JP2003525046A - Ｌ−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、ｌ−セリンを微生物学的に製造するための改善された方法、ならびにこのために適切な遺伝子的に改変した微生物 - Google Patents
Ｌ−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードするヌクレオチド配列、ｌ−セリンを微生物学的に製造するための改善された方法、ならびにこのために適切な遺伝子的に改変した微生物Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Ｌ−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードするコリネ型の細菌のヌクレオチド配列ならびにその単離の方法に関する。さらにＬ−セリンの産生のための改善された方法も本発明の対象である。さらに本発明は、食品、飼料および／または医薬工業またはヒト医学におけるＬ−セリンの使用にも関する。
Description
【０００１】
本発明は、Ｌ−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードするコリネ型の細菌
のヌクレオチド配列ならびに微生物によりＬ−セリンを製造するための改善され
た方法およびこのために適切な、遺伝子的に改変された微生物に関する。さらに
本発明は、食品、飼料および／または医薬工業における、またはヒト医学におけ
る、Ｌ−セリンおよび／またはその後続産物の使用に関する。
のヌクレオチド配列ならびに微生物によりＬ−セリンを製造するための改善され
た方法およびこのために適切な、遺伝子的に改変された微生物に関する。さらに
本発明は、食品、飼料および／または医薬工業における、またはヒト医学におけ
る、Ｌ−セリンおよび／またはその後続産物の使用に関する。
【０００２】
アミノ酸、たとえばＬ−グルタミン酸、Ｌ−リシンまたは分枝鎖状のＬ−アミ
ノ酸は近年、ますます経済的な関心の焦点となっている。このことは同様にアミ
ノ酸のＬ−セリンにも該当し、これは脂肪族アミノ酸であるＬ−グリシンまたは
Ｌ−システインを合成するための前駆物質としてのみではなく、インドールとＬ
−セリンとからＬ−トリプトファンを製造するためにも使用される。この場合、
アミノ酸Ｌ−セリンについては、特に食品、飼料および医薬工業において、なら
びにヒト医学の広い領域でますます経済的な可能性が認識される。
ノ酸は近年、ますます経済的な関心の焦点となっている。このことは同様にアミ
ノ酸のＬ−セリンにも該当し、これは脂肪族アミノ酸であるＬ−グリシンまたは
Ｌ−システインを合成するための前駆物質としてのみではなく、インドールとＬ
−セリンとからＬ−トリプトファンを製造するためにも使用される。この場合、
アミノ酸Ｌ−セリンについては、特に食品、飼料および医薬工業において、なら
びにヒト医学の広い領域でますます経済的な可能性が認識される。
【０００３】
微生物によりＬ−セリンを製造するための方法は、文献に多数記載されている
。Ｌ−セリンを製造するためのコリネ型の細菌の発酵もまたすでに公知である。
たとえばコリネバクテリウム グリシノフィルム株(corynebacterium glycinoph
ilum)はグリシンと炭水化物とからＬ−セリンを形成することができる（Kubota Ｋ、Kageyama Ｋ、Shiro TおよびOkumura Ｓ（１９７１年）、Journal of General Applications in Microbiology、１７：第１６７〜１６８頁；Kub
ota K、Kageyama K、Maeyashiki I、Yamada KおよびOkumura S（１９７２
年）、Journal of General Applications in Microbiology １８：第３６
５頁）。ここではグリシンからＬ−セリンへの反応に酵素Ｌ−セリン−ヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼが関与している（Kubota KおよびYokozeki K（１
９８９年）、Journal of Fermentation and Bioengeneering、６７（６）：
第３８７〜３９０頁）。使用される細菌株はさらにセリン分解が低減しており、
これは酵素Ｌ−セリン−デヒドラターゼの活性の低減に起因している（Kubota
K、Kageyama K、Shiro TおよびOkumura S（１９７１年）、Journal of Gen
eral Applications in Microbiology、１７：第１６７〜１６８頁；Kubota
K（１９８５年）、Agricultural Biological Chemistry、４９：第７〜１２頁
）。
。Ｌ−セリンを製造するためのコリネ型の細菌の発酵もまたすでに公知である。
たとえばコリネバクテリウム グリシノフィルム株(corynebacterium glycinoph
ilum)はグリシンと炭水化物とからＬ−セリンを形成することができる（Kubota Ｋ、Kageyama Ｋ、Shiro TおよびOkumura Ｓ（１９７１年）、Journal of General Applications in Microbiology、１７：第１６７〜１６８頁；Kub
ota K、Kageyama K、Maeyashiki I、Yamada KおよびOkumura S（１９７２
年）、Journal of General Applications in Microbiology １８：第３６
５頁）。ここではグリシンからＬ−セリンへの反応に酵素Ｌ−セリン−ヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼが関与している（Kubota KおよびYokozeki K（１
９８９年）、Journal of Fermentation and Bioengeneering、６７（６）：
第３８７〜３９０頁）。使用される細菌株はさらにセリン分解が低減しており、
これは酵素Ｌ−セリン−デヒドラターゼの活性の低減に起因している（Kubota
K、Kageyama K、Shiro TおよびOkumura S（１９７１年）、Journal of Gen
eral Applications in Microbiology、１７：第１６７〜１６８頁；Kubota
K（１９８５年）、Agricultural Biological Chemistry、４９：第７〜１２頁
）。
【０００４】
さらに、Izumi Y、Yoshida T、Miyazaki SS、Mitsunaga T、Ohshiro T、
Shiamo M、Miyata AおよびTanabe T（１９９３年）、Applied Microbiology and Biotechnology、３９：第４２７〜４３２頁では、メチロトローフ細菌、
たとえばハイフォミクロビウム(hyphomicrobium)属を使用してメタノールとグリ
シンとから発酵によりＬ−セリンを製造することが記載されている。
Shiamo M、Miyata AおよびTanabe T（１９９３年）、Applied Microbiology and Biotechnology、３９：第４２７〜４３２頁では、メチロトローフ細菌、
たとえばハイフォミクロビウム(hyphomicrobium)属を使用してメタノールとグリ
シンとから発酵によりＬ−セリンを製造することが記載されている。
【０００５】
しかし前記の事例では炭水化物から出発してアミノ酸Ｌ−セリンを形成するた
めの前駆物質として、アミノ酸であるグリシンの添加が必要である。
めの前駆物質として、アミノ酸であるグリシンの添加が必要である。
【０００６】
これに対して、別の前駆物質を付加的に添加することなく、Ｌ−セリンを炭水
化物から直接製造することができるコリネ型の細菌の発酵のための方法がすでに
公知である。たとえばコリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム グルタ
ミクム種の細菌株がYoshida HおよびNakayama K（１９７４年）、Nihon-Nogei
-Kagakukaishi ４８：第２０１〜２０８頁に記載されており、これはランダム
突然変異誘発により得られたものであり、かつ特にＬ−セリンの類似体であるセ
リン−ヒドロキサメートもしくはβ−クロロアラニンに対して耐性であることに
より優れている。このことは特に、物質代謝流がＬ−セリン生合成の方向へと増
大して流れることができることにつながる。というのも、相応する酵素の活性は
、最終産物の阻害が低減しているからである。
化物から直接製造することができるコリネ型の細菌の発酵のための方法がすでに
公知である。たとえばコリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム グルタ
ミクム種の細菌株がYoshida HおよびNakayama K（１９７４年）、Nihon-Nogei
-Kagakukaishi ４８：第２０１〜２０８頁に記載されており、これはランダム
突然変異誘発により得られたものであり、かつ特にＬ−セリンの類似体であるセ
リン−ヒドロキサメートもしくはβ−クロロアラニンに対して耐性であることに
より優れている。このことは特に、物質代謝流がＬ−セリン生合成の方向へと増
大して流れることができることにつながる。というのも、相応する酵素の活性は
、最終産物の阻害が低減しているからである。
【０００７】
ＥＰ０９３１８３３からさらに、ブレビバクテリウム フラブム(brevibacter
ium flavum)種の細菌株が公知であり、これは同様にランダム突然変異誘発によ
り得られ、かつこのことに基づいてセリン分解における欠損を有する。さらにこ
こに記載されている株は改変されたｓｅｒＡ遺伝子を有しており、これはフィー
ドバック−不感受性の３−ホスホグリセリン酸−デヒドロゲナーゼをコードする
。さらにこれらの株は異種の生物である大腸菌(escherichia coli)に由来する、
酵素ホスホセリン−ホスファターゼもしくはホスホセリン−アミノトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣを有している。従ってここに
記載されている系は、冒頭に記載したランダム突然変異誘発に関して細菌株の遺
伝子的な不確定性と結びついて、付加的に導入された、一部異種の多数の遺伝子
構造に関して高い複雑さを有する。このことは、大工業的な規模での製造方法の
