CN111491949A

CN111491949A - 用于制备含有能够控制血管性血友病因子(vwf)的含量的因子8和血管性血友病因子的组合物的方法

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Publication number: CN111491949A
Application number: CN201880075786.XA
Authority: CN
Inventors: 安智远; 高官泳; 尹贞惠; 白承湖; 金民静; 吕槿惠; 林正爱; 金秀珖
Original assignee: Green Cross Holdings Corp
Current assignee: Green Cross Holdings Corp
Priority date: 2017-10-27
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-10-26
Also published as: KR102388176B1; WO2019083319A3; CA3079956C; CA3079956A1; EP3719034A2; US20200247843A1; EP3719034A4; US11608358B2; EP3719034C0; WO2019083319A2; CN111491949B; EP3719034B1; KR20200060504A

Abstract

本发明涉及一种用于制备含有能够控制血管性血友病因子(vWF)的含量的因子8(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法，并且更特别地，本发明涉及一种用于通过在单一过程中从血浆分别纯化因子8(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)，以及在适当比率下混合因子8(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)来制备含有能够控制血管性血友病因子(vWF)的含量的因子8(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法。根据本发明，可在相较于因子8(FVIII)的单一纯化产品不使除血管性血友病因子(vWF)以外的杂质的量增加的情况下，在相较于因子8(FVIII)的单一纯化工艺不使处理时间显著增加(在3小时内)的情况下，以及在不改变因子8(FVIII)的产率的情况下，产生/纯化含有以各种方式改变血管性血友病因子(vWF)的含量的因子8(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的组合物。

Description

用于制备含有能够控制血管性血友病因子(VWF)的含量的因子8和血管性血友病因子的组合物的方法

【技术领域】

本发明涉及一种制备包含因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vonWillebrand factor，vWF)的组合物的方法，其中所述血管性血友病因子(vWF)的含量可被控制，并且更特别地，本发明涉及一种用于制备包含因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法，其中所述血管性血友病因子(vWF)的含量可通过在单一过程中从血浆分别纯化所述因子VIII(FVIII)和所述血管性血友病因子(vWF)，以及在适当比率下混合所述因子VIII(FVIII)与所述血管性血友病因子(vWF)来控制。

【背景技术】

抗血友病因子(因子VIII)是一种具有通过在血液凝结期间促进因子X的活性来促使形成纤维蛋白凝块的功能的蛋白质辅酶。因子VIII矫正血友病患者的血浆中的血液凝结缺陷，并且在血浆中以与血管性血友病因子(在下文中被称为“vWF”)的复合物形式循环。

vWF是一种可改变血管性血友病因子缺乏症中的血小板功能缺陷并且与因子VIII形成复合物的蛋白质。vWF是一种在血管内皮细胞或骨髓巨核细胞中产生并且以多聚结构(具有500至20,000kDa的分子量)存在的止血因子，在所述多聚结构中，包括2050个氨基酸残基的单一亚单位(具有约250kDa的分子量的单体)通过二硫键连接。血液中的vWF的浓度是约10μg/ml，并且当其分子量增加时，其失活性增加。vWF作为止血因子具有两种主要功能。一种功能是作为通过结合血液凝结因子VIII来使其稳定的载体蛋白的功能，并且另一功能是通过使血小板粘附于受损血管壁的血管内皮细胞中的组织以及使血小板聚集来形成血栓的功能。

因子VIII/血管性血友病因子复合物的具有血液凝结活性的部分被称为“因子VIII凝结蛋白”、“VIII凝结活性”，或简称为“因子VIII:C”，并且具有矫正血管性血友病因子缺乏症中的血小板功能缺陷的活性的另外部分被称为“因子VIII相关抗原”、“VIII:Ag”、“VIII:RP因子”或“vWF”。此复合物通过非共价键形成，并且可被分成两种蛋白质，各自在适当条件下具有它的自身特征。

新近临床SIPPET研究结果已显示FVIII/VWF产品相比于通过在高纯度下纯化单独FVIII获得的产品，在血友病A患者中具有较低免疫原性发生率。

为确定由因子VIII:C所致的血液凝结活性的医学价值以及复合物VIII:C/vWF、因子VIII:C和vWF的结构，已进行许多尝试来分离、纯化和浓缩因子VIII:C和vWF。用于此举的方法通常基于免疫吸附或离子交换色谱，并且由于与之相关的问题而未得以在工业上应用，即其中难以在不影响蛋白质活性的情况下使靶蛋白质脱离，或从带电荷的离子性材料回收具有同样活性的蛋白质。

Tuddenham等人报道了一种用于使用免疫吸附色谱使因子VIII:C与vWF分离的方法(参见：E.G.D.Tuddenham等人,Journal of Laboratory Clinical Medicine,93:40(1979))。即，利用以结合有针对vWF的多价抗血清(抗vWF)的琼脂糖珠粒装填的柱子，使用色谱使因子VIII:C与vWF和其他血浆蛋白质分离。使含有VIII:C/vWF的血浆通过柱子，VIII:C与vWF两者均被吸附在所述柱子上，将非所需血浆蛋白质通过用缓冲液洗涤从所述柱子去除，并且接着通过用钙离子洗脱来获得所需因子VIII:C。尽管此方法实现因子VIII:C的纯度和效率改进，但最终产品仍然含有vWF和其他血浆蛋白质。这些杂质被认为归因于使用结合琼脂糖珠粒的多价抗血清。因为构成抗血清的大多数免疫球蛋白不对vWF具有特异性，所以vWF特异性抗体与琼脂糖的结合程度由于与其他类型的抗体的竞争而相对较低。出于此原因，最终产品常常受到其他血浆蛋白质污染。

