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CN111471631A - 发酵产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents

发酵产生l-赖氨酸的方法 Download PDF

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CN111471631A CN202010062515.XA CN202010062515A CN111471631A CN 111471631 A CN111471631 A CN 111471631A CN 202010062515 A CN202010062515 A CN 202010062515A CN 111471631 A CN111471631 A CN 111471631A
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G·蒂尔巴赫
K·福斯
T·贝克尔
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Abstract

本发明提供一种具有分泌L‑赖氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌物种的细菌，其在其染色体中包含编码突变的多肽的多核苷酸，所述突变的多肽具有假定的酰基转移酶、水解酶、α/β水解酶或庚二酰‑ACP甲基酯酯酶的功能和使用这种细菌产生L‑赖氨酸的方法。

Description

发酵产生L-赖氨酸的方法
本发明涉及具有分泌(excrete)L-赖氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)物种的细菌，所述细菌在其染色体中包含的编码突变的多肽的多核苷酸，所述突变的多肽具有假定的酰基转移酶、水解酶、α/β水解酶的功能或庚二酰-ACP甲基酯酯酶的功能和使用这种细菌产生L-赖氨酸的方法。
L-赖氨酸用于人类医学、制药工业、食品工业、以及尤其是用于动物营养。L-赖氨酸是通过谷氨酸棒状杆菌物种的菌株的发酵而产生的。用于改善这些微生物的性能特性的方法是诱变、选择和筛选突变体的方法。为了改善谷氨酸棒状杆菌物种的L-赖氨酸产生菌株，重组DNA技术的方法同样已经使用多年，其通过修饰(即增强或减弱)参与L-赖氨酸生物合成的单独基因并研究对L-赖氨酸产生的影响。
已经公开了属于谷氨酸棒状杆菌物种的多种细菌或菌株的染色体的核苷酸序列及其分析。该信息可从公众可访问的数据库中获得，并可用于菌株开发的目的。此类数据库之一就是NCBI(National Center for Biotechnology Information,U.S.NationalLibrary of Medicine 8600Rockville Pike,Bethesda MD,20894USA)的GenBank数据库。在对生物体的已测序染色体进行注释的过程中，已鉴别的结构(比如例如基因或编码序列)由数据库信息提供者配有被称为locus_tag的唯一标识符。
Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62，99-109(2003))和EP1108790A2描述了谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析。该信息在NCBI以登录号NC_003450可获得。
locus_tag NCgl0292鉴别编码作为α/β水解酶超家族成员的多肽的核苷酸序列。EC编号给定为3.3.2.9。进一步预测该基因产物是水解酶或酰基转移酶。长度为331个氨基酸的多肽的氨基酸序列也在标识符NP_599549下可获得。
Kalinowski等(Journal of Biotechnology 104(1-3),5-25(2003))独立描述了谷氨酸棒状杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析。该信息在NCBI以登录号NC_006958可获得。Locus_tag CGTRNA_RS01565鉴别编码预测的α/β水解酶的核苷酸序列。在本领域中也使用old_locus_tag名称cg0358。长度为331个氨基酸的多肽的氨基酸序列也在标识符WP_011013543下可获得。
locus_tag NCgl0292和CGTRNA_RS01565的核苷酸序列相同。
Yukawa等(Microbiology 153(4):1042-1058(2007))描述了谷氨酸棒状杆菌R染色体的核苷酸序列及其分析。其在NCBI以登录号AP009044可获得。Locus_tag cgR_0383鉴别编码假设的蛋白质的核苷酸序列。长度为331个氨基酸的多肽的氨基酸序列也在标识符BAF53347下可获得。将该氨基酸序列的第54位到第329位的区域称为MhpC，并且给出了作为庚二酰-ACP甲基酯羧酸酯酶的功能预测。
大肠杆菌的基因mhpC(间羟基苯基丙酸(m-hydroxyphenylpropionic acid)的助记符)编码参与间羟基苯基丙酸降解的酶(Ferrandez et al.,Journal of Bacteriology179(8),2573-2581(1997))。该酶是作用于C-C键的水解酶，并称为2-羟基-6-氧代壬三烯二酸酯(2-hydroxy-6-oxononatrienedioate)水解酶。EC编号为EC 3.7.1.14。
谷氨酸棒状杆菌R染色体的核苷酸序列及其分析也在登录号NC_009342下可获得。在locus_tag名称CGR_RS01990和old_locus_tag cgR_0383下，给出了编码预测的α/β水解酶的核苷酸序列。
S.Binder(Schriften des Forschungszentrums Jülich,Vol.65,2013；ISSN1866-1875)在筛选了改良的谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸产生者后，观察到了由NCgl0292鉴别的多肽中的氨基酸交换A95V。
由locus_tag NCgl0292(菌株ATCC13032)鉴别的多肽的氨基酸序列与由locus_tag cg_0383(菌株R)鉴别的多肽的氨基酸序列具有>97％相同性。
可以在Pfeifer-Sancar等(BMC Genomics 14:888(2013))、Albersmeier等(Journal of Biotechnology 257(2017)99-109)或Menz等(BMC Genomics 2013,14:714)中找到有关谷氨酸棒状杆菌中转录信号的信息，例如启动子的-10区域或由old_locus_tagcg0358鉴别的基因的转录起始位点(TSS)。
SEQ ID NO：1显示对应于NCgl0292的核苷酸序列。SEQ ID NO：2显示了NCgl0292多肽的氨基酸序列。
关于多肽的功能，本领域进行了有关SEQ ID NO：2所示多肽或菌株R的同源物作为酰基转移酶、水解酶、α/β水解酶和庚二酰-ACP甲基酯酯酶的功能预测。
酰基转移酶是一类作用于酰基的转移酶。根据Recommendations of theNomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology(NC-IUBMB)，酰基转移酶归类于EC 2.3。A.