過程において、これらの細菌株の不安定性が比較的高いという危険をはらんでい
る。さらに、ここに記載された細菌株によってＬ−セリンの産生は２倍から最大
で５倍向上するにすぎないことが記載されている。このことは特に、異種遺伝子
の最適以下の発現が原因であると思われる。異種系のもう１つの欠点は、特に医
学、薬学および食品に関連する物質を製造するための、外来ＤＮＡを有する系の
許容性が低いことである。
ium flavum)種の細菌株が公知であり、これは同様にランダム突然変異誘発によ
り得られ、かつこのことに基づいてセリン分解における欠損を有する。さらにこ
こに記載されている株は改変されたｓｅｒＡ遺伝子を有しており、これはフィー
ドバック−不感受性の３−ホスホグリセリン酸−デヒドロゲナーゼをコードする
。さらにこれらの株は異種の生物である大腸菌(escherichia coli)に由来する、
酵素ホスホセリン−ホスファターゼもしくはホスホセリン−アミノトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣを有している。従ってここに
記載されている系は、冒頭に記載したランダム突然変異誘発に関して細菌株の遺
伝子的な不確定性と結びついて、付加的に導入された、一部異種の多数の遺伝子
構造に関して高い複雑さを有する。このことは、大工業的な規模での製造方法の
過程において、これらの細菌株の不安定性が比較的高いという危険をはらんでい
る。さらに、ここに記載された細菌株によってＬ−セリンの産生は２倍から最大
で５倍向上するにすぎないことが記載されている。このことは特に、異種遺伝子
の最適以下の発現が原因であると思われる。異種系のもう１つの欠点は、特に医
学、薬学および食品に関連する物質を製造するための、外来ＤＮＡを有する系の
許容性が低いことである。
【０００８】
経済的に興味深いＬ−アミノ酸、たとえばＬ−セリンを生合成する以外に、こ
れらの代謝産物の培地への分泌もまた、最終産物中でのＬ−セリンの収率にとっ
て極めて重要である。この分泌は非特異的に拡散によって行われるか、またはた
とえばアミノ酸Ｌ−イソロイシンもしくはＬ−リシンに関して記載されているよ
うに（Zittrich, S等、１９９４年、Journal of Bacteriology、１７６：第
６８９２〜６８９９頁およびBroeer, S等、１９９１年、European Journal o
f Biochemistry、２０２：１３１〜１５３頁）、膜輸送システムにより能動的
に媒介される。このような活性な輸送システムの場合の問題は、輸送すべき物質
代謝産物が細胞中で、自然な状態で存在する濃度の臨界値を越えた途端に、この
「エキスポートキャリア(Exportcarrier)」の容量をただちに越えてしまうこと
である。つまりたとえばＬ−セリンの生合成が増大した場合、細胞からのその分
泌は制限されうる。
れらの代謝産物の培地への分泌もまた、最終産物中でのＬ−セリンの収率にとっ
て極めて重要である。この分泌は非特異的に拡散によって行われるか、またはた
とえばアミノ酸Ｌ−イソロイシンもしくはＬ−リシンに関して記載されているよ
うに（Zittrich, S等、１９９４年、Journal of Bacteriology、１７６：第
６８９２〜６８９９頁およびBroeer, S等、１９９１年、European Journal o
f Biochemistry、２０２：１３１〜１５３頁）、膜輸送システムにより能動的
に媒介される。このような活性な輸送システムの場合の問題は、輸送すべき物質
代謝産物が細胞中で、自然な状態で存在する濃度の臨界値を越えた途端に、この
「エキスポートキャリア(Exportcarrier)」の容量をただちに越えてしまうこと
である。つまりたとえばＬ−セリンの生合成が増大した場合、細胞からのその分
泌は制限されうる。
【０００９】
従って同種系における発現のためにＬ−セリンの生合成に決定的に関与する遺
伝子をコリネ型の細菌から得ることが所望されており、同様に形成されたＬ−セ
リンの培地への改善された分泌が所望されている。
伝子をコリネ型の細菌から得ることが所望されており、同様に形成されたＬ−セ
リンの培地への改善された分泌が所望されている。
【００１０】
従って本発明の目標は、前記の欠点をもはや有しておらず、かつＬ−セリンま
たはここから誘導可能な物質代謝産物の改善された産生およびこれらの単離を可
能にする系を提供することである。
たはここから誘導可能な物質代謝産物の改善された産生およびこれらの単離を可
能にする系を提供することである。
【００１１】
この課題は本発明により解決される。
【００１２】
本発明の対象は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または５もしくは２または６（図１
）による配列から選択される遺伝子ｓｅｒＢを有するホスホセリン−ホスファタ
ーゼをコードする単離された核酸ならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３または７もし
くは４または８（図２）による配列から選択される遺伝子ｓｅｒＣを有するホス
ホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする単離された核酸、またはこれ
らのヌクレオチド配列のアレル、同族体または誘導体またはこれらとハイブリダ
イズするヌクレオチド配列を提供することである。
）による配列から選択される遺伝子ｓｅｒＢを有するホスホセリン−ホスファタ
ーゼをコードする単離された核酸ならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３または７もし
くは４または８（図２）による配列から選択される遺伝子ｓｅｒＣを有するホス
ホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする単離された核酸、またはこれ
らのヌクレオチド配列のアレル、同族体または誘導体またはこれらとハイブリダ
イズするヌクレオチド配列を提供することである。
【００１３】
本発明によれば同様に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１によるＬ−トレオ
ニン−エキスポートキャリア、ならびにこれらから誘導される、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１０または１２によるポリペプチド配列をコードする核酸、ならびにＬ−
セリンを製造するための本発明による方法におけるこれらの使用が含まれている
。コリネ型の細菌からのこれらの配列の単離はドイツ特許出願明細書１９９４１
４７８．５に開示されている。
ニン−エキスポートキャリア、ならびにこれらから誘導される、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１０または１２によるポリペプチド配列をコードする核酸、ならびにＬ−
セリンを製造するための本発明による方法におけるこれらの使用が含まれている
。コリネ型の細菌からのこれらの配列の単離はドイツ特許出願明細書１９９４１
４７８．５に開示されている。
【００１４】
使用される核酸は、コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グルタミクム種または
ブレビバクテリウム フラブム種から単離されることにより優れている。株培養
に寄託されているコリネ型の細菌の野生型の例は、コリネバクテリウム グルタ
ミクム ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４７５２、コリネバクテリウム アセトグルタミクム(acetoglutamicum)
ＡＴＣＣ １５８０６、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ＡＴＣＣ
１５８０６、コリネバクテリウム メラッセコラ(melassecola) ＡＴＣＣ １
７９６５、コリネバクテリウム テルモアミノゲネス(thermoaminogenes) ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム フラブム ＡＴＣＣ １４０６７
、ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム(lactofermentum) ＡＴＣＣ １
３８６９およびブレビバクテリウム ジバリカツム(divaricatum) ＡＴＣＣ
１４０２０である。Ｌ−セリンの製造のために適切な突然変異株または産生株の
例はコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ ２１５８６、コリネバクテ
リウム グルタミクム ＫＹ １０１５０およびブレビバクテリウム ケトグル
タミクム ＡＴＣＣ ２１２２２である。本発明は前記の細菌株の記載により詳
細に特徴付けられるが、しかしこれらは本発明を限定するものではない。
レビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グルタミクム種または
ブレビバクテリウム フラブム種から単離されることにより優れている。株培養
に寄託されているコリネ型の細菌の野生型の例は、コリネバクテリウム グルタ
ミクム ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４７５２、コリネバクテリウム アセトグルタミクム(acetoglutamicum)
ＡＴＣＣ １５８０６、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ＡＴＣＣ
１５８０６、コリネバクテリウム メラッセコラ(melassecola) ＡＴＣＣ １
７９６５、コリネバクテリウム テルモアミノゲネス(thermoaminogenes) ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム フラブム ＡＴＣＣ １４０６７
、ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム(lactofermentum) ＡＴＣＣ １
３８６９およびブレビバクテリウム ジバリカツム(divaricatum) ＡＴＣＣ
１４０２０である。Ｌ−セリンの製造のために適切な突然変異株または産生株の
例はコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ ２１５８６、コリネバクテ
リウム グルタミクム ＫＹ １０１５０およびブレビバクテリウム ケトグル
