CN111778222B

CN111778222B - 一个能在真菌中产生黄酮类化合物的nrps-pks杂合蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN111778222B
Application number: CN201910271880.9A
Authority: CN
Inventors: 尹文兵; 周爽; 张宏娇; 李自馨
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-04-04
Filing date: 2019-04-04
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2039-04-04
Also published as: CN111778222A

Abstract

本发明涉及一种NRPS‑PKS杂合蛋白、载体、重组菌及其蛋白和黄酮类化合物的制备方法。该NRPS‑PKS杂合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该NRPS‑PKS杂合蛋白在异源表达时可以产生黄酮类化合物柚皮素查尔酮和柚皮素。

Description

一个能在真菌中产生黄酮类化合物的NRPS-PKS杂合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明总地涉及基因工程技术领域，具体涉及NRPS-PKS杂合蛋白、载体、重组菌及其蛋白和黄酮类化合物的制备方法。

背景技术

真菌作为自然界第二大类生物，其次级代谢产物是天然药物的重要来源。已应用于临床治疗的真菌次级代谢产物有青霉素、灰黄霉素、环孢素A、洛伐他汀以及生物碱等。其合成酶主要分为四类：聚酮合酶(Polyketide synthases,PKSs)、非核糖体多肽合成酶(Non-ribsomal peptide synthases,NRPSs)、萜类合成酶 /环化酶(Terpene synthases/cyclases,TCs)以及二甲丙烯基色氨酸合成酶(Dimethylallyl tryptophan synthases,DMATSs)。除此之外，真菌中还存在一类PKS和NRPS杂合酶也能催化次级代谢产物的生成。杂合酶分为 PKS-NRPS和NRPS-PKS两种，其结构的复杂多变导致其产物有着多样的生物活性。

但是，大量真菌转录组测序表明，实验室常规培养条件下真菌中超过90％的次级代谢产物合成基因簇处于沉默状态，无法表达获得相应的产物，极大地限制了新代谢产物的发现及其合成机制研究。同时，部分原生菌株培养周期长、遗传操作困难等也增加了研究难度。

黄酮类化合物是具有2-苯基色原酮结构母核、含有两个酚羟基苯环并通过中央三个碳原子相互连接而成的一类化合物。黄酮类化合物常见于植物体中，研究表明黄酮类化合物具有多种生物活性和药理活性，如抗菌活性、抗肿瘤活性、抗氧化活性、抗凝血作用、免疫调节等，对糖尿病和老年性痴呆等疾病也有一定治疗作用。因此，快速、高效地获取大量黄酮类化合物对生产和生活具有重要意义。

黄酮类化合物的制备一般采用化学或生物合成法。生物合成法比化学合成法具有更多优势，如选择性强、效率高、反应种类多、反应条件温和及环境污染小等；而相对于从植物体内获得黄酮类化合物，真菌体系具有生长周期短、营养要求较低、适应环境能力和繁殖能力强、产物分离简单等特点。

但目前，从真菌中分离得到黄酮类化合物的研究只有一例(Biosynthesis ofChlorflavonin in Aspergillus candidus:A Novel Fungal Route toFlavonoids.J.C.S.CHEM.COMM.,1979)，且并没有报道证明在真菌中找到黄酮类化合物的合成基因。

发明内容

基于前述背景技术，本发明涉及了一个能在真菌中产生黄酮类化合物的NRPS-PKS杂合蛋白及其编码基因与应用。该蛋白来源于植物内生真菌无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici CGMCC3.15140)，大小约为293.1kDa。其基因编号为PFICI_04360，编码序列全长为8154个核苷酸，可编码一个含2717个氨基酸的蛋白。PFICI_04360 基因及其编码蛋白在异源表达时可以产生黄酮类化合物柚皮素查尔酮和柚皮素。

本发明提供了一种NRPS-PKS杂合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

可选地，根据前述的杂合蛋白，编码所述杂合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种载体，其核苷酸序列包括编码前述杂合蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供了一种重组菌，其为将前述的载体导入出发菌株获得。

可选地，根据前述的重组菌，所述出发菌株为曲霉属或酵母属中的菌株。优选地，所述出发菌为构巢曲霉或酿酒酵母。

本发明还提供了一种前述杂合蛋白的制备方法，包括：发酵前述的重组菌。优选地，所述出发菌为酿酒酵母。优选地，所述制备方法在发酵前述的重组菌后还包括：蛋白纯化。

本发明还提供了一种黄酮类化合物的制备方法，包括：发酵前述的重组菌。

可选地，根据前述的制备方法，所述黄酮类化合物为柚皮素和/或柚皮素查尔酮。

可选地，根据前述的制备方法，所述重组菌的出发菌株为曲霉属中的菌株。优选地，所述黄酮类化合物为柚皮素查尔酮。优选地，所述制备方法在发酵前述的重组菌后还包括：萃取和分离黄酮类化合物。所述萃取黄酮类化合物为萃取发酵产物获得粗浸膏。所述萃取条件为采用乙酸乙酯超声萃取。所述分离黄酮类化合物为采用正向硅胶柱色谱经二氯甲烷/甲醇梯度洗脱粗浸膏，获得所述黄酮类化合物。

可选地，根据前述的制备方法，所述重组菌的出发菌株为酵母属中的菌株，发酵底物选自对羟基苯甲酸、香豆酸、对羟基苯甲醛和苯甲酸中的一种或多种。优选地，所述发酵底物浓度为0.1-10mg/ml。优选地，所述黄酮类化合物为柚皮素。优选地，所述制备方法在发酵前述的重组菌后还包括：萃取和分离黄酮类化合物。所述萃取黄酮类化合物为萃取发酵产物获得粗浸膏。所述萃取条件为采用乙酸乙酯超声萃取。所述分离黄酮类化合物为采用正向硅胶柱色谱经二氯甲烷/甲醇梯度洗脱粗浸膏，获得所述黄酮类化合物。

无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici CGMCC3.15140)是从茶树枝条分离的一株植物内生菌，全基因组测序及生物信息学分析显示无花果拟盘多毛孢含有76个次级代谢产物合成基因簇，然而转录组测序显示实验室条件下仅有10个次级代谢产物基因簇能够表达，极大限制了次级代谢产物的多样性。因此，通过改变培养条件、利用表观调控和全局调控因子以及异源表达等策略激活沉默基因簇的表达对获得具有良好生物活性的新化合物具有重要意义。且利用遗传背景清楚、分子生物学操作容易且遗传系统成熟的模式菌株进行异源表达，能够高效、快速的获得相应基因的表达产物并且在背景简单清晰的菌株中进行合成机制研究。

本发明通过对基因组进行生物信息学分析，利用异源表达的策略，在模式真菌酿酒酵母和构巢曲霉中表达无花果拟盘多毛孢中的沉默的NRPS-PKS杂合酶，获得了黄酮类化合物柚皮素查尔酮和柚皮素，丰富了黄酮类化合物的来源，同时为高效获得大量黄酮类化合物做出了重要贡献。

附图说明

图1为实施例1pYWL82酶切验证图；

图2为实施例1pYWL82定点插入构巢曲霉示意图；

图3为实施例2构巢曲霉突变株粗提物的HPLC分析图；

图4为实施例2构巢曲霉突变株粗提物的HPLC分析图；

图5为实施例3柚皮素查尔酮的分离流程以及HPLC分析，其中A为柚皮素查尔酮的分离流程，B为柚皮素查尔酮的HPLC分析；

图6为实施例4pYZX10的构建及其酶切验证，其中，A为pYZX10的设计方案，B为pYZX10质粒的酶切验证；

图7为实施例4的转化子PCR验证；

图8为实施例5的PFICI_04360蛋白纯化的SDS-PAGE分析；

图9为实施例6的柚皮素HPLC分析图谱；

图10为实施例3的柚皮素查尔酮的核磁图谱；

图11为实施例6的柚皮素的核磁图谱；

图12为柚皮素和柚皮素查尔酮的化学结构式。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

所述构巢曲霉(Aspergillus nidulans)LO8030、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BJ5464等菌株可通过商业途径购买得到(如中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC等)。

本文提及的“出发菌株”是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。

本文所使用的启动子没有特别限制，只要能够起到RNA聚合酶识别、结合和开始转录的功能即可，例如gpdA、AMAI等

实施例1 PFICI_04360基因在构巢曲霉中异源表达菌株的构建

构巢曲霉LO8030作为此实施例基因改造的出发菌株。

本实施例所用基因PFICI_04360(如SEQ ID NO.2所示)来自无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici CGMCC3.15140)，以无花果拟盘多毛孢基因组为模板，利用高保真酶以及如下引物进行PCR扩增，将其分成3段进行克隆，各片段间含有约150bp左右overlap序列。

Name	Oligonucleotide sequence(5’-3’)
		PF4360-1for	ttcagtatattcatcttcccatccaagaacctttaatcgggcagttcacctccttgacc
4360-R1	ggaggatccaagaccaagatg
		4360-F2	gactggttgcttcattggcacg
4360R2	ggagaatggcagtcgaatctgg
		4360F3	gtcagcacgacaacgagctc
PF4360-3rev	cacaacatatttcgtcagacacagaataactctcgctagcgtgctaattccgacaagcc

然后利用酵母组装技术(具体原理和操作见文献：Muller,NarayanaAnnaluru,Joy Wu Schwerzmann,Sarah M.Richardson,Jessica S.Dymond,EricM.Cooper,Joel S.Bader,Jef D.Boeke,Srinivasan Chandrasegaran.Assembling LargeDNA Segments in Yeast,Protocol Gene Synthesis of the series Methods inMolecular Biology.2012(852):133-150)将PFICI_04360(即前述克隆的3段overlap序列)组装到pYH-wA-gpdA-pyrG质粒(pYH-wA-gpdA-pyrG质粒的构建为：以pYH-wA-pyrG为出发质粒，将gpdA片段通过同源重组的方式连接到出发质粒上；pYH-wA-pyrG质粒参见文献：Yin,W.-B.,Chooi,Y.H.,Smith, A.M.,Cacho,R.A.,Hu,Y.,White,T.C.,and Tang,Y*.Discovery of cryptic polyketide metabolites from dermatophytes usingheterologous expression in Aspergillus nidulans.ACS Synth.Biol.2013,2(11):629-634.) 上，获得PFICI_04360异源表达质粒pYWL82。pYWL82重组质粒的酶切验证如图1所示，如图可知， PFICI_04360已成功连接到pYH-wA-gpdA-pyrG质粒。