Figure BDA0002374938900000021
和A.Steinbüchel(Microbiology and Molecular Biology Reviews 77(2),277-321,2013)给出了关于酰基转移酶的综述。
水解酶是一类使用水破坏化学键的酶。根据NC-IUBMB，水解酶归类于EC3。作用于酯键的水解酶(酯酶)总结在酶类别EC 3.1下。
术语α/β水解酶概括了一组水解作用的酶，其特征在于酶核心中的α/β水解酶折叠(Ollis et al.,Protein Engineering 1992；5(3):197-211)。所述核的特征在于α/β折叠，其包括通过α螺旋连接的8个β折叠。
大肠杆菌的酶庚二酰-ACP甲基酯酯酶(EC 3.1.1.85)催化庚二酰-ACP甲基酯(ACP＝酰基载体蛋白)或庚二酰-CoA甲基酯(CoA＝辅酶A)的甲基酯键的水解以得到庚二酰-ACP或庚二酰-CoA。这些化合物是生物素的生物合成中的中间体。在大肠杆菌中，所述庚二酰-ACP甲基酯酯酶多肽由称为bioH的基因编码。
使用由NCBI提供的BLAST(基本局部比对搜索工具)算法对由NCgl0292编码的多肽(另请参见SEQ ID NO：2)进行的保守结构域搜索揭示了与保守的蛋白结构域家族MhpC匹配的单个特定命中(标识符COG0596)。该家族在数据库中也称为庚二酰ACP甲基酯羧酸酯酶。
由Lin等(Nature Chemical Biology 6,682-688(2010))给出了大肠杆菌中生物素合成途径的总结。由L.Eggeling和M.Bott(编辑)在Handbook of Corynebacteriumglutamicum(CRC Press,Taylor&Francis Group,Boca Raton,US,2005)中给出了谷氨酸棒状杆菌中存在的生物素的生物合成的酶的总结。
本发明的目的是提供通过谷氨酸棒状杆菌物种的细菌发酵产生L-赖氨酸的新方法。
因此，本发明提供了具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌物种的细菌，所述细菌在其染色体中含有编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽(即NCgl0292)的多核苷酸，其中在第225位的氨基酸丝氨酸被不同的蛋白源性(proteinogenic)氨基酸取代，优选被半胱氨酸取代(“NCgl0292(S225C)”)。
其中第225位的氨基酸丝氨酸被半胱氨酸取代的SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸相同。
已经发现，与对于NCgl0229未修饰的细菌相比，根据本发明修饰的细菌在合适的发酵条件下以增加的方式将L-赖氨酸分泌到合适的培养基中。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的细菌在其染色体中含有多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的第328位至第1320位的核苷酸序列，其中第1001位的核碱基是鸟嘌呤。SEQ ID NO：1的第328位至第1320位的核苷酸序列，其中第1001位的核碱基为鸟嘌呤，这与SEQ ID NO：3的第328位至第1320位的核苷酸序列相同。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的细菌在其染色体中含有多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的第328位至第1323位的核苷酸序列，其中第1001位的核碱基是鸟嘌呤。SEQ ID NO：1的第328位至第1323位的核苷酸序列，其中第1001位的核碱基是鸟嘌呤，这与SEQ ID NO：3的第328位至第1323位的核苷酸序列相同。
本文中提及的术语L-赖氨酸，特别是在产物形成的上下文中，还包括其离子形式和盐，例如L-赖氨酸一氢氯化物或L-赖氨酸硫酸盐。
为了实施本发明，使用谷氨酸棒状杆菌物种的L-赖氨酸分泌细菌。合适的谷氨酸棒状杆菌的菌株是从该物种的野生菌株例如菌株ATCC13032获得的L-赖氨酸分泌菌株。
菌株ATCC13032(也作为DSM20300可获得)是谷氨酸棒状杆菌物种的分类学类型菌株。菌株ATCC14067(也作为DSM20411可获得)也已知过去名称为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)。菌株ATCC13869(也作为DSM1412可获得)也已知过去名称为乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)。
谷氨酸棒状杆菌物种的L-赖氨酸分泌菌株通常含有编码抗反馈天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸。抗反馈天冬氨酸激酶多肽变体指与酶的野生形式(包含在野生菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中)相比，该天冬氨酸激酶对于由L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如各为10mM)、L-赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mM S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)的抑制敏感性较低或脱敏。天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。例如在US5688671、US6844176和US6893848中给出了谷氨酸棒状杆菌的编码抗反馈天冬氨酸激酶多肽变体的多核苷酸的描述。总结列表尤其可在WO2009141330中找到。本领域中使用的用于编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号是lysC。在基因编码抗反馈多肽变体的情况下，本领域通常使用诸如lysCfbr的符号，其中fbr指抗反馈。
因此，用于本发明方法的谷氨酸棒状杆菌物种的所述L-赖氨酸分泌菌株优选含有至少一个拷贝的编码抗反馈天冬氨酸激酶多肽的多核苷酸。
SEQ ID NO:5显示了菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列和SEQ ID NO:6显示了所编码的多肽的氨基酸序列。本领域已知(参见US6893848)，SEQID NO:6的第311位处的氨基酸Thr替换为Ile时，赋予酶对于由L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制的反馈抗性。因此，优选所述抗反馈天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在第311位含有异亮氨酸而不是苏氨酸的SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
所述氨基替换可通过将SEQ ID NO:5的第932位核碱基胞嘧啶(c)替换给胸腺嘧啶(t)来实现。因此苏氨酸的acc密码子变为异亮氨酸的atc密码子。
将天冬氨酸激酶多肽的编码序列的gtg起始密码子替换为atg，增强所述多肽的表达(参见例如EP2796555A2)。因此，优选编码抗反馈天冬氨酸激酶多肽的序列以atg起始密码子开始。
谷氨酸棒状杆菌物种的L-赖氨酸分泌菌株是本领域众所周知的，并且可以如本发明中所述被修饰。例如，US 7,338,790B2描述了菌株DM1797。其根据布达佩斯条约以保藏号DSM16833保藏于DSMZ。DM1797是经N'-甲基-N-硝基-亚硝基胍诱变后获得的菌株ATCC13032的氨基乙基半胱氨酸抗性突变体。例如Blombach等(Applied and EnvironmentalMicrobiology 75(2),419-427,2009)描述了菌株DM1933，其根据布达佩斯条约以保藏号DSM25442保藏。菌株DM1933是通过菌株开发的几个步骤从ATCC13032获得的。此外，可以使用根据布达佩斯条约以DSM32514保藏的L-赖氨酸分泌谷氨酸棒状杆菌菌株DM2031。菌株DM2031是具有增强的L-赖氨酸分泌能力的DM1933的进一步开发的衍生物。其他L-赖氨酸分泌谷氨酸棒状杆菌菌株例如在WO2008033001和EP0841395中所描述。
术语DSM表示位于德国不伦瑞克(Braunschweig)的保藏机构Deutsche Sammlungfür Mikroorganismen und Zellkulturen。术语ATCC表示位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的保藏机构American Type Culture Collection。
关于多核苷酸的处理和实验工作的教导和信息尤其可以在J.Sambrook等的手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、C.R.Newton和A.Graham的教科书(PCR,Spektrum Akademischer Verlag,1994)和D.Rickwood和B.D.Hames的手册(Gel electrophoresis of nucleic acids,a practicalapproach,IRL Press,1982)中找到。
在本发明的工作过程中，发现通过将SEQ ID NO：2所示的多肽的编码的氨基酸序列的第225位处的氨基酸丝氨酸替换为不同的蛋白源性优选半胱氨酸来修饰谷氨酸棒状杆菌物种的L-赖氨酸分泌细菌，与未修饰的细菌相比，增加了它们分泌L-赖氨酸的能力。