タミクム ＡＴＣＣ ２１２２２である。本発明は前記の細菌株の記載により詳
細に特徴付けられるが、しかしこれらは本発明を限定するものではない。
【００１５】
単離される核酸または単離される核酸フラグメントとは本発明によれば、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡからなるポリマーと理解するものであり、これは１本鎖であって
も２本鎖であってもよく、かつ場合により天然、化学的に合成された、修飾され
た、または人工的なヌクレオチドを有していてもよい。この場合、ＤＮＡポリマ
ーという概念は、ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの混合物であってもよ
い。
ＡまたはＤＮＡからなるポリマーと理解するものであり、これは１本鎖であって
も２本鎖であってもよく、かつ場合により天然、化学的に合成された、修飾され
た、または人工的なヌクレオチドを有していてもよい。この場合、ＤＮＡポリマ
ーという概念は、ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはこれらの混合物であってもよ
い。
【００１６】
アレルとは本発明によれば機能的に等価の、つまり実質的に同じ作用のヌクレ
オチド配列と理解する。機能的に等価の配列とは、異なったヌクレオチド配列に
もかかわらず、つまりたとえば遺伝子コードの縮重により制限されても、なお所
望の機能を有する配列である。従って機能的な等価物とは、ここに記載の配列の
天然に由来する変種ならびに人工的な、たとえば化学合成により得られ、かつ場
合により宿主生物のコドンの消費に適合したヌクレオチド配列を含む。機能的に
等価の配列はさらに、たとえば阻害物質に対する不感受性または耐性を酵素に付
与する、改変されたヌクレオチド配列を有する配列を含む。
オチド配列と理解する。機能的に等価の配列とは、異なったヌクレオチド配列に
もかかわらず、つまりたとえば遺伝子コードの縮重により制限されても、なお所
望の機能を有する配列である。従って機能的な等価物とは、ここに記載の配列の
天然に由来する変種ならびに人工的な、たとえば化学合成により得られ、かつ場
合により宿主生物のコドンの消費に適合したヌクレオチド配列を含む。機能的に
等価の配列はさらに、たとえば阻害物質に対する不感受性または耐性を酵素に付
与する、改変されたヌクレオチド配列を有する配列を含む。
【００１７】
機能的な等価物とは特に、本来単離される配列の天然もしくは人工的な突然変
異とも理解し、これらはさらに所望の機能を示す。突然変異はヌクレオチド基の
置換、付加、欠失、交換または挿入を含む。
異とも理解し、これらはさらに所望の機能を示す。突然変異はヌクレオチド基の
置換、付加、欠失、交換または挿入を含む。
【００１８】
ここではまたたとえば、蛋白質レベルで保存されるアミノ酸の交換につながり
うる、いわゆるセンス突然変異(sense mutations)も含まれるが、しかしこれは
蛋白質の活性の基本的な変化にはつながらず、従って機能的に中立である。この
ことは、蛋白質レベルで蛋白質のＮ−末端またはＣ−末端に該当するが、しかし
蛋白質の機能を実質的に損なうことのないヌクレオチド配列の変化も含む。しか
もこれらの変化は蛋白質構造を安定化させる影響を与えることができる。
うる、いわゆるセンス突然変異(sense mutations)も含まれるが、しかしこれは
蛋白質の活性の基本的な変化にはつながらず、従って機能的に中立である。この
ことは、蛋白質レベルで蛋白質のＮ−末端またはＣ−末端に該当するが、しかし
蛋白質の機能を実質的に損なうことのないヌクレオチド配列の変化も含む。しか
もこれらの変化は蛋白質構造を安定化させる影響を与えることができる。
【００１９】
さらにたとえばヌクレオチド配列の修飾により得られ、相応する誘導体が生じ
るヌクレオチド配列もまた本発明により含まれる。このような修飾の目標はたと
えば、その中に含まれているコード配列をさらに限定すること、またはたとえば
別の制限酵素の切断部位を挿入することであってもよい。機能的な等価物は、そ
の機能が、出発遺伝子もしくは遺伝子フラグメントと比較して弱くなっている、
もしくは強くなっている変種でもある。
るヌクレオチド配列もまた本発明により含まれる。このような修飾の目標はたと
えば、その中に含まれているコード配列をさらに限定すること、またはたとえば
別の制限酵素の切断部位を挿入することであってもよい。機能的な等価物は、そ
の機能が、出発遺伝子もしくは遺伝子フラグメントと比較して弱くなっている、
もしくは強くなっている変種でもある。
【００２０】
さらに人工的なＤＮＡ配列は、上記のとおり、所望の特性を媒介するのであれ
ばこれらも本発明の対象である。このような人工的なＤＮＡ配列はたとえばコン
ピュータにより支援されたプログラム（分子モデリング）を用いて得られる蛋白
質の逆翻訳により、またはインビトロ−選択により確認することができる。宿主
生物に対して特異的なコドン利用によるポリペプチド配列を逆翻訳することによ
り得られるコードＤＮＡ配列は特に好適である。この特異的なコドン利用は、分
子遺伝学的な方法に精通した当業者が、その他のすでに公知の、形質転換すべき
生物の遺伝子のコンピュータ評価によって容易に確認することができる。
ばこれらも本発明の対象である。このような人工的なＤＮＡ配列はたとえばコン
ピュータにより支援されたプログラム（分子モデリング）を用いて得られる蛋白
質の逆翻訳により、またはインビトロ−選択により確認することができる。宿主
生物に対して特異的なコドン利用によるポリペプチド配列を逆翻訳することによ
り得られるコードＤＮＡ配列は特に好適である。この特異的なコドン利用は、分
子遺伝学的な方法に精通した当業者が、その他のすでに公知の、形質転換すべき
生物の遺伝子のコンピュータ評価によって容易に確認することができる。
【００２１】
相同的配列とは本発明によれば、本発明によるヌクレオチド配列に対して相補
的であり、かつ／または該ヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列と理解す
る。ハイブリダイズする配列の概念は、本発明によればＤＮＡまたはＲＮＡの群
からの実質的に類似するヌクレオチド配列を包含し、これらは自体公知のストリ
ンジェント条件下で前記のヌクレオチド配列と特異的に相互作用する（結合する
）。これにはたとえば１０〜３０、有利には１２〜１５のヌクレオチド長さを有
する短いヌクレオチド配列もまた挙げられる。これは本発明によれば特にいわゆ
るプライマーまたはプローブを含む。
的であり、かつ／または該ヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列と理解す
る。ハイブリダイズする配列の概念は、本発明によればＤＮＡまたはＲＮＡの群
からの実質的に類似するヌクレオチド配列を包含し、これらは自体公知のストリ
ンジェント条件下で前記のヌクレオチド配列と特異的に相互作用する（結合する
）。これにはたとえば１０〜３０、有利には１２〜１５のヌクレオチド長さを有
する短いヌクレオチド配列もまた挙げられる。これは本発明によれば特にいわゆ
るプライマーまたはプローブを含む。
【００２２】
本発明によればコード領域（構造遺伝子）に先行する（５′−もしくは上流）
配列領域および／または後に続く（３′−もしくは下流）配列領域が包含される
。特にここでは調節機能を有する配列領域も含まれる。これらは転写、ＲＮＡ安
定性またはＲＮＡ産生ならびに翻訳に影響を与えることができる。調節配列の例
は特にプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーターまたは翻訳
エンハンサーである。
配列領域および／または後に続く（３′−もしくは下流）配列領域が包含される
。特にここでは調節機能を有する配列領域も含まれる。これらは転写、ＲＮＡ安
定性またはＲＮＡ産生ならびに翻訳に影響を与えることができる。調節配列の例
は特にプロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーターまたは翻訳
エンハンサーである。
【００２３】
本発明の対象はさらに、ホスホセリン−ホスファターゼ、ホスホセリン−アミ
ノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−トレオニンエキスポートキャリアをコ
ードする、少なくとも１つの前記のヌクレオチド配列を有する遺伝子構造、なら
びにこれらと機能的に結合した、宿主細胞中でのコード配列の発現を制御する調
節配列である。
ノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−トレオニンエキスポートキャリアをコ
ードする、少なくとも１つの前記のヌクレオチド配列を有する遺伝子構造、なら
びにこれらと機能的に結合した、宿主細胞中でのコード配列の発現を制御する調
節配列である。
【００２４】
機能的な結合とは、たとえばプロモーター、コード配列、ターミネーターおよ
び場合によりその他の調節要素が、それぞれの調節要素がコード配列の発現の際
にその機能を特定の方法で満足することができるように配列されている配置と理
解する。これらの調節ヌクレオチド配列は天然由来のものであってもよいし、ま
たは化学合成により得られるものであってもよい。プロモーターとして基本的に
、相応する宿主生物中の遺伝子発現を制御することができるそれぞれのプロモー
ターが適切である。この場合、本発明によれば化学的に誘導可能なプロモーター
であってもよく、このプロモーターによって宿主細胞中の従属する遺伝子の発現
を特定の時点で制御することができる。ここではたとえばＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−チオガラクトシド）により誘導可能なプロモーターが挙げられる（Eikm
anns, B. J.等、１９９１年、Gene、１０２：第９３〜９８頁）。
び場合によりその他の調節要素が、それぞれの調節要素がコード配列の発現の際
にその機能を特定の方法で満足することができるように配列されている配置と理
解する。これらの調節ヌクレオチド配列は天然由来のものであってもよいし、ま
たは化学合成により得られるものであってもよい。プロモーターとして基本的に
、相応する宿主生物中の遺伝子発現を制御することができるそれぞれのプロモー
ターが適切である。この場合、本発明によれば化学的に誘導可能なプロモーター
であってもよく、このプロモーターによって宿主細胞中の従属する遺伝子の発現