利用PEG介导的原生质体遗传转化方法对构巢曲霉进行遗传转化(转化方法同专利：构巢曲霉异源表达系统的构建及其应用，申请号：201710283508.0公布号：CN108795970A，具体为其说明书中0039段-0047 段)，然后挑取转化子并提取基因组DNA，利用PCR方法对转化子进行鉴定，获得PFICI_04360异源表达菌株。pYWL82定点插入构巢曲霉的示意图见图2。

实施例2 PFICI_04360基因在构巢曲霉中异源表达产物的HPLC验证

为验证基因异源表达的产物，将实施例1获得的PFICI_04360异源表达菌株和构巢曲霉LO8030分别在大米培养基(每个500mL三角瓶中加入80g大米、1.2g YE、115mL水，营养缺陷按照突变株的基因型添加，121℃高压蒸汽灭菌30mim)中25℃培养12天，然后进行化合物萃取，萃取得到的化合物通过高效液相色谱HPLC分析方法来检测PFICI_04360在构巢曲霉中的异源表达产物。结果见图3和图4。

在下述条件下进行萃取：将培养12天获得菌丝和培养基进行化合物萃取。将培养物分成小块置于三角瓶中，加入2倍体积MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)进行超声萃取(超声频率100Hz，时间为 1小时)，期间晃动三角瓶使萃取更充分；收集提取液转移至100mL旋蒸瓶，利用旋转蒸发仪将液体蒸干 (温度30℃，转速100rpm/min，真空度<3mm Hg)；蒸干后用800μL分析纯甲醇溶解，使用有机相微孔滤膜过滤掉不溶于甲醇的物质，使稀释适当浓度进样20μL，100％甲醇冲柱，进行HPLC分析。在下述条件下进行HPLC分析：装置：Waters e2695系统检测器：Waters 2998(200-600nm)；色谱柱：38020-41 COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column，4.6mm I.D.x 250mm；洗脱速度：1mL/min，洗脱剂：水和甲醇在20min内将甲醇含量由20％甲醇增加至100％甲醇。

在图3中，HPLC分析对象分为空白对照(CK)为原始菌株LO8030，粗提物(Crudeextract)为上述萃取所获得的化合物以及柚皮素查尔酮标准品(Naringenin chalconeST)。

由图3可知，粗提物中有一个峰与柚皮素查尔酮标准品的出峰时间和紫外吸收完全相同，可判定为同一化合物，而空白对照中无此峰。

在图4中，HPLC分析对象为粗提物(Crude extract-10d)为上述萃取所获得的化合物，柚皮素查尔酮标准品(Naringenin chalcone ST)以及柚皮素标准品(Naringenin ST)。由图4可知，粗提物中同时含有柚皮素和柚皮素查尔酮。

实施例3 PFICI_04360基因在构巢曲霉中异源表达产物——柚皮素查尔酮的分离、纯化和鉴定

为进一步确定在构巢曲霉中异源表达的产物，将实施例1获得的PFICI_04360异源表达菌株在大米培养基中发酵培养。首先将菌株划线接种到GMM(补充相应营养缺陷)，37℃黑暗条件下静置培养3天，待产孢后，用0.1％Tween 80帮助湿润孢子，经过滤布过滤菌丝，制成孢子悬液。每个500mL三角瓶中加入80g大米、1.2g YE、115mL水，营养缺陷按照突变株的基因型添加，121℃高压蒸汽灭菌30mim。每瓶大米培养基中接种2.5×10⁷个孢子，25℃黑暗条件下静置培养12天。

在下述条件下进行萃取：将发酵产物连同培养基收集到5L广口瓶中，加入1倍体积的乙酸乙酯，超声萃取1h。用旋转蒸发仪浓缩粗提物(温度30℃，转速100rpm/min，真空度<3mmHg)。重复萃取共3 次。

具体分离流程如图5A，在下述条件下进行目标产物分离：根据实施例2异源表达产物的HPLC验证结果确定目标峰。将萃取得到的粗浸膏由正向硅胶柱色谱经二氯甲烷/甲醇梯度洗脱(CH₂Cl₂:MeOH＝100:0, 250:1,100:1,50:1,30:1,20:1,10:1,0:100)，HPLC检测分析后，确定目标化合物所在馏分(即F7-F13)。合并目标化合物所在馏分后经丙基葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)分离，甲醇洗脱，HPLC检测合并，再次确定目标化合物所在馏分(F93-F101)，最终得到目标化合物(compound 1)。分离流程中HPLC的分析结果如图5B。其中，HPLC分析对象包括：空白对照(CK(LO8030))为原始菌株LO8030，小量培养的粗浸膏是指实施例2中萃取所获得的化合物复合物，粗浸膏是指本实施例萃取的粗浸膏，正向硅胶柱色谱是指粗浸膏由正向硅胶柱色谱经二氯甲烷/甲醇梯度洗脱所获得的馏分F7-F13，丙基葡聚糖凝胶柱是指由经丙基葡聚糖凝胶柱(Sephadex LH-20)分离，甲醇洗脱的合并物，柚皮素查尔酮是指最终得到的目标化合物(compound 1)。

在下述条件下进行NMR分析：Bruker AvanceⅢ500核磁共振波谱仪；将分离得到的目标化合物 (compound 1)溶解于acetone-d6中采集核磁共振氢谱图数据，通过1H和13CNMR分析，将氢谱数据归属后与已发表的数据进行比较，其波谱数据与文献(Slimetad R,FossenT,Verheul MJ.The flavonoidsof tomatoes[J].Journal of Agricultural andFood Chemistry,2008,56(7):2436-41.)报道的柚皮素查尔酮一致， NMR图谱见图10。

柚皮素查尔酮的结构式如下：

。

实施例4 PFICI_04360基因在酿酒酵母中异源表达菌株的构建

以无花果拟盘多毛孢的cDNA序列(如SEQ ID NO.3所示)为模板，PCR获得可以直接在酵母中表达的外显子基因，利用酵母组装的策略构建酵母异源表达质粒，并转化到酿酒酵母BJ5464中。

在如下条件下获取无花果拟盘多毛孢总RNA：使用ambion的试剂盒。选择在PDA培养基中培养5天的无花果拟盘多毛孢作为材料，用SPEX SamplePrep 6870Freezer/Mill冷冻液氮研磨仪磨碎菌体。将研磨成粉末状(少量)的样品转移至离心管(RNase-free)中，加入1mL TRIZOL Reagent/100mg组织，剧烈摇匀，室温静置5min；加0.2mL氯仿/mLTRIZOL Reagent，剧烈振荡10s，室温静置5min；12000rpm 4℃离心15min(离心机提前4℃预冷)，此时样品分成三层，无色的水相(上层)，中间层，粉红色有机相(下层)；转移无色的水相于新的离心管中，加入等量异丙醇TRIZOL Reagent，轻微颠倒混匀，室温静置10min；12000rpm 4℃离心10min，去上清，在管侧和管底形成胶状沉淀；加1mL 75％乙醇(RNase-free)，摇匀，弃上清，吸取剩余液体，将沉淀溶于50-200μL RNA溶解液中；2.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA。

在如下条件下合成无花果拟盘多毛孢cDNA：使用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒。将模板RNA 在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃) 解冻，解冻后迅速置于冰上，使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心，收集残留在管壁的液体；配制基因组DNA的去除体系混合液(5×gDNABuffer 5μL，Total RNA，RNase-Free ddH2O补足到10μL)，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min，然后于冰上放置；按照所述的反转录反应体系配制混合液 (10Fast RTBuffer 2 L，RT Enzyme Mix 1 L，FQ-RT Primer Mix 2 L，RNase-Free ddH2O补足到10L)；将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀；42℃孵育15min；95℃孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA用于后续实验或保存于-20℃。

在如下条件下构建酵母异源表达质粒：

酵母转化试剂盒为S.c.EasyComp Transformation Kit:Invitrogen by lifetechnology。

以获得的上述cDNA为模板，利用高保真酶根据如下引物进行PCR扩增，扩增序列如SEQ ID NO.3所示。具体地，根据SOE-PCR的原理将其划分为6个长度约1.5kb的片段，每个片段都包含相连片段的重复区域，和载体相连的片段两侧都含有载体同源序列。

Name	Oligonucleotide sequence(5’-3’)
		YE4360-P1-F	atggctagcgattataaggatgatgatgataagactagtatgtctcaaccaacttcggt
YE4360-P1-R	ctcgccaagcaatccgtgtagaatg
		YE4360-P2-F	gaattctcaccacttcggatgtcgg
YE4360-P2-R	gagaacatcaatgtcggtaggcgac
		YE4360-P3-F	gccgaacgtactcgagcgac
YE4360-P4-F	cacggcaatcattgcagttgtcaac
		YE4360-P4-R	cttcaactcggtccacttgagtcgg
YE4360-P5-F	catacaagtctttgaggctgccacc
		YE4360-P5-R	gagtatcggagcgactctctggag
YE4360-P6-F	catctgtttgaccgcgcactac
		YE4360-P6-R	ttgtcatttaaattagtgatggtgatggtgatgcacgtgaacccccaactgctcctttg

将线性化的带有自主复制序列的载体pXW55(pXW55载体参考W.Xu,X.Cai,M.E.Jung and Y.Tang, J.Am.Chem.Soc.,2010,132,13604-13607)及上述PCR的6个长度约1.5kb的片段混合，快速离心后加至置于冰上解冻的50μL酵母感受态细胞中；加入500μL室温的SolutionⅢ，涡旋混匀；30℃孵育1h，期间每15min涡旋1-2s；将上述菌液涂布于SDCt(A，U)平板上，30℃培养2天；将长出的单菌落划线接种于SDCt(A，U)平板上，30℃培养过夜；菌落PCR验证转化子。使用Zymoprep^TM Yeast Plasmid Miniprep I试剂盒提取酵母质粒，并转化到大肠杆菌感受态中；挑取转化子进行菌落PCR验证，并对正确的转化子摇菌培养后提取质粒，使用NEB限制性核酸内切酶进行酶切验证，获得命名为pYZX10的重组载体。重组质粒设计方案及酶切验证结果如图6，酶切结果条带与预期一致，编码本发明所述杂合蛋白的cDNA已成功连接到载体pXW55。

