制)作为测定装置测定血红蛋白的浓度。上述测定试剂包括负载了抗人血红蛋白兔多克隆抗体的乳胶颗粒。
根据测定的血红蛋白的浓度，计算出相对于将粪便样本加入保存溶液后的血红蛋白浓度(即，加入粪便样本0天后的浓度)的回收率(％)。结果如表1所示。从表1可知，在粪便1、粪便2和粪便3的任一试样中，都通过以0.5mmol/L以上的浓度添加苯基硼酸，试样中的血红蛋白的回收率提高。血红蛋白的回收率随着苯基硼酸浓度的提高而提高，苯基硼酸浓度最大为15mmol/L，在添加50mmol/L以上时表观回收率降低。在不含粪便样本的试样中，并未发现由于添加苯基硼酸引起的回收率的提高。这些结果显示，苯基硼酸稳定了含有粪便的试样中的血红蛋白。此外，由于试样中的血红蛋白作为与保存溶液中所含的结合珠蛋白结合的血红蛋白-结合珠蛋白复合物存在，因此，上述结果意味着苯基硼酸稳定了血红蛋白-结合珠蛋白复合物。
表1
Figure BDA0002659218930000121
Figure BDA0002659218930000131
实施例2
代替实施例1的保存溶液的苯基硼酸，制备分别各添加了15mmol/L的2-羧基苯基硼酸(2-CPBA)、3-羧基苯基硼酸(3-CPBA)、4-羧基苯基硼酸(4-CPBA)、3-羟基苯基硼酸(3-HPBA)和3-氨基苯基硼酸(3-APBA)的保存溶液，与实施例1相同地进行试验。作为比较例，制备不添加芳基硼酸的保存溶液，进行相同的试验。结果如表2所示。从表2可知，即使是使用其他芳基硼酸的情况下，与不添加芳基硼酸的比较例相比，在粪便1、粪便2和粪便3的任一粪便样本中，试样中的血红蛋白的回收率都提高。
表2
Figure BDA0002659218930000132
实施例3
将实施例1的保存溶液的苯基硼酸的浓度固定在15mmol/L，制备进一步添加了50mmol/L或100mmol/L的糖(山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、或甘露醇)的保存溶液、或不添加糖的保存溶液，与实施例1相同地进行试验。作为比较例，制备不添加苯基硼酸和糖的保存溶液，进行相同的试验。结果如表3所示。从表3可知，在苯基硼酸中进一步添加了山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、或果糖的情况下，在粪便1、粪便2和粪便3的任一粪便样本中，试样中的血红蛋白的回收率都进一步提高，尤其是山梨糖醇和甘露醇中的回收率显著地提高。然而，海藻糖、或葡萄糖中，也观察到未发现回收率的提高的粪便样本(粪便3)。这些结果显示，通过在苯基硼酸中进一步添加糖，能够进一步提高含有粪便的试样中的血红蛋白的稳定性，但根据添加的糖的种类不同，效果上会有所差异。在山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、或甘露醇中，山梨糖醇和甘露醇的效果显著，特别是山梨糖醇在粪便样本(粪便1)中完全没有发现回收率的降低。
表3
Figure BDA0002659218930000141
Figure BDA0002659218930000151
实施例4
制备在不含有苯基硼酸的实施例1的保存溶液中添加了100mmol/L的山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、或甘露醇的保存溶液，与实施例1相同地进行试验。为了比较，在不添加这些糖的情况下，进行相同的试验。结果如表4所示。从表4可知，即使在不含有苯基硼酸的保存溶液中添加山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或果糖，含有粪便样本的试样中的血红蛋白的回收率也不会提高。该结果显示，单独的山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、或果糖等糖未稳定含有粪便的试样中的血红蛋白，显示了苯基硼酸与糖需要共同存在。
表4
Figure BDA0002659218930000152
Figure BDA0002659218930000161
实施例5
将实施例1的保存溶液的苯基硼酸固定在15mmol/L，制备添加了10-500mmol/L的山梨糖醇、或者10-250mmol/L的蔗糖的保存溶液、或不添加糖的保存溶液，与实施例1相同地进行试验。作为比较例，制备不添加苯基硼酸和糖的保存溶液，进行相同的试验。结果如表5所示。从表5可知，在粪便1、粪便2和粪便3的任一试样中，含有粪便的试样中的血红蛋白的回收率随着山梨糖醇、或蔗糖的添加浓度的提高而提高，在添加25mmol/L以上时趋于稳定。
表5
Figure BDA0002659218930000162
Figure BDA0002659218930000171
实施例6
