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CN113045410A - 一种双环降二萜类化合物及其合成基因及制备方法 - Google Patents

一种双环降二萜类化合物及其合成基因及制备方法 Download PDF

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CN113045410A CN202110334393.XA CN202110334393A CN113045410A CN 113045410 A CN113045410 A CN 113045410A CN 202110334393 A CN202110334393 A CN 202110334393A CN 113045410 A CN113045410 A CN 113045410A
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张立新
张雪
朱国良
吕康杰
邢翠平
张敬宇
张维燕
杨欢婷
兰珂盈
徐发龙
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Abstract

本发明公开了一种双环降二萜类化合物varienordienoids A‑G及其制备方法。通过米曲霉异源表达隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020中varienordienoids的生物合成基因簇中的基因来获得varienordienoids A‑G，该基因簇含有vndD、vndE、vndA、vndB以及vndc五个基因，序列分别如SEQ ID NO.1～5所示。本发明获得的产物为降二萜化合物的生物合成提供了新的资源，为该类化合物种类提供一种新选择，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源；且本发明整个操作过程简单，工艺成熟，成本低廉，且不含有害杂质，无毒，对环境非常友好。

Description

一种双环降二萜类化合物及其合成基因及制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种双环降二萜类化合物的新型结构、从隔孢球壳菌17020(Didymosphaeria variabile 17020)中克隆得到的该化合物的合成基因簇、及利用该基因簇通过异源表达合成该化合物的方法。
背景技术
萜类化合物是一类由异戊二烯基本单位构成的通式为(C5H8)n的碳氢化合物及其衍生物，其来源分布广泛，种类丰富，是天然产物中最大的家族，迄今为止已有8万多个成员。萜类的结构多样性赋予了它广泛的的生物学活性，在日常生活中发挥着重要作用，如人体必需维生素A和B、抗疟疾的青蒿素、抗肿瘤的紫杉醇和紫苏醇、航空燃油替代物法尼烯等。
萜类化合物丰富的结构类型及广泛的生物活性决定了其在天然药物研究中的重要地位，随着NCBI中释放基因组数据库的不断增加，研究者发现微生物基因组中蕴含着大量萜类生物合成基因簇，这就意味着以萜类合酶为基因组挖掘的“探针”，靶向调取并异源表达新颖生物合成基因簇，是开发新骨架及全新生物合成机制萜类成分的强有力工具。然而，采用基因组挖掘策略系统研究新颖萜类化合物的困难集中在以下方面：(1)需要考量“探针”的新颖程度，以获取更新颖萜类产物；(2)对于有助于进一步提升萜类化合物活性的后修饰基因研究较少。
近年来从丝状真菌中发现了一类特殊的双功能萜合酶(Bifunctional TerpeneSynthase,BFTP)，其C端异戊烯基转移酶(prenyltransferase，PT)结构域和N端萜类合酶(terpene synthase，TPS)结构域嵌合，大多具有新颖的催化机制并催化形成全新的萜类骨架。目前仅有22个真菌BFTSs的研究报道，尚有大量新颖的萜类合酶及其催化的二倍半萜骨架待发现，具有巨大的挖掘潜力。这种新颖BFTSs的发现为萜类化合物基因组挖掘提供了新途径，可作为后续基因组挖掘的重要“探针”，是开发新骨架及全新生物合成机制萜类成分的强有力工具。尽管双功能萜合酶在萜类骨架形成中起着核心作用，但后修饰基因对于结构多样化和活性改进必不可少。目前对于后修饰酶的开发远远落后于BFTSs的相关研究，仅有个别BFTS进行了后修饰表达，大部分还只局限于单个基因的表达，这表明未来这部分的工作具有很大的发展空间，有待挖掘和研究。
隔孢球壳菌(D.variabile 17020)是一种植物病原真菌，为了适应复杂环境的生物环境，可能促使其产生更多具有新颖合成机制和作用机制的次级代谢产物，具有良好的挖掘潜力，检索发现目前国内外尚无任何关于通过异源表达的方式表达D.variabile中varienordienoids的生物合成基因簇中的基因来生产萜类化合物的报道。
发明内容
本发明是为解决上述不足进行的，提供了一种双环降二萜类化合物varienordienoids A-G的结构、其合成基因簇，并基于该其合成基因簇提供了一种双环降二萜类化合物的生物合成方法。
本发明的思路如下：研发过程中发明人通过基因组挖掘的策略从隔孢球壳菌17020(D.variabile 17020)中发现了新颖的varienordienoids生物合成基因簇。通过异源表达的方式，实现了varienordienoids生物合成基因簇中的基因在米曲霉中的表达。最终，分离纯化获得了七个具有全新骨架的5-5二环系降二萜化合物，即varienordienoids A-G。本发明的创新点体现在利用基因工程的方法，构建产生新化合物varienordienoids A-G的自给自足工程菌。
本发明的第一方面，提供了一种双环降二萜类化合物varienordienoids A-G，所述化合物为含5-5-二环二萜骨架的化合物，其分子式为C19H30O4，结构式如下所示：
Figure BDA0002996764170000021
本发明的第二方面，提供了上述双环降二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过米曲霉异源表达隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020中varienordienoids的生物合成基因簇中的基因来获得varienordienoidsA-G。其中，隔孢球壳菌Didymosphaeriavariabile17020保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21066。
优选的，所述基因簇含有五个基因，分别为编码二萜合酶VndD的基因vndD或其功能等同体、编码细胞色素P450酶VndE的基因vndE或其功能等同体、编码水解酶VndA的基因vndA或其功能等同体、编码脱羧酶VndB的基因vndB或其功能等同体、以及编码pH响应VndC的基因vndc或其功能等同体。所述基因簇的核苷酸序列是分别与编码蛋白VndA，VndB，VndC，VndD和VndE的氨基酸序列一致性高于80％所对应的DNA编码序列。
更优选的，vndD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，vndE的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，vndA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，vndB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，vndC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步，本发明所提供的双环降二萜类化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
A、基因异源表达载体的构建