在如下条件下构建酵母异源表达菌株：使用上述酵母转化方法将重组载体pYZX10转化到酵母感受态中，获得骨架基因酵母异源表达菌株。转化子PCR验证结果如图7，其中正对照(+CK)为重组载体pYZX10 为PCR模板，负对照为(-CK)为不加模板。

实施例5 PFICI_04360在酿酒酵母中蛋白纯化

上述实施例4中构建的酵母异源表达菌株，接种到5mL SDCt培养基中，在30℃，280rpm培养两天后，显微镜下镜检无污染且生长状态正常。以1:1000的比例接种到YPD培养基(1％Yeast extract，2％ Peptone，灭菌后加入葡萄糖储液使其终浓度为1％)中，在28℃，280rpm培养96h后，高速离心收集菌体，溶于适量Lysis buffer。将菌液在液氮中迅速冷冻后，使用超声破碎仪或冷冻液氮研磨仪，镜检以确定细胞的破碎率，获得lysate。超声破碎仪：600W，破碎20S，间歇20S，100次；冷冻液氮研磨仪：破碎 20S，间歇20S，15次。17.000rpm，4℃离心2h。取上清。加1mL 50％Ni-NTA悬浮液到上清中，轻轻混匀，冰浴搅拌60min后，Lysate-Ni-NTA上柱子。液体流过，收集流分FT。冰上，5mL Wash buffer加入 Ni柱洗脱杂质，收集流分。洗脱二次。冰上，2.5mL Elution buffer加入Ni柱洗脱洗脱目标蛋白，收集E1 流分。冰上，2.5mL Elution buffer加入Ni柱洗脱洗脱目标蛋白，收集E2流分。100LBradford加入96 孔板中，每孔加入10L流分，检测蛋白浓度确定SDS-PAGE上样量；确定好上样量后，加入6×protein loading buffer，用lysis buffer补足总体积至20L。100℃加热套上加热10min，冷却后短暂离心。样品用SDS-PAGE 分析，本实施例中使用的Marker是Thermo SCIENTIFIC的#26625。电泳后的SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝染色液染色2h。脱色液脱色40min后再次用脱色液脱色，40min后用蒸馏水脱色。脱色和染色时摇床转速在80rpm左右。SDS-PAGE分析如图8所示，其中1为被检样品。该蛋白大小约为293.1kDa。

SDS-PAGE电泳分析目标蛋白存在的Elution buffer流分，使用PD-10凝胶柱脱盐。冰上，PD-10凝胶柱使用storage buffer冲洗后，加入Elution buffer流分，流干。然后依次加入0.5mL storage buffer，收集S1-S7流分。使用Bradford确定目标蛋白存在的流分，将流分分装成100μL每管，-80℃保存。

实施例6 PFICI_04360基因在酿酒酵母中喂养香豆酸及其产物——柚皮素的分离、纯化和鉴定

上述实施例4中构建的酵母异源表达菌株接种到YPD培养基(1％Yeast extract，2％Peptone，灭菌后加入葡萄糖储液使其终浓度为1％)中，在28℃，280rpm培养两天后，分为试验组和对照组。试验组加入 1mg/mL香豆酸作为喂养底物，28℃，280rpm继续培养三天，MEA萃取。对照组(CK)为没有添加香豆酸，其它实验操作与实验组相同。发酵样品的处理方式同实施例3。获得粗浸膏后，使用液相进行化合物分离，获得目标差异峰。分离获得其纯品，溶解于CD₃OD进行1H-NMR分析，其波谱数据与文献(Qian Y X, Kang J C,Luo Y K,etal.Secondary Metabolites of an Endophytic Fungus Phomopsis castaneae-mollissimae[J]. Chemistry of Natural Compounds,2018:1-2.)报道的柚皮素一致。HPLC分析结果及核磁图谱如图9和图11。如图可知，只有加入香豆酸为底物的试验组才会获得产物柚皮素。

柚皮素的结构式如下：

。

此外，发酵样品采用实施例3相同的方法进行NMR分析，可得到与图10相同的NMR图谱，因此， PFICI_04360基因在酿酒酵母中喂养香豆酸的产物还包括柚皮素查尔酮。

实施例7 PFICI_04360基因在酿酒酵母中喂养不同浓度香豆酸

该实施例实验方法与实施例6相比，除香豆酸浓度外，其余条件相同，试验组1-4分别加入浓度为0.1、 0.3、0.5、10mg/ml香豆酸。

采用HPLC验证PFICI_04360基因在酿酒酵母中喂养不同浓度香豆酸的异源表达产物。具体实施方法参见实施例2。

通过HPLC分析可知，试验组1-4的菌株均产生柚皮素以及柚皮素查尔酮。

实施例8 PFICI_04360基因在酿酒酵母中喂养不同发酵底物

该实施例实验方法与实施例6相比，除额外添加的发酵底物外，其余条件相同，试验组1-15分别加入浓度为0.1、0.3、0.5、1、10mg/ml对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、苯甲酸。

采用HPLC验证PFICI_04360基因在酿酒酵母中喂养不同发酵底物的异源表达产物。具体实施方法参见实施例2。

通过HPLC分析可知，试验组1-15的菌株均产生柚皮素以及柚皮素查尔酮。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一个能在真菌中产生黄酮类化合物的NRPS-PKS杂合蛋白及其编码基因与应用

<130> 190158CI

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2717

<212> PRT

<213> 无花果拟盘多毛孢(Pestalopsis fici)

<400> 1

Met Ser Gln Pro Thr Ser Val Pro Lys Leu Leu Leu His His Ala Val

1 5 10 15

Glu Ser Arg Asp Lys Val Ala Phe Leu Gly Pro Gly Trp Ser Ile Thr

20 25 30

Tyr Ser Asp Leu Glu Lys Arg Thr Arg Leu Val Ala Ala His Leu Ala

35 40 45

Arg Ala Gly Ile Gly Arg Gly Asp Phe Val Ala Ile Val Leu Gly Arg

50 55 60

Cys Leu Glu Ala Val Glu Ser Val Leu Ala Ile Met Arg Ala Gly Ala

65 70 75 80

Val Ser Val Pro Leu Asp Pro Arg Ser Pro Pro Ala Asp Leu Ala Arg

85 90 95

Val Leu Glu His Ser Gly Ala Arg Ala Ile Ile Thr Asp Asp Arg His

100 105 110

Leu Ala Thr Val Ser Ala Ala Ala Val Lys Gly Ser Leu Ile Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Thr Asn Ala Gln Val Asp Val Ile Glu Ser Leu Lys Thr Glu

130 135 140

Arg Tyr Gln Asp Trp Val Glu Asp Asp Gly Tyr Ser Thr Ser Asp Val

145 150 155 160

His Leu Asp Ser Leu Gly Asp Glu Glu Glu Ala Phe Leu His Tyr Thr

165 170 175

Ser Gly Thr Thr Ser Leu Pro Lys Gly Val Leu Ser Ser Gln Lys Ser

180 185 190

Ala Leu Trp Asn Val Glu Lys Val Thr Ser Val Phe Glu Phe Ser Ser

195 200 205

Glu Asp Arg Phe Phe Trp Pro Leu Pro Leu Phe His Ile Leu Gly His

210 215 220

Ser Leu Cys Ile Leu Ala Thr Val Ala Lys Gly Ala Ser Ala Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Asp Pro Asp Gln Leu Leu Leu Asp Asn Leu Leu Val Lys Asp Val

245 250 255

Glu Asp Thr Thr Phe Ile Ala Gly Ala Pro Ala Thr Phe His Glu Leu

260 265 270

Val Glu Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Thr Leu Ser Leu Pro Lys Leu

275 280 285

Arg Ala Cys Met Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ser Val Ser Leu Cys Asp

290 295 300

Gln Val His Glu Leu Phe Gly Val Ser Leu Leu Asn Asn Tyr Gly Cys

305 310 315 320

Thr Glu Thr Cys Gly Ala Ile Ala Ile Ser Arg Pro Gly His Val Tyr

325 330 335

Arg Gln His Gly Ser Val Thr Pro Leu Pro Asp Trp Glu Ile Gln Leu

340 345 350

Met Asp Gln Asp Gly Lys Gln Val Arg Glu Gly Glu Gln Gly Glu Leu

355 360 365

Trp Val Arg Gly Pro Gly Leu Met Leu Gly Tyr Tyr Lys Glu Thr Gln

370 375 380

Ser Pro Phe Thr Glu Asp Ala Trp Phe Pro Thr Gly Asp Thr Gly Ile

385 390 395 400

Leu Thr Thr Ser Asp Val Gly Lys Glu Leu Ser Leu Val Gly Arg Lys

405 410 415

Lys Glu Leu Ile Ile Arg Gly Gly Glu Asn Ile Gln Pro Ala Glu Leu

420 425 430

Glu Gln Val Leu Leu Gln His Pro Gly Val Ala Asp Val Ala Val Ser

435 440 445

Gly Ile Leu His Gly Leu Leu Gly Glu Thr Pro Ala Ala Phe Ile Val

450 455 460

Lys Glu Thr Pro Asp Leu Asp Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ile Ala Thr