可以通过使用诱变物质例如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍或紫外线光对谷氨酸棒状杆菌菌株的细胞群进行经典的体内诱变来获得根据本发明的突变细菌。可以使用选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的引物通过PCR扩增包含基因内诱变位点的核苷酸序列。通过对PCR产物进行测序，鉴别了期望的突变体。关于这种方法的细节尤其可以在US7754446中找到。
诱变的另一种方法是Jiang等(Nature Communications,2017May 8,15179.DOI:10.1038/ncomms15179)描述的CRISPR-Cpf1辅助的基因组编辑或Cho等(MetabolicEngineering,2017Jul；42:157-167.doi:10.1016/j.ymben.2017.06.010.)，Peng等(Microbial Cell Factories,2017Nov 14；16(1):201.doi:10.1186/s12934-017-0814-6.)和Liu等(Microbial Cell Factories,2017Nov 16；16(1):205.doi:10.1186/s12934-017-0815-5.)描述的CRISPR-Cas9辅助的基因组编辑。
突变谷氨酸棒状杆菌基因的另一种常见方法是Schwarzer和Pühler(Bio/Technology9,84–87(1991))描述的基因置换方法，并且
Figure BDA0002374938900000051
等(Gene 145,69-73(1994))进一步阐述了该方法。
Peters-Wendisch等(Microbiology，144，915-927(1998))使用了基因置换方法使谷氨酸棒状杆菌编码丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)的pyc基因失活。在US7585650中，该方法被应用于zwf基因以实现葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase)的Zwf亚单元的氨基酸序列的第321位处的氨基酸替换。在US7754446中，该方法被应用于rel基因以实现GTP-焦磷酸激酶(GTP-pyrophosphate kinase)多肽的氨基酸序列的第38位处的氨基酸替换。
在基因置换方法中，突变(例如至少一个核碱基的缺失、插入或取代)是通过分离的多核苷酸提供的，所述分离的多核苷酸包括含有所述突变的所讨论的基因的核苷酸序列或其部分。
在本发明的上下文中，所讨论的基因的核苷酸序列是由locus_tag NCgl0292鉴别的基因。
在本发明的上下文中，所述突变是位于密码子中的至少一个核碱基的取代，所述密码子指定NCgl0292多肽的编码的氨基酸序列(参见SEQ ID NO：1)的第225位处的氨基酸丝氨酸。
作为所述突变的结果，所述密码子指定不同于丝氨酸的蛋白源性氨基酸，优选为半胱氨酸。指定半胱氨酸的密码子是tgt或tgc。密码子tgc是优选的。
氨基酸序列的第225位处氨基酸的密码子在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3中具有从第1000至第1002的位置。从第1000位到第1002位的核苷酸序列，特别是在第1001位的核苷酸，也可以称为突变位点。
含有所述突变的所讨论的基因的突变的核苷酸序列或其部分包含i)突变位点的5'端处的核苷酸序列，其在本领域中也称为5'-侧翼序列或上游序列，ii)突变位点的3'端处的核苷酸序列，其在本领域中也称为3'-侧翼序列或下游序列，以及iii)i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。
同源重组所需的所述5'-侧翼序列和3'-侧翼序列通常具有至少200bp、至少400bp、至少600bp或至少800bp的长度。最大长度通常为1000bp、1500bp或2000bp。
在本发明的上下文中，包含突变的核苷酸序列的多核苷酸的实例显示在SEQ IDNO：7中。SEQ ID NO：7的从第24位至第1511位的核苷酸序列对应于SEQ ID NO：3的从第261位至第1748位。SEQ ID NO：7所示的多核苷酸在其5'-和3'-端含有用于克隆目的的限制性内切核酸酶的识别位点。SEQ ID NO：7含有本发明中描述的NCgl0292多肽的变体的编码序列。5'-侧翼序列由SEQ ID NO：7的第24位至第763位的核苷酸序列组成。3'-侧翼序列由SEQID NO：7的第765位至第1511位的核苷酸序列组成。所述突变的位点在SEQ ID NO：7的第764位。
所提供的突变的核苷酸序列被克隆到质粒载体中，所述质粒载体例如
Figure BDA0002374938900000061
等(Gene 145,69-73(1994))描述的不能在谷氨酸棒状杆菌中自主复制的pK18mobsacB。随后通过转化或接合将包含所述突变的核苷酸序列的所述质粒载体转移到期望的谷氨酸棒状杆菌的菌株中。在包含质粒载体提供的5'-侧翼序列与谷氨酸棒状杆菌染色体的同源序列的重组事件以及质粒载体提供的3'-侧翼序列与谷氨酸棒状杆菌染色体的同源序列的重组事件的两个同源重组事件(一方面实现整合，并且一方面实现所述质粒载体的切除)后，突变被掺入到谷氨酸棒状杆菌染色体中。因此，包含在所述期望的菌株的染色体中的所讨论的基因的核苷酸序列被突变的核苷酸序列置换。然后，在期望的菌株中确认所述突变的存在，例如通过上述核苷酸序列分析或使用FRET的实时PCR。
同源重组的事件也可以称为交换(crossing over)。
本发明进一步提供了使用本发明的谷氨酸棒状杆菌产生L-赖氨酸的发酵过程。
在根据本发明的发酵过程中，根据本发明修饰的并具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌在合适的条件下在合适的培养基中培养。由于所述分泌所述L-赖氨酸的能力，在发酵过程中，L-赖氨酸在培养基中的浓度增加并积聚，并且从而产生了L-赖氨酸。
发酵过程可以是不连续过程或连续过程，所述不连续过程如分批过程或补料分批过程。有关发酵过程的一般性质的总结在以下中可获得：H.Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik,Spektrum Akademischer Verlag,2011)、C.Ratledge和B.Kristiansen的教科书(Basic Biotechnology,Cambridge University Press,2006)或V.C.Hass和R.
Figure BDA0002374938900000062
的教科书(Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum AkademischerVerlag,2011)。
用于通过发酵过程产生L-赖氨酸的合适培养基根据需要包含碳源、氮源、磷源、无机离子和其他有机化合物。
合适的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖以及相应的原料如淀粉水解产物、糖蜜或高果糖玉米糖浆。
作为氮源可以使用有机含氮化合物如蛋白胨、肉膏、大豆水解物或尿素，或无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨气或氨水。
作为磷源可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其它痕量元素等，以硫酸、磷酸或盐酸的盐提供。
其他有机化合物指必需的生长因子，如维生素例如硫胺素或生物素，或L-氨基酸例如L-高丝氨酸。
培养基组分可以以单一批次的形式加入培养物中或在培养过程中以合适的方式给入。
在发酵过程中，可以以合适的方式通过使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制培养物的pH。通常将pH调节至6.0至8.5的值，优选6.5至8.0。为了控制起泡，可以使用消泡剂，比如例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，比如例如抗生素。发酵过程优选在有氧条件下进行。为保持这些条件，将氧气或含氧气体混合物比如例如空气引入培养物中。适当时，在升高的压力下(例如在0.03-0.2MPa的升高的压力下)进行发酵过程。培养温度通常为25℃至40℃，优选30℃至37℃。在不连续过程中，继续所述培养直至已经形成L-赖氨酸足以被回收的量。随之完成所述培养。该目标通常在10小时到160小时内完成。在连续过程中，更长的培养时间是可能的。
因此，发酵过程产生了含有期望的L-赖氨酸的发酵液。
相应地，提供了一种发酵产生L-赖氨酸的方法，其包括以下步骤：
a)在合适条件下在合适的培养基中培养本发明的谷氨酸棒状杆菌，以及
b)在培养基中积聚所述L-赖氨酸以产生含L-赖氨酸的发酵液。
然后以液体或固体形式从发酵液回收含有L-赖氨酸的产物。
“发酵液”是指其中本发明的谷氨酸棒状杆菌已在一定时间和特定条件下培养的培养基。
当发酵过程完成时，所得发酵液因此包含：本发明的谷氨酸棒状杆菌的生物质(细胞物质)，所述生物质已经由于所述谷氨酸棒状杆菌的细胞繁殖而产生、发酵过程中积聚的期望的L-赖氨酸、发酵过程中积聚的有机副产物、和在发酵过程中未消耗的所使用的培养基的组分。
有机副产物包括在根据本发明的发酵过程中除了产生L-赖氨酸之外，可以由谷氨酸棒状杆菌形成的化合物。
发酵液从培养容器或发酵罐中移除，在适当时收集，并用于提供含L-赖氨酸的产物，以液体或固体形式。对此也使用“回收含L-赖氨酸的产物”的表述。在最简单的情况下，已从发酵罐中移除的含L-赖氨酸的发酵液自身构成回收的产物。
随后可以使发酵液经受从所述发酵液中提取水或基本除去水。
尤其可以通过离心、过滤或倾析、或其组合来实现去除生物质。
L-赖氨酸产物的制造还可包括纯化步骤，该纯化步骤优选选自由以下组成的组：离子交换色谱法、用活性炭处理或结晶。