Austin等人也报道了一种用于使用装填有氨基己基取代的琼脂糖的柱子，通过色谱使因子VIII:C与vWF和瑞斯托菌素(ristocetin)辅因子分离的方法。(参见：D.E.G.Austen,British Journal of Haematology,43:669(1979))。此方法关于人和猪VIII:C/vWF复合物得以改进，但因为最终产品仍然包括杂质而具有问题。

由Tuddenham等人和Austin等人采用的方法均因为最终纯化产品的浓度低下，并且大量杂质含于最终产品中而具有缺点。

此外，Zimmerman等人报道了一种用于使用两步纯化在高浓度下使高纯度因子VIII:C与vWF分离的方法(参见：USP 4,361,509)。即，第一步是免疫吸附含于血浆和浓缩物中的因子VIII:C，并且用于此举的吸附剂是结合至适当介质诸如琼脂糖珠粒的vWF特异性单克隆抗体。其中使用的单克隆抗体通过从小鼠的腹水产生单克隆抗体，接着对所述单克隆抗体进行纯化获得。使含有VIII:C/vWF的血浆通过装填有电吸附剂的柱子，以使VIII:C/vWF首先被吸附，将未吸附蛋白质通过用缓冲液洗涤从所述柱子去除，并且仅有吸附的因子VIII:C通过用含钙溶液处理被洗脱。vWF部分仍然吸附于与介质结合的抗vWF单克隆抗体。由此回收的因子VIII:C是高度纯净的，并且几乎完全不含杂质，但不利的是，其浓度对于在医学中使用来说太低。因此，此工艺的第二步是使用亲和色谱对纯化因子VIII:C进行浓缩。将在第一步中获得的含有约10至20IU(国际单位)的VIII:C因子的溶液注射至装填有氨基己基取代的琼脂糖的柱子中，并且用缓冲溶液充分洗涤，接着将含钙离子溶液注射至所述柱子中来以至少1,000单位/毫升的浓度洗脱因子VIII:C，所述浓度对应于至少160,000倍血浆浓度。然而，根据此纯化方法，结合于介质的抗vWF单克隆抗体(由小鼠的腹水产生)在洗脱因子VIII:C后脱离，并且最终洗脱物含有小鼠源性蛋白质，即抗vWF单克隆抗体。因此，此方法因为洗脱物不适于向需要因子VIII:C的人受试者给予而具有问题。

迄今为止，在用于纯化因子VIII/血管性血友病因子复合物的工艺中，除非人工丢弃因子VIII，否则血管性血友病因子的含量不能根据需要加以控制同时又维持40％至60％的高产率。已报道没有工艺能够使除血管性血友病因子以外的杂质的含量相较于控制之前降低。

因此，存在对开发能够通过控制vWF的含量在高浓度下分离和纯化包括在适当比率下结合的因子VIII和vWF的复合物，同时使杂质的污染最小化的新纯化方法的需要。

在这种情况下，诸位发明人已发现在从血浆分离和纯化因子VIII和vWF的过程中，vWF的含量可通过以下方式来控制：进行使用阴离子交换色谱的两个洗脱过程和使用阳离子交换色谱的一个额外洗脱过程，以及必要时在所需比率下混合在一个过程中的每个洗脱期间获得的洗脱物；因此可在高纯度和高浓度下分离和纯化具有人工控制的vWF含量以及因子VIII和vWF的含量比率的组合物。基于此发现，完成本发明。

【发明内容】

【技术问题】

本发明的一个目标在于提供一种在不导致因子VIII的产率变化的情况下制备含有因子VIII/血管性血友病因子(FVIII/vWF)以及具有不同含量的血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法。

【技术方案】

根据本发明的一个方面，以上和其他目标可通过提供一种制备包含因子VIII和血管性血友病因子(FVIII/vWF)的具有受控含量的所述血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法实现，所述方法包括：

(a)通过对从人体分离的血浆样品进行阴离子交换色谱，使用第一洗脱缓冲液获得初级洗脱物；

(b)通过对所述初级洗脱物进行阳离子交换色谱获得洗脱物；

(c)通过对用于通过步骤(a)的所述阴离子交换色谱获得所述初级洗脱物的柱子施加第二洗脱缓冲液获得洗脱物；和

(d)将步骤(b)中获得的所述阳离子交换色谱的洗脱物与步骤(c)中获得的所述阴离子交换色谱的二级洗脱物混合。

在本发明的另一方面，提供了一种用于治疗血液凝结障碍的药物组合物，所述药物组合物包含通过所述方法制备的包含因子VIII和血管性血友病因子(FVIII/vWF)的组合物作为活性成分。

在本发明的另一方面，提供了一种治疗血液凝结障碍的方法，所述方法包括向患有血液凝结障碍的患者给予组合物。

在本发明的另一方面，提供了组合物用于制备用以治疗血液凝结障碍的药物的用途。

【附图说明】

图1是显示根据本发明的制备包含因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的组合物的工艺的流程图。

图2显示作为主要杂质的纤维蛋白原(fibrinogen)、纤连蛋白(fibronectin)、FII、FX、IgA和IgM在本发明的工艺中的去除性能。

图3显示对在本发明的工艺中的相应步骤期间获得的产物的SDS-PAGE分析的结果。

图4显示根据本发明的工艺中的阴离子交换色谱步骤中的蛋白质分布，其中黑色矩形代表柱子上样步骤，浅灰色矩形代表柱子洗涤步骤，并且深灰色矩形代表柱子洗脱步骤。

图5显示对在根据本发明的工艺中通过使AEX洗脱物与CEX洗脱物混合、随后进行浓缩来获得的产品的SDS-PAGE分析的结果。

图6显示标准人血浆(泳道1)与根据本发明的三个纯化产品批次(泳道2、3和4)之间在vWF多聚样式方面比较的结果。

图7显示根据本发明的产品的在280nm下测量的尺寸排阻色谱结果。

【具体实施方式】

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与由本发明所涉及领域中的技术人员所理解的含义相同。一般来说，本文所用的命名法在本领域中是熟知的，并且是通常使用的。