を特定の時点で制御することができる。ここではたとえばＩＰＴＧ（イソプロピ
ル−β−チオガラクトシド）により誘導可能なプロモーターが挙げられる（Eikm
anns, B. J.等、１９９１年、Gene、１０２：第９３〜９８頁）。
【００２５】
遺伝子構造の作製は、適切なプロモーターと少なくとも１種の本発明によるヌ
クレオチド配列とを、通例の組み換え技術およびクローニング技術により融合す
ることにより行うが、これらの技術はたとえばT. Maniatis、E. F. Fritsch
およびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spr
ing Harbor Laboratury、Cold Spring Harbor、ＮＹ（１９８９年）に記載
されている。ＤＮＡフラグメント相互の結合のために、フラグメントにアダプタ
ーまたはリンカーを設置することができる。
クレオチド配列とを、通例の組み換え技術およびクローニング技術により融合す
ることにより行うが、これらの技術はたとえばT. Maniatis、E. F. Fritsch
およびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spr
ing Harbor Laboratury、Cold Spring Harbor、ＮＹ（１９８９年）に記載
されている。ＤＮＡフラグメント相互の結合のために、フラグメントにアダプタ
ーまたはリンカーを設置することができる。
【００２６】
本発明はさらに、宿主細胞中での複製のため、または相応する宿主細胞ゲノム
への組み込みのための、前記の種類の、ホスホセリン−ホスファターゼ、ホスホ
セリン−アミノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−トレオニンエキスポート
キャリアをコードする、少なくとも１種のヌクレオチド配列、これらと機能的に
結合した調節ヌクレオチド配列ならびに形質転換した宿主細胞を選択するための
付加的なヌクレオチド配列を有するベクターに関する。さらに本発明によるベク
ターは前記の種類の遺伝子構造を有していてもよい。
への組み込みのための、前記の種類の、ホスホセリン−ホスファターゼ、ホスホ
セリン−アミノトランスフェラーゼおよび／またはＬ−トレオニンエキスポート
キャリアをコードする、少なくとも１種のヌクレオチド配列、これらと機能的に
結合した調節ヌクレオチド配列ならびに形質転換した宿主細胞を選択するための
付加的なヌクレオチド配列を有するベクターに関する。さらに本発明によるベク
ターは前記の種類の遺伝子構造を有していてもよい。
【００２７】
ベクターとして、コリネ型の細菌中で複製されるベクターが適切である（Proc
ess Biochem ３３（１９９８年）、第１４７〜１６１頁）。数多くの公知のプ
ラスミドベクター、たとえばｐＺ１（Menkel等、Applied and Environmental Microbiology（１９８９年）６４：第５４９〜５５４頁）、ｐＥＫＥｘ１（Ei
kmanns等、Gene １０２：第９３〜９８（１９９１年））またはｐＨＳ２−１（
Sonnen等、Gene １０７：第６９〜７４頁（１９９１年））は、クリプティック
プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に由来する。その他のプラ
スミドベクター、たとえばｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４，４８９，１６０）またはｐＮ
Ｇ２（Serwold-Davis等、FEMS Microbiology Letters ６６、第１１９〜１２
４頁（１９９０年））またはｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ５，１５８，８９１）に由来す
るものを、同様に使用することができる。しかしこれらの記載は本発明にとって
限定的なものではない。
ess Biochem ３３（１９９８年）、第１４７〜１６１頁）。数多くの公知のプ
ラスミドベクター、たとえばｐＺ１（Menkel等、Applied and Environmental Microbiology（１９８９年）６４：第５４９〜５５４頁）、ｐＥＫＥｘ１（Ei
kmanns等、Gene １０２：第９３〜９８（１９９１年））またはｐＨＳ２−１（
Sonnen等、Gene １０７：第６９〜７４頁（１９９１年））は、クリプティック
プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に由来する。その他のプラ
スミドベクター、たとえばｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４，４８９，１６０）またはｐＮ
Ｇ２（Serwold-Davis等、FEMS Microbiology Letters ６６、第１１９〜１２
４頁（１９９０年））またはｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ５，１５８，８９１）に由来す
るものを、同様に使用することができる。しかしこれらの記載は本発明にとって
限定的なものではない。
【００２８】
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５、７、９または１１による核酸配列を利用し
て、相応するプローブまたはプライマーを合成し、たとえばＰＣＲ技術を用いて
その他の微生物、有利にはコリネ型の細菌から類似の遺伝子を増幅し、かつ単離
するために使用することができる。
て、相応するプローブまたはプライマーを合成し、たとえばＰＣＲ技術を用いて
その他の微生物、有利にはコリネ型の細菌から類似の遺伝子を増幅し、かつ単離
するために使用することができる。
【００２９】
従って本発明の対象は、Ｌ−セリンの生合成またはＬ−トレオニンおよび／ま
たはＬ−セリンの発現に関与する蛋白質をコードする遺伝子を同定および／また
は単離するためのプローブにも関し、この場合、このプローブは前記の種類の核
酸配列から出発して製造され、かつ検出のために適切な標識を有する。このプロ
ーブは、たとえば１０〜３０または有利には１２〜１５のヌクレオチド長さを有
し、かつストリンジェント条件下で同種のヌクレオチド配列と特異的にハイブリ
ダイズすることができる本発明による配列、たとえば保存された領域からの本発
明による配列の部分切片であってもよい。適切な標識は文献から多数が公知であ
る。
たはＬ−セリンの発現に関与する蛋白質をコードする遺伝子を同定および／また
は単離するためのプローブにも関し、この場合、このプローブは前記の種類の核
酸配列から出発して製造され、かつ検出のために適切な標識を有する。このプロ
ーブは、たとえば１０〜３０または有利には１２〜１５のヌクレオチド長さを有
し、かつストリンジェント条件下で同種のヌクレオチド配列と特異的にハイブリ
ダイズすることができる本発明による配列、たとえば保存された領域からの本発
明による配列の部分切片であってもよい。適切な標識は文献から多数が公知であ
る。
【００３０】
当業者はこのための手引きを特にたとえばGaitによるハンドブック：Oligonuk
leotide synthesis：a practical approach（ＩＲＬ Press、Oxford、ＵＫ
、１９８４年）およびNewtonおよびGraham：ＰＣＲ（Spektrum Akademischer
Verlag、Heidelberg、ドイツ、１９９４年）またはたとえばRoche Diagnostics
社（Mannheim、ドイツ）のハンドブック"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"およびLiebl等（International Journal of Syste
matic Bacteriology（１９９１年）４１：第２５５〜２６０頁）に見られる。
leotide synthesis：a practical approach（ＩＲＬ Press、Oxford、ＵＫ
、１９８４年）およびNewtonおよびGraham：ＰＣＲ（Spektrum Akademischer
Verlag、Heidelberg、ドイツ、１９９４年）またはたとえばRoche Diagnostics
社（Mannheim、ドイツ）のハンドブック"The DIG System Users Guide for Filter Hybridization"およびLiebl等（International Journal of Syste
matic Bacteriology（１９９１年）４１：第２５５〜２６０頁）に見られる。
【００３１】
本発明の対象はさらに、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または５による配列から選択
される核酸配列によりコードされるホスホセリン−ホスファターゼまたはその一
部、または前記の種類のその変種である。本発明は同様に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．２または６による配列から選択されるアミノ酸配列を有するホスホセリン−ホ
スファターゼまたはこれらのポリペプチド配列の修飾された形またはそのイソ型
またはこれらの混合物である。
される核酸配列によりコードされるホスホセリン−ホスファターゼまたはその一
部、または前記の種類のその変種である。本発明は同様に、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ
．２または６による配列から選択されるアミノ酸配列を有するホスホセリン−ホ
スファターゼまたはこれらのポリペプチド配列の修飾された形またはそのイソ型
またはこれらの混合物である。
【００３２】
本発明は同様にＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３または７による配列から選択される核
酸配列によってコードされるホスホセリン−アミノトランスフェラーゼまたはそ
の一部、または前記の種類のその変種を含む。本発明は同様にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．４または８による配列から選択されるアミノ酸配列を有するホスホセリン−
ホスファターゼまたはこれらのポリペプチドの配列の改変された形またはそのイ
ソ型またはこれらの混合物である。
酸配列によってコードされるホスホセリン−アミノトランスフェラーゼまたはそ
