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CN111781175B - 一种用于提高细胞中线粒体活性的方法及装置和应用 - Google Patents

一种用于提高细胞中线粒体活性的方法及装置和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及太赫兹技术领域，尤其涉及一种用于提高细胞中线粒体活性的方法及装置和应用。所述方法包括：使用波长为7‑9μm，辐照度为2‑5mw/cm2的光在25μm‑230μm距离内对细胞进行辐照。在这一辐照条件下，线粒体温度明显上升，进而促使呼吸率上升，驱动ATP的合成和代谢产物的运输，并最终提高细胞的活性。所述装置通过调节辐射源的位置、强度，可选择性地增强特定细胞或组织中线粒体的能量代谢。本发明提供的装置及系统可以显著提高患者细胞内线粒体的温度，进而提高线粒体的活力，起到治疗线粒体疾病的作用，同时不会对细胞造成任何损伤，为线粒体疾病提供了一种新的治疗方法。

Description

一种用于提高细胞中线粒体活性的方法及装置和应用
技术领域
本发明涉及太赫兹技术领域，尤其涉及一种用于提高细胞中线粒体活性的方法及装置和应用。
背景技术
线粒体是绝大多数真核细胞内存在的一种双层膜结构的细胞器，在人类生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等许多方面有着重要的作用。线粒体主要进行两个能量转换过程：三羧酸循环和氧化磷酸化。三羧酸循环可以利用糖代谢产生的丙酮酸来还原生成大量的NADH和FADH，氧化磷酸化是通过线粒体呼吸链利用他们提供的H+来还原O2，生成ATP。线粒体呼吸链是线粒体内进行氧化磷酸化的一组复合物，这些复合物通过氧化还原反应进行电子传递，进而形成足够的质子浓度梯度，然后由复合物Ⅴ(ATP合成酶)生成ATP。
由于各种原因所致的线粒体损伤都可以导致呼吸链的功能障碍，从而影响线粒体功能，使其能量代谢发生异常，导致一系列线粒体疾病。现有技术中的线粒体疾病主要包括：线粒体肌病、线粒体脑病、线粒体心肌病、视神经病、聋病、心血管疾病，代谢疾病(如糖尿病、高胆固醇血症等)，神经退行性疾病(如帕金森病、阿兹海默病等)。传统的药物治疗一直是线粒体疾病治疗的主流，然而到了复杂的细胞环境中，药物的靶向性和药效可能大大降低，且药物的发明发现过程通常漫长而昂贵。有研究发现，温度会对线粒体呼吸链关键代谢酶的活性产生影响，产生ATP的速率也随之发生调控。吸热物种中，物质代谢释放的热量可确保整个生物体内的内部温度稳定，呼吸底物的氧化释放的部分能量驱动ATP的合成和代谢产物的运输。法国科学家Dominique通过自制的温度敏感型荧光探针发现，在38℃的恒定外部温度下，当人类细胞中的呼吸链(RC)完全发挥功能时，线粒体的温度升高了10℃以上。在50℃或略高于50℃时，各种RC酶的活性最大。在此温度下进行测定时，在完整的线粒体中测得的呼吸链(RC)活性可以增加至三倍。
发明内容
为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供一种用于提高细胞中线粒体活性的方法及装置和应用。
第一方面，本发明提供一种提高细胞中线粒体活性的方法，包括：
使用波长为7-9μm，辐照度为2-5mw/cm2的光在25μm-230μm距离内对所述细胞进行辐照。
进一步地，所述提高细胞中线粒体活性为提高线粒体温度、提高线粒体的呼吸率、提高细胞的ATP合成能力中的一种或多种。
在现有技术中，太赫兹波科学技术得到了很大发展，已经涉及物理化学、生物医学、航空航天、新波段通讯技术等诸多领域，本发明在实验过程中，偶然发现，线粒体对于太赫兹波段内的7-9μm波长的光有特征吸收，在经过一段时间的辐照后(10s以内)，线粒体温度提高，RC酶活性增强，呼吸率上升，并进一步驱动ATP的合成和代谢产物的运输，并且在持续照射100s后，效果趋于稳定。