465 470 475 480

Cys Arg Glu Ala Leu Pro Asp Tyr Lys Val Pro Thr Ala Phe Tyr Glu

485 490 495

Ile Asp Ala Val Pro Arg Thr Leu Leu Gly Lys Pro Lys Arg Leu Ala

500 505 510

Val Ala Ser Tyr Thr Ser Lys Pro Leu Thr Val Arg Ser Arg Leu Gln

515 520 525

Thr Arg Ala Ala Val Glu Ala Leu Val Leu Ala Glu Thr Ala Gly Ala

530 535 540

Cys Gly Val Gln Ala Glu Pro Gly Glu Lys Glu Ser Asp Pro Asp Trp

545 550 555 560

Leu Arg Lys Tyr Ala Asp Glu Ser Phe Ser His Leu Gly Leu Thr Ser

565 570 575

Met Ala Gly Val Val Leu Arg Asp Arg Leu Ala Asn Leu Thr Gly Leu

580 585 590

Val Asp Leu Pro Asn Thr Leu Val Phe Asp Tyr Ser Thr Pro Ala Ala

595 600 605

Val Arg Asp Tyr Leu Phe Asn Arg Leu Arg Glu Gln Glu Ser Pro Leu

610 615 620

Pro Ser Lys Ser Ala Pro Ala Leu Ser Leu Pro Ser Lys Ala Glu Pro

625 630 635 640

Ile Ala Ile Ile Ser Met Ala Cys Arg Tyr Pro Gly Gly Ile Ser Ser

645 650 655

Pro Glu Asp Leu Trp Gln Leu Val Ser Asp Glu Ile Asp Ala Thr Thr

660 665 670

Asp Phe Pro Ser Asp Arg Gly Trp Asp Ile Asp Ser Leu Tyr Ser Thr

675 680 685

Asp Pro Thr Glu Pro Phe Thr Ser Thr Thr Lys Arg Gly Gly Phe Leu

690 695 700

Pro Asp Phe Ala Asp Phe Asp Ala Gly Leu Phe Gly Met Ala Pro Arg

705 710 715 720

Glu Ala Leu Ala Thr Asp Pro Gln Gln Arg Leu Leu Leu Glu Thr Thr

725 730 735

Trp Glu Leu Ala Glu Arg Gly Gly Ile Ala Pro Leu Ser Leu Lys Gly

740 745 750

Thr Gln Thr Gly Cys Phe Ile Gly Thr Leu Tyr Asp Asp Tyr Glu Ala

755 760 765

Asn Gly Phe Gly Asn Ala Glu Leu Glu Ala His Leu Gly Leu Gly Ser

770 775 780

Ser Gly Ser Val Met Ser Gly Arg Ile Ser Tyr Tyr Phe Gly Leu His

785 790 795 800

Gly Pro Ser Ile Val Ile Ser Thr Gly Cys Ser Ser Ser Leu Cys Ala

805 810 815

Val His Ser Ala Ala Gln Ala Leu Arg Asn Glu Glu Cys Thr Leu Ala

820 825 830

Ile Ala Gly Gly Ile Thr Cys Met Ala Ser Pro Arg Pro Phe Thr Met

835 840 845

Phe Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ser Ala Asp Gly Arg Cys Arg Thr Tyr

850 855 860

Ser Ser Asp Ala Ala Gly Thr Gly Trp Ser Glu Gly Val Gly Leu Ile

865 870 875 880

Met Leu Glu Lys Leu Ser Asp Ala Gln Arg Asn Gly His Arg Val Leu

885 890 895

Gly Val Ile Arg Gly Ser Ala Val Asn Ser Asp Gly Thr Ser Asn Gly

900 905 910

Leu Thr Ala Pro Ser Gly Pro Ala Gln Gln Met Cys Ile Gln Ser Ala

915 920 925

Leu Ser Gln Ala Ala Leu Ser Pro Thr Asp Ile Asp Val Leu Glu Gly

930 935 940

His Gly Thr Ala Thr Pro Leu Gly Asp Pro Ile Glu Val Gln Ala Val

945 950 955 960

Ile Asn Thr Tyr Gly Asn Gly Ser Gly Asn Asp Pro Arg Ala Asn Pro

965 970 975

Leu Leu Ile Gly Ser Ile Lys Ser Asn Ile Gly His Thr Gln Ala Ala

980 985 990

Ala Ala Val Ala Gly Ile Ile Lys Met Val Lys Ser Ile His His Gly

995 1000 1005

Val Ala Pro Ala Ser Leu His Ile Arg Glu Pro Ser Arg His Ile Asp

1010 1015 1020

Trp Asp Gly Cys Gly Val Glu Pro Leu Ser Lys Ala Lys Gln Trp Pro

1025 1030 1035 1040

Ser Val Asp Arg Ala Arg Arg Ala Ala Val Ser Ser Phe Gly Ile Gly

1045 1050 1055

Gly Thr Asn Ala His Ile Ile Leu Glu Gln Pro Asp Ser Ile Glu Gln

1060 1065 1070

Asn Gly Val Ser Thr Pro Lys Asn His Thr Ile Ala Phe Pro Trp Ile

1075 1080 1085

Ile Ser Gly Ala Asp Glu Asn Ala Leu Arg Ala Gln Ala Gln Ser Leu

1090 1095 1100

Leu Ala Ala Trp Arg Lys Ser Leu Ser His Glu Ser Pro Ser Asp Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Phe Ser Leu Ala Thr Ala Arg Ser Ser Leu Lys Tyr Arg Ala Val

1125 1130 1135

Val Thr Tyr Thr Ala Gly Gly Asp Leu Asn Asp Gln Ile Glu Thr Ala

1140 1145 1150

Leu Thr Ala Leu Ala Glu Asp Glu Ser His Pro Asp Val Val Thr Gly

1155 1160 1165

His Thr Asn Thr Thr Gly Asn Lys Pro Arg Leu Ala Cys Leu Phe Ser

1170 1175 1180

Gly Gln Gly Ser Arg Met Pro Asp Pro Ser Ala Ile Glu Glu Leu Ser

1185 1190 1195 1200

Thr Val Phe Pro Ile Phe Ser Arg Ala Phe Lys Glu Ala Cys Glu Glu

1205 1210 1215

Val Asn Gln Tyr Leu Glu Cys Pro Leu Glu Arg Ala Leu Ser Asp Ser

1220 1225 1230

Ser Leu Leu Asp Arg Thr Asp Phe Ala Gln Pro Ala Leu Phe Val Phe

1235 1240 1245

Glu Val Ala Met Tyr Arg Leu Leu Glu Ser Phe Asp Val Ile Pro Asp

1250 1255 1260

Val Val Ser Gly His Ser Leu Gly Glu Ile Ala Ala Ala His Ile Ser

1265 1270 1275 1280

Gly Ala Leu Thr Leu Arg Asp Ala Ala Ile Ile Val Thr Thr Arg Ser

1285 1290 1295

Arg Leu Met Ala Ala Leu Asp Ala Asn Gly Gly Met Val Ser Ile Ala

1300 1305 1310

Ala Pro Glu Gln Glu Val Ala Glu Glu Leu Ser Arg Leu Gly Ser Thr

1315 1320 1325

Ala Ile Ile Ala Val Val Asn Ser Glu Lys Ser Val Val Val Ser Gly

1330 1335 1340

Thr Arg Glu Ala Ile Thr Ala Val Ala Asp Arg Phe Thr Glu Leu Gly

1345 1350 1355 1360

Arg Arg Thr Thr Ile Leu Arg Asn Val Asn His Gly Phe His Ser Pro

1365 1370 1375

Met Met Asn Gly Ile Leu Gly Asp Leu Glu Glu Ala Leu Ala Ser Ser

1380 1385 1390

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Ser Lys Ile Pro Leu Val Ser Thr Val Thr