本发明基于以下发现：在从血浆分离和纯化因子VIII和血管性血友病因子(vWF)的过程中，通过进行使用阴离子交换色谱的两个洗脱过程和使用阳离子交换色谱的一个额外洗脱过程，以及必要时在所需比率下混合在一个过程中的每个洗脱期间获得的洗脱物，在阴离子交换色谱期间的血管性血友病因子(vWF)损失可得以减小，并且vWF的含量可被控制，并且可在高纯度和高浓度下分离和纯化因子VIII(FVIII)和vWF的具有受控vWF含量的复合物。

因此，在一个方面，本发明涉及一种制备包含因子VIII/血管性血友病因子(FVIII/vWF)的具有受控含量的血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法。

所述方法可包括：

(b)通过对所述初级洗脱物进行阳离子交换色谱获得洗脱物；

(c)通过对用于通过步骤(a)的所述阴离子交换色谱获得所述初级洗脱物的柱子施加第二洗脱缓冲液获得二级洗脱物；和

本发明中的从人体分离的血浆样品可通过以下方法获得，所述方法包括：(i)将从人体分离的血浆样品冷冻，将所得沉淀物溶解，形成冷沉淀物，以及去除杂质；和(ii)将步骤(i)的产物通过用洗涤剂处理来灭菌。

在本发明中，因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)可从分离自人体的血浆样品纯化，并且另外，为提取存在于冷冻血浆沉淀物中的因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)，在将冷冻血浆沉淀物溶解的步骤中，将冷冻血浆沉淀物添加至提取剂中，接着在以200至300rpm搅拌下在23℃至27℃的温度下溶解3至5小时。

在本发明中，将冷冻血浆沉淀物溶解于含有每kg冷糊状物1.5±0.5IU肝素(greencross，肝素钠，目录号50-1341-7)、每kg冷糊状物1±0.5％乙醇(Korean alcohol，目录号40000533)和每kg冷糊状物3L注射用水的提取溶液中，但此提取溶液可用本领域中通常使用的提取溶液替换。当使用未冷冻血清时，可修改将沉淀物溶解的步骤以适于未冷冻血清。

为去除维生素K依赖性蛋白质诸如FII、FVII、FIX和FX，将氢氧化铝凝胶添加至溶解的沉淀物中以形成冷沉淀物。特别地，在22℃至28℃下以及在200至300rpm下搅拌溶解的沉淀物5至10分钟，将pH调整至6.1至6.6，并且使溶解的沉淀物历经30分钟至90分钟的时间段缓慢冷却至10℃至14℃的温度以形成冷沉淀物。添加的氢氧化铝凝胶优选地是每1kg冷冻血浆沉淀物150至250g的1％至3％氢氧化铝凝胶悬浮液配制品，但视血浆沉淀物的状态而定，量可适当增加或减少。

为去除氢氧化铝凝胶和杂质，将冷沉淀物在5至7L/min的输入速率下施加至离心机，并且在3,000rpm或更大的速率下以及在10℃至14℃的恒定温度下离心，并且将经离心溶液通过澄清-过滤来收集。

将步骤(i)的产物通过用洗涤剂处理来灭菌。在这种情况下，溶剂和洗涤剂可不加限制地使用，只要它们可使病毒，特别是脂质包膜病毒失活即可。洗涤剂可选自非离子性和离子性洗涤剂，并且优选地是基本上未改性的。特别地，考虑到去除的容易性，非离子性洗涤剂是优选的，并且如美国专利号4,764,369中公开的磷酸三正丁酯(TNBP)作为溶剂是最优选的，但本发明不限于此。

特别优选用于实施本发明的病毒失活剂是选自TNBP以及聚山梨醇酯80(吐温80(Tween 80))、曲通X-100(Triton X-100)和曲通X-45的一者或多者的混合物，但不限于此。

添加优选洗涤剂混合物以使澄清化溶液中的TNBP的浓度在0.2至0.6重量％，特别地在0.24至0.36重量％的范围内，并且聚山梨醇酯80的浓度在0.6至1.5重量％，特别地在0.8至1.2重量％的范围内。

将洗涤剂混合物在能够通过使脂质包膜病毒失活来形成基本上不具有来自病毒活性的风险的溶液的条件下进行处理。在以上条件下的反应温度特别地是4℃至30℃，更特别地是19℃至28℃，并且最特别地是26℃至27℃，反应时间特别地是1至24小时，更特别地是4至12小时，并且最特别地是约5至7小时，并且将洗涤剂混合物优选地在40至80rpm下缓慢搅拌洗涤剂混合物的情况下进行处理。

Toyopearl DEAE 650M树脂作为阴离子交换树脂用于步骤(a)的阴离子交换色谱中，并且添加Na⁺控制液体以使经洗涤剂处理的溶液的Na⁺浓度被调整至120至150mmol/L，将pH调整至6.8至7.2，并且将经洗涤剂处理的溶液在80至120厘米/小时的流速下施加至柱子中并吸附于树脂上。接着，通过在80至120厘米/小时的流速下以柱子体积4至6倍的量施加再平衡缓冲液来进行再平衡，接着通过在80至120厘米/小时的流速下以柱子体积4至6倍的量施加第一洗脱缓冲液来洗脱初级洗脱物。第一洗脱缓冲液含有150至170mM NaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O、100至140mM甘氨酸和0.5至1.5mM CaCl₂·2H₂O，并且可特别地将pH调整至6.6至7.4，更特别地，可将pH调整至6.8至7.2，并且最特别地，可将pH调整至6.9至7.1。