据此，本发明提供了使用波长为7-9μm辐照度为2-5mw/cm2的光在25μm-230μm距离内对细胞进行辐照以提高线粒体活性的方法，此方法针对的是细胞中的线粒体，对于正常以及病变的细胞均可以生效，故可以应用于非疾病治疗领域，例如：制备成一种保健装置，该保健装置可以稳定在25μm-230μm距离内辐照度为2-5mw/cm2光功率辐照7-9μm波长的光，可以对正常人体也起到照射区域细胞中线粒体活性升高的作用，同时波长为7-9μm的波具有类似于X射线的穿透能力，而其光子能量只有X射线光子能量的百分之一，不会对活体产生光致电离的损害。在本发明中，辐照度影响细胞的温度提升速率，在2-5mw/cm2范围内，细胞不会因辐照度过低而不产生响应，也不会因为辐照度过高而温度提升过快，致使细胞死亡。
本发明进一步提供一种治疗线粒体疾病的方法，包括：使用波长为7-9μm，辐照度为2-5mw/cm2的光在25μm-230μm距离内对待治疗区域进行辐照。
第二方面，本发明提供一种用于治疗线粒体的装置，包括：
脉冲电源、电磁辐射转换器和载物容器；
所述脉冲电源和所述电磁辐射转换器相连接；
所述电磁辐射转换器接收所述脉冲电源的脉冲电流后，产生电磁辐射，并进一步将所述电磁辐射传递至所述载物容器中。
进一步地，所述电磁辐射转换器通过光纤将所述电磁辐射传递至所述载物容器中；所述光纤一端与所述电磁辐射转换器连接，另一端位于所述载物容器中，并与所述载物容器中的检测物距离为25μm-230μm；所述光纤优选为毫米级的Se化物中远红外光纤，更优选为多模光纤。
进一步地，所述光纤靠近所述载物容器的一端的端口还设有四维光纤耦合装置。
进一步地，所述四维光纤耦合装置以非球面透镜作为系统的耦合透镜。
通过四维光纤耦合装置可以灵活调整光纤发出的光的功率。
进一步地，在所述载物容器中，光纤的一端可以在所述载物容器内灵活移动，只要可以在25μm-230μm距离内对目标物进行辐照即可。
进一步地，所述载物容器优选为培养皿，培养皿中装载有生物组织，电磁辐射转换器发出7-9μm波长的光通过所述光纤直接对所述生物组织进行辐照，光的辐照强度可以通过脉冲电源进行调整。
进一步地，所述载物容器可根据实际需要进行调整，例如用作保健装置的功能来提高细胞活性时，可以将光纤直接对目标区域按照波长和距离的规定直接照射；在需要对患者进行治疗时，可以直接调整光纤的位置，直接辐照患者的待治疗区域。
长期以来，可靠的激发光源是制约太赫兹发展的瓶颈之一。近年来随着超快激光以及半导体技术的发展，使得太赫兹脉冲的产生所得以保障，这大大促进了太赫兹波在生物医学领域的研究应用。本发明提供的辐照装置可以持续稳定地输出一定波长的太赫兹光。
通过本发明的装置可以显著升高活细胞内线粒体温度，使用线粒体温度探针MTY对线粒体温度进行表征发现激光照射可在短时间内(1-10s)使线粒体温度发生显著上升。
本发明进一步提供所述方法和所述装置在制备用于提高细胞活性的保健装置中的应用。
本发明进一步提供所述方法和所述装置在制备所述用于治疗线粒体疾病的系统中的应用。
2017年发表于BioRxiv上的一篇研究报告中，研究人员发现，人类机体细胞线粒体的内部温度在“运行”时温度或可高达50℃，此温度下，在完整的线粒体中测得的呼吸链(RC)活性可以增加至三倍，研究人员还对代谢强于正常细胞的人类皮肤癌细胞、肾癌细胞以及肺癌细胞的线粒体进行了研究，结果表明这些细胞的温度相比预期更高。
本发明具备如下有益效果：
1、本发明通过波长为7-9μm，辐照度为2-5mw/cm2的光在25μm-230μm距离内对细胞照射，可以显著提升细胞中线粒体的温度，进而提高细胞活力。
2、本发明提供了一种7-9μm辐照发生装置，可以在1-10s内使线粒体温度发生显著上升，为治疗线粒体疾病提供了一种更为方便有效的途径，以优化现有的治疗手段。