1395 1400 1405

Gly Lys Leu Ala Glu Ala Ala Gln Leu Thr Ser Pro Gln Tyr Trp Thr

1410 1415 1420

Arg His Val Ser Glu Pro Val Arg Phe Ala Asp Ser Val Asn Glu Leu

1425 1430 1435 1440

Arg Ser Asn Glu Arg Val Ser Val Phe Ile Glu Val Gly Pro Ser Ala

1445 1450 1455

Val Leu Ser Pro His Val Pro Gly Thr Val Ala Thr Tyr Gly Thr Val

1460 1465 1470

Gly Lys Leu Leu Asn Thr Leu Gly Gln Ile Trp Ala Arg Gly Val Pro

1475 1480 1485

Val Asn Trp Gln Ala Val Phe Gly Gly Val Gly Ala His Leu Val Asp

1490 1495 1500

Leu Pro Val Tyr Ala Phe Gln Arg Arg Lys Tyr Trp Leu Pro Tyr Arg

1505 1510 1515 1520

Thr Leu Leu Pro Ala Glu Ser Val Gly Ala Ser Gly Ala Ser Ser Pro

1525 1530 1535

Gly Arg Thr Ser Asp Ile Gly Thr Ser Thr Leu Asn His Gly Val Leu

1540 1545 1550

Tyr Arg Thr Thr Ser Ile Ala Gly Thr Asn Asp Ile Ile Cys Ala Gly

1555 1560 1565

Phe Val Ser Ala Ser Lys Gln Pro Trp Leu Arg Asp His Ile Ile Ser

1570 1575 1580

Gly Gln Ser Leu Val Pro Ala Thr Ala Phe Ala Glu Leu Ala Leu Arg

1585 1590 1595 1600

Ala Gly Arg Glu Cys Ala Asp Pro Ser Gly Ser Glu Gln Val Ile Leu

1605 1610 1615

Asp Glu Leu Ile Ile Leu Ala Pro Leu Ala Leu Ser Leu Glu Glu Asp

1620 1625 1630

Asp Glu Glu Gln Glu Phe Glu Val Gln Val Val Ile Lys Glu Leu Glu

1635 1640 1645

Asp Glu Glu Ser Thr Ile Arg Arg Ser Ile Asp Val Tyr Ser Arg Leu

1650 1655 1660

His Ala Val Ser Thr Gln Pro Asp Trp Val Gln His Ala Thr Gly Thr

1665 1670 1675 1680

Leu Lys Leu Ile Ser Leu Pro Pro Pro Glu Lys Asp Val Phe Thr Asn

1685 1690 1695

Gly Thr His Asp Val Glu Asn Ser Glu Val Asp Val Ser Lys Ala Tyr

1700 1705 1710

Ala Met Leu Glu Asp Phe Gly Ile Ser Tyr Gly Pro Ala Phe Gln Gly

1715 1720 1725

Val Arg Gly Gly Trp Arg Gln His Asp Asn Glu Leu Leu Val Gln Ile

1730 1735 1740

Asn Pro Pro Gln Asp Gln Asp Ser Lys Ala Gly Phe Val Leu His Pro

1745 1750 1755 1760

Ala Leu Leu Asp Ala Ala Leu His Ala Pro Ile Leu Ala Ala Pro Glu

1765 1770 1775

Lys Val Ser Ser Gly Gln Ile Arg Leu Pro Phe Ser Phe Lys Gly Ile

1780 1785 1790

Gln Val Phe Glu Ala Ala Thr Ser Thr Ser Gly Pro Val Leu Ala Arg

1795 1800 1805

Ile Arg Asp Leu Asp Asp Glu Arg Phe Ser Val Thr Ile Thr Asn Lys

1810 1815 1820

Ala Thr Gly Ala Ala Val Ala Glu Ile Ser Glu Val Met Leu Arg Ala

1825 1830 1835 1840

Val Gln Pro Pro Val Val Glu Gly Asp Leu Tyr Arg Leu Lys Trp Thr

1845 1850 1855

Glu Leu Lys Ala Ala Gln Thr Thr Lys Pro Asn Leu Val Asp Asp Ile

1860 1865 1870

Phe Thr Val Gln Ala Pro Arg Asn Val Asp Ala Ala Asp Ile Pro Lys

1875 1880 1885

Ala Val His Asn Ala Val Ser Glu Ala Leu Arg Ala Ile Gln Gln Trp

1890 1895 1900

Arg Thr Lys Lys Ala Asn Ser Ser Asp Lys Ile Arg Leu Ile Phe Val

1905 1910 1915 1920

Thr Glu Gln Ala Ser Leu His Pro Asp Val Asn Val Ile Asp Ala Ala

1925 1930 1935

Val Trp Gly Phe Val Arg Ser Ala Gln Thr Glu Phe Gly Gly Glu Asn

1940 1945 1950

Ile Ile Leu Ile Asp Leu Asp Gly Ser Ala Glu Ser Gln Glu Ala Leu

1955 1960 1965

Pro Ser Ala Phe Asp Cys Gly Gln Glu Val Val Ala Leu Gln Asp Gly

1970 1975 1980

Lys Ile Met Val Pro Thr Leu Ser Lys Glu Pro Pro Val Pro Ser Thr

1985 1990 1995 2000

Ser Thr Thr Leu Asp Val Ser Gly Thr Val Leu Ile Thr Gly Gly Thr

2005 2010 2015

Gly Gly Leu Gly Ala Ile Leu Ser Arg His Leu Val Gln Thr Cys Gly

2020 2025 2030

Ala Arg Asn Leu Leu Leu Thr Ser Arg Ser Gly Ile Lys Ala Ala Gly

2035 2040 2045

Ala Thr Glu Leu Leu Asp Glu Leu Ser Ala Gln Asp Ala Thr Val Val

2050 2055 2060

Arg Ile Glu Ser Cys Asp Ile Ser Asp Arg Ala Gln Leu Ala Thr Leu

2065 2070 2075 2080

Leu Glu Gly Asn His Gly His Pro Pro Ile Thr Ala Ile Ile His Cys

2085 2090 2095

Ala Gly Val Val Asp Asp Gly Val Leu Thr Ser Leu Thr Pro Glu Arg

2100 2105 2110

Ile Ser Arg Val Leu Gln Ala Lys Val Asp Ala Ala Trp Asn Leu His

2115 2120 2125

Gln Leu Ala Pro Glu Thr Thr Arg Thr Phe Val Leu Tyr Ser Ser Phe

2130 2135 2140

Val Gly Ile Val Gly Asn Glu Gly Gln Ala Ala Tyr Thr Ala Gly Asn

2145 2150 2155 2160

Ala Phe Leu Asn Ala Leu Ala Arg Met Arg Val Ala Gln Gly Leu Pro

2165 2170 2175

Ala Val Ser Leu Ala Trp Gly Pro Trp Ala Asn Asp Val Gly Met Ala

2180 2185 2190

Ala Gly Asp Lys Leu Val Ile Pro Asn Leu Arg Ile Ala Ser Ala Gln

2195 2200 2205

Pro Val Val Asp Gln Gln Gly Leu His Leu Phe Asp Arg Ala Leu Gln

2210 2215 2220

Thr Ser Glu Pro Val Leu Val Pro Leu Leu Leu Arg Gly Pro Phe Pro

2225 2230 2235 2240

Met Val Pro Ser Ala Ala Ala Val Thr Lys Ser Lys Lys Ala Thr Ala

2245 2250 2255

Lys Gly Lys Ala Lys Thr Gly Ala Ala Trp Arg Lys Lys Leu Ala Ala

2260 2265 2270

Val Ser Pro Glu Ser Arg Ser Asp Thr Leu Leu Gly Leu Val Arg Asp

2275 2280 2285

Glu Ile Ala Ala Val Leu Gly Tyr Gln Gly Gln Glu Leu Pro Asp Gly

2290 2295 2300

Pro Leu Ser Asp Leu Gly Phe Asp Ser Phe Thr Ser Val Thr Val Ser

2305 2310 2315 2320

Asn Arg Met Arg Val Leu Thr Gly Phe Arg Asp Leu Pro Val Thr Leu

2325 2330 2335

Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Pro Gln Ala Leu Val Gln Tyr Leu Leu Asp

2340 2345 2350

Arg Ile Asn Ala Glu Pro Glu Thr Glu Ile Glu Leu Asp Gln Asp Val

2355 2360 2365

Ala Glu Glu Glu Thr Val Ser Gly Thr Asn Gly His Gln Asn Gly His

2370 2375 2380

Gln Asn Gly Thr Gln Asn Gly His Ser Asn Gly His Ala Asn Gly Ala

2385 2390 2395 2400

Ser Thr Asn Gly Asp Ala Thr Asp Gly Ile Asp Pro Glu Glu Phe Arg

2405 2410 2415

Gly Leu Ser Thr Leu His Arg Arg Leu Cys Arg Leu Glu Gln Tyr Thr

2420 2425 2430

Ala Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Ala Leu Ala Met Pro Thr Phe

2435 2440 2445

Pro Ser Asn Gly Arg Lys Leu Leu Asp Tyr Val Ala Asp Pro His Arg

2450 2455 2460

Leu Ala Thr Gly Pro Glu Val Ser Pro Gly Asn Asp Ala Pro Leu Pro

2465 2470 2475 2480

Val Val Phe Ile Ala Pro Phe Phe Pro Arg Ile Lys Ile Gly Gly Ile

2485 2490 2495

Ser Leu Ser Val Tyr Ser Ala Val Ala Ala Ser Leu Asn Gly Lys Arg

2500 2505 2510

Asp Val Phe Glu Leu Pro His Pro Glu Gly Gln Tyr Val Pro Glu Asp

2515 2520 2525

Leu Asp Thr Leu Ala Glu Leu His Val Ser Thr Ile Glu Gln Gln Phe

2530 2535 2540

Gly Asp Arg Pro Gly Ile Ile Leu Ala Gly Tyr Ser Ala Gly Gly Thr

2545 2550 2555 2560

Val Ala Tyr Ala Val Ala Ser Lys Leu Ala Gln Ala Gly Lys His Pro

2565 2570 2575

Arg Leu Ala Gly Phe Val Leu Val Asp Thr Tyr Leu Thr Met Thr Gly

2580 2585 2590

Arg Gly Asp Pro Asp Trp Leu Asn Ala Leu Pro Ala Glu Ala Leu Val

2595 2600 2605

Ser Arg Leu Gly Gly Pro Asp Ser Thr Gly Glu Ser Leu Val Gly Asp

2610 2615 2620

Leu Asp Leu Ala Leu Ala Lys Val Gly Gly Tyr Phe Arg Thr Leu Arg

2625 2630 2635 2640

Asp Trp Asp Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Asp Ala Leu Ser Thr Leu

2645 2650 2655

Phe Val Arg Ala Leu Asp Pro Ser Glu Lys Met Pro Lys Asn Ala Asp

2660 2665 2670

Ile Trp Arg Pro Arg Trp Gln Arg Ala Asn His Thr Val Glu Val Pro

2675 2680 2685

Gly Ser His Leu Ala Leu Leu Asp Lys Arg Tyr Ala Pro Ala Ile Ala

2690 2695 2700

Val Glu Ile Glu His Trp Ala Lys Glu Gln Leu Gly Val

2705 2710 2715

<210> 2

<211> 8604

<212> DNA

<213> 无花果拟盘多毛孢(Pestalopsis fici)