の一部、または前記の種類のその変種を含む。本発明は同様にＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．４または８による配列から選択されるアミノ酸配列を有するホスホセリン−
ホスファターゼまたはこれらのポリペプチドの配列の改変された形またはそのイ
ソ型またはこれらの混合物である。
【００３３】
本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０または１２による配列から選択され
るアミノ酸配列を有するＬ−トレオニン−エキスポートキャリアまたはこれらの
ポリペプチド配列の改変された形またはこれらのイソ型またはこれらの混合物の
使用も含み、その際、該キャリアはＬ−セリンの輸送も媒介し、かつＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．９または１１による配列から選択される核酸配列またはこれらの変種
によりコードされる。
るアミノ酸配列を有するＬ−トレオニン−エキスポートキャリアまたはこれらの
ポリペプチド配列の改変された形またはこれらのイソ型またはこれらの混合物の
使用も含み、その際、該キャリアはＬ−セリンの輸送も媒介し、かつＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．９または１１による配列から選択される核酸配列またはこれらの変種
によりコードされる。
【００３４】
本発明によるポリペプチドはさらに、コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グル
タミクム種またはブレビバクテリウム フラブム種に由来することにより優れて
いる。
リウム属またはブレビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グル
タミクム種またはブレビバクテリウム フラブム種に由来することにより優れて
いる。
【００３５】
イソ型とは同一もしくは比較可能な基質−および作用特異性を有するが、しか
し異なった一次構造を有する酵素であると理解する。
し異なった一次構造を有する酵素であると理解する。
【００３６】
改変された形とは、本発明によれば、配列中、たとえばポリペプチドのＮ−末
端および／またはＣ−末端、または保存されたアミノ酸の領域に変化が存在する
が、しかし酵素の機能は損なわれていない酵素であると理解する。これらの変化
は自体公知の方法によりアミノ酸交換の形で行われてもよい。
端および／またはＣ−末端、または保存されたアミノ酸の領域に変化が存在する
が、しかし酵素の機能は損なわれていない酵素であると理解する。これらの変化
は自体公知の方法によりアミノ酸交換の形で行われてもよい。
【００３７】
本発明の特別な実施態様は、それぞれの出発蛋白質と比較して、その活性がた
とえばアミノ酸交換により弱くなっているか、もしくは強くなっている、本発明
によるポリペプチドの変種を含む。たとえばプロテアーゼによる分解に対する傾
向が強くなっている、もしくは弱くなっている細胞中の本発明による酵素の安定
性に関して同じことが該当する。
とえばアミノ酸交換により弱くなっているか、もしくは強くなっている、本発明
によるポリペプチドの変種を含む。たとえばプロテアーゼによる分解に対する傾
向が強くなっている、もしくは弱くなっている細胞中の本発明による酵素の安定
性に関して同じことが該当する。
【００３８】
さらに、アミノ酸配列が、調節作用のある化合物、たとえばその活性を調節す
る物質代謝最終産物に対して不感受性である（フィードバック−不感受性）よう
に改変されている、ホスホセリン−ホスファターゼまたはホスホセリン−アミノ
トランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドが本発明の対象である。
る物質代謝最終産物に対して不感受性である（フィードバック−不感受性）よう
に改変されている、ホスホセリン−ホスファターゼまたはホスホセリン−アミノ
トランスフェラーゼの機能を有するポリペプチドが本発明の対象である。
【００３９】
本発明の対象はさらにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５または７によるホスホ
セリン−ホスファターゼまたはホスホセリン−アミノトランスフェラーゼ、これ
らのアレル、同族体または誘導体をコードする少なくとも１つの核酸配列または
その一部ならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１によるＬ−トレオニンエキ
スポートキャリア、そのアレル、同族体または誘導体をコードする核酸配列の、
同種の宿主系への移送である。これは前記の遺伝子構築物またはベクターの、同
種の宿主系への移送も含む。宿主細胞へのこのＤＮＡの移送は、遺伝子工学的な
方法により行う。有利な方法としてここでは形質転換および特に有利には電気穿
孔によるＤＮＡの移送が挙げられる。
セリン−ホスファターゼまたはホスホセリン−アミノトランスフェラーゼ、これ
らのアレル、同族体または誘導体をコードする少なくとも１つの核酸配列または
その一部ならびにＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１によるＬ−トレオニンエキ
スポートキャリア、そのアレル、同族体または誘導体をコードする核酸配列の、
同種の宿主系への移送である。これは前記の遺伝子構築物またはベクターの、同
種の宿主系への移送も含む。宿主細胞へのこのＤＮＡの移送は、遺伝子工学的な
方法により行う。有利な方法としてここでは形質転換および特に有利には電気穿
孔によるＤＮＡの移送が挙げられる。
【００４０】
同種の宿主系とは、類似の科に属する全ての微生物であると理解する。本発明
によればこれらは、本発明によりコリネ型の細菌から単離された核酸が導入され
るコリネ型の細菌と理解すべきである。従って核酸の移送が成功した結果として
得られた、形質転換された微生物は、本発明による種類の付加的な核酸を含有し
、かつこれらを相応して発現させることができることによって、形質転換されて
いない相応する微生物から区別される。適切な同種の宿主系のための代理として
細菌のコリネバクテリウム グルタミクムおよび有利には株ＡＴＣＣ １３０３
２が挙げられ、これは標準条件下で次の通りに培養することができる： 培養は５００ｍｌの振とうフラスコ中、１２０回転／分および３０℃で行い、そ
の際、フラスコあたり５０ｍｌの培地を使用する。培地の接種は、予め同一の条
件下で１２〜１６時間培養してあったコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴ
ＣＣ １３０３２株の細菌（前）培養の添加により行い、その際、接種される培
地の光学密度を０．７〜１．５の範囲に調整する。
によればこれらは、本発明によりコリネ型の細菌から単離された核酸が導入され
るコリネ型の細菌と理解すべきである。従って核酸の移送が成功した結果として
得られた、形質転換された微生物は、本発明による種類の付加的な核酸を含有し
、かつこれらを相応して発現させることができることによって、形質転換されて
いない相応する微生物から区別される。適切な同種の宿主系のための代理として
細菌のコリネバクテリウム グルタミクムおよび有利には株ＡＴＣＣ １３０３
２が挙げられ、これは標準条件下で次の通りに培養することができる： 培養は５００ｍｌの振とうフラスコ中、１２０回転／分および３０℃で行い、そ
の際、フラスコあたり５０ｍｌの培地を使用する。培地の接種は、予め同一の条
件下で１２〜１６時間培養してあったコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴ
ＣＣ １３０３２株の細菌（前）培養の添加により行い、その際、接種される培
地の光学密度を０．７〜１．５の範囲に調整する。
【００４１】
培地としてそれぞれの要求に応じて天然培地、たとえばＬＢ−培地（T. Mani
atis、E. F. FritschおよびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laborato
y Manual、Cold Spring Harbor Laboratury、Cold Spring Harbor、NY（
１９８９年））または無機塩培地、たとえばＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer、C.
等、１９９３年、J. Bacteriol. １７５：第５５９３〜５６０３頁）が適切で
ある。相応する培養の後で細菌懸濁液を回収し、かつさらなる試験、たとえば通
例の方法により形質転換または核酸の単離のために使用することができる。この
実施法は同様にその他のコリネ型の細菌株にも適用することができる。その際、
宿主系としてコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌が有利で
ある。コリネバクテリウム属の中で、特にコリネバクテリウム グルタミクム種
が、およびブレビバクテリウム属の中で、特にブレビバクテリウム フラブム種
が有利である。これらの属の代表例には一方ではその特性において野生型として
特徴付けられている株が挙げられる。ここではたとえばコリネバクテリウム グ
ルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴ
ＣＣ １４７５２、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５
８０６、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５８０６、コ
リネバクテリウム メラッセコラ ＡＴＣＣ １７９６５、コリネバクテリウム テルモアミノゲネス ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム フラ
ブム ＡＴＣＣ １４０６７、ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム Ａ
ＴＣＣ １３８６９およびブレビバクテリウム ジバリカツム ＡＴＣＣ １４
０２０が挙げられる。
atis、E. F. FritschおよびJ. Sambrook、Molecular Cloning：A Laborato
y Manual、Cold Spring Harbor Laboratury、Cold Spring Harbor、NY（
１９８９年））または無機塩培地、たとえばＣＧＸＩＩ−培地（Keilhauer、C.