因此例如可获得含有L-赖氨酸x HCl，优选含有≥80％L-赖氨酸x HCl，特别优选≥90％L-赖氨酸x HCl或≥95％L-赖氨酸x HCl的产物。
如Spackman等人(Analytical Chemistry 30：1190-1206(1958))所述，可以借助离子交换色谱(优选阳离子交换色谱)分离L-赖氨酸，随后使用茚三酮(ninhydrin)进行柱后衍生化(post-column derivatization)，实现分析L-赖氨酸以确定其在发酵期间在一个或多个时间点的浓度。还可以使用邻苯二甲醛而非茚三酮进行柱后衍生化。在Pickering(LC.GC(Magazine of Chromatographic Science 7(6)：484-487(1989))中可以找到关于离子交换色谱的综述性文章。同样可以进行柱前衍生化，例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯，并通过反相色谱(RP)将所得氨基酸衍生物分级(fractionate)，优选以高效液相色谱(HPLC)的形式。这类型的方法在例如Lindroth等(Analytical Chemistry 51：1167-1174(1979))中描述。检测是用光度法(吸收、荧光)进行的。关于氨基酸分析的综述可尤其在Lottspeich和Zorbas的教科书“Bioanalytic”(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，Germany，1998)中找到。
实验部分
A)材料与方法
此处简述所用的分子生物学试剂盒、引物和化学品以及所应用的方法的一些细节。
1.抗生素和化学品
a.卡那霉素：来自Sigma Aldrich(St.Louis，美国，目录号K0254)的来自卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素溶液。
b.萘啶酸：来自Sigma Aldrich(St.Louis，美国，目录号N4382)的萘啶酸钠盐。
c.如无另外说明，所有化学品均购自Merck(Darmstadt，德国)、Sigma Aldrich(St.Louis，美国)或Carl-Roth(Karlsruhe，德国)，分析纯。
2.培养
如无另外说明，则按照如下所述进行所有培养/孵育过程：
a.使用来自Merck(Darmstadt，德国；目录号110285)的LB肉汤(MILLER)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。在来自Infors GmbH(Einsbach，德国)的Infors HTMultitron标准培养摇床中，于37℃和200rpm下孵育液体培养物(10ml液体培养基/每100ml带3个挡板的锥形瓶)。
b.使用来自Merck(Darmstadt，德国，目录号110283)的LB琼脂(MILLER)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。在来自VWR(Radnor，USA)的
Figure BDA0002374938900000081
迷你培养箱中，将琼脂平板于37℃孵育。
c.使用来自Merck(Darmstadt，德国；目录号110493)的脑心浸液肉汤(BHI)在液体培养基中培养谷氨酸棒状杆菌菌株。在来自Infors GmbH(Einsbach，德国)的Infors HTMultitron标准培养摇床中，于33℃和200rpm下孵育液体培养物(10ml液体培养基/每100ml带3个挡板的锥形瓶)。
d.使用来自Merck(Darmstadt，德国；目录号113825)的脑心琼脂(BHI-琼脂)在琼脂平板上培养谷氨酸棒状杆菌菌株。在具有
Figure BDA0002374938900000091
温度控制器的Heraeus Instruments的培养箱(Hanau，德国)中，将琼脂平板于33℃孵育。
3.确定光密度
a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg，德国)的BioPhotometer，在600nm(OD600)下确定摇瓶培养物中细菌悬浮液的光密度。
b.用来自Tecan Group AG(
Figure BDA0002374938900000092
瑞士)的GENiosTM读板仪，在660nm(OD660)下确定在Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24孔板)中产生的细菌悬浮液的光密度。
4.离心
a.用于容量高达2毫升的反应管的台式离心机
使用Eppendorf 5417R离心机(13000rpm，5分钟)，使用1ml或2ml反应管(例如Eppendorf
Figure BDA0002374938900000093
3810X)来引起最大体积为2ml的细菌悬浮液的沉降。
b.用于容量高达50毫升的管的台式离心机
使用Eppendorf 5810R离心机(4000rpm，10分钟)，使用15ml或50ml离心管(例如Falcon TM 50ml锥形离心管)来引起最大体积为50ml的细菌悬浮液的沉降。
5.使用FRET检测突变
通过实时PCR与FRET杂交探针的组合检测给定突变的存在(例如一个核碱基的替换)。术语FRET是荧光共振能量转移的缩写。作为实时PCR仪器，使用了来自Roche
Figure BDA0002374938900000094
的Lightcycler(参见下文)。
此方法为例如由M.J.Lay和C.T.Wittwer使用(Clinical Chemistry 42(12)，2262-2267(1997))用于因子V Leiden的基因分型。Cyril DS Mamotte(The ClinicalBiochemist Reviews 27,63-75(2006)评论了使用这种方法的单核苷酸取代的基因分型。有关这种方法的总结可以在Jocelyn E.Krebs、Elliott S.Goldstein和StephanT.Kilpatrick的教科书Lewin's Genes XII(Jones and Bartlett Publishers，US，2018)、W.Edward Highsmith的Molecular Diagnostics,12Tests that changed everything(Humana Press，Springer，New York，2014)、或本领域其他出处中找到。
FRET杂交供体探针用荧光染料荧光素标记，并且受体探针用荧光染料LC-Red640标记。本质上，检测方法包括三个步骤：菌落PCR、探针杂交和随后的熔解曲线分析。该方法在此简称为实时PCR。
a.引物和探针
所用的寡核苷酸由eurofins genomics GmbH(Ebersberg，德国)合成。
b.模板
作为PCR模板，使用菌落中含有的总DNA。通过用牙签从琼脂平板上的菌落中取出细胞材料并将细胞材料直接放入PCR反应管中来制备。在来自SEVERIN
Figure BDA0002374938900000104
GmbH(Sundern，德国)的Mikrowave&Grill型微波炉中以800W将细胞材料加热10秒，并然后将PCR试剂添加到PCR反应管中的模板中。
b.反应混合物
使用来自Qiagen的
Figure BDA0002374938900000105
Fast SNP探针PCR试剂盒(Type-it Kit)(Hilden，德国，目录号206045)用于实时检测突变。因此，将2.5μl Qiagen Fast SNP Puffer(2x)与0.5μl的每种LC-PCR引物[10μM]和0.5μl的每种1：500稀释的受体和供体探针[100pmol/μl]混合以获得用于实时PCR的预混液(mastermix)。
表1：用
Figure BDA0002374938900000106
(步骤1-3)和熔解曲线分析(步骤4-6)进行PCR的热循环条件。
Figure BDA0002374938900000101
c.PCR循环仪
反应在
Figure BDA0002374938900000102
2.0仪器中进行，并用Roche Diagnostics(Rotkreuz,瑞士)的
Figure BDA0002374938900000103
Software 4.1分析。
6.大肠杆菌的化学转化
使用大肠杆菌K-12菌株S17-1作为供体，用于将基于pK18mobsacB的质粒从大肠杆菌通过接合转移至谷氨酸棒状杆菌。Simon.R等人描述了菌株S17-1(Bio/Technology1，784-794，1983)。其从American Type Culture Collection以保藏号ATCC47055可获得。
如下制备化学感受态大肠杆菌S17-1细胞：用100μl菌株S17-1的细菌悬浮液接种于10ml LB培养基(10ml液体培养基/每100ml具有3个挡板的锥形瓶)的预培养物，并且培养物于37℃和250rpm下孵育过夜约18小时。主培养物(有3个挡板的250ml锥形瓶中的70mlLB)接种300μl预培养物，并于37℃孵育至OD600为0.5-0.8。将培养物于4℃和4000rpm下离心6分钟，并弃去上清液。将细胞沉淀重新悬浮于20ml无菌的冰冷的50mM CaCl2溶液中，并在冰上孵育30分钟。另一离心步骤后，将沉淀重悬于5ml冰冷的50mM CaCl2溶液中，并将悬浮液在冰上孵育30分钟。然后用85％(v/v)无菌的冰冷的甘油将细胞悬浮液调节至20％甘油(v/v)的最终浓度。将悬浮液分为50μl等分的样品并储存在-80℃。
为转化S17-1细胞，使用具有45秒热激根据Tang等人的方案(Nucleic Acids Res，22(14)，2857-2858，1994)。
7.谷氨酸棒状杆菌的接合
使用
Figure BDA0002374938900000112
等人描述的pK18mobsacB质粒系统(Gene 145，69-73，1994)将期望的DNA片段整合到谷氨酸棒状杆菌的染色体中。使用改进后的
Figure BDA0002374938900000113