通过PCR技术，以隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020基因组为模板，分别以引物VndD-F/VndD-R、VndE-F/VndE-R、VndA-F/VndA-R、VndB-F/VndB-R和VndC-F/VndC-R进行PCR扩增，得到基因vndD，vndE，vndA，vndB和vndC的PCR产物，扩增过程中所用到的引物序列分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15所示：
然后以米曲霉A.oryzae表达载体pUARA2为载体构建vndD和vndE的共表达载体pUARA2-vndDE；以米曲霉A.oryzae表达载体pUSA2为载体构建vndA，vndB和vndC的共表达载体pUSA2-vndABC；并将该两个连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，筛选阳性转化子，培养后提取质粒PCR验证，
B、原生质体转化
在PEG溶剂的介导下，将共表达载体pUARA2-vndDE和pUSA2-vndABC共同转化至易于表达萜类合酶基因的高产宿主米曲霉A.oryzae NSAR1的原生质体中，获得能产生varienordienoidsA-G的米曲霉转化子AO-vndABCDE，
C、异源表达菌株培养及产物分离
将米曲霉转化子AO-vndABCDE的菌丝体接种于含0.1％腺嘌呤的MPY培养基中，于30℃，220rpm培养2d作为种子液，按照80g大米加入5mL种子液的比例，接种于添加0.1％腺嘌呤的大米固体培养基中，30℃，静置培养24d，产物分离后得到varienordienoids A-G。
进行产物分离的步骤如下：将varienordienoidsA-G的固体发酵物加入等体积的乙酸乙酯萃取，蒸干后获得浸膏；浸膏用水萃取去除极性大的组分，乙酸乙酯萃取液再蒸干后进行凝胶和反相分离富集目标组分，最终溶于乙腈用于反相C18-PEP色谱柱半制备获得纯化的varienordienoidsA-G；色谱条件为：色谱柱为ACE C18-PFP column，规格10×250mm，5μm；洗脱程序为：10～45％甲醇梯度冲洗17min，再使用40～99％甲醇梯度洗脱5min，99％甲醇等度冲洗5min。
本发明的第三方面，提供了一种双环降二萜类化合物合成基因簇重组表达载体，该重组表达载体为运载有上述所述基因的真核或原核表达载体。
本发明的第四方面，提供了一种双环降二萜类化合物合成基因簇重组表达宿主细胞，含有上述所述的重组表达载体。
本发明的第五方面，提供了上述双环降二萜类化合物合成基因簇在制备双环降二萜类化合物中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明发现了来自于隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020中的合成双环降二萜类化合物合成基因簇。将该基因簇与米曲霉A.oryzae表达载体重组后，转化入米曲霉原生质体，通过米曲霉异源表达该合成基因簇中的基因来获得varienordienoids A-G。整个操作过程简单，工艺成熟，成本低廉，且不含有害杂质，无毒，对环境非常友好。获得的产物varienordienoids A-G为降二萜化合物的生物合成提供了新的资源，为该类化合物种类的提供一种选择，为丰富天然产物化合物库、发现新抗生素提供了宝贵的先导化合物资源。
附图说明
图1为本发明化合物varienordienoids A-H的紫外谱图。
图2为本发明化合物varienordienoids A的HRMS光谱图。
图3为本发明化合物varienordienoids B的HRMS光谱图。
图4为本发明化合物varienordienoids C的HRMS光谱图。
图5为本发明化合物varienordienoids D的HRMS光谱图。
图6为本发明化合物varienordienoids E的HRMS光谱图。
图7为本发明化合物varienordienoids F的HRMS光谱图。
图8为本发明化合物varienordienoids G的HRMS光谱图。
图9为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图10为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图11为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图12为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图13为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图14为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图15为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。
图16为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图17为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图18为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图19为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图20为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图21为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图22为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。
图23为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图24为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图25为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图26为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图27为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图28为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图29为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。
图30为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图31为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图32为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图33为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图34为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图35为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图36为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。
图37为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图38为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图39为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图40为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图41为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图42为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图43为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。