SP琼脂糖(SP Sepharose)树脂作为阳离子交换树脂用于步骤(b)的阳离子交换色谱中，并且将初级洗脱物在180至200厘米/小时的流速下施加至柱子中并吸附于树脂上。接着，在230至270厘米/小时的流速下以柱子体积4至6倍的量将洗脱缓冲液施加至吸附了初级洗脱物的柱子中以对洗脱物进行洗脱。用以通过阳离子交换色谱获得洗脱物的洗脱缓冲液含有380至420mM NaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O、100至140mM甘氨酸和0.5至1.5mMCaCl₂·2H₂O，并且可特别地将pH调整至6.0至7.0，更特别地，可将pH调整至6.3至6.7，并且最特别地，可将pH调整至6.4至6.6。

接着，在步骤(c)中，在30至60厘米/小时的流速下以柱子体积的2至4倍的量将第二洗脱缓冲液施加至用于获得初级洗脱物的柱子中以洗脱二级洗脱物。第二洗脱缓冲液含有230至270mM NaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O、100至140mM甘氨酸和0.5至1.5mM CaCl₂·2H₂O，并且可特别地将pH调整至6.6至7.4，更特别地，可将pH调整至6.8至7.2，并且最特别地，可将pH调整至6.9至7.1。

在本发明中，步骤(b)和(c)可同时进行，或可以按适当变化的顺序进行。同时，步骤(a)的阴离子交换色谱的洗脱物可含有因子VIII和vWF的混合物，步骤(b)的阳离子交换色谱的洗脱物可含有vWF，并且因子VIII以0.01重量％或更少的量存在。将步骤(b)的阳离子交换色谱的洗脱物和步骤(c)的阴离子交换色谱的二级洗脱物可以9:1至1:9的体积比率混合。

本文所用的阴离子交换树脂可被二乙基氨基乙基(DEAE)或季铵基团取代，但不限于此。特别地，可选择和使用具有强碱性季铵基团或弱碱性二乙基氨基乙基(DEAE)基团的阴离子交换树脂。

举例来说，强碱性阴离子交换树脂包括但不限于速流Q琼脂糖(Q Sepharose FastFlow)、高性能Q琼脂糖(Q Sepharose High Performance)、Resource Q、Source 15Q、Source 30Q、Mono Q、Mini Q、Capto Q、Capto Q ImpRes、Q HyperCel、Q-Ceramic HyperDF、Nuvia Q、UNOsphere Q、Macro-prep high Q、Macro-prep 25Q、Fractogel EMD TMAE(S)、Fractogel EMD TMAE Hicap(M)、Fractogel EMD TMAE(M)、Eshmuno Q、Toyopearl QAE-550C、Toyopearl SuperQ-650C、Toyopearl GigaCap Q-650M、Toyopearl Q-600C AR、Toyopearl SuperQ-650M、Toyopearl SuperQ-650S、TSKgel SuperQ-5PW(30)、TSKgelSuperQ-5PW(20)、TSKgel SuperQ-5PW等，但可使用本领域中已知的任何其他强碱性阴离子交换树脂。此外，弱碱性阴离子交换树脂的例子包括但不限于Toyopearl DEAE、速流DEAE琼脂糖(DEAE Sepharose Fast Flow)、Eshmuno Q、Fractogel EMD DEAE等，并且可使用本领域中已知的任何其他弱碱性阴离子交换树脂。更特别地，可使用选自以下的阴离子交换色谱树脂进行阴离子交换色谱：Toyopearl DEAE、速流Q琼脂糖、速流DEAE琼脂糖、Mono Q、Capto Q、Fractogel EMD TMAE(M)、Eshmuno Q、Toyopearl GigaCap Q-650M和FractogelEMD DEAE。

用于阴离子交换色谱的适当树脂体积是基于柱子尺寸即柱子的直径和树脂的高度来确定，并且取决于例如所施加的溶液中的免疫球蛋白溶液的量以及所使用的树脂的结合性能。在阴离子交换色谱之前，将阴离子交换树脂用缓冲液加以特别地平衡以允许树脂结合其反离子。

在本发明中，Toyopearl DEAE 650M树脂用作阴离子交换树脂，并且本领域中已知的任何平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，诸如磷酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸缓冲液，都可用作柱子缓冲液。

在本发明中，阳离子交换树脂可为交联葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)、HyperCel、Source、SP琼脂糖、速流SP琼脂糖(SP Sepharose Fast Flow)、Fractogel EMDSO3等，但不限于此，并且可使用本领域中已知的任何阳离子交换树脂。在本发明的一个实施方案中，SP琼脂糖树脂用作阳离子交换树脂。同时，本领域中已知的任何平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，诸如磷酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或乙酸缓冲液，都可用作柱子缓冲液。

在本发明的步骤(d)中，将步骤(b)中获得的阳离子交换色谱的洗脱物和步骤(c)中获得的阴离子交换色谱的二级洗脱物混合，并且因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价是1:0.6至1:1.4，特别地是1:1。在这种情况下，测量初级洗脱物和二级洗脱物中的因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价以及洗脱物(在阳离子交换色谱之后获得的洗脱物)中的血管性血友病因子(vWF)的效价以确定混合程度。

在本发明中，所述方法可还包括在步骤(d)之后，(e)将混合溶液浓缩以使因子VIII(FVIII)的浓度被调整至125IU/mL或更大；和(f)添加步骤(c)中获得的二级洗脱物以进一步控制因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价。