代替实施例1的保存溶液的苯基硼酸，制备分别各添加15mmol/L的3-羧基苯基硼酸(3-CPBA)、3-羟基苯基硼酸(3-HPBA)和3-氨基苯基硼酸(3-APBA)，并添加100mmol/L的山梨糖醇、蔗糖，或甘露醇的保存溶液，与实施例1相同地进行试验。作为比较例，制备不添加芳基硼酸的保存溶液，进行相同的试验。结果如表6所示。从表6可知，即使是在使用了其它芳基硼酸的情况下，在进一步添加了山梨糖醇、蔗糖、或甘露醇的情况下，在粪便1、粪便2和粪便3的任一粪便样本中，试样中的血红蛋白的回收率都进一步提高，认为可协同提高含有粪便的试样中的血红蛋白的稳定性。
表6
Figure BDA0002659218930000181
Figure BDA0002659218930000191
实施例7
制备将实施例1的保存溶液的苯基硼酸设为0-50mmol/L，并添加了100mmol/L的山梨糖醇、或甘露醇的保存溶液，与实施例1相同地进行试验。结果如表7所示。从表7可知，在添加了糖的保存溶液中，即使添加50mmol/L的苯基硼酸也未发现表观回收率的降低。考虑该原因是因为，虽然芳基硼酸(高浓度中)具有抑制免疫凝集反应的特性，若存在高浓度的芳基硼酸则会对免疫学测定方法造成不利影响，表观回收率降低，但另一方面，在进一步有高浓度的糖共存的情况下，通过芳基硼酸与糖形成复合物，抑制了高浓度的芳基硼酸对免疫学测定方法的不利影响。
表7
Figure BDA0002659218930000192
Figure BDA0002659218930000201
实施例8
制备添加了40mmol/L的HEPES(pH6.8)、0.1％的BSA、0.1％的NaN3、和0-2.5mmol/L的苯基硼酸的保存溶液。另外，代替苯基硼酸，合并分别各添加了0.5mmol/L的3-羧基苯基硼酸(3-CPBA)、3-羟基苯基硼酸(3-HPBA)以及3-氨基苯基硼酸(3-APBA)的保存溶液而制备。将添加了血红蛋白的粪便样本添加于保存溶液中，制备粪便浓度成为0.5％的试样，将该试样在37℃下保存0、16、38以及62个小时。此外，在粪便样本中添加试样中的血红蛋白浓度为约300μg/L的量的血红蛋白。代替添加了血红蛋白的粪便样本，将血红蛋白添加于保存溶液，同样地保存使试样中的血红蛋白浓度成为300μg/L的、不含粪便样本的试样。使用与实施例1相同的测定试剂和测定装置，通过乳胶凝集法测定保存的试样中的血红蛋白(Hb)浓度(μg/L)。
在本实施例中，由于保存溶液中不含结合珠蛋白，所以与实施例1-7相比，血红蛋白更快分解，但芳基硼酸对血红蛋白的稳定效果在本实施例中也观察到了。即，从表8可知，在粪便1、粪便2和粪便3的任一试样中，通过以0.25mmol/L以上的浓度添加芳基硼酸，试样中的血红蛋白的回收率都提高。另外，与实施例1-7不同，因保存溶液中不含结合珠蛋白，观察到试样中的血红蛋白的大部分未与结合珠蛋白形成复合物而存在。因此，上述结果意味着芳基硼酸也稳定了没有与结合珠蛋白形成复合物的血红蛋白。
表8
Figure BDA0002659218930000202
Figure BDA0002659218930000211
实施例9
将实施例8的保存溶液的苯基硼酸的浓度固定在0.5mmol/L，制备进一步添加了10-250mmol/L的山梨糖醇或蔗糖、或者50-100mmol/L的海藻糖、葡萄糖、果糖或甘露醇的保存溶液，与实施例8相同地进行试验。另外，制备添加苯基硼酸而不添加糖的保存溶液，进一步作为比较例，制备不添加苯基硼酸和糖的保存溶液，进行相同的试验。结果如表9A和9B所示。从表9A和9B可知，即使是不含结合珠蛋白的保存溶液，在苯基硼酸中进一步添加了山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、果糖或甘露醇的情况下，在粪便1、粪便2和粪便3的任一粪便样本中，试样中的血红蛋白的回收率进一步提高。另外，即使在不含苯基硼酸的保存溶液中添加糖，含有粪便样本的试样中的血红蛋白的回收率也不会提高。这些结果显示，即使是不含结合珠蛋白的保存溶液，也可以与实施例2-7相同地得到苯基硼酸与各种糖的协同效果。
表9A
Figure BDA0002659218930000212
Figure BDA0002659218930000221
表9B
Figure BDA0002659218930000222
Figure BDA0002659218930000231
将实施例8的保存溶液的苯基硼酸的浓度固定在0.5mmol/L，另外，代替苯基硼酸，制备分别各添加了0.5mmol/L的3-羧基苯基硼酸(3-CPBA)、3-羟基苯基硼酸(3-HPBA)和3-氨基苯基硼酸(3-APBA)，并添加了100mmol/L的山梨糖醇或蔗糖的保存溶液，与实施例8相同地进行试验。作为比较例，制备不添加芳基硼酸的保存溶液，进行相同的试验。结果如表10所示。从表10可知，即使是不含结合珠蛋白的保存溶液，通过各种芳基硼酸与糖的并用，试样中的血红蛋白的回收率也会进一步提高，观察到能够使含有粪便的试样中的血红蛋白的稳定性协同提高。
表10
Figure BDA0002659218930000241
Figure BDA0002659218930000251

Claims (22)

1.一种稳定源自活体的样本中所含蛋白质的方法，其特征在于，