图44为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
图45为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
图46为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
图47为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
图48为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
图49为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
图50为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。
菌种保藏信息：隔孢球壳菌17020(Didymosphaeria variabile 17020)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月16号，保藏编号为CGMCC No.21066。
具体实施方式
下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明实施例中所采用的PCR扩增，质粒提取、转化等基础分子生物学实验技术如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(SambrookJ,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)，或按照相关产商提供的说明书执行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所提供的双环二萜化合物varienordienoids的合成基因簇，是从隔孢球壳菌17020中克隆得到，所述基因簇含有5个基因，分别为编码二萜合酶VndD的基因vndD或其功能等同体，编码细胞色素P450酶VndE的基因vndE其功能等同体，编码水解酶VndA的基因vndA或其功能等同体，编码脱羧酶VndB的基因vndB或其功能等同体以及编码pH响应VndC的基因vndc或其功能等同体。
其中，所述vndD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，vndE的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，vndA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，vndB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，vndC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，或者所述基因核苷酸序列是分别与编码蛋白VndA，VndB，VndC，VndD和VndE的氨基酸序列一致性高于80％所对应的DNA编码序列。
实施例1二环二萜化合物varienordienoids的合成基因的异源表达及二倍半萜骨架化合物的结构鉴定。
利用异源表达的方法，将隔孢球壳菌17020菌体中的varienordienoids生物合成基因簇通过构建表达质粒转入宿主米曲霉中，检测异源表达菌株产物生产情况。本实施例所用到培养基配方如表1所示。
表1实施例所用到培养基配方
Figure BDA0002996764170000061
1.Varienordienoids基因簇异源表达载体的构建
(1)以D.variabile 17020的基因组为模板，分别以引物VndD-F/VndD-R，VndE-F/VndE-R，VndA-F/VndA-R，VndB-F/VndB-R和VndC-F/VndC-R对二萜合酶的基因vndD，细胞色素P450酶基因vndE，水解酶基因vndA，脱氢酶基因vndB和pH响应基因vndC进行PCR扩增。
(2)基因vndD，vndE的PCR产物经核酸纯化试剂盒纯化后，利用Ezmax重组试剂盒将vndD整合至KpnI酶切消化后的线性载体pUARA2中，连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pUARA2-vndD质粒。在此基础上，再利用Ezmax重组试剂盒将vndE整合至PacI酶切消化后的线性载体pUARA2-vndD，连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，最终获得表达载体pUARA2-vndDE。
(3)同样，以如上方法在基因vndA，vndB和vndC的PCR产物经核酸纯化试剂盒纯化后，再利用Ezmax重组试剂盒将vndA整合至KpnI酶切消化后的线性载体pUSA2中，连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pUSA2-vndA质粒；在此基础上，再利用Ezmax重组试剂盒将vndB整合至PacI酶切消化后的线性载体pUSA2-vndA，连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pUSA2-vndAB质粒；最后利用Ezmax重组试剂盒将vndC整合至NheI酶切消化后的线性载体pUSA2-vndAB，连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取表达载体pUSA2-vndABC质粒。
表2实例中用到的引物序列
Insert Primer sequence 5’-3’ 编号
vndD-F CGGAATTCGAGCTCGATGAAATATCAACACTCCCATCTCA SEQ ID NO.6
vndD-R ACTACAGATCCCCGGCTAAAGCAGCGGCGCCTCTA SEQ ID NO.7
vndE-F TTCGAATCGATTTGAGCTAGATGGATGCCACCATCCTTTG SEQ ID NO.8
vndE-R GTCACTAGTGCGGCCGCTAGTTAAGGCACGGTTCCAACCG SEQ ID NO.9
vndA-F AGCTCCGGAATTCGAGCTCGATGTCGTCGTCCATGGCGCA SEQ ID NO.10
vndA-R GAGCTACTACAGATCCCCGGCTACTGTGCCGTCTTCCGGT SEQ ID NO.11
vndB-F TTCGAATCGATTTGAGCTAGATGGCTGGCTACAACACACT SEQ ID NO.12
vndB-R GTCACTAGTGCGGCCGCTAGCTACGTCCACACCTCTCCCA SEQ ID NO.13
vndC-F AGCTCCGGAATTCGAGCTCGATGTCGGGACAATCTAGCGT SEQ ID NO.14
vndC-R GAGCTACTACAGATCCCCGGTTATTTCTTTCCGGGCATAGAATCG SEQ ID NO.15
2.原生质体的转化
(1)将米曲霉A.oryzae NSAR1涂于PDA平板，30℃培养7d。
(2)收集抱子于10mL 0.1％Tween-80(一般需要收集1个平板的抱子)，用血球计数板计数。接种约107个孢子于50mL DPY中，30℃、220rpm培养2-3d。
(3)称量100mg Yatalase，加入solution 0溶解，20ml用0.22μm滤膜过滤灭菌，加入到50ml离心管中。
(4)收集菌体。将培养好的100ml菌丝体倒入到P250玻璃过滤器中，去除培养基，用灭菌水清洗(或0.8M NaCl)3～5次，用灭菌药勺将水分挤干去除，然后将压干的菌体加入到Yatalase溶液中。30℃，200rpm震荡培养1-2小时，至球状菌丝体消失上清明显秽浊状为止。