在步骤(e)中，将混合物浓缩并加以微滤。在本发明中，使用由乙酸纤维素制得的100kDa截止大小的膜将混合物浓缩。在本发明中，优选地将因子VIII(FVIII)浓缩至125IU/mL或更大的浓度。

在步骤(f)中，可添加步骤(c)中获得的二级洗脱物以进一步控制因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价。此时，根据二级洗脱物的添加量控制因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价。

在控制因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价之后，通过施加配制缓冲液制备配制品。配制缓冲液含有8.9至9.1mg/mL的甘氨酸、2.8至3.2mg/mL的柠檬酸钠·2H₂O、0.1至0.2mg/mL的CaCl₂·2H₂O、20至30mg/mL的蔗糖以及1.0至1.5mg/mL的聚山梨醇酯80。

同时，在本发明的每个步骤中，适当地进行微滤以使因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)可以纯化为高纯度。

在再另一方面，本发明涉及一种用于治疗血液凝结障碍的药物组合物，所述药物组合物包含通过所述方法制备的包含因子VIII和血管性血友病因子(FVIII/vWF)的组合物作为活性成分。

在本发明中，因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的效价可为1:0.2至1:3.0，优选地，1:0.6至1:2.8，但不限于此。

血液凝结障碍可为血友病A或血管性血友病因子缺乏症，但不限于此。

根据本发明的药物组合物可还含有药学上可接受的载体。

药物组合物中含有的药学上可接受的载体可包括制备中通常使用的药学上可接受的载体，诸如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶(gum acacia)、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。除上述成分之外，药物组合物可还含有润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。

通过根据普通方法使用药学上可接受的载体和赋形剂进行配制，组合物可被制备成单位剂型，或可被并入多剂量容器中。在这种情况下，配制品可呈于油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳液形式，或可呈浸膏、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊形式。组合物可还含有分散剂或稳定剂。此外，可将组合物作为单一治疗剂单独给予，或与另一治疗剂组合给予。在这种情况下，可将本发明的组合物与常规治疗剂依序或同时给予。

在另一方面，本发明提供了一种治疗血液凝结障碍的方法，所述方法包括向患有血液凝结障碍的患者给予组合物。

视患者的状况和副作用的存在而定，可通过多种途径和某一剂量向受试者给予根据本发明的组合物，并且最优给予方法和剂量可由本领域技术人员在适当范围内选择。此外，可将组合物与针对待治疗疾病的治疗作用是已知的其他药物或生理活性物质组合给予，或可以作为与其他药物的组合来配制。

在另一方面，本发明提供了组合物用于制备用以治疗血液凝结障碍的药物的用途。

在下文中，将参考实施例更加详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

实施例1：对因子VIII/血管性血友病因子(FVIII/vWF)复合物进行纯化的工艺

1-1.沉淀物溶解

将血浆冷冻冷沉淀物添加至提取缓冲液(含有每kg冷糊状物1.5±0.5IU肝素(Green Cross，肝素钠，目录号50-1341-7)、每kg冷糊状物1±0.5％乙醇(Korean alcohol)和每kg冷糊状物3L注射用水)中，并且在添加冷沉淀物之后在以250rpm搅拌下在25±1℃下溶解4小时，接着将pH调整至7.1±0.1。

1-2.冷沉淀/离心

将2％氢氧化铝凝胶[Al(OH)₃凝胶，Brenntag，目录号A1090S]的悬浮液(200g/kg冷糊状物)添加至溶解的沉淀物溶液中，并且在250rpm下以及在24℃至26℃下搅拌5至10分钟。在将pH调整至6.3至6.4之后，使液体的温度持续60分钟逐渐下降至10℃至13℃以形成冷沉淀物。在将离心机(GEA，BKB45)的旋转速度调整至5,400rpm之后，通过在维持温度为10℃至14℃的情况下在5至7L/min的输入速率下将冷沉淀物施加至离心机中来进行离心。将经离心溶液通过穿过2.0/1.2μm过滤器(Merck Millipore，PolySep II)进行澄清化过滤来收集。

1-3.用溶剂/洗涤剂(S/D)预处理

将已经受澄清化过滤的液体的温度调整至26℃至27℃，并且将pH调整至6.9至7.1。在以350rpm搅拌pH经调整的溶液下，持续20分钟至60分钟添加失活溶液以使磷酸三正丁酯(TNBP)(Merck Millipore，目录号1.00002)和聚山梨醇酯80(J.T.Baker，目录号4117)分别以0.3±0.06％和1.0±0.2％的量存在，并且接着将溶液再搅拌30分钟。将经搅拌溶液通过穿过0.45/0.2μm过滤器(Sartorius，Sartobran P)进行微滤来收集。

1-4.用溶剂/洗涤剂(S/D)处理

在以40至80rpm缓慢搅拌下，将经S/D预处理的溶液在26℃至27℃下持续5至7小时失活。

1-5.阴离子交换色谱工艺

将Toyopearl DEAE 650M树脂(Tosoh，目录号0007974)装填至柱子中以达到23±2cm的高度。添加Na⁺控制液体以使经S/D处理的溶液中的Na⁺浓度是135±13.5mmol/L，并且将pH调整至6.9至7.1。使pH经调整的溶液经受澄清化过滤，接着在100厘米/小时的流速下注射至柱子中并得以吸附。在吸附之后，通过在100厘米/小时的流速下使4至6CV的再平衡缓冲液(120mM NaCl、10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸，pH 7.0±0.1)流动来进行再平衡。在再平衡之后，通过在100厘米/小时的流速下使4至6CV的第一洗脱缓冲液(160mMNaCl、10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸、1mM CaCl₂·2H₂O，pH 7.0±0.1)流动来进行初级洗脱。在初级洗脱之后，通过在45厘米/小时的流速下使3CV的第二洗脱缓冲液(250mMNaCl、10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸、1mM CaCl₂·2H₂O，pH 7.0±0.1)流动来进行二级洗脱。