等人的接合方法(Journal of Bacteriology 172，1663-1666，1990)将各质粒转移到期望的谷氨酸棒状杆菌受体菌株中。
谷氨酸棒状杆菌菌株的液体培养于33℃下在BHI培养基中进行。于48.5℃进行热激9分钟。通过将接合批次铺在EM8琼脂(表2)上来筛选转接合子(Transconjugant)，所述EM8琼脂(表2)补充有25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸。将EM8琼脂平板于33℃孵育72小时。
表2：EM8琼脂的组成。
Figure BDA0002374938900000111
使用无菌牙签将转接合子(Transconjugant)转移至BHI琼脂上，所述BHI琼脂补充25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸。琼脂平板于33℃孵育20小时。然后将这种方式产生的各转接合子的培养物于33℃下在具有3个挡板的100ml锥形瓶中含有的10ml BHI培养基中继续繁殖24小时。从液体培养物中取出等分的样品、适当稀释并(将通常100至200μl)铺板在补充有10％蔗糖的BHI琼脂上。琼脂平板于33℃孵育48小时。然后检查在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性表型。为此，使用牙签从菌落中除去细胞材料，并将其转移至含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上以及含有10％蔗糖的BHI琼脂上。琼脂平板于33℃孵育60小时。通过实时PCR的手段对已证明对卡那霉素敏感并对蔗糖具有抗性的克隆检查期望的DNA片段的整合。
8.大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌菌株的甘油菌
为了长时间储存大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌菌株，制备了甘油菌。在补充有2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养筛选得到的大肠杆菌克隆。在补充有2g/l葡萄糖的2倍浓缩的BHI培养基中培养筛选得到的谷氨酸棒状杆菌克隆。含质粒的大肠杆菌菌株的培养补充50mg/l卡那霉素。含质粒的谷氨酸棒状杆菌菌株的培养补充25mg/l卡那霉素。培养基包含在带有3个挡板的100ml锥形瓶中。接种从菌落取的一圈细胞，并且在大肠杆菌的情况下，将培养物于37℃和200rpm下孵育约18小时，以及在谷氨酸棒状杆菌的情况下，将培养物于33℃和200rpm下孵育约18小时。所述孵育期后，向培养物中加入1.2ml 85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含有甘油的细胞悬浮液等分成2ml份并储存于-80℃。
9.根据Wouter Duetz(WDS)的培养系统
使用根据Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升规模(millilitre-scale)培养系统研究构建的谷氨酸棒状杆菌菌株的性能。为此目的，使用添加有2.5mL培养基的来自EnzyScreen BV(Heemstede，荷兰；目录号CR1424)的24深孔微孔板(24孔WDS板)。
在10ml 2倍浓缩的BHI培养基中进行菌株预培养。培养基包含在带有3个挡板的100ml锥形瓶中。接种100μl甘油菌培养物并将培养物于33℃和200rpm下孵育24小时。
在所述孵育期后，确定预培养物的光密度OD600。通过在24孔WDS-Plate的含有2.5ml培养基的孔中接种预培养物的等分的样品以给出光密度OD600为0.1，来制备主培养物。
使用由Keilhauer等人描述的CGXII培养基(J.Bacteriol.1993Sep；175(17)：5595-5603)作为主培养物的培养基。为方便起见，CGXII培养基的组成如表3所示。
表3：Keilhauer CGXII培养基的组成。
Figure BDA0002374938900000121
Figure BDA0002374938900000131
将这些主培养物在来自Infors GmbH(Bottmingen，瑞士)的Infors HT Multitron标准培养摇床中于33℃和300rpm下孵育约45小时直至葡萄糖完全消耗。
用来自LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，德国)的血糖仪OneTouch
Figure BDA0002374938900000132
分析悬浮液中的葡萄糖浓度。
培养后将培养悬浮液转移至深孔微孔板中。将一部分培养悬浮液适当稀释以测量OD600。将培养物的另一部分离心并分析上清液中L-氨基酸(特别是L-赖氨酸)和残余葡萄糖的浓度。
10.氨基酸分析仪
使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，德国)的SYKAM S433氨基酸分析仪，通过离子交换色谱确定培养物上清液中L-赖氨酸和其他L-氨基酸的浓度。作为固相，使用来自SYKAM的具有球形的基于聚苯乙烯的阳离子交换剂的柱(Peek LCA N04/Na，尺寸150×4.6mm)。取决于L-氨基酸，使用用于洗脱的缓冲液A和B的混合物在等度运行中进行分离，或使用所述缓冲液通过梯度洗脱进行分离。作为缓冲液A，使用在20l中含有263g柠檬酸三钠、120g柠檬酸、1100ml甲醇、100ml 37％HCl和2ml辛酸的水溶液(最终pH3.5)。作为缓冲液B，使用在20l中含有392g柠檬酸三钠、100g硼酸和2ml辛酸的水溶液(最终pH10.2)。游离氨基酸通过柱后衍生化用茚三酮着色，并在570nm用光度法检测。
11.用连续流动系统(CFS)的葡萄糖测定
使用来自SKALAR analytic GmbH(Erkelenz，德国)的SANplus多通道连续流动分析仪确定上清液中的葡萄糖浓度。通过NADH形成，用偶联酶测定法(己糖激酶/葡萄糖6-磷酸脱氢酶)检测葡萄糖。
B)实验结果
实施例1
谷氨酸棒状杆菌DM1933株NCgl0292基因的序列
菌株DM1933由Blombach等(Applied and Environmental Microbiology 75(2),419-427,2009)描述是L-赖氨酸生产菌。根据布达佩斯条约以保藏号为DSM25442保藏于DSMZ。谷氨酸棒状杆菌DM1933具有以下特征(参见Blombach et al.Applied andEnvironmental Microbiology 75(2),419-427,2009；第420页,表1)：Δpck pyc(P458S)hom(V59A)、2拷贝的lysC(T311I)、2拷贝的asd、2拷贝的dapA、2拷贝的dapB、2拷贝的ddh、2拷贝的lysA、2拷贝的lysE(源自谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的野生型菌株)。
通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.,San Diego,CA,美国)确定菌株DM1933的染色体的核苷酸序列。参见例如Benjak等(2015)Whole-Genome Sequencing forComparative Genomics and De Novo Genome Assembly.In:Parish T.,Roberts D.(eds)Mycobacteria Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol 1285.Humana Press,NY,US)和Bennet,S.(Pharmacogenomics 5(4),433-438,2004)。发现菌株DM1933的NCgl0292编码序列的核苷酸序列(包括其上游和下游的核苷酸序列)与SEQ ID NO：1所示的ATCC13032的核苷酸序列相同。
DM1933在其染色体中包含编码抗反馈天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因(lysC)的变体。所述抗反馈天冬氨酸激酶多肽具有序列表的SEQ ID NO：6的氨基酸序列，其中氨基酸序列的第311位的氨基酸苏氨酸(Thr)被异亮氨酸(Ile)取代。在US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”用于指示所述替换。Blombach等使用缩写“lysC(T311I)”。
实施例2
质粒pK18mobsacB_NCgl0292_S225C的构建
构建质粒pK18mobsacB_NCgl0292_S225C以使造成氨基酸替换S225C的突变掺入菌株DM1933的NCgl0292编码序列的核苷酸序列中。该质粒基于
Figure BDA0002374938900000141
等(Gene 145,69-73,1994)描述的可移动载体pK18mobsacB。为了构建pK18mobsacB_NCgl0292_S225C，合成了根据SEQ ID NO：7的NCgl0292_S225C序列，并由GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham,美国))亚克隆到pK18mobsacB中。
质粒pK18mobsacB_NCgl0292_S225C的组装由GeneArt(ThermoFisher Scientific(Waltham，美国))如下完成：连接两个多核苷酸，即用SbfI和XmaI切割的载体pK18mobsacB和用SbfI加上XmaI切割的多核苷酸NCgl0292_S225C，并且然后将连接混合物用于转化大肠杆菌。然后从转化体中分离质粒DNA。
实施例3
菌株DM1933_NCgl0292_S225C的构建