(5)用Miracloth滤布过滤消化好的菌液，收集原生质体，转到新50ml离心管中，4℃，800g，5min离心。
(6)去除上清液，加入20ml，0.8M NaCl再悬浮清洗，4℃，800g，5min离心(清洗两次)。去除上清液，加10ml，0.8M NaCl。用细菌计数器在显微镜下数原生质体的数目。原生质体数目＝总计数/80×400ml×104×稀释倍数。
(7)将原生质体浓度调成2×108cell/ml(sol 2/sol 3＝4/1)，依据菌体生长情况可收获0.5ml～2ml原生质体不等。
(8)取200μl的原生质体溶液移至新的50ml的离心管中，分别加入10μg表达质粒pUARA2-vndDE和pUSA2-vndABC，轻轻地混匀。在冰上静置20min。期间将灭菌好的Top agar，在50℃水浴中保温。
(9)往10的混悬液中加入1ml的sol 3，用枪头轻轻的混匀。在室温下静置20min。加入10ml的sol2，轻轻混匀。
(10)4℃，800g，10min离心，除去上清，加入1ml的sol 2，用移液枪轻轻地混悬，加入200μl到pUARA2质粒筛选固体培养基的中央(x3板)。在培养皿的周围迅速加入5ml 50℃保温的top agar，快速混匀。平板表面充分干燥后，用parafilm缠好，盖朝下，进行30℃培养3-7天。
(11)每平板挑2-3个克隆，共8个；将长出的转化子进行PCR验证，阳性转化子即为varienordienoids基因簇异源表达菌株AO-vndABCDE。
3、异源表达菌株AO-vndABCDE表达产物的分离纯化
接种异源表达菌株AO-vndABCDE菌丝体接种于含0.1％腺嘌呤的MPY培养基中，于30℃，220rpm培养2d作为种子液，按照80g大米5mL种子液的比例，接种于添加千分之一腺嘌呤的大米固体培养基中，30℃，静置培养24天。
将AO-vndABCDE的固体发酵物加入等体积的乙酸乙酯萃取，蒸干后获得浸膏，浸膏用水萃取去除极性大的组分，乙酸乙酯萃取液再蒸干后进行凝胶和反相分离富集目标组分，最终溶于乙腈用于反相C18-PEP色谱柱半制备获得纯化的varienordienoids A-G；其中，色谱柱为ACE C18-PFP column，规格10×250mm,5μm，洗脱程序为：10％～45％甲醇梯度冲洗17min，再使用40％～99％甲醇梯度洗脱5min，99％甲醇等度冲洗5min。
分离的二环二萜化合物的NMR测试采用Bruker 600MHz(1H 600MHz；13C 150MHz)。二倍半萜骨架化合物的溶剂为氘代吡啶，NMR谱仪器分辨率为600MHz，先进行1HNMR和13CNMR的测定，将其与数据库中的数据做对比，若为新结构，则再补全HSQC，COSY，HMBC谱图解谱确定具体结构。
4、鉴定二环二萜化合物varienordienoidsA-G。
将上述得到的二环二萜化合物varienordienoidsA-G进行鉴定：
(1)外观：为淡黄色透明油状。
(2)溶解性：易溶于甲醇，难溶于水。
(3)紫外光谱：化合物varienordienoids A-G甲醇溶液的紫外光谱在245nm处有最大吸收峰，紫外光谱见图1所示，图1为本发明化合物varienordienoidsA-G的紫外谱图。紫外光谱测试仪器为Mariner System 5304 instrument。
(4)质谱：图2为本发明化合物varienordienoid A的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 321.20604，提示其最可能分子式为C19H29O4。图3为本发明化合物varienordienoid B的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 337.20095，提示其最可能分子式为C19H29O5。图4为本发明化合物varienordienoid C的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 337.20200，提示其最可能分子式为C19H29O5。图5为本发明化合物varienordienoid D的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 303.19547，提示其最可能分子式为C19H27O3。图6为本发明化合物varienordienoid E的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 391.19039，提示其最可能分子式为C19H27O4。图7为本发明化合物varienordienoid F的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 321.20604，提示其最可能分子式为C19H29O4。图8为本发明化合物varienordienoid G的HR-ESI-MS谱图，显示其[M-H]-峰为m/z 319.19039，提示其最可能分子式为C19H27O4。HR-ESI-MS图谱测试采用Thermal Fisher Orbitrap Q Exactive massspectrometer，甲醇为溶剂。
(5)核磁共振谱：图9为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图10为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图11为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图12为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图13为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图14为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图15为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的1H-NMR谱图。图16为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。图17为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。图18为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。图19为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。图20为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。图21为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。图22为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的13C-NMR谱图。对本发明化合物varienordienoidsA-G的核磁共振谱进行了研究并对1H和13C信号进行了归属，见表3和表4。图23为本发明化合物varienordienoid A溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图24为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图25为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图26为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图27为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图28为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图29为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的1H-1H COSY谱图。