等、１９９３年、J. Bacteriol. １７５：第５５９３〜５６０３頁）が適切で
ある。相応する培養の後で細菌懸濁液を回収し、かつさらなる試験、たとえば通
例の方法により形質転換または核酸の単離のために使用することができる。この
実施法は同様にその他のコリネ型の細菌株にも適用することができる。その際、
宿主系としてコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属の細菌が有利で
ある。コリネバクテリウム属の中で、特にコリネバクテリウム グルタミクム種
が、およびブレビバクテリウム属の中で、特にブレビバクテリウム フラブム種
が有利である。これらの属の代表例には一方ではその特性において野生型として
特徴付けられている株が挙げられる。ここではたとえばコリネバクテリウム グ
ルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２、コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴ
ＣＣ １４７５２、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５
８０６、コリネバクテリウム アセトグルタミクム ＡＴＣＣ １５８０６、コ
リネバクテリウム メラッセコラ ＡＴＣＣ １７９６５、コリネバクテリウム テルモアミノゲネス ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９、ブレビバクテリウム フラ
ブム ＡＴＣＣ １４０６７、ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム Ａ
ＴＣＣ １３８６９およびブレビバクテリウム ジバリカツム ＡＴＣＣ １４
０２０が挙げられる。
【００４２】
さらに本発明は、Ｌ−セリンを産生する突然変異体または産生株として優れて
いる細菌株も含む。これらはたとえば野生型の株から出発して古典的（化学的ま
たは物理的）または遺伝子工学的な方法により製造することができる。本発明に
より適切な株の例は特にコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ ２１５
８６、コリネバクテリウム グルタミクム ＫＹ １０１５０およびブレビバク
テリウム ケトグルタミクム ＡＴＣＣ ２１２２２である。微生物の選択され
た実施例により本発明を詳細に特徴付けるが、しかしこれによって限定されるも
のではない。
いる細菌株も含む。これらはたとえば野生型の株から出発して古典的（化学的ま
たは物理的）または遺伝子工学的な方法により製造することができる。本発明に
より適切な株の例は特にコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ ２１５
８６、コリネバクテリウム グルタミクム ＫＹ １０１５０およびブレビバク
テリウム ケトグルタミクム ＡＴＣＣ ２１２２２である。微生物の選択され
た実施例により本発明を詳細に特徴付けるが、しかしこれによって限定されるも
のではない。
【００４３】
本発明によれば、Ｌ−セリン産生株として優れている前記の細菌株以外に、細
胞から培地への所望の物質代謝産物、有利にはＬ−アミノ酸の改善された分泌を
有する産生株もまた含まれている。これらの改善された分泌はたとえば、膜輸送
蛋白質、たとえばエキスポートキャリア−蛋白質、特に特異的なＬ−アミノ酸−
エキスポートキャリア−蛋白質をコードする１種以上の遺伝子の過剰発現により
達成することができる。
胞から培地への所望の物質代謝産物、有利にはＬ−アミノ酸の改善された分泌を
有する産生株もまた含まれている。これらの改善された分泌はたとえば、膜輸送
蛋白質、たとえばエキスポートキャリア−蛋白質、特に特異的なＬ−アミノ酸−
エキスポートキャリア−蛋白質をコードする１種以上の遺伝子の過剰発現により
達成することができる。
【００４４】
本発明の特別な実施態様では、Ｌ−セリン産生のために使用される細菌株は、
遺伝子的に改変された微生物であることによって優れており、これは複製可能な
形で、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５または７によるホスホセリン−ホスファ
ターゼ（ｓｅｒＢ）をコードする核酸および／またはホスホセリン−アミノトラ
ンスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）をコードする核酸およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９ま
たは１１によるＬ−トレオニンエキスポートキャリア（ｔｈｒＥ）をコードする
核酸を有しており、これらは相応する、遺伝子的に改変されていない微生物と比
較して、発現が強まっているおよび／またはその複製数が向上している。
遺伝子的に改変された微生物であることによって優れており、これは複製可能な
形で、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５または７によるホスホセリン−ホスファ
ターゼ（ｓｅｒＢ）をコードする核酸および／またはホスホセリン−アミノトラ
ンスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）をコードする核酸およびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９ま
たは１１によるＬ−トレオニンエキスポートキャリア（ｔｈｒＥ）をコードする
核酸を有しており、これらは相応する、遺伝子的に改変されていない微生物と比
較して、発現が強まっているおよび／またはその複製数が向上している。
【００４５】
同様に本発明によれば、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２、４、６または８による遺伝
子ｓｅｒＢおよび／またはｓｅｒＣによりコードされるポリペプチドを含有する
遺伝子的に改変された微生物が含まれ、これらは遺伝子的に改変されていない相
応する微生物と比較して高められた活性および／または寿命および／またはより
わずかな最終産物の阻害を有する。従って同様に、少なくとも１つの高められた
Ｌ−セリン産生率および付加的に１つの高められたＬ−セリン−および／または
Ｌ−トレオニン−分泌率を有する、遺伝子的に改変された微生物は本発明の対象
である。
子ｓｅｒＢおよび／またはｓｅｒＣによりコードされるポリペプチドを含有する
遺伝子的に改変された微生物が含まれ、これらは遺伝子的に改変されていない相
応する微生物と比較して高められた活性および／または寿命および／またはより
わずかな最終産物の阻害を有する。従って同様に、少なくとも１つの高められた
Ｌ−セリン産生率および付加的に１つの高められたＬ−セリン−および／または
Ｌ−トレオニン−分泌率を有する、遺伝子的に改変された微生物は本発明の対象
である。
【００４６】
同様に本発明は、複製可能な形で、前記の種類の遺伝子構造またはベクターを
有する、遺伝子的に改変された微生物を含む。本発明により遺伝子的に改変され
た微生物はさらに、コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グルタミクム種またはブ
レビバクテリウム フラブム種であることにより優れている。
有する、遺伝子的に改変された微生物を含む。本発明により遺伝子的に改変され
た微生物はさらに、コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グルタミクム種またはブ
レビバクテリウム フラブム種であることにより優れている。
【００４７】
原則として遺伝子は自体公知の方法、たとえば短い合成ヌクレオチド配列（プ
ライマー）を用いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、かつ引き続き
単離することができる。使用されるプライマーの製造は一般に、公知の遺伝子配
列を用いて遺伝子の保存された領域内の既存の相同性に基づいて、および／また
は試験すべき微生物のＤＮＡのＧＣ含有率を考慮して行う。しかしこの方法は、
たとえばＰＣＲ法自体の欠点に基づいて存在する、または同定すべき遺伝子配列
がすでに公知の配列に対して、予測されるよりも少ない相同性を有するという、
一連の欠点を有する。このことは、試験すべき核酸配列において、使用されるプ
ライマーが非特異的にハイブリダイズするか、もしくはハイブリダイズしないと
いうことにつながる可能性がある。
ライマー）を用いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、かつ引き続き
単離することができる。使用されるプライマーの製造は一般に、公知の遺伝子配
列を用いて遺伝子の保存された領域内の既存の相同性に基づいて、および／また
は試験すべき微生物のＤＮＡのＧＣ含有率を考慮して行う。しかしこの方法は、
たとえばＰＣＲ法自体の欠点に基づいて存在する、または同定すべき遺伝子配列
がすでに公知の配列に対して、予測されるよりも少ない相同性を有するという、
一連の欠点を有する。このことは、試験すべき核酸配列において、使用されるプ
ライマーが非特異的にハイブリダイズするか、もしくはハイブリダイズしないと
いうことにつながる可能性がある。
【００４８】
コードヌクレオチド配列を単離するためのもう１つの実施法は、少なくとも表
現型で試験すべき遺伝子または相応する蛋白質の活性における機能損失を有する
試験すべき生物の、いわゆる欠損−突然変異体の機能相補である。機能相補とは
、突然変異対の遺伝子欠損の除去および突然変異誘発の前の本来の表現型の回復
であると理解すべきであり、これは試験すべき微生物からの機能的な遺伝子また
は遺伝子フラグメントを導入することにより達成される。
現型で試験すべき遺伝子または相応する蛋白質の活性における機能損失を有する
試験すべき生物の、いわゆる欠損−突然変異体の機能相補である。機能相補とは
、突然変異対の遺伝子欠損の除去および突然変異誘発の前の本来の表現型の回復
であると理解すべきであり、これは試験すべき微生物からの機能的な遺伝子また
は遺伝子フラグメントを導入することにより達成される。
【００４９】
欠損突然変異体を製造するための古典的な突然変異誘発の方法は、たとえば化
学薬品、たとえばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いるか