<400> 2

atgtctcaac caacttcggt tcccaagctg ctcctccacc atgcggtgga aagccgggac 60

aaggtggcct tcttgggccc aggctggtcc attgtatgtc tttccgaagc gtgtcccttt 120

tgctgagatg tttctcgtag tcgtttgaca tgactgactc catattctcc ttgtagacct 180

acagtgacct tgaaaagcga acgcggcttg tggcagctca tctggcgcgg gccggtatag 240

gacgaggaga tttcgtagcc attgtgctag ggagatgctt ggaggcggtg gagtctgtgt 300

tggcaatcat gagagccggc gccgtgagcg ttcccctaga tccgcgttca ccaccagcag 360

acctggccag ggttttggag cacagcggag cccgcgcaat cataactgat gatcggcact 420

tggctacggt gtccgccgca gccgtcaaag gatccttgat tatcataagc actacgaatg 480

ctcaggtgga tgtcatagaa agcctcaaga cggagcggta ccaagactgg gttgaagatg 540

atggatactc gacgtcggat gtccacctgg acagcctagg cgatgaggag gaggcctttc 600

tgcactacac ttctggaaca accagcctac ccaagggagt cttgtcgagt caaaagagcg 660

cactgtggaa cgttgaaaag gtcacttcag tgtttgagtt ttcctctgag gaccgcttct 720

tctggccact ccccttgttt cacattctcg gccactcctt atgtatactg gccaccgtgg 780

ccaagggtgc cagcgcctat ctttcggacc ctgaccagtt gctgttggat aacctcttgg 840

tcaaggatgt tgaagacacg accttcattg caggtgcccc ggccacgttt cacgagcttg 900

tcgaagccaa ggcggcatcg tcgtcgactc tgagtttgcc caaattgagg gcatgtatga 960

gcgcaggtgc tgcggcatct gtttctctgt gtgatcaggt ccatgagctg ttcggagtgt 1020

cgcttctcaa caactacgga tgcacagaga cttgcggcgc cattgccatt agccggcctg 1080

gccatgtcta tcggcaacat gggagtgtta ccccactccc cgactgggag attcagctga 1140

tggatcaaga tgggaagcaa gtccgcgaag gcgagcaagg cgagctctgg gtgcgcggtc 1200

ccggcctgat gctgggttac tacaaagaaa ctcagtcgcc attcactgaa gatgcttggt 1260

ttcccactgg tgatacagga attctcacca cttcggatgt cggaaaagag ctcagcctcg 1320

tgggtcggaa aaaggagttg atcatccggg gaggagaaaa catacagcca gctgagttgg 1380

aacaagtctt gctccagcac cctggcgtgg cagacgttgc tgtttctggc attctacacg 1440

gattgcttgg cgagacgcct gccgcgttca ttgtcaagga gactccagac cttgaccttg 1500

acctttcctc cctgatcgcc acgtgcagag aagctttgcc agactacaag gtgcctacag 1560

gtaagtgacg ggcgccgttt ctttcactga tctagattta ttgctgactc aatcctcgac 1620

agcattttac gaaatcgacg ctgtgcctcg gaccctttta ggcaagccca agcggttggc 1680

cgtagcgtct tacacgagca aaccactcac ggttcgctcc aggttacaaa caagagccgc 1740

cgtcgaggca ttggttcttg cagaaacggc cggggcctgc ggtgtgcaag ccgagcccgg 1800

ggagaaggaa tcggacccgg attggcttcg caaatacgcc gacgagtcct tttcccatct 1860

cggcctgacc tccatggccg gtgtcgtcct gcgagaccga ctggccaacc tcaccggctt 1920

ggttgatctg cccaacaccc tcgtctttga ctactctact ccagcggctg tgcgcgacta 1980

cctattcaac aggctcaggg agcaggaatc gccgctccca tccaagtcag cacctgcact 2040

gagcttgccc agcaaggctg agcccattgc cattatctca atggcctgta gatatcctgg 2100

aggaatctct tcgccagagg acttgtggca actcgtttcc gacgagatag acgcaactac 2160

tgactttccg agtgatcgtg gctgggatat cgatagtctg tatagtaccg acccgacgga 2220

acctttcacc tcgaccacga agcgcggcgg tttcctgccc gactttgccg actttgatgc 2280

cggtctattt ggcatggcac ctcgagaagc cctggctacg gatccccagc aacgtttact 2340

actggaaacg acgtgggaac tagccgaacg aggaggcatt gccccgttgt cgctcaaagg 2400

cacccagact ggttgcttca ttggcacgct gtatgatgat tacgaagcaa acggctttgg 2460

caacgctggt aacgtaccct ccttcgtaca aaggtatgaa gaatgaatat ctactgacga 2520

aaaacttctc cttttgacag aattggaagc tcatcttggt cttggatcct ccggcagtgt 2580

catgtccggt cgcatttcct actactttgt gagtgctttc caatcgcata tttcattgca 2640

ggaaaatctc ctagacgctt tgcggcacga ttgaattcaa tagactgatt aatccctttt 2700

ggcagggtct ccacggtccg tcaatagtca tatcaaccgg ttgttcgtcc tcgctctgcg 2760

ccgtccattc agcagcccaa gctctcagga acgaagagtg cacactcgcc attgcaggtg 2820

gaatcacgtg catggcttcg cccaggccat tcaccatgtt tagcaagcga cgaggtctct 2880

cggccgatgg gcgatgccga acgtactcga gcgacgccgc cggcaccggt tggtccgagg 2940

gcgtaggtct catcatgctc gaaaagctct cagacgccca gcgcaacgga catcgcgtac 3000

tgggcgtgat tcggggctcc gccgtcaact cggacggcac gtccaacggt ctgacggccc 3060

cgagcggacc tgcgcagcaa atgtgtatcc agagcgcgct gtcccaagcg gcgctgtcgc 3120

ctaccgacat tgatgttctc gaaggtcacg ggactgccac gcccttgggt gatcccatcg 3180

aggtacaggc cgtgatcaac acctacggca atgggtctgg caatgatccc cgcgcgaatc 3240

cattgctgat tggttcaatc aagtccaata ttggccacac ccaggccgca gccgccgtgg 3300

ctggaatcat caagatggtc aagtccattc atcatggtgt tgccccagca tccttgcaca 3360

tccgcgaacc ttcacgacac attgattggg atgggtgtgg tgttgagcca cttagcaagg 3420

ccaagcagtg gccatctgtg gacagggcga gacgtgcagc cgtgtcatca ttgtaagttc 3480

tcaagataat gattcgatta ctggtgaaat agagctgacg gttttgaatt agtggtattg 3540

gaggcacaaa cgcagtatgt gccttctcac aacctccctt aattcaaacc tttaaagatt 3600

gaaaaagtta ctgactcgtg ggaataacag cacatcattt tggaacagcc tgattctatt 3660

gaacagaatg gcgtctcgac gccaaagaat cacacaattg cttttccatg gatcatttct 3720

ggcgccgacg aaaatgctct gcgcgcgcaa gcccagtcac ttctggcggc ctggcgcaag 3780

tccctcagtc atgagagccc gtccgacatt gcattctccc ttgcaaccgc gagatcttct 3840

ctcaaatata gggccgtggt gacgtacacc gccggaggcg acttgaacga tcagattgaa 3900

acggcactta cggctctcgc tgaagatgaa tcccatcccg acgtcgtgac aggacacacc 3960

aacaccactg gcaacaagcc gcgtctggct tgtctattct cgggacaggg tagtcggatg 4020

cccgatccca gcgccatcga ggagctttct accgttttcc ccatcttctc ccgcgcattc 4080

aaggaggcct gcgaggaagt caatcagtac ctcgaatgtc cgcttgaacg tgctttgagt 4140

gacagtagcc tcctggaccg aactgacttt gcgcagcccg ccttgtttgt ctttgaggtg 4200

gcaatgtacc gcctgctcga gtccttcgat gtgattcccg acgtggtgtc tggacattct 4260

ctaggagaaa tcgcagcagc tcacatttct ggagctctga ctctccgcga cgctgccatc 4320