图30为本发明化合物varienordienoidA溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图31为本发明化合物varienordienoidB溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图32为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图33为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图34为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图35为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图36为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的HSQC谱图。图37为本发明化合物varienordienoidA溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图38为本发明化合物varienordienoidB溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图39为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图40为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图41为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图42为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图43为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的HMBC谱图。图44为本发明化合物varienordienoidA溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。图45为本发明化合物varienordienoid B溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。图46为本发明化合物varienordienoid C溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。图47为本发明化合物varienordienoid D溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。图48为本发明化合物varienordienoid E溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。图49为本发明化合物varienordienoid F溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。图50为本发明化合物varienordienoid G溶于pyridine-d6中的NOESY谱图。最终确定结构式如下：
Figure BDA0002996764170000101
表3化合物varienordienoids A-C的1H和13C-NMR谱各峰归属
Figure BDA0002996764170000102
Figure BDA0002996764170000111
表4化合物varienordienoids D-G的1H和13C-NMR谱各峰归属
Figure BDA0002996764170000112
Figure BDA0002996764170000121
化合物varienordienoids A-G的NMR测试采用Bruker 600MHz(1H 600MHz；13C150MHz)。化合物varienordienoids A-G的溶剂为pyridine-d6。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 一种双环降二萜类化合物及其合成基因及制备方法
<130> 权利要求书、说明书
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2494
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 1
atgaaatatc aacactccca tctcatcgat ccatcttcat acgacaatca atgcctctgt 60
gacgggatcc cactccgctg ccatcgtaac tcagacatag aggaattcgg tcttatgcga 120
ttgcgcaatg actggcagaa acacatcggc tccctcccat caacaacgta tggcggccaa 180
ggtccccagt ataatttcac cgccgtgact attccagaat gtcttccaga gcgtctcgag 240
atcgttgcgt atattatgga gtttgcattc ctgcatgatg atcttgtgga tcaggctgag 300
gcgagtgagg tatgaaacat atacgagtgc gcagtcaagt gaattgacat agcacaggga 360
ttgggtttct ttgaaaagat gatgaaagag atcaaggcgg ggtttcgaag tactgataga 420
agacaaggca gttccggcga aagccgaatt ctgggcgaca tttttgagga gatgatggct 480
gttgactcac ccagagctaa gcaattccta gagtactgga agcgcggtgt aagcctcccg 540
cgagatcgaa cccgtttcga aagtctcgac gactatttgg atttcagact cgtggattca 600
ggagctttgt cagtttcctc tctgtatctg caacactgtg aagacagatg ctgataatgt 660
ccctccaagc ctcctaagtg gactgataac cttcgggatg ggtctcacga ttcctccaag 720
cgaaatagac gaatgttcca gactgactcg gcccgcttgg gccgctgcct ttcttacgaa 780
cgacgtccag tcctgggaga aggagtgcga agagtacaag aaccagataa aatggaacca 840
caccgcagac gcgccacaca tggtaaacgg agtttggata cttatgagac aatattccat 900
caatgtacag gaagcgatcg accgcgtctt ccagaaagta aaggtttttg tagcagaatt 960
tgttgacact gtcagaaccg tccacgacag aaaagatcta tccgaggatt cgcgctgctt 1020
catagaagcc gtacagcaca tggtcagcgg caatctgatt tggggaatct ccagtccccg 1080
gtatcatcct gatcgatcct taaatgagct ccaggtggcg agggtgaagc atactggacc 1140
acttcacatc ccaccggtta taaaggacac aaagcaccct cctgcgccac ctgacgaaga 1200