、または紫外線照射による細菌細胞の処理である。突然変異を誘発するためのこ
のような方法は一般に公知であり、かつ特にMiller（A Short Course in Ba
cterial Genetics、A Laboratory Manual and Handbook for Escherichi
a coli and Related Bacteria（Cold Spring Harbor Laboratory Press
、１９９２年）またはAmerican Society for Bacteriologyのハンドブック"M
anual of Methods for General Bacteriology"（Washington D.C.、ＵＳ
Ａ、１９８１年）から読みとることができる。この場合の欠点は、所望の表現型
を有する突然変異体を時間とコストをかけて選択すること、ならびに単離される
突然変異体は遺伝子的に定義されていないという事実である。というのも、突然
変異誘発はランダムに行われるからである。後者はしばしば、たとえば大工業的
な規模での製造法に範囲で、これらの突然変異体の安定性に関して予期せぬ問題
につながる。
学薬品、たとえばＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用いるか
、または紫外線照射による細菌細胞の処理である。突然変異を誘発するためのこ
のような方法は一般に公知であり、かつ特にMiller（A Short Course in Ba
cterial Genetics、A Laboratory Manual and Handbook for Escherichi
a coli and Related Bacteria（Cold Spring Harbor Laboratory Press
、１９９２年）またはAmerican Society for Bacteriologyのハンドブック"M
anual of Methods for General Bacteriology"（Washington D.C.、ＵＳ
Ａ、１９８１年）から読みとることができる。この場合の欠点は、所望の表現型
を有する突然変異体を時間とコストをかけて選択すること、ならびに単離される
突然変異体は遺伝子的に定義されていないという事実である。というのも、突然
変異誘発はランダムに行われるからである。後者はしばしば、たとえば大工業的
な規模での製造法に範囲で、これらの突然変異体の安定性に関して予期せぬ問題
につながる。
【００５０】
本発明のもう１つの課題は、コリネ型の細菌からのコード核酸配列を単離する
ために、前記の欠点をもはや有していない方法を提供することである。本発明に
よる解決方法を以下の記載により詳細に説明する。
ために、前記の欠点をもはや有していない方法を提供することである。本発明に
よる解決方法を以下の記載により詳細に説明する。
【００５１】
本発明は、本発明による核酸を単離するための方法に関し、この場合、トラン
スポゾン−突然変異誘発により生じた遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣにおける欠
損を有するコリネ型の細菌が得られる。
スポゾン−突然変異誘発により生じた遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣにおける欠
損を有するコリネ型の細菌が得られる。
【００５２】
トランスポゾン−突然変異誘発法の場合、ＤＮＡ配列中で「飛ぶ」ことができ
、かつこのことによって該当する遺伝子の機能を妨げる、もしくは止めることが
できるトランスポゾンの特性を利用する。
、かつこのことによって該当する遺伝子の機能を妨げる、もしくは止めることが
できるトランスポゾンの特性を利用する。
【００５３】
コリネ型の細菌のトランスポゾンの例を以下に記載する。たとえばコリネバク
テリウム ゼローシス(xerosis)株Ｍ８２Ｂから、エリスロマイシン耐性のトラ
ンスポゾンＴｎ５４３２（Tauch等、Plasmid（１９９５年）３３：第１６８〜１
７９頁）およびクロラムフェニコール耐性のトランスポゾンＴｎ５５４６が単離
された。Tauch等（Plasmid（１９９５年）３４：第１１９〜１３１頁およびPlas
mid（１９９８年）４０：第１２６〜１３９頁）は、これらのトランスポゾンに
よる突然変異誘発が可能であることを示している。さらにコリネバクテリウム
グルタミクム ＡＴＣＣ ３１８３１から、挿入配列ＩＳ３１８３１が単離され
た（Vertes等、Molecular Microbiology（１９９４年）１１：第７３９〜７４
６頁）。ＩＳ３１８３１とカナマイシン耐性遺伝子ａｐｈＡとの組合せにより、
人工的なトランスポゾンＴｎ３１８３１が構築された（Vertes等、Molecular a
nd General Genetics（１９９４年）２４５：第３９７〜４０５頁）。Vertes
等（Molecular and General Genetics（１９９４年）２４５：３９７〜４０
５頁）およびJaeger等（FEMS Microbiology Letters（１９９５年）１２６：
１〜６頁）は、株ブレビバクテリウム フラブムＭＪ２３３Ｃおよびコリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８におけるこれらのトランスポゾンの
適用を説明している。
テリウム ゼローシス(xerosis)株Ｍ８２Ｂから、エリスロマイシン耐性のトラ
ンスポゾンＴｎ５４３２（Tauch等、Plasmid（１９９５年）３３：第１６８〜１
７９頁）およびクロラムフェニコール耐性のトランスポゾンＴｎ５５４６が単離
された。Tauch等（Plasmid（１９９５年）３４：第１１９〜１３１頁およびPlas
mid（１９９８年）４０：第１２６〜１３９頁）は、これらのトランスポゾンに
よる突然変異誘発が可能であることを示している。さらにコリネバクテリウム
グルタミクム ＡＴＣＣ ３１８３１から、挿入配列ＩＳ３１８３１が単離され
た（Vertes等、Molecular Microbiology（１９９４年）１１：第７３９〜７４
６頁）。ＩＳ３１８３１とカナマイシン耐性遺伝子ａｐｈＡとの組合せにより、
人工的なトランスポゾンＴｎ３１８３１が構築された（Vertes等、Molecular a
nd General Genetics（１９９４年）２４５：第３９７〜４０５頁）。Vertes
等（Molecular and General Genetics（１９９４年）２４５：３９７〜４０
５頁）およびJaeger等（FEMS Microbiology Letters（１９９５年）１２６：
１〜６頁）は、株ブレビバクテリウム フラブムＭＪ２３３Ｃおよびコリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０５８におけるこれらのトランスポゾンの
適用を説明している。
【００５４】
もう１つのトランスポゾンはトランスポゾンＴｎ５５３１であり、これはAnkr
i等（Journal of Bacteriology（１９９６年）１７８：第４４１２〜４４１９
頁）により記載されており、かつ本発明のプロセスで例として使用する。本発明
の特別な実施態様ではこのためにコリネバクテリウム グルタミクム株ＡＴＣＣ
１４７５２に相応する突然変異誘発を行う。あるいはコリネバクテリウム グル
タミクム株ＡＴＣＣ１３０３２もまた適切である。トランスポゾンＴｎ５５３１
は、ａｐｈ３カナマイシン耐性遺伝子を有し、かつプラスミドベクターｐＣＧＬ
００４０（図１）の形で与えることができる。トランスポゾンＴｎ５５３１のヌ
クレオチド配列は、アクセッション番号Ｕ５３５８７でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ、Bethesda、ＭＤ、ＵＳＡ）で自由に
入手することができる。本発明は、前記のトランスポゾンを列挙することにより
詳細に特徴付けられるが、しかしこれによって限定されない。
i等（Journal of Bacteriology（１９９６年）１７８：第４４１２〜４４１９
頁）により記載されており、かつ本発明のプロセスで例として使用する。本発明
の特別な実施態様ではこのためにコリネバクテリウム グルタミクム株ＡＴＣＣ
１４７５２に相応する突然変異誘発を行う。あるいはコリネバクテリウム グル
タミクム株ＡＴＣＣ１３０３２もまた適切である。トランスポゾンＴｎ５５３１
は、ａｐｈ３カナマイシン耐性遺伝子を有し、かつプラスミドベクターｐＣＧＬ
００４０（図１）の形で与えることができる。トランスポゾンＴｎ５５３１のヌ
クレオチド配列は、アクセッション番号Ｕ５３５８７でNational Center for Biotechnology Information（ＮＣＢＩ、Bethesda、ＭＤ、ＵＳＡ）で自由に
入手することができる。本発明は、前記のトランスポゾンを列挙することにより
詳細に特徴付けられるが、しかしこれによって限定されない。
【００５５】
トランスポゾン−突然変異誘発に引き続き、所望の遺伝子において欠損した突
然変異体を選択する。ｓｅｒＢ遺伝子および／またはｓｅｒＣ遺伝子において欠
損した突然変異体は本発明によれば、Ｌ−セリンを用いた最小培地では良好な成
長を示すが、しかしＬ−セリンを含有しない最小培地では成長が劣ることによっ
て認識される。
然変異体を選択する。ｓｅｒＢ遺伝子および／またはｓｅｒＣ遺伝子において欠
損した突然変異体は本発明によれば、Ｌ−セリンを用いた最小培地では良好な成
長を示すが、しかしＬ−セリンを含有しない最小培地では成長が劣ることによっ
て認識される。
【００５６】
コリネ型の細菌株の相応して選択される欠損突然変異体を引き続きｓｅｒＢ遺
伝子およびｓｅｒＣ遺伝子のクローニングおよび配列決定のために使用する。
伝子およびｓｅｒＣ遺伝子のクローニングおよび配列決定のために使用する。
【００５７】
遺伝子のクローニングはたとえば欠損突然変異体の機能相補により行うことが
できる。このために、試験すべきコリネ型の細菌のＤＮＡの遺伝子バンクを作成
する。遺伝子バンクの作成は一般に公知の教科書およびハンドブックに記載され
ている。例としてWinnackerの教科書：Gene und Klone、Eine Einfuehrung
in die Gentechnologie（Verlag Chemie、Weinheim、ドイツ、１９９０年）
またはSambrook等のハンドブック：Molecular Cloning、Ａ Laboratory Manu