atcgttacca cccgttccag attaatggct gctctagatg ccaatggcgg catggtgagc 4380

attgcggctc ctgagcaaga agtcgccgaa gagctgtcac gcctgggcag cacggcaatc 4440

attgcagttg tcaactctga aaaatcggtt gtggtatccg gtactcgaga ggccataacc 4500

gctgttgcag acagatttac agagctagga cgaagaacga ctattctgcg caatgtcaac 4560

cacggcttcc actcgccaat gatgaacggt attctgggag accttgaaga agctctggcg 4620

tcgtccattg gaagtggaac atcctccaag attccgctcg tgtccaccgt cacgggcaag 4680

ctcgccgaag cggcccagct gacctctccc caatactgga cacgccacgt cagcgagcca 4740

gttcgcttcg cagactccgt caacgagctt cgctcaaacg aacgtgtctc ggtgtttatt 4800

gaagtcggtc cctctgcagt cctctctccc catgtcccgg gtactgtcgc cacatatggc 4860

acagtcggca agctactgaa cacgctgggt caaatctggg cgcgcggcgt gcccgtcaac 4920

tggcaggccg tattcggtgg cgtaggtgcg catctcgtcg acttgcccgt ctatgccttc 4980

cagaggcgca agtattggct accatataga accctgttgc cagcagaatc tgtgggggcg 5040

tctggcgcct cctcaccggg tcgcacttca gacattggta cttctacatt gaaccatgga 5100

gtgctctacc ggactacatc cattgcgggg acaaacgaca tcatctgtgc cggtttcgtc 5160

tccgcaagca agcagccctg gctgcgcgac catattatta gtggtcagag ccttgttcct 5220

gccacagcct ttgccgagct ggctttgcgg gctggtcgcg aatgtgccga tccctctgga 5280

tctgagcagg tgattctcga tgagctcatc attctcgcac ccctagcctt gtctctagag 5340

gaagatgacg aggaacaaga atttgaggta caagtcgtga tcaaggagtt ggaagacgaa 5400

gagagcacta tccgacgaag cattgacgtt tattcacgtc ttcatgctgt ctcaacccaa 5460

cccgactggg tacagcatgc cacgggtacc ctgaagttga tttcgttgcc accacccgaa 5520

aaggatgtat ttaccaatgg cacacacgac gtagagaact ccgaggtgga tgtttccaaa 5580

gcatatgcca tgctagaaga ctttggcatc agctatggac cagccttcca aggcgtccgc 5640

ggtggttggc gtcagcacga caacgagctc ttggtacaga tcaacccgcc tcaggaccag 5700

gactccaagg cgggcttcgt cctccaccca gcccttctcg atgctgcttt gcacgctccc 5760

atcctcgcag cacctgaaaa ggtttctagt ggccagattc gactgccatt ctccttcaag 5820

ggcatacaag tctttgaggc tgccaccagc acctctgggc cagttttggc ccgcattcgc 5880

gatttggatg atgagcgctt ttccgtgacc atcacgaaca aggcaacagg cgcagcagtg 5940

gcagagattt ctgaagtcat gctgcgcgca gtccagcctc ccgttgtcga aggagattta 6000

taccgactca agtggaccga gttgaaggca gctcagacaa caaagccaaa ccttgtcgat 6060

gacatcttca ccgttcaagc tccccgcaac gtagatgccg ccgatattcc caaggctgtt 6120

cataatgccg tctcggaagc actccgtgct atacaacagt ggaggaccaa aaaggcgaat 6180

tcttccgaca aaattcgtct catctttgtc actgaacagg cgtcgctgca ccctgacgtc 6240

aatgttatcg atgccgccgt ctggggcttt gtgcggtctg cgcagacaga gtttggtggg 6300

gagaatatca ttctgataga tctcgacggg tcggcagagt cacaggaggc tcttccatcc 6360

gcctttgatt gtggacaaga agttgttgct ctgcaagatg gcaagatcat ggttcccacg 6420

ctcagcaaag aacccccggt tccaagcacc tcgacaactc tcgatgtcag tggtacagtt 6480

ctaatcaccg gaggtacagg aggtctgggt gccatactca gtagacacct tgtgcaaacc 6540

tgcggggcaa gaaatctgct tttgacaagt aggtcgggca tcaaggctgc cggagcgact 6600

gagttgcttg acgagctaag cgctcaagac gcaacggttg tgcgtatcga gtcgtgcgat 6660

attagtgatc gcgctcagtt ggccacgcta cttgaaggca atcacggaca tccacccata 6720

actgccatca tccactgcgc cggcgtggtg gatgatggag tcttgacctc gctaactcca 6780

gaacggattt cccgtgtctt gcaagcaaag gttgatgctg cttggaatct gcaccagctg 6840

gcgccagaga caacacgtac ttttgtcctc tactcatcct ttgtcggcat tgttggaaac 6900

gaaggccaag ccgcatacac ggcgggcaat gccttcctca atgctttggc ccgcatgcgc 6960

gttgctcagg gactccccgc agtgtcgctg gcttggggcc cttgggccaa tgatgtcggc 7020

atggctgccg gggataaatt ggtgattccc aatcttcgca tcgccagcgc tcaaccggtc 7080

gtggatcagc aaggactgca tctgtttgac cgcgcactac agacttcaga gcctgttctt 7140

gtgccactat tgctacgcgg acccttcccc atggtgccat ccgccgctgc ggtgaccaag 7200

tccaagaagg ctaccgccaa gggcaaggca aagacgggcg ctgcatggcg caagaagctt 7260

gcagcagtct ctccagagag tcgctccgat actcttctgg gtctggtgcg agacgaaatt 7320

gccgcggtgc ttggatatca gggccaggag ctgccagacg ggccactgtc cgaccttggt 7380

ttcgactcgt ttacctcggt cacggtcagc aacaggatga gagtgctgac gggtttccgt 7440

gaccttccag tgaccctggc actcgactac gatacacctc aggcactggt gcagtacctg 7500

ctggatcgaa tcaatgctga accagaaacc gaaatcgagt tggaccaaga cgttgccgag 7560

gaagagacag tttctggaac aaacggtcac cagaatggcc atcaaaatgg cacccagaat 7620

ggccattcca acggacatgc caacggcgcg tccaccaatg gcgatgctac tgatggcatt 7680

gaccccgaag agttccgagg gctttccaca cttcaccggc gcctctgccg actcgagcag 7740

tacactgccg cggcagacct gctggcctct gccgcactgg caatgccaac attccccagc 7800

aatggccgca aactgttgga ttatgtggcg gatcctcatc gcctggcgac tggtcccgaa 7860

gtctcgcctg gcaacgacgc gcccctgccc gtagtcttta ttgccccctt cttcccacgc 7920

atcaagattg gaggaatctc gctcagtgtg tacagtgctg tagcagcttc tctgaatgga 7980

aagagggacg tgtttgagct cccacacccc gagggacaat atgttcccga ggaccttgac 8040

acactggccg agctacatgt cagtaccatc gagcaacagt ttggcgatag gccaggcatc 8100

attttggcag gttactctgc cggcggcacg gtcgcgtacg ccgtggcctc caagctggcc 8160

caggccggca aacacccccg tctggcgggc tttgtcttgg tagacacata cctgaccatg 8220

acgggacggg gcgatccaga ctggctcaac gccttgccgg ccgaggcgct cgtgtcgcgt 8280

ctcggaggac cggacagcac aggggagagt ctggtgggag atttggatct ggcattggcc 8340

aaggtgggcg ggtactttag aactctgcga gactgggacc aagagcttta tcccctaccc 8400

gatgcactgt cgactctctt tgtgcgagct ctagatccgt cggagaagat gcccaagaac 8460

gcggatatat ggcgtccaag atggcaacgg gcgaatcaca cggttgaggt gcctggaagt 8520

catttggccc ttcttgacaa gcgctatgct ccggcaattg ctgttgaaat tgaacattgg 8580

gcaaaggagc agttgggggt ttga 8604

<210> 3

<211> 8154

<212> DNA

<213> 无花果拟盘多毛孢(Pestalopsis fici)