包括使所述源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤，
所述源自活体的样本中所含蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述芳基硼酸是选自由苯基硼酸及其衍生物组成的组中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述芳基硼酸是选自由苯基硼酸、羟基苯基硼酸、羧基苯基硼酸、氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中，所述使所述源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤是将所述源自活体的样本中所含蛋白质分散在含有所述芳基硼酸的溶液中的步骤，
所述溶液中所述芳基硼酸的浓度为0.1mmol/L以上。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中，所述使所述源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤是使所述源自活体的样本中所含蛋白质与所述芳基硼酸以及糖共存的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述糖是选自由糖醇、单糖和二糖组成的组中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述糖是选自由山梨糖醇、葡萄糖、甘露醇、果糖、木糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、和麦芽糖组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求5-7中的任一项所述的方法，其中，所述使所述源自活体的样本中所含蛋白质与芳基硼酸共存的步骤是将所述源自活体的样本中所含蛋白质分散在含有所述芳基硼酸和所述糖的溶液中，
所述溶液中所述糖的浓度为5mmol/L以上。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中，所述源自活体的样本至少包括血红蛋白，
所述方法包括使该血红蛋白与结合珠蛋白接触而形成血红蛋白与结合珠蛋白的复合物的步骤。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中，所述源自活体的样本是粪便、唾液或尿。
11.一种用于稳定源自活体的样本中所含蛋白质的稳定溶液，其特征在于，
含有芳基硼酸，
所述源自活体的样本中所含蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
12.根据权利要求11所述的稳定溶液，其中，所述芳基硼酸是选自由苯基硼酸及其衍生物组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求11或12所述的稳定溶液，其中，所述芳基硼酸是选自由苯基硼酸、羟基苯基硼酸、羧基苯基硼酸、氨基苯基硼酸和这些硼酸的盐组成的组中的至少一种。
14.根据权利要求11-13中的任一项所述的稳定溶液，其中，含有糖。
15.根据权利要求14所述的稳定溶液，其中，所述糖是选自由山梨糖醇、葡萄糖、甘露醇、果糖、木糖醇、赤藓糖醇、蔗糖、海藻糖、乳糖、和麦芽糖组成的组中的至少一种。
16.根据权利要求11-15中的任一项所述的稳定溶液，其中，含有结合珠蛋白。
17.根据权利要求11-16中的任一项所述的稳定溶液，其中，所述样本是粪便、唾液或尿。
18.根据权利要求11-17中的任一项所述的稳定溶液，其中，所述稳定溶液是用于保存所述源自活体的样本的溶液。
19.一种检测源自活体的样本中的蛋白质的方法，其特征在于，
包括：在权利要求11-18中的任一项所述的稳定溶液中添加所述源自活体的样本而得到含有该样本的试样的步骤；和
通过免疫学测定方法检测试样中的所述蛋白质的步骤，
所述源自活体的样本中的蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白、和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述源自活体的样本至少包括血红蛋白，
所述试样中的所述血红蛋白与结合珠蛋白形成复合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述稳定溶液是权利要求16所述的稳定溶液。
22.一种用于检测源自活体的样本中所含蛋白质的试剂盒，其特征在于，
包括：权利要求11-18中的任一项所述的稳定溶液，和
含有识别所述蛋白质的抗体的试剂，
所述蛋白质是选自由血红蛋白、结合珠蛋白和血红蛋白-结合珠蛋白复合物组成的组中的至少一种。
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