实施例2中获得的质粒pK18mobsacB_NCgl0292_S225C用于将导致氨基酸替换S225C的突变(参见SEQ ID No：7的核苷酸第764位)掺入L-赖氨酸生产菌DM1933的染色体中。用pK18mobsacB_NCgl0292_S225C的质粒DNA转化大肠杆菌菌株S17-1的化学感受态细胞。
Figure BDA0002374938900000152
等(Journal of Bacteriology 172,1663–1666,1990)在材料和方法中描述的改进的接合方法，被用于接合转移到菌株DM1933中，并用于借助其蔗糖抗性和卡那霉素敏感性表型而选择转接合子克隆。使用Type-it试剂盒和用于PCR扩增的引物NCgl0292_fw和NCgl0292_rev和用于熔解曲线分析的作为受体探针的NCgl0292_C和作为供体探针的NCgl0292_A通过实时PCR分析转接合子克隆(表4)。所述引物和探针也示于序列表的SEQ IDNO 9至12。
表4：用于实时PCR的引物和探针列表。
名称 序列
NCgl0292_fw CAACGAGGTAGCGGTTGGTG
NCgl0292_rev TCCGCGGCCTAATTTCCCTC
NCgl0292_C<sup>1</sup> ACAACACGTGCTCGTCCTAC
NCgl0292_A<sup>2</sup> TTCGGAATCACCAGCGAAGCTCGACGTGAGATCGT
1在5'-端标记有LC-Red640并在3'-端磷酸化的受体探针
2在3'-端标记有荧光素的供体探针
如此表征的转接合子克隆之一称为DM1933_NCgl0292_S225C。制备了转接合子克隆的甘油菌培养物，并将其用作进一步研究的起始材料。
因此，菌株DM1933的NCgl029基因被突变，其效果是编码的NCgl0292多肽的氨基酸序列的第220位的氨基酸丝氨酸被半胱氨酸取代。
实施例4
通过菌株DM1933_NCgl0292_S225C的L-赖氨酸产生
使用根据Wouter Duetz的培养系统通过分批培养对菌株DM1933(参照)和实施例3中获得的DM1933_NCgl0292_S225C分析其从葡萄糖产生L-赖氨酸的能力。
使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的CGXII培养基。将培养物孵育45小时，直到使用血糖仪通过葡萄糖分析确认葡萄糖完全消耗为止，并确定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果列于表5。
表5：通过菌株DM1933_NCgl0292_S225C的L-赖氨酸产生。
Figure BDA0002374938900000151
Figure BDA0002374938900000161
1作为L-赖氨酸x HCl
该实验表明，与亲本菌株DM1933相比，菌株DM1933_NCgl0292_S225C中L-赖氨酸的产生增加。
序列表
<110> 赢创运营有限公司
<120> 发酵产生L-赖氨酸的方法
<130> file: 2018
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2001
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (328)..(1320)
<223> NCgl0292的编码序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1000)..(1002)
<223> 丝氨酸的tcc密码子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1001)..(1001)
<223> 核碱基胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (1321)..(1323)
<223> taa终止密码子
<400> 1
tggcgtaatc gcactgtaca gctccttctt ctttttcttc ttcgtcgcag cactgctgag 60
cgagtggatt aagccttggg cagcattcct catcgtgttc ctcttcatgc tggtcatcgc 120
cgcagctctc gcactgttcg gctggcgcaa ggtgaagaag atgggcgctc cgaagaacac 180
catccaatcg gtcaaccaac tgaagaacct ggtcccaggt caggcatccg agaagctgga 240
gaaggccaac aagcgtggcc tctacacctc cgcgtccttc cacagccccg gcgccatcac 300
tggcgaccac taaaaaagga gacttcg atg gcc ttt ttt agc ttt tcg acg tct 354
Met Ala Phe Phe Ser Phe Ser Thr Ser
1 5
ccc ctc acc cgc ctc atc ccc ggc agc cgc tcc aaa gcc aca ggc gcc 402
Pro Leu Thr Arg Leu Ile Pro Gly Ser Arg Ser Lys Ala Thr Gly Ala
10 15 20 25
aaa cgg cgc ctg agc agc aca atc gcg tcg att gaa cgc tcc ccc ggc 450
Lys Arg Arg Leu Ser Ser Thr Ile Ala Ser Ile Glu Arg Ser Pro Gly
30 35 40
atc att gcc cta gac gga ccg ttc acc cac gat cac gtc tcc gta cgt 498
Ile Ile Ala Leu Asp Gly Pro Phe Thr His Asp His Val Ser Val Arg
45 50 55
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Gly Ile Arg Leu His Leu Ala Glu Ala Gly Ser Pro Thr Lys Pro Leu
60 65 70
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Val Leu Leu Ile His Gly Ala Phe Gly Gly Trp Tyr Asp Tyr Arg Glu
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Val Ile Gly Pro Leu Ala Asp Ala Gly Phe His Val Ala Ala Ile Asp
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190 195 200
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Arg Arg Trp Glu His Leu Ala Asn Thr Ala Arg Thr Arg Thr Thr Gly
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330
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<223> NCgl0292的变体的编码序列
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<223> 半胱氨酸的tgc密码子
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<223> 核碱基鸟嘌呤
<220>
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Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 7
<211> 1531
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码NCgl0292的变体的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(23)
<223> 限制性内切酶SbfI的识别位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> 对应于SEQ ID NO:3的第261位的核碱基胸腺嘧啶(t)
<220>
<221> CDS
<222> (91)..(1083)
<220>
<221> misc_feature
<222> (763)..(765)
<223> 半胱氨酸的tgc密码子
<220>
<221> mutation
<222> (764)..(764)
<223> 核碱基鸟嘌呤
<220>
<221> misc_feature
<222> (1084)..(1086)
<223> taa终止密码子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1510)..(1515)
<223> 限制性内切酶XmaI的识别位点
<220>
<221> misc_feature
<222> (1511)..(1511)
<223> 核碱基胞嘧啶(c); 对应于SEQ ID NO:3的第1748位
<400> 7
tgccaagctt gcatgcctgc aggtctacac ctccgcgtcc ttccacagcc ccggcgccat 60
cactggcgac cactaaaaaa ggagacttcg atg gcc ttt ttt agc ttt tcg acg 114
Met Ala Phe Phe Ser Phe Ser Thr
1 5