1-6.阳离子交换色谱工艺

将SP琼脂糖树脂(GE，目录号17-0729)装填至柱子中以达到17±1.7cm的高度。将通过阴离子交换色谱收集的初级洗脱物通过穿过0.45/0.2um过滤器(Sartorius，Sartobran P)进行微滤来收集。经微滤溶液在200厘米/小时的流速下施加至柱子中并得以吸附。在吸附之后，通过在250厘米/小时的流速下使5CV的洗涤缓冲液(260mM NaCl、10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸、1mM CaCl₂·2H₂O，pH 6.5±0.1)流动来进行洗涤。在洗涤之后，通过在250厘米/小时的流速下使5CV的洗脱缓冲液(400mM NaCl、10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸、1mM CaCl₂·2H₂O，pH：6.5±0.1)流动来进行洗脱。将所收集洗脱物(三级洗脱物)与是洗脱物体积0.6倍的量的CEX平衡缓冲液(10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸、1mMCaCl₂·2H₂O，pH 6.5±0.1)混合。

1-7.对FVIII活性的效价的分析

1-7-1.标准品制备

将标准品(NIBSC，人血液凝结因子VIII:C浓缩物(07/350)或其标准等同物)于缺乏FVIII的血浆(Siemens，目录号OTXW100)中稀释至1.0IU/mL，接着用含有1％白蛋白的CA系统缓冲液(Siemens，目录号B4265-35)稀释5、10、20和40倍。

1-7-2.样品制备

将每个样品用缺乏FVIII的血浆(Siemens，目录号OTXW100)稀释至1.0IU/mL的因子VIII，接着用含有1％白蛋白的CA系统缓冲液稀释16、18、20和22倍。

1-7-3.效价测量

使用血凝度计(Merlin medical，MC10 Plus)测量标准品和样品达成凝结所花费的时间以分析活化部分凝血活酶时间(aPTT)。

当获得样品达成凝结所花费的时间相对于标准品达成凝结所花费的时间的百分比(％)时，使用以下方程获得样品的效价值：

方程)样品的效价值(IU/mL)

＝样品测量结果(％)x稀释因子(倍数)x 0.002(校正因子)x标准品效价(IU/mL)

1-8.vWF添加

使阴离子交换色谱的所收集二级洗脱物和阳离子交换色谱的稀释洗脱物(三级洗脱物)经受工序检验，并且将通过以1:1的总效价比率使FVIII和vWF混合所制备的混合溶液通过穿过0.45/0.2um过滤器(Sartorius，Sartobran P)进行微滤来收集。

1-9.浓缩和微滤

使用由乙酸纤维素制得的100kDa截止大小100kDa膜(Sartorius，Hydrosart)使添加有vWF的溶液浓缩以将FVIII浓度调整至125IU/mL或更大。将浓缩溶液通过穿过0.45/0.2um过滤器(Sartorius，Sartobran P)进行微滤来收集，其用作储备级分。

1-10.效价调整

将FVIII的效价通过添加阴离子交换色谱第二洗脱缓冲液(250mM NaCl、10mM柠檬酸钠·2H₂O、120mM甘氨酸、1mM CaCl₂·2H₂O，pH 7.0±0.1)调整至125IU/mL。

1-11.配制

通过添加配制缓冲液(8.97mg/mL的甘氨酸、2.936mg/mL的柠檬酸钠·2H₂O、0.16mg/mL的CaCl₂·2H₂O、25.0mg/mL的蔗糖以及1.25mg/mL的聚山梨醇酯80)，将效价和Na⁺浓度分别调整至100IU/mL和200±50mM。

1-12.无菌过滤

将通过穿过0.45/0.2um过滤器(Sartorius，Sartobran P)进行无菌过滤来收集的滤液用作最终储备溶液，并且冷藏直至灌装。

总体工艺概述于下表1中。

[表1]

实施例2：对主要杂质在纯化工艺期间的去除性能的测定

测定作为主要杂质存在的纤维蛋白原、纤连蛋白、FII、FX、IgA和IgM在工艺的每个步骤中的去除性能。

纤维蛋白原、纤连蛋白、FII、FX、IgA和IgM的去除性能全都通过ELISA来测定。详细实验方法如下。

使用可商购的人纤维蛋白原ELISA试剂盒(由Assaypro制造，目录号EF1040-1)，根据由试剂盒制造商提供的手册测试纤维蛋白原含量。

使用可商购的人纤连蛋白ELISA试剂盒(由Assaypro制造，目录号EF1045-1)，根据由试剂盒制造商提供的手册测试纤连蛋白含量。

使用可商购的人凝血酶原(prothrombin)ELISA试剂盒(由Assaypro制造，目录号EP3023-1)，根据由试剂盒制造商提供的手册测试FII含量。

使用可商购的人纤维蛋白原ELISA试剂盒(由Assaypro制造，目录号EF1010-1)，根据由试剂盒制造商提供的手册测试FX含量。

使用可商购的人IgA ELISA定量套件(由Bethyl制造，目录号E80-102)和ELISA起始辅助试剂盒(由Bethyl制造，目录号E101)，根据由试剂盒制造商提供的手册测试IgA含量。

使用可商购的人IgM ELISA定量套件(由Bethyl制造，目录号E80-102)和ELISA起始辅助试剂盒(由Bethyl制造，目录号E101)，根据由试剂盒制造商提供的手册测试IgM含量。