3、波长为7-9μm的波具有类似于X射线的穿透能力，而其光子能量只有X射线光子能量的百分之一，不会对活体产生光致电离的损害。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的辐照装置的结构说明图；
图2为本发明实施例2提供的单细胞线粒体荧光检测装置示意图；
图3为本发明实施例2提供的单细胞线粒体荧光检测装置细胞培养皿与光纤俯视局部示意图；
图4为本发明实施例3提供的细胞群实验平台示意图；
图5为本发明实施例4提供的辐照下荧光探针荧光强度变化结果；其中，A是HT22细胞给予辐照干预(图中101s-480s)，激光共聚焦显微镜记录的0-500s MTY荧光强度变化；B和C是辐照干预与荧光强度的关系；
图6为本发明实施例4线粒体氧化磷酸化过程示意图；
图7为本发明实施例4提供的线粒体温度对呼吸链影响的示意图；
图8为本发明实施例5提供的辐照对细胞活性氧水平的影响结果。
其中1、脉冲电源；2、电磁辐射转换器；3、光纤；4、培养皿；5、太赫兹发生装置；6、光纤；7、Confocal支架；8、激光发生装置；9、细胞培养皿；10、倒置激光共聚焦显微镜；11、载物台；12、物镜；13、太赫兹源；14、恒温箱；15、铁板；16、培养皿；17、温度调节器；18、铁架台。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1辐照发生装置的组装
本实施例提供一种可定向辐照生物细胞或组织的辐照发生装置，如图1所示，该装置由脉冲电源1、电磁辐射转换器2和光纤3组成。搭建时用导线将脉冲电源1和电磁辐射转换器2连接，光纤3组装到电磁辐射转换器上。电源接通后，脉冲电源1会产生特定频率(实验时为50kHZ)的脉冲电流，脉冲电流通过电磁辐射转换器2后，产生相应频率的电磁辐射。电磁辐射2可通过光纤传递。光纤一端与加药系统进行固定，另一端浸入细胞培养皿中，浸入细胞培养皿一端的光纤端口设有四维光纤耦合装置，四维光纤耦合装置以非球面透镜作为系统的耦合透镜。
实施例2单细胞荧光检测系统的搭建
本实施例提供一种可实时观测细胞中线粒体温度变化状况的装置。使用激光共聚焦专用培养皿培养细胞，如图2所示，包括太赫兹发生装置5、光纤6、Confocal支架7、激光发生装置8、细胞培养皿9和倒置激光共聚焦显微镜10，其中太赫兹发生装置5通过光纤6传递光，光纤6通过Confocal支架7固定，另一端靠近细胞培养皿9，激光发生装置8和倒置激光共聚焦显微镜10共同对细胞培养皿9中的荧光分子进行激发，检测。
图3为图2中细胞培养皿处的俯视局部放大图，细胞培养皿9设置在载物台11上，在细胞培养皿9正下方设置有倒置激光共聚焦显微镜10的物镜12，光纤6伸入细胞培养皿9中用于辐照细胞培养皿中的生物材料。
该单细胞荧光检测系统的使用方法如下：
当细胞密度为50％时，按照观察目的对细胞进行荧光探针标记，实施辐射干预。启动太赫兹发生装置5，利用辐照源对应的碳卡，检测光纤端口处是否正常输出辐照。
将光纤端口接入细胞培养皿9，按照设定时间对细胞进行辐照(辐照范围为距离光纤端口约25μm-230μm范围内细胞)，倒置激光共聚焦显微镜10实时记录细胞荧光变化。
本装置适用于辐照干预后，在单细胞水平对细胞结构与功能进行荧光观察。如线粒体温度探针MTY的观察，线粒体特异性氧化损伤探针(如mito-timer，mito-red-sox)的荧光观察。细胞观测在激光共聚焦荧光检测系统(蔡司700，xy平面分辨率最高可达0.1nm)完成。
实施例3细胞群实验平台的搭建和细胞干预
本实施例提供一种可以对细胞群实施辐照的装置，辐射面积可覆盖48孔板一孔，适用于48孔板或96孔板接种细胞后的辐射干预和细胞功能参数测定。该装置如图4所示，由一个太赫兹源13、铁架台18(上由底部带小孔的铁板15)和下有小孔的恒温箱14搭建而成。铁板15安装于铁架台1上，用于支撑恒温箱14，恒温箱14底部小孔和铁板15的小孔重叠以便透过光照照射到放置在恒温箱14内的培养皿16。恒温箱14内部温度可通过温度调节器17按照细胞培养要求设定。太赫兹源13发出的光直接透过铁板15的小孔以及恒温箱14底部小孔照射至培养皿。