tct ccc ctc acc cgc ctc atc ccc ggc agc cgc tcc aaa gcc aca ggc 162
Ser Pro Leu Thr Arg Leu Ile Pro Gly Ser Arg Ser Lys Ala Thr Gly
10 15 20
gcc aaa cgg cgc ctg agc agc aca atc gcg tcg att gaa cgc tcc ccc 210
Ala Lys Arg Arg Leu Ser Ser Thr Ile Ala Ser Ile Glu Arg Ser Pro
25 30 35 40
ggc atc att gcc cta gac gga ccg ttc acc cac gat cac gtc tcc gta 258
Gly Ile Ile Ala Leu Asp Gly Pro Phe Thr His Asp His Val Ser Val
45 50 55
cgt ggc att cgc ctc cat tta gca gag gca ggc tcc ccc acc aaa ccc 306
Arg Gly Ile Arg Leu His Leu Ala Glu Ala Gly Ser Pro Thr Lys Pro
60 65 70
ctg gtt ctt ctg atc cac ggg gct ttc ggc ggt tgg tac gac tac cgc 354
Leu Val Leu Leu Ile His Gly Ala Phe Gly Gly Trp Tyr Asp Tyr Arg
75 80 85
gaa gtc atc ggc cca ctc gca gat gcc ggc ttc cac gtc gcc gcc atc 402
Glu Val Ile Gly Pro Leu Ala Asp Ala Gly Phe His Val Ala Ala Ile
90 95 100
gat cta cgc ggc tac ggc atg tcc gac aaa ccc cca aca ggc tac gac 450
Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Met Ser Asp Lys Pro Pro Thr Gly Tyr Asp
105 110 115 120
ctc cgc cac gca gcc gga gaa ctc agc agc gtt atc gca gct ctc ggc 498
Leu Arg His Ala Ala Gly Glu Leu Ser Ser Val Ile Ala Ala Leu Gly
125 130 135
cac gat gac gca ctt ctt gtc ggc tcc gac acc ggc gcc agc atc gcc 546
His Asp Asp Ala Leu Leu Val Gly Ser Asp Thr Gly Ala Ser Ile Ala
140 145 150
tgg gct atc gct tcc atg tac ccc gaa cgg gtc cgc ggc cta att tcc 594
Trp Ala Ile Ala Ser Met Tyr Pro Glu Arg Val Arg Gly Leu Ile Ser
155 160 165
ctc ggc gcg atc cac ccc ctt gac atg cga cgc gcc atc cga cga aaa 642
Leu Gly Ala Ile His Pro Leu Asp Met Arg Arg Ala Ile Arg Arg Lys
170 175 180
ccc cac cta cac gtc tct gac ctc agc cga ctt gct cct ttt cgg ttg 690
Pro His Leu His Val Ser Asp Leu Ser Arg Leu Ala Pro Phe Arg Leu
185 190 195 200
ccc tca ttc ctg cat aac ctc ttc cac ttc gga atc acc agc gaa gct 738
Pro Ser Phe Leu His Asn Leu Phe His Phe Gly Ile Thr Ser Glu Ala
205 210 215
cga cgt gag atc gtc aac aac acg tgc tcg tcc tac cag cgc agc aac 786
Arg Arg Glu Ile Val Asn Asn Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Arg Ser Asn
220 225 230
gca ttc aca gag aca gtg ctc ctc cgc aaa aaa gca cta tcg atc gac 834
Ala Phe Thr Glu Thr Val Leu Leu Arg Lys Lys Ala Leu Ser Ile Asp
235 240 245
cac acc atc acc ccg atc atc cgc acc aac cgc tac ctc gtt ggg tcg 882
His Thr Ile Thr Pro Ile Ile Arg Thr Asn Arg Tyr Leu Val Gly Ser
250 255 260
atc ccc agc aaa aca gtc tcc gca ccg gtg tgg ctg ctc aga acc aac 930
Ile Pro Ser Lys Thr Val Ser Ala Pro Val Trp Leu Leu Arg Thr Asn
265 270 275 280
act cga cgc tgg gaa cat cta gcc aat act gcg cgc act cga acg aca 978
Thr Arg Arg Trp Glu His Leu Ala Asn Thr Ala Arg Thr Arg Thr Thr
285 290 295
ggg cca ttc acc acc atc gcg atc ccc ggc ggc tac gaa ctc ccc tac 1026
Gly Pro Phe Thr Thr Ile Ala Ile Pro Gly Gly Tyr Glu Leu Pro Tyr
300 305 310
ctc gag aac cct tcc gaa ttt gca gca acc atc gca gag ttc gcg cgc 1074
Leu Glu Asn Pro Ser Glu Phe Ala Ala Thr Ile Ala Glu Phe Ala Arg
315 320 325
acc acg ttt taagcactgt ggctgaggcg ctgctgctca tttggcgtca 1123
Thr Thr Phe
330
gaaggtcgca tgattttggc gtgaattagt ggtttttccc tggttttacc ccggcgcatt 1183
gaccggacca gacaggcgtg acaagaatca agattttcgc caggttttgt cacgtgtgtc 1243
tggtttgagc gactcgaaac caaacaggcg tgccaaaact tagatgtttt agcaattttt 1303
gtcacgtgtg tctggtttca tctagttcga ccgcaaacct cacggatttc cccctagtca 1363
ctcaaaaacc aaaactccct atatgcccct ctaagcgctt gggattcccc gacccatacc 1423
aatagacacc tctcctattc caggccctta aaacgccaca caggattggt cgtatctatc 1483
tcggattggg cgattcactg ccaagacccg ggtaccgagc tcgaattc 1531
<210> 8
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
Met Ala Phe Phe Ser Phe Ser Thr Ser Pro Leu Thr Arg Leu Ile Pro
1 5 10 15
Gly Ser Arg Ser Lys Ala Thr Gly Ala Lys Arg Arg Leu Ser Ser Thr
20 25 30
Ile Ala Ser Ile Glu Arg Ser Pro Gly Ile Ile Ala Leu Asp Gly Pro
35 40 45
Phe Thr His Asp His Val Ser Val Arg Gly Ile Arg Leu His Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Gly Ser Pro Thr Lys Pro Leu Val Leu Leu Ile His Gly Ala
65 70 75 80
Phe Gly Gly Trp Tyr Asp Tyr Arg Glu Val Ile Gly Pro Leu Ala Asp
85 90 95
Ala Gly Phe His Val Ala Ala Ile Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Met Ser
100 105 110
Asp Lys Pro Pro Thr Gly Tyr Asp Leu Arg His Ala Ala Gly Glu Leu
115 120 125
Ser Ser Val Ile Ala Ala Leu Gly His Asp Asp Ala Leu Leu Val Gly
130 135 140
Ser Asp Thr Gly Ala Ser Ile Ala Trp Ala Ile Ala Ser Met Tyr Pro
145 150 155 160