catcaaagtt gttgacggct cgaaagagat tgaggagagc gcccatcata ttactcgtgt 1260
cgacagccat agtggaccgt cacccaatga cccgattcct cagagtctcg gtgtatttct 1320
cactcaaggc ctccccactc cttcaagttt ggtattcacc tattgacctt catccgtcct 1380
ctgtcacacc cactaactcc tactcagccc atctcttccc catcttccta catcaacgca 1440
cttccatcca agaacatacg cgacaaagct gcagacgcat tgaacgtctg gctcaacgtc 1500
ccacaggccg atctgtccca tatcaagcgc atcgtcaaca tgcttcacaa tgcgtctttg 1560
atgctagacg acatggaaga tggctcgact ctgcgcaggg gcagtcccgc cgcacatact 1620
atctttggaa ttgcgcagac gatgaactcg gcgggctggc aggttgtgga ggctaccagg 1680
gagatccaga agctcaacga tgatagtagc attgagatgt gtatgggtaa gtatatatag 1740
tccttactgc actccaagcg gaccgaatct cacatgtgat tctttcagaa gagttaagca 1800
acatgtacat cgggcaagga catgacatct tctgggcgac gaatgttgtc tgcccgagtc 1860
ttgatgagta cctcaagatg gtggactaca gtaagccaag cagtcttacc tcaccctcaa 1920
ttatcctaac gaacgaacag aaaccggtgg gctcttccgc atactcacca ggctcatgct 1980
tgccaagtca ccgacgcccc cttggtcaga cttgacggcc attgcgtcgc tgatgggcag 2040
atacttccag gtccgagatg actacatgaa cctaagttcc gctgatgtga gacaagcccc 2100
tccctacact cttacttttg gcgatgcatc ccgacgtcgc taaactttcc accagtacac 2160
caagaagaag ggcttctgcg aggatctcga cgagggtaaa ttcagcttgt taatgatcca 2220
cacgatgcag gcggcgcccg aggtggacag aatgctcttg caaaatttgc tggcgcagag 2280
gcgcgcggcg gggaaaatgt caatggcaca gaagcatctg atactggaga taatgaagaa 2340
gacgggtagt atggagtacg tggccaaagt gttggaggcg ctgttggctg aggtcaggaa 2400
gatggttgat gatgttgaca aggagtgtgg tatagagaac gagatgatga ggtctttact 2460
tggtagtctg ggtgtagagg cgccgctgct ttag 2494
<210> 2
<211> 2078
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 2
atggatgcca ccatcctttg ggctgccgcc ggtatcttgt gtgccatctt tcttgtgtac 60
tgtacctgcc ttgtcctata tcgactctac ctttcccctc ttgcgcagtt ccctggacca 120
agactagtcg cagcaacagc gtggtatgaa acattcattg acgtcacgag caacaacttc 180
cacgaagttc tgctggacat gcataagaaa tatggtaagc ctcgaccggg ccaaggatag 240
cggatcgact gaccactctc gcaaaatagg accaatcgtt cgatgttcgc catgggagct 300
gtcgatcaat gacgcagaat acttcagcaa gctctatgtg ccagccggaa ttcgacacac 360
taactcgatg gtttcaaggt ttggttttgg tctcgagggt aagtttttac agtaagaaca 420
cggtaaaatg cttcgatcat cgagcctgac tcatgaggat agatactatc gcaacgacaa 480
gcaaccatga gctccatcag cttcgaagga gacccttgga aagttttctc tcacgcaaag 540
gtgttacgca ggctgaaagt gtcatccatg acaagaccag agtcctcgac caaagactta 600
gtgccctgca aggtacaggc tctttcgttc gtctggacca agcatattca gcatatctgg 660
gtgatgtcac tgttgagctc actgttggcg aatcctcaca gcttctggaa gaacccgatt 720
tcgccccgga gtggtaagct tcctttccag ttcatgatct tatttatcac tctggcccat 780
gtagtggtag cctcattaaa actctctgag ctgactacct cgaggcacaa aatcatacgt 840
agcatcttga ttgtgaaccc tgtaattcgg aatttccccc ttctaggcag gtatggcttc 900
attggcaccc tcatgtccca catggaaggc gactaatccc tacagattat tgacgatgat 960
tccaacgagc tgcatacaat gggcatttcc acgaatagca gcattcaaga tgtggcctgt 1020
ggttcgtgca acccactatg cccagtagtc tcgtatcgat gctgacatgg caagctcggc 1080
cgggacaaag tcaacaacgt caagtccgat cttgcccaag aagaaggcga tccggagaag 1140
ttctcgttct tccattccct tctcaggagc gacctacccg agtacgagaa gcatccatcc 1200
agattggccg cagaagcagt gggcgtattc ggcggcggaa ccatcaaccc gacatctgcg 1260
ctcgccttca ttacgttcca tatactcgcc aacgtgcata tgcacaggca cctacaagaa 1320
agcctggcgg acgtcatggc tcaatatccc aagaccattc ctgcttggac ggagttcgaa 1380
caagttccct acctcgcggc gtgtgtcaag gaaggccttc ggtaggtgtc ccttccgcga 1440
ttcaaagctg tcaaggatag gtgctaaggg aggttgctct agtatgagtt gccagttccg 1500
acgtagcgcg cgtatggcac ccgataccga gctgcattat aaagaatggg tcattccaaa 1560
aaacgtaagt cgtcctctct cacaactttg cactatgcaa atcctaatgc ttaaattata 1620
acgcagacac ctgtggcaat gtcggtttac aacatgcatt atgatccgag cgtgttccca 1680