结果显示在冷沉淀和离心工艺之后，90.6％的纤维蛋白原被去除，并且在AEX工艺之后，99.9％或更多的纤维蛋白原被去除，并且在冷沉淀和离心工艺之后，95.9％的纤连蛋白被去除，并且在AEX工艺之后，99.9％或更多的纤连蛋白被去除。这指示纤维蛋白原和纤连蛋白主要是通过冷沉淀和离心去除的。此外，在冷沉淀和离心之后，97.4％的FII和97.3％的FX被去除。接着，在AEX工艺之后，93.6％的FII和85.1％的FX被去除。从溶解工艺至AEX工艺，99.8％的FII和99.6％的FX被去除，并且大多数的FII和FX通过冷沉淀和离心被去除。同时，不同于四个种类的杂质，大多数的IgA和IgM在AEX工艺期间被去除。在冷沉淀和离心之后，IgA和IgM的去除率是相对较低的，分别是18.9％和55.6％，但在AEX之后，99.9％的IgA和99.2％的IgM被去除。也就是说，发现IgA和IgM主要通过AEX工艺被去除。CEX上样溶液中含有的纤维蛋白原、纤连蛋白和FX中的99.9％或更多通过CEX工艺被去除。95.6％的IgA和97.4％的IgM被去除，但仅87.7％的FII被去除，这低于对其他杂质的去除(图2)。

分析显示在冷沉淀和离心工艺期间对主要杂质诸如纤维蛋白原、纤连蛋白、FII和FX的去除以及在AEX工艺期间对IgA和IgM的去除在决定品质方面是重要的。此外，分析显示保持在AEX初级洗脱物中的一些杂质通过CEX工艺被去除，并且根据本发明工艺的残余杂质的量显示于下表2中。如可由下表所见，可影响纯化产品的安全性的杂质的水平等于或高于常规产品的杂质水平。

[表2]

实施例3：对在每个步骤期间获得的工艺产物的SDS-PAGE[非还原性条件]分析

对在每个工艺步骤期间获得的产物进行SDS-PAGE分析。将每个样品用非还原性上样缓冲液稀释至7.5ug/孔，并且上样于3％至8％Tris-乙酸凝胶中并在100V下电泳90分钟。

结果显示70kDa或更小的杂质和230至270kDa的杂质在AEX柱工艺期间被去除。发现CEX柱工艺仅高效用于在高纯度下纯化460kDa或更大的多聚vWF(图3)。

实施例4：在阴离子交换色谱工艺步骤期间的vWF损失

分析在用于FVIII纯化的AEX工艺期间的每个步骤的中间体。如图4中所示，结果显示上样至AEX柱子中的样品具有的vWF(IU)含量是FVIII(IU)含量的超过2倍，但最终洗脱物具有的vWF(IU)含量仅是FVIII(IU)含量的0.4倍，这指示大量vWF在AEX洗涤步骤中损失(图4)。

实施例5：对阴离子交换色谱工艺步骤中的FVIII效价回收的分析

测定AEX工艺步骤中的FVIII效价的回收率。如可由表3所见，对三个批次的分析结果显示在AEX工艺中，FVIII效价回收率是85％，并且在柱工艺期间在未吸附液体和所洗涤液体中的所丢弃FVIII是上样物的约15％。

[表3]

实施例6：通过添加阳离子交换色谱洗脱物进行的表征

6-1.vWF损失的恢复

将AEX洗脱物和CEX洗脱物混合并浓缩，接着将每个样品于相同量的还原性上样缓冲液和非还原性上样缓冲液中稀释并上样于4％-12％Bis-Tris凝胶上，并且在120V下电泳90分钟。结果显示可获得具有改进vWF比率的产品(图5)。

当将CEX洗脱物与AEX洗脱物混合时，vWF:Rco/FVIII:OS的比率高于通过AEX工艺纯化的vWF:Rco/FVIII:OS的比率(表4)，这指示相比于混合之前，在混合之后，vWF含量增加至超过两倍。

同时，发现在混合CEX洗脱物之前和之后，杂质相对于FVIII(IU)的含量比率不变，这被认为归因于在CEX工艺期间对杂质的有效去除。同时，在混合CEX洗脱物之前和之后之间进行的FVIII活性比较的结果显示在混合之后的FVIII活性类似于或高于在混合之前的FVIII活性(表4)。

[表4]

6-2.对最终产品的表征

在三个批次中关于最终产品的特性进行的精确分析的结果显示于表5中，并且在vWF:Rco/FVIII:OS比率与vWF:Rco/FVIII:CS比率之间不存在差异。因此，发现当在控制FVIII含量之后将最终本体溶液灌装至小瓶中以产生血友病A产品时，FVIII:OS与FVIII:CS两者均可易于用于FVIII活性测量。源于冷沉淀物的杂质和工艺相关杂质诸如肝素和铝的残余含量全都被测量为极低值。

同时，vWF:Rco/vWF:Ag比率是约0.9，这表明最终产品形成高分子量多聚体(HMWM)，由此极其有效促进血小板聚集。已知的是HMWM极其有效地治疗粘膜出血，并且vWF:Rco/vWF:Ag的有效用于VWD治疗的浓度已知是0.7或更大。

[表5]

发现vWF多聚体样式类似于含有丰富高分子量多聚体的正常血浆的vWF多聚体样式(图6)。这意味着向低比率vWF:Rco/FVIII:C中添加纯化vWF可产生含有高分子量vWF多聚体的产品。

对FVIII是否与vWF形成复合物的尺寸排阻色谱分析的结果揭示了四个主峰(图7)。对每个峰的分级分离以及对每个级分的FVIII和vWF活性分析的结果显示670kDa或更大的峰1不仅展现vWF活性，而且还展现FVIII活性，并且其他三个小型峰既不展现vWF活性，也不展现FVIII活性。考虑到FVIII的大小是约270kDa的事实，可见大多数FVIII以与vWF组合的稳定复合物的形式存在。