Glu Arg Val Arg Gly Leu Ile Ser Leu Gly Ala Ile His Pro Leu Asp
165 170 175
Met Arg Arg Ala Ile Arg Arg Lys Pro His Leu His Val Ser Asp Leu
180 185 190
Ser Arg Leu Ala Pro Phe Arg Leu Pro Ser Phe Leu His Asn Leu Phe
195 200 205
His Phe Gly Ile Thr Ser Glu Ala Arg Arg Glu Ile Val Asn Asn Thr
210 215 220
Cys Ser Ser Tyr Gln Arg Ser Asn Ala Phe Thr Glu Thr Val Leu Leu
225 230 235 240
Arg Lys Lys Ala Leu Ser Ile Asp His Thr Ile Thr Pro Ile Ile Arg
245 250 255
Thr Asn Arg Tyr Leu Val Gly Ser Ile Pro Ser Lys Thr Val Ser Ala
260 265 270
Pro Val Trp Leu Leu Arg Thr Asn Thr Arg Arg Trp Glu His Leu Ala
275 280 285
Asn Thr Ala Arg Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe Thr Thr Ile Ala Ile
290 295 300
Pro Gly Gly Tyr Glu Leu Pro Tyr Leu Glu Asn Pro Ser Glu Phe Ala
305 310 315 320
Ala Thr Ile Ala Glu Phe Ala Arg Thr Thr Phe
325 330
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物NCgl0292_fw
<400> 9
caacgaggta gcggttggtg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物NCgl0292_rev
<400> 10
tccgcggcct aatttccctc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针NCgl0292_C
<400> 11
acaacacgtg ctcgtcctac 20
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针NCgl0292_A
<400> 12
ttcggaatca ccagcgaagc tcgacgtgag atcgt 35
201800314 17

Claims (9)

1.一种具有分泌L-赖氨酸能力的谷氨酸棒状杆菌物种的细菌，所述细菌在其染色体中含有编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其中第225位的氨基酸丝氨酸被不同的蛋白源性氨基酸取代。
2.如权利要求1所述的细菌，其中在SEQ ID NO：2的氨基酸序列的第225位的所述氨基酸是半胱氨酸。
3.如权利要求2所述的细菌，其中编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的第328位至第1320位的核苷酸序列，其中第1001位的核碱基为鸟嘌呤。
4.如权利要求2所述的细菌，其中编码所述氨基酸序列的多核苷酸包含SEQ ID NO：1的第328位至第1323位的核苷酸序列，其中第1001位的核碱基为鸟嘌呤。
5.如前述权利要求中任一项所述的细菌，其包含至少一个拷贝的编码抗反馈天冬氨酸激酶多肽的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的细菌，其中所述抗反馈天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含在第311位含有异亮氨酸而不是苏氨酸的SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
7.一种发酵产生L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：a)在合适的条件下在合适的培养基中培养权利要求1至6中任一项所定义的细菌，和b)在该培养基中积聚L-赖氨酸以形成含L-赖氨酸的发酵液。
8.权利要求7的方法，进一步包括L-赖氨酸纯化的步骤。
9.权利要求8的方法，其中所述纯化步骤选自由以下组成的组：用活性炭处理、离子交换和结晶。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11634314B1 (en) 2022-11-17 2023-04-25 Sharkninja Operating Llc Dosing accuracy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1370234A (zh) * 1999-06-25 2002-09-18 Basf公司 编码参与内环境稳定和适应的蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因
US20100192985A1 (en) * 2008-11-11 2010-08-05 Wolfgang Aehle Compositions and methods comprising serine protease variants

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3473042B2 (ja) 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
DK0841395T3 (da) 1995-06-07 2012-01-09 Ajinomoto Kk Fremgangsmåde til at fremstille L-lysin
CN100540668C (zh) 1999-04-19 2009-09-16 协和发酵生化株式会社 新型脱敏型天冬氨酸激酶
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US6844176B1 (en) 2001-10-16 2005-01-18 Degussa Ag Alleles of the lysC gene from corynebacteria
DE102005032426A1 (de) 2004-12-18 2006-06-22 Degussa Ag Allele des gnd-Gens aus coryneformen Bakterien
US20070092951A1 (en) 2005-03-24 2007-04-26 Degussa Ag Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria
EP3170889A1 (en) 2006-09-15 2017-05-24 CJ Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
DE102006048882A1 (de) 2006-10-17 2008-04-24 Evonik Degussa Gmbh Allele des rel-Gens aus coryneformen Bakterien
WO2008092956A1 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Production of l-lysine and l-lysine-containing feed additives
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
KR101512432B1 (ko) 2010-06-15 2015-04-16 백광산업 주식회사 미생물을 이용한 아스파테이트 계열 아미노산의 생산방법
EP3404101A3 (en) 2011-12-21 2018-12-26 Cj Cheiljedang Corporation Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1370234A (zh) * 1999-06-25 2002-09-18 Basf公司 编码参与内环境稳定和适应的蛋白质的谷氨酸棒杆菌基因
US20100192985A1 (en) * 2008-11-11 2010-08-05 Wolfgang Aehle Compositions and methods comprising serine protease variants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. OHNISHI 等: ""A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum genome information to generate a new L-lysine-producing mutant"", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》, vol. 58, pages 217 - 223, XP002289984, DOI: 10.1007/s00253-001-0883-6 *
张军华 等: ""微生物发酵法生产L-赖氨酸的研究进展"", 《生物加工过程》, vol. 10, no. 2, pages 73 - 78 *

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