细胞干预方案为：细胞单层平铺培养在48孔细胞培养板中，待细胞密度达到90％时进行辐照干预实验。调节恒温箱14使其内部温度保持在37℃，并将48孔板(相当于培养皿16)放在37℃恒温培养箱内，将铺有细胞的测试单孔正对源的辐照出口，同时调整端口的高度，辐照端口尽量接近细胞培养板底部。调整好高度后，打开太赫兹源13进行辐照。此装置可用于细胞群体活力和功能指标测定，如：细胞氧化应激(ROS水平)：测定细胞内活性氧生成水平，反映细胞氧化应激状态；线粒体膜电位(JC-1染色)：测定细胞内线粒体膜电位水平，反映线粒体功能。
实施例4辐照对线粒体温度的影响检验
采用实施例2得到的单细胞荧光检测系统开展实验(参照图2)。本实验事先对实施例2中光纤发出的光强度进行检测，最大可达到6.45mw/cm2。本实验利用线粒体温度敏感性探针MTY对正常神经细胞HT22进行染色，在辐照条件下(波长为7-9μm，辐照度在2-5mw/cm2范围内)，利用激光共聚焦显微镜实时观察MTY荧光强度的变化。
实验结果如图5所示，图A是HT22细胞给予辐照干预(图中101s-480s)，激光共聚焦显微镜记录的0-500s MTY荧光强度变化。图B和图C是辐照干预与荧光强度的关系。实验结果表明，在辐射下，MTY的荧光强度有明显的降低趋势，提示辐射可引起线粒体温度上升。
图6为人体内ATP的合成途径(氧化磷酸化)，而温度会对线粒体氧化磷酸化过程呼吸链关键代谢酶的活性产生影响，温度上升，RC酶活性增强，进而促使呼吸率上升，驱动ATP的合成和代谢产物的运输，并最终提高细胞的活性(如图7所示)。
实施例5辐照是否会造成细胞氧化损伤的检验
本实施例采用实施例3中的细胞群实验平台(参照图4)。HT-22细胞培养至合适密度，置激光源辐照(波长为7-9μm)，辐射时间分别为5min，10min，20min及30min。采用MTT和活性氧荧光染料DCF进行细胞染色，检测辐照对活性氧水平的影响。
在使用时，太赫兹源13紧贴铁板15，使得太赫兹源13发出的光到达培养皿时辐照度保持在2-5mw/cm2范围内。
结果如图8所示，结果显示，在实验组与对照组之间，活性氧含量未发生显著变化，说明辐照未对细胞造成明显氧化损伤。
这些结果有力的证明了线粒体对特定波段的7-9μm波长光的辐照有特征吸收，可有效的提高线粒体的温度，从而起到保健作用提高正常人的细胞活力，或治疗由于能量代谢异常引起的线粒体疾病，且不会对细胞造成氧化损伤。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种提高细胞中线粒体活性的方法，其特征在于，包括：使用波长为7-9μm，辐照度为2-5mw/cm2的光在25 μm-230 μm距离内对细胞进行辐照；
所述提高细胞中线粒体活性为提高线粒体温度、提高线粒体的呼吸率、提高细胞的ATP合成能力中的一种或多种。
2.权利要求1所述方法在制备用于提高细胞活性的保健装置中的应用。
3.权利要求1所述方法在制备用于治疗线粒体疾病的系统中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述线粒体疾病为ATP产生不足，能量代谢异常导致的疾病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述线粒体疾病为心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病、线粒体肌病、线粒体脑肌病中的一种或多种。
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