实施例7：具有受控混合比率的FVIII和vWF的产品的纯化

浓缩FVIII和vWF共存于实施例1的AEX洗脱物中，并且vWF存在于CEX洗脱物中(参见图3，泳道5和泳道9)。在这种情况下，FVIII和vWF的比率可根据AEX洗脱物和CEX洗脱物的混合比率来调整。下表6显示根据AEX洗脱物和CEX洗脱物的混合比率调整FVIII和vWF的比率，并且每个效价单位的FVIII对应的主要杂质的含量几乎不存在变化，即使当调整混合比率时也是如此。

[表6]

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由随附权利要求及其等同物限定。

【工业实用性】

本发明具有i)在相较于因子VIII(FVIII)的单独纯化产品，不使除血管性血友病因子(vWF)以外的杂质的量增加的情况下，ii)在相较于因子VIII(FVIII)的单独纯化工艺，不使处理时间显著增加(在3小时内)的情况下，和iii)在不改变因子VIII(FVIII)的产率的情况下制备包含因子VIII(FVIII)和不同含量的血管性血友病因子(vWF)的组合物的作用。

Claims

1.一种制备包含因子VIII(FVIII)和血管性血友病因子(vWF)的具有受控含量的所述血管性血友病因子(vWF)的组合物的方法，所述方法包括：

(b)通过对所述初级洗脱物进行阳离子交换色谱获得洗脱物；

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的所述阴离子交换色谱的初级洗脱物包含因子VIII和vWF的混合物，并且步骤(b)的所述阳离子交换色谱的洗脱物包含vWF和0.01重量％或更少的所述因子VIII。

3.根据权利要求1所述的方法，其中将步骤(b)的所述阳离子交换色谱的洗脱物和步骤(c)的所述阴离子交换色谱的二级洗脱物以9:1至1:9的体积比率混合。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含140至170mM NaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O、100至140mM甘氨酸和0.5至1.5mM CaCl₂·2H₂O，并且具有6.8至7.2的pH。

5.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第一洗脱缓冲液在80至120厘米/小时的流速下以所述柱子的体积的4至6倍的量施加以洗脱所述初级洗脱物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含230至270mM NaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O、100至140mM甘氨酸和0.5至1.5mM CaCl₂·2H₂O，并且具有6.8至7.2的pH。

7.根据权利要求1所述的方法，其中将所述第二洗脱缓冲液在30至60厘米/小时的流速下以所述柱子的体积的2至4倍的量施加以洗脱所述二级洗脱物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中使用选自以下的阴离子交换色谱树脂进行步骤(a)中的所述交换色谱：Toyopearl DEAE、速流Q琼脂糖、速流DEAE琼脂糖、Mono Q、Capto Q、Fractogel EMD TMAE(M)、EshmunoQ、Toyopearl GigaCap Q-650M和Fractogel EMD DEAE。

9.根据权利要求1所述的方法，其中使用包含380至420mM NaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O、100至140mM甘氨酸和0.5至1.5mM CaCl₂·2H₂O并且具有6.3至6.7的pH的洗脱缓冲液获得步骤(b)的所述洗脱物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中通过在230至270厘米/小时的流速下以所述柱子的体积4至6倍的量施加洗脱缓冲液获得步骤(b)的所述洗脱物。

11.根据权利要求1所述的方法，其中使用选自以下的阳离子交换色谱树脂进行步骤(b)中的所述阳离子交换色谱：SP琼脂糖、速流SP琼脂糖和Fractogel EMD SO3。

12.根据权利要求1所述的方法，其中从所述人体分离的所述血浆样品是通过以下方法获得的，所述方法包括：

(i)将从所述人体分离的所述血浆样品冷冻，将所得沉淀物溶解，形成冷沉淀物，以及去除杂质；和

(ii)将步骤(i)的产物通过用洗涤剂处理来灭菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述步骤(a)通过以下方式进行：添加Na⁺控制液体以使经洗涤剂处理的溶液的Na⁺浓度被调整至120至150mmol/L，将pH调整至6.8至7.2，并且将所述经洗涤剂处理的溶液在80至120厘米/小时的流速下施加至所述柱子中以吸附所述经洗涤剂处理的溶液。

14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤(a)还包括通过在80至120厘米/小时的流速下以所述柱子的体积4至6倍的量施加再平衡缓冲液来进行再平衡。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述再平衡缓冲液包含80至120mMNaCl、8至12mM柠檬酸钠·H₂O和100至140mM甘氨酸，并且具有6.8至7.2的pH。

16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(c)包括将步骤(c)中获得的所述二级洗脱物与步骤(b)中获得的所述洗脱物混合，以使所述因子VIII(FVIII)和所述血管性血友病因子(vWF)的效价被调整至1:0.2至1:3.0。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(d)之后：

(e)将所混合的溶液浓缩以使所述因子VIII(FVIII)的浓度被调整至125IU/mL或更大；和

(f)添加步骤(c)中获得的所述二级洗脱物以进一步控制所述因子VIII(FVIII)和所述血管性血友病因子(vWF)的效价。

18.一种用于治疗血液凝结障碍的药物组合物，所述药物组合物包含通过根据权利要求1至17中任一项所述的方法制备的包含因子VIII和血管性血友病因子(FVIII/vWF)的组合物作为活性成分。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述因子VIII(FVIII)和所述血管性血友病因子(vWF)的效价是1:0.2至1:3.0。

20.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述血液凝结障碍是血友病A或血管性血友病因子缺乏症。