<400> 3

atgtctcaac caacttcggt tcccaagctg ctcctccacc atgcggtgga aagccgggac 60

aaggtggcct tcttgggccc aggctggtcc attacctaca gtgaccttga aaagcgaacg 120

cggcttgtgg cagctcatct ggcgcgggcc ggtataggac gaggagattt cgtagccatt 180

gtgctaggga gatgcttgga ggcggtggag tctgtgttgg caatcatgag agccggcgcc 240

gtgagcgttc ccctagatcc gcgttcacca ccagcagacc tggccagggt tttggagcac 300

agcggagccc gcgcaatcat aactgatgat cggcacttgg ctacggtgtc cgccgcagcc 360

gtcaaaggat ccttgattat cataagcact acgaatgctc aggtggatgt catagaaagc 420

ctcaagacgg agcggtacca agactgggtt gaagatgatg gatactcgac gtcggatgtc 480

cacctggaca gcctaggcga tgaggaggag gcctttctgc actacacttc tggaacaacc 540

agcctaccca agggagtctt gtcgagtcaa aagagcgcac tgtggaacgt tgaaaaggtc 600

acttcagtgt ttgagttttc ctctgaggac cgcttcttct ggccactccc cttgtttcac 660

attctcggcc actccttatg tatactggcc accgtggcca agggtgccag cgcctatctt 720

tcggaccctg accagttgct gttggataac ctcttggtca aggatgttga agacacgacc 780

ttcattgcag gtgccccggc cacgtttcac gagcttgtcg aagccaaggc ggcatcgtcg 840

tcgactctga gtttgcccaa attgagggca tgtatgagcg caggtgctgc ggcatctgtt 900

tctctgtgtg atcaggtcca tgagctgttc ggagtgtcgc ttctcaacaa ctacggatgc 960

acagagactt gcggcgccat tgccattagc cggcctggcc atgtctatcg gcaacatggg 1020

agtgttaccc cactccccga ctgggagatt cagctgatgg atcaagatgg gaagcaagtc 1080

cgcgaaggcg agcaaggcga gctctgggtg cgcggtcccg gcctgatgct gggttactac 1140

aaagaaactc agtcgccatt cactgaagat gcttggtttc ccactggtga tacaggaatt 1200

ctcaccactt cggatgtcgg aaaagagctc agcctcgtgg gtcggaaaaa ggagttgatc 1260

atccggggag gagaaaacat acagccagct gagttggaac aagtcttgct ccagcaccct 1320

ggcgtggcag acgttgctgt ttctggcatt ctacacggat tgcttggcga gacgcctgcc 1380

gcgttcattg tcaaggagac tccagacctt gaccttgacc tttcctccct gatcgccacg 1440

tgcagagaag ctttgccaga ctacaaggtg cctacagcat tttacgaaat cgacgctgtg 1500

cctcggaccc ttttaggcaa gcccaagcgg ttggccgtag cgtcttacac gagcaaacca 1560

ctcacggttc gctccaggtt acaaacaaga gccgccgtcg aggcattggt tcttgcagaa 1620

acggccgggg cctgcggtgt gcaagccgag cccggggaga aggaatcgga cccggattgg 1680

cttcgcaaat acgccgacga gtccttttcc catctcggcc tgacctccat ggccggtgtc 1740

gtcctgcgag accgactggc caacctcacc ggcttggttg atctgcccaa caccctcgtc 1800

tttgactact ctactccagc ggctgtgcgc gactacctat tcaacaggct cagggagcag 1860

gaatcgccgc tcccatccaa gtcagcacct gcactgagct tgcccagcaa ggctgagccc 1920

attgccatta tctcaatggc ctgtagatat cctggaggaa tctcttcgcc agaggacttg 1980

tggcaactcg tttccgacga gatagacgca actactgact ttccgagtga tcgtggctgg 2040

gatatcgata gtctgtatag taccgacccg acggaacctt tcacctcgac cacgaagcgc 2100

ggcggtttcc tgcccgactt tgccgacttt gatgccggtc tatttggcat ggcacctcga 2160

gaagccctgg ctacggatcc ccagcaacgt ttactactgg aaacgacgtg ggaactagcc 2220

gaacgaggag gcattgcccc gttgtcgctc aaaggcaccc agactggttg cttcattggc 2280

acgctgtatg atgattacga agcaaacggc tttggcaacg ctgaattgga agctcatctt 2340

ggtcttggat cctccggcag tgtcatgtcc ggtcgcattt cctactactt tggtctccac 2400

ggtccgtcaa tagtcatatc aaccggttgt tcgtcctcgc tctgcgccgt ccattcagca 2460

gcccaagctc tcaggaacga agagtgcaca ctcgccattg caggtggaat cacgtgcatg 2520

gcttcgccca ggccattcac catgtttagc aagcgacgag gtctctcggc cgatgggcga 2580

tgccgaacgt actcgagcga cgccgccggc accggttggt ccgagggcgt aggtctcatc 2640

atgctcgaaa agctctcaga cgcccagcgc aacggacatc gcgtactggg cgtgattcgg 2700

ggctccgccg tcaactcgga cggcacgtcc aacggtctga cggccccgag cggacctgcg 2760

cagcaaatgt gtatccagag cgcgctgtcc caagcggcgc tgtcgcctac cgacattgat 2820

gttctcgaag gtcacgggac tgccacgccc ttgggtgatc ccatcgaggt acaggccgtg 2880

atcaacacct acggcaatgg gtctggcaat gatccccgcg cgaatccatt gctgattggt 2940

tcaatcaagt ccaatattgg ccacacccag gccgcagccg ccgtggctgg aatcatcaag 3000

atggtcaagt ccattcatca tggtgttgcc ccagcatcct tgcacatccg cgaaccttca 3060

cgacacattg attgggatgg gtgtggtgtt gagccactta gcaaggccaa gcagtggcca 3120

tctgtggaca gggcgagacg tgcagccgtg tcatcatttg gtattggagg cacaaacgca 3180

cacatcattt tggaacagcc tgattctatt gaacagaatg gcgtctcgac gccaaagaat 3240

cacacaattg cttttccatg gatcatttct ggcgccgacg aaaatgctct gcgcgcgcaa 3300

gcccagtcac ttctggcggc ctggcgcaag tccctcagtc atgagagccc gtccgacatt 3360

gcattctccc ttgcaaccgc gagatcttct ctcaaatata gggccgtggt gacgtacacc 3420

gccggaggcg acttgaacga tcagattgaa acggcactta cggctctcgc tgaagatgaa 3480

tcccatcccg acgtcgtgac aggacacacc aacaccactg gcaacaagcc gcgtctggct 3540

tgtctattct cgggacaggg tagtcggatg cccgatccca gcgccatcga ggagctttct 3600

accgttttcc ccatcttctc ccgcgcattc aaggaggcct gcgaggaagt caatcagtac 3660

ctcgaatgtc cgcttgaacg tgctttgagt gacagtagcc tcctggaccg aactgacttt 3720

gcgcagcccg ccttgtttgt ctttgaggtg gcaatgtacc gcctgctcga gtccttcgat 3780

gtgattcccg acgtggtgtc tggacattct ctaggagaaa tcgcagcagc tcacatttct 3840

ggagctctga ctctccgcga cgctgccatc atcgttacca cccgttccag attaatggct 3900

gctctagatg ccaatggcgg catggtgagc attgcggctc ctgagcaaga agtcgccgaa 3960

gagctgtcac gcctgggcag cacggcaatc attgcagttg tcaactctga aaaatcggtt 4020

gtggtatccg gtactcgaga ggccataacc gctgttgcag acagatttac agagctagga 4080

cgaagaacga ctattctgcg caatgtcaac cacggcttcc actcgccaat gatgaacggt 4140

attctgggag accttgaaga agctctggcg tcgtccattg gaagtggaac atcctccaag 4200

attccgctcg tgtccaccgt cacgggcaag ctcgccgaag cggcccagct gacctctccc 4260

caatactgga cacgccacgt cagcgagcca gttcgcttcg cagactccgt caacgagctt 4320

cgctcaaacg aacgtgtctc ggtgtttatt gaagtcggtc cctctgcagt cctctctccc 4380

catgtcccgg gtactgtcgc cacatatggc acagtcggca agctactgaa cacgctgggt 4440

caaatctggg cgcgcggcgt gcccgtcaac tggcaggccg tattcggtgg cgtaggtgcg 4500

catctcgtcg acttgcccgt ctatgccttc cagaggcgca agtattggct accatataga 4560

accctgttgc cagcagaatc tgtgggggcg tctggcgcct cctcaccggg tcgcacttca 4620

gacattggta cttctacatt gaaccatgga gtgctctacc ggactacatc cattgcgggg 4680

acaaacgaca tcatctgtgc cggtttcgtc tccgcaagca agcagccctg gctgcgcgac 4740

catattatta gtggtcagag ccttgttcct gccacagcct ttgccgagct ggctttgcgg 4800

gctggtcgcg aatgtgccga tccctctgga tctgagcagg tgattctcga tgagctcatc 4860

attctcgcac ccctagcctt gtctctagag gaagatgacg aggaacaaga atttgaggta 4920

caagtcgtga tcaaggagtt ggaagacgaa gagagcacta tccgacgaag cattgacgtt 4980

tattcacgtc ttcatgctgt ctcaacccaa cccgactggg tacagcatgc cacgggtacc 5040

ctgaagttga tttcgttgcc accacccgaa aaggatgtat ttaccaatgg cacacacgac 5100

gtagagaact ccgaggtgga tgtttccaaa gcatatgcca tgctagaaga ctttggcatc 5160

agctatggac cagccttcca aggcgtccgc ggtggttggc gtcagcacga caacgagctc 5220

ttggtacaga tcaacccgcc tcaggaccag gactccaagg cgggcttcgt cctccaccca 5280

gcccttctcg atgctgcttt gcacgctccc atcctcgcag cacctgaaaa ggtttctagt 5340

ggccagattc gactgccatt ctccttcaag ggcatacaag tctttgaggc tgccaccagc 5400

acctctgggc cagttttggc ccgcattcgc gatttggatg atgagcgctt ttccgtgacc 5460

atcacgaaca aggcaacagg cgcagcagtg gcagagattt ctgaagtcat gctgcgcgca 5520

gtccagcctc ccgttgtcga aggagattta taccgactca agtggaccga gttgaaggca 5580

gctcagacaa caaagccaaa ccttgtcgat gacatcttca ccgttcaagc tccccgcaac 5640

gtagatgccg ccgatattcc caaggctgtt cataatgccg tctcggaagc actccgtgct 5700

atacaacagt ggaggaccaa aaaggcgaat tcttccgaca aaattcgtct catctttgtc 5760

actgaacagg cgtcgctgca ccctgacgtc aatgttatcg atgccgccgt ctggggcttt 5820

gtgcggtctg cgcagacaga gtttggtggg gagaatatca ttctgataga tctcgacggg 5880

tcggcagagt cacaggaggc tcttccatcc gcctttgatt gtggacaaga agttgttgct 5940

ctgcaagatg gcaagatcat ggttcccacg ctcagcaaag aacccccggt tccaagcacc 6000

tcgacaactc tcgatgtcag tggtacagtt ctaatcaccg gaggtacagg aggtctgggt 6060

gccatactca gtagacacct tgtgcaaacc tgcggggcaa gaaatctgct tttgacaagt 6120

aggtcgggca tcaaggctgc cggagcgact gagttgcttg acgagctaag cgctcaagac 6180

gcaacggttg tgcgtatcga gtcgtgcgat attagtgatc gcgctcagtt ggccacgcta 6240

cttgaaggca atcacggaca tccacccata actgccatca tccactgcgc cggcgtggtg 6300

gatgatggag tcttgacctc gctaactcca gaacggattt cccgtgtctt gcaagcaaag 6360

gttgatgctg cttggaatct gcaccagctg gcgccagaga caacacgtac ttttgtcctc 6420

tactcatcct ttgtcggcat tgttggaaac gaaggccaag ccgcatacac ggcgggcaat 6480

gccttcctca atgctttggc ccgcatgcgc gttgctcagg gactccccgc agtgtcgctg 6540

gcttggggcc cttgggccaa tgatgtcggc atggctgccg gggataaatt ggtgattccc 6600

aatcttcgca tcgccagcgc tcaaccggtc gtggatcagc aaggactgca tctgtttgac 6660

cgcgcactac agacttcaga gcctgttctt gtgccactat tgctacgcgg acccttcccc 6720

atggtgccat ccgccgctgc ggtgaccaag tccaagaagg ctaccgccaa gggcaaggca 6780

aagacgggcg ctgcatggcg caagaagctt gcagcagtct ctccagagag tcgctccgat 6840

actcttctgg gtctggtgcg agacgaaatt gccgcggtgc ttggatatca gggccaggag 6900

ctgccagacg ggccactgtc cgaccttggt ttcgactcgt ttacctcggt cacggtcagc 6960

aacaggatga gagtgctgac gggtttccgt gaccttccag tgaccctggc actcgactac 7020

gatacacctc aggcactggt gcagtacctg ctggatcgaa tcaatgctga accagaaacc 7080

gaaatcgagt tggaccaaga cgttgccgag gaagagacag tttctggaac aaacggtcac 7140

cagaatggcc atcaaaatgg cacccagaat ggccattcca acggacatgc caacggcgcg 7200

tccaccaatg gcgatgctac tgatggcatt gaccccgaag agttccgagg gctttccaca 7260

cttcaccggc gcctctgccg actcgagcag tacactgccg cggcagacct gctggcctct 7320

gccgcactgg caatgccaac attccccagc aatggccgca aactgttgga ttatgtggcg 7380

gatcctcatc gcctggcgac tggtcccgaa gtctcgcctg gcaacgacgc gcccctgccc 7440

gtagtcttta ttgccccctt cttcccacgc atcaagattg gaggaatctc gctcagtgtg 7500

tacagtgctg tagcagcttc tctgaatgga aagagggacg tgtttgagct cccacacccc 7560

gagggacaat atgttcccga ggaccttgac acactggccg agctacatgt cagtaccatc 7620

gagcaacagt ttggcgatag gccaggcatc attttggcag gttactctgc cggcggcacg 7680

gtcgcgtacg ccgtggcctc caagctggcc caggccggca aacacccccg tctggcgggc 7740

tttgtcttgg tagacacata cctgaccatg acgggacggg gcgatccaga ctggctcaac 7800

gccttgccgg ccgaggcgct cgtgtcgcgt ctcggaggac cggacagcac aggggagagt 7860

ctggtgggag atttggatct ggcattggcc aaggtgggcg ggtactttag aactctgcga 7920

gactgggacc aagagcttta tcccctaccc gatgcactgt cgactctctt tgtgcgagct 7980

ctagatccgt cggagaagat gcccaagaac gcggatatat ggcgtccaag atggcaacgg 8040

gcgaatcaca cggttgaggt gcctggaagt catttggccc ttcttgacaa gcgctatgct 8100

ccggcaattg ctgttgaaat tgaacattgg gcaaaggagc agttgggggt ttga 8154

Claims

1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括连接NRPS-PKS杂合蛋白基因的表达载体；

所述重组菌的出发菌为构巢曲霉LO8030，所述NRPS-PKS杂合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；或

所述重组菌的出发菌为酿酒酵母BJ5464，所述NRPS-PKS杂合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

2.一种柚皮素查尔酮的制备方法，其特征在于，包括：发酵权利要求1中的构巢曲霉重组菌。

3.一种柚皮素和柚皮素查尔酮的制备方法，其特征在于，包括：发酵权利要求1中的酿酒酵母重组菌；发酵底物选自对羟基苯甲酸、香豆酸、对羟基苯甲醛和苯甲酸中的一种或多种。