gaccccttta cgtataagcc ggagcgttgg ctgggagaca tcgactcgcg catgaacagg 1740
tactttgttc cttggtccaa gggctcgagg gactgcccgg gtaaaaagta agtagctcct 1800
tcatcagact ggcattaagg ttgtacgctg attacatctt gtcatattag cctcgcctct 1860
gccgaaatgt acgttgtgct cgggacattg tttcgtcctg gcggtccttt tagttctcaa 1920
gtggttttga aagattgcga tgagacggat tttgccttcg tccgcgagag tgagtttggg 1980
gtattccctt acagtagcag agggctcggc gtcctcttca attgattttg actggatgag 2040
tagctcagtg ggtctttacg gttggaaccg tgccttaa 2078
<210> 3
<211> 925
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 3
atgtcgtcgt ccatggcgca gagactgaag ggcaagacgg tggtcgtaac gggcgcgagt 60
tctggcattg gaaagagcgt tgcgctggag tttgcgagga cgcagccaga tgacttgaag 120
ctcattatca ccgcgcggag aatcgacacg ctaaaggagg tcgccaaaga aataaatggc 180
tttgcgaagg gcgtcaaggt gcaccctgtg aagctggacg tgagcaaacc ggaggaaata 240
cagagctttg ttggacagct gcccgacgag ttcaaggagg ttgatgtgct tgttaacaac 300
gcgtgagtca gccttctcct tcctttcacc tagattggaa aggaaaacaa cttatatgag 360
gtagtggtct agtcaaaggc gttgcacaag cacctaatat cgcgtctgag gatatcgatg 420
ttatgtttag taccaacgtc accggcctca tcaacatgac acaagccatc cttcccatct 480
acaagtcacg ccccgacggc ggccgcggcg acatcataaa cattggctcc atcgccggcc 540
gagagcccta ccaaggcggc agcatctact gcgcgaccaa agccgccgtg cgctccttca 600
ccgatgcgct tcgaaaggag ctcatcgcta cccgcattcg cgtcatcgag gtcgaccccg 660
gacaggtgga aaccgagttc agcgttgtgc ggttctacgg cgacaaggag aaggcgaaga 720
aggtgtatga gggtgtggag ccgttgacag gtgatgatat cgccgaggtg gtggtctttg 780
cggcagggag aagggagaat gttgtgctgg cggatacgtt agtatatccg aatcatcagg 840
tgagtttcca gcttcactat gtagaaaagc tgctgatgtt tctcaggcgg cggcgacggt 900
tatgcaccgg aagacggcac agtag 925
<210> 4
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 4
atggctggct acaacacact tccaactacc gcgacaggca agatcgaacc attcgagatt 60
cacattgaag aacaggagtt acaagatttg aaaactttag ttagactgag tccaatcgtg 120
caagacacgt atgagaacca gaaagagcgg gtagctgaag ggcacacctt cggcatcaca 180
cgggaatggc tgatcgaagc gaagaaatac tgggagactg attttgactg gtaaacctct 240
cattgtcagc catcatccca tatattgaca gaacacaggc gcacccaaga agccaaccta 300
aacagctccc cccactataa agcttctatc acagacgagg atggaagaac ctacaccatc 360
cacttctgtg ccctcttctc tcgctcccct accgcaatcc ccctcgcccg cctcagcggc 420
tggccctgca ccttcgcaga atctctcccc ctcctcactc tcctccagca aaaatacact 480
ccggagactt taccctatca tataatcctg ccgtcacagg taggctgggc attctcctcc 540
ccaccaccac tagataaaga ctggacatac gcagactccg cacgcatact acacaaactc 600
atggccacga cgctcggctt cgaaaagtac gccgtgagcg gaggcgacat cggcgcaggc 660
ataggacgca tcatggcatc ctcatacccc gagatccgcg ccttccacac gaatcacaac 720
cagatgccgc gcccagactc cgccaccgac gacgagcttg aagaattcga gaaagagggc 780
gtgcgcaggg gtgacgagtt tttgagcacg ggaacggcgt atgggaggat ggcagggacg 840
aggccgggca cactgggtgc ggtgctggcg tcttcccctg tggctttgct ggcgtgggta 900
ggcgagaagt atctttcctg ggccgatcag aggacgccga ttccccttcc acatatacta 960
gaagccgtct gcatgtattg gttcactggc tgcctggcta cgacatttta tccctaccgc 1020
gaggactttc tcgcggggcc gggaaagaag gggtatctgc atgggcaaga ggagttgtat 1080
gtggagtgtc cgatgggcta tagctatttt cctagagagt tgattgcttg tccgaggagt 1140
tgggcggaga ggagtgggaa gttgaggtgg tataggagac atgaggttgg agggcatttt 1200
ccggctttgg agaggagtga tgtcttgttg gaagatcttg aagatttctt gggagaggtg 1260
tggacgtag 1269
<210> 5
<211> 433
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 5
atgtcgggac aatctagcgt cggtaccagt ggtgtctacg aggcaggcga ccagcgcaac 60
gttaagaact ccgagatcga gcaggcaaag gctgagaacc gcttccacga gggcaagcag 120
aactcccacc ttgctcagga ctccagtaag atctaccagt tttaccttga tcaattgaat 180
actttctaac gtcactgcag aggacgagcg ctccatcgcc aacaagcttg ctcgcgaaga 240
gaagcgcgag aaggaggatg agaacaacct atccgaagag gcccgcgcat cacagatcga 300
ctctacactg ccggcgaagc tgcacggtaa cgagccttcc aagggcgcca agatcgacca 360
ggagttgaag gaggaggagg aggctgagct caggcggaaa ggcaagggcg attctatgcc 420
cggaaagaaa taa 433
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 6
cggaattcga gctcgatgaa atatcaacac tcccatctca 40
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 7
actacagatc cccggctaaa gcagcggcgc ctcta 35
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 8
ttcgaatcga tttgagctag atggatgcca ccatcctttg 40
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 9
gtcactagtg cggccgctag ttaaggcacg gttccaaccg 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 10
agctccggaa ttcgagctcg atgtcgtcgt ccatggcgca 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 11
gagctactac agatccccgg ctactgtgcc gtcttccggt 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 12
ttcgaatcga tttgagctag atggctggct acaacacact 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 13
gtcactagtg cggccgctag ctacgtccac acctctccca 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 14
agctccggaa ttcgagctcg atgtcgggac aatctagcgt 40
<210> 15
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence ）
<400> 15
gagctactac agatccccgg ttatttcttt ccgggcatag aatcg 45

Claims (9)

1.一种双环降二萜类化合物varienordienoids A-G，其特征在于，所述化合物为含5-5-二环二萜骨架的化合物，其分子式为C19H30O4，结构式如下所示：
Figure FDA0002996764160000011
2.权利要求1所述的双环降二萜类化合物的制备方法，其特征在于：通过米曲霉异源表达隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020中varienordienoids的生物合成基因簇中的基因来获得varienordienoidsA-G，
其中，所述隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21066。
3.根据权利要求2所述的双环降二萜类化合物的制备方法，其特征在于：
其中，所述基因簇含有五个基因，分别为编码二萜合酶VndD的基因vndD或其功能等同体、编码细胞色素P450酶VndE的基因vndE或其功能等同体、编码水解酶VndA的基因vndA或其功能等同体、编码脱羧酶VndB的基因vndB或其功能等同体、以及编码pH响应VndC的基因vndc或其功能等同体，
所述基因簇的核苷酸序列是分别与编码蛋白VndA，VndB，VndC，VndD和VndE的氨基酸序列一致性高于80％所对应的DNA编码序列。
4.根据权利要求3所述的双环降二萜类化合物的制备方法，其特征在于：
其中，所述vndD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，vndE的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，vndA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，vndB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，vndC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求3所述的双环降二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、基因异源表达载体的构建
通过PCR技术，以隔孢球壳菌Didymosphaeria variabile 17020基因组为模板，分别以引物VndD-F/VndD-R、VndE-F/VndE-R、VndA-F/VndA-R、VndB-F/VndB-R和VndC-F/VndC-R进行PCR扩增，得到基因vndD，vndE，vndA，vndB和vndC的PCR产物，扩增过程中所用到的引物序列分别如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.15所示；
然后以米曲霉A.oryzae表达载体pUARA2为载体构建vndD和vndE的共表达载体pUARA2-vndDE；以米曲霉A.oryzae表达载体pUSA2为载体构建vndA，vndB和vndC的共表达载体pUSA2-vndABC；并将该两个连接产物转化到大肠杆菌DH10B中，筛选阳性转化子，培养后提取质粒PCR验证，
B、原生质体转化
在PEG溶剂的介导下，将共表达载体pUARA2-vndDE和pUSA2-vndABC共同转化至易于表达萜类合酶基因的高产宿主米曲霉A.oryzae NSAR1的原生质体中，获得能产生varienordienoidsA-G的米曲霉转化子AO-vndABCDE，
C、异源表达菌株培养及产物分离
将米曲霉转化子AO-vndABCDE的菌丝体接种于含0.1％腺嘌呤的MPY培养基中，于30℃，220rpm培养2d作为种子液，按照80g大米加入5mL种子液的比例，接种于添加0.1％腺嘌呤的大米固体培养基中，30℃，静置培养24d，产物分离后得到varienordienoids A-G。
6.根据权利要求5所述的双环降二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
其中，步骤C中，进行产物分离的步骤如下：将varienordienoidsA-G的固体发酵物加入等体积的乙酸乙酯萃取，蒸干后获得浸膏；浸膏用水萃取去除极性大的组分，乙酸乙酯萃取液再蒸干后进行凝胶和反相分离富集目标组分，最终溶于乙腈用于反相C18-PEP色谱柱半制备获得纯化的varienordienoidsA-G；
色谱条件为：色谱柱为ACE C18-PFP column，规格10×250mm，5μm；洗脱程序为：10～45％甲醇梯度冲洗17min，再使用40～99％甲醇梯度洗脱5min，99％甲醇等度冲洗5min。
7.一种双环降二萜类化合物合成基因簇重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体为运载有权利要求3或4所述基因的真核或原核表达载体。
8.一种双环降二萜类化合物合成基因簇重组表达宿主细胞，其特征在于：含有权利要求7所述的重组表达载体。
9.权利要求3或4所述的双环降二萜类化合物合成基因簇在制备双环降二萜类化合物中的应用。
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