al（Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年）が挙げられる。B
athe等（Molecular and General Genetics、２５２：第２５５〜２６５頁、
１９９６年）は、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝
子バンクを記載しており、これはコスミドベクターSuperCos Ｉ（Wahl等、１９
８７年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、８４
：第２１６０〜２１６４頁）を用いてE. coli Ｋ−１２株ＮＭ５５４（Raleig
h等、１９８８年、Nucleic Acids Research １６：第１５６３〜１５７５頁
）を用いて作成したものである。本発明によれば、コリネ型の細菌、有利にはコ
リネバクテリウム グルタミクム中で複製するベクターが適切である。このよう
なベクターは、従来技術から公知である。例としてプラスミドベクターｐＺ１が
挙げられ、これはMenkel等（Applied and Environmental Microbiology（１
９８９年）６４：第５４９〜５５４頁）に記載されている。
できる。このために、試験すべきコリネ型の細菌のＤＮＡの遺伝子バンクを作成
する。遺伝子バンクの作成は一般に公知の教科書およびハンドブックに記載され
ている。例としてWinnackerの教科書：Gene und Klone、Eine Einfuehrung
in die Gentechnologie（Verlag Chemie、Weinheim、ドイツ、１９９０年）
またはSambrook等のハンドブック：Molecular Cloning、Ａ Laboratory Manu
al（Cold Spring Harbor Laboratory Press、１９８９年）が挙げられる。B
athe等（Molecular and General Genetics、２５２：第２５５〜２６５頁、
１９９６年）は、コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝
子バンクを記載しており、これはコスミドベクターSuperCos Ｉ（Wahl等、１９
８７年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA、８４
：第２１６０〜２１６４頁）を用いてE. coli Ｋ−１２株ＮＭ５５４（Raleig
h等、１９８８年、Nucleic Acids Research １６：第１５６３〜１５７５頁
）を用いて作成したものである。本発明によれば、コリネ型の細菌、有利にはコ
リネバクテリウム グルタミクム中で複製するベクターが適切である。このよう
なベクターは、従来技術から公知である。例としてプラスミドベクターｐＺ１が
挙げられ、これはMenkel等（Applied and Environmental Microbiology（１
９８９年）６４：第５４９〜５５４頁）に記載されている。
【００５８】
引き続き遺伝子バンクを形質転換により、本発明によれば有利には電気穿孔に
よってｓｅｒＢ遺伝子またはｓｅｒＣ遺伝子において欠損している前記の細菌株
へ導入する。自体公知の方法により、Ｌ−セリンの不在下に最小培地で成長する
能力を有する、形質転換細菌を選択する。引き続き、これらの選択された形質転
換体から再度単離される、本来使用された遺伝子バンクのＤＮＡフラグメントの
配列分析を行う。
よってｓｅｒＢ遺伝子またはｓｅｒＣ遺伝子において欠損している前記の細菌株
へ導入する。自体公知の方法により、Ｌ−セリンの不在下に最小培地で成長する
能力を有する、形質転換細菌を選択する。引き続き、これらの選択された形質転
換体から再度単離される、本来使用された遺伝子バンクのＤＮＡフラグメントの
配列分析を行う。
【００５９】
本発明の別の実施態様ではトランスポゾンＴｎ５５３１を用いた突然変異誘発
により得られた、コリネ型の細菌の欠損突然変異体、たとえば株ＡＴＣＣ１４７
５２ｓｅｒＢ：：Ｔｎ５５３１およびＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒＣ：：Ｔｎ５５
３１に基づいて、ｓｅｒＢ：：Ｔｎ５５３１−アレルもしくはｓｅｒＣ：：Ｔｎ
５５３１−アレルを直接、トランスポゾン中に含まれているカナマイシン耐性遺
伝子ａｐｈ３を利用してクローニングし、かつ単離することができる。このため
に公知のクローニングベクター、たとえばｐＵＣ１８（Norrander等、Gene（１
９８３年）２６：第１０１〜１０６頁およびYanisch-Perron等、Gene（１９８５
年）３３：第１０３〜１１９頁）またはｐＧＥＭ−Ｔ（Zhou M-Y、Clark SEお
よびGomez-Sanchez CE（１９９５年）Bio Techniques １９：３４；Kobs G
（１９９５年）Promega Notes ５５：第２８頁；Promega Cooperation、Madi
son、ＵＳＡ）を使用する。クローニングのための宿主系として特に制限−およ
び組み換え欠損の大腸菌株が適切である。このための１例は株ＤＨ５αｍｃｒで
あり、これはGrant等（Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA、８７（１９９０年）、第４６４５〜４６４９頁）により記載されてい
る。形質転換体の選択はカナマイシンの存在下に行う。
により得られた、コリネ型の細菌の欠損突然変異体、たとえば株ＡＴＣＣ１４７
５２ｓｅｒＢ：：Ｔｎ５５３１およびＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒＣ：：Ｔｎ５５
３１に基づいて、ｓｅｒＢ：：Ｔｎ５５３１−アレルもしくはｓｅｒＣ：：Ｔｎ
５５３１−アレルを直接、トランスポゾン中に含まれているカナマイシン耐性遺
伝子ａｐｈ３を利用してクローニングし、かつ単離することができる。このため
に公知のクローニングベクター、たとえばｐＵＣ１８（Norrander等、Gene（１
９８３年）２６：第１０１〜１０６頁およびYanisch-Perron等、Gene（１９８５
年）３３：第１０３〜１１９頁）またはｐＧＥＭ−Ｔ（Zhou M-Y、Clark SEお
よびGomez-Sanchez CE（１９９５年）Bio Techniques １９：３４；Kobs G
（１９９５年）Promega Notes ５５：第２８頁；Promega Cooperation、Madi
son、ＵＳＡ）を使用する。クローニングのための宿主系として特に制限−およ
び組み換え欠損の大腸菌株が適切である。このための１例は株ＤＨ５αｍｃｒで
あり、これはGrant等（Proceedings of the National Academy of Scienc
es USA、８７（１９９０年）、第４６４５〜４６４９頁）により記載されてい
る。形質転換体の選択はカナマイシンの存在下に行う。
【００６０】
得られる形質転換体から単離され、関心の対象である遺伝子を有するＤＮＡを
引き続き配列決定する。このためにSanger等（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA（１９
７７年）７４：第５４６３〜５４６７頁）により記載されているジデオキシ−連
鎖中断法を使用することができる。その後、Ｔｎ５５３１−挿入部位の上流およ
び下流に含有されている遺伝子が得られる。次いで、得られたヌクレオチド配列
を市販の配列分析プログラム、たとえばプログラムパッケージLasergene（Bioco
mputing Software for Windows（登録商標）、DNASTAR、Madison、USA）また
はプログラムパッケージHUSAR（Release ４．０、EMBL、ハイデルベルク、ドイ
ツ）を用いて分析し、かつ組み合わせる。前記の方法で本発明による、コリネ型
の細菌のｓｅｒＢ遺伝子およびｓｅｒＣ遺伝子の核酸を単離し、かつその配列を
決定することができる。
引き続き配列決定する。このためにSanger等（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA（１９
７７年）７４：第５４６３〜５４６７頁）により記載されているジデオキシ−連
鎖中断法を使用することができる。その後、Ｔｎ５５３１−挿入部位の上流およ
び下流に含有されている遺伝子が得られる。次いで、得られたヌクレオチド配列
を市販の配列分析プログラム、たとえばプログラムパッケージLasergene（Bioco
mputing Software for Windows（登録商標）、DNASTAR、Madison、USA）また
はプログラムパッケージHUSAR（Release ４．０、EMBL、ハイデルベルク、ドイ
ツ）を用いて分析し、かつ組み合わせる。前記の方法で本発明による、コリネ型
の細菌のｓｅｒＢ遺伝子およびｓｅｒＣ遺伝子の核酸を単離し、かつその配列を
決定することができる。
【００６１】
意外なことに公知の配列との相同性を比較することにより、ｓｅｒＢによりコ
ードされるポリペプチドは、大腸菌からのホスホセリン−ホスファターゼに対し
て適度な類似性を有しており、その一方でｓｅｒＣから誘導されるポリペプチド
は、大腸菌のホスホセリン−アミノトランスフェラーゼに対する著しい類似性を
有している場合でもごくわずかな類似性を有しているにすぎないことが明らかに
なった。その他の生物（たとえば酵母）からの公知のホスホセリン−ホスファタ
ーゼもしくはホスホセリン−アミノトランスフェラーゼに対して、判明したコリ
ネバクテリウムの遺伝子はごくわずかな類似性から相当の類似性を有している。
おそらくマイコバクテリウム ツベルクローシスからのｓｅｒＢ遺伝子およびｓ
ｅｒＣ遺伝子の誘導されたポリペプチド配列のみが、コリネバクテリウムの蛋白
質に対する高い類似性を示す。このような相同性の比較の結果を第２表に記載す
る。さらにコリネ型の遺伝子のヌクレオチド配列から、ＥＰ０９３１８３３で使
用されているＰＣＲ−プライマーがたしかに大腸菌からの遺伝子の増幅のために
適切であるが、しかし前記のわずかな配列の類似性に基づいてコリネ型のｓｅｒ
Ｂ遺伝子およびｓｅｒＣ遺伝子の単離のためには不適切であることが明らかにな
る。
ードされるポリペプチドは、大腸菌からのホスホセリン−ホスファターゼに対し
て適度な類似性を有しており、その一方でｓｅｒＣから誘導されるポリペプチド
は、大腸菌のホスホセリン−アミノトランスフェラーゼに対する著しい類似性を
有している場合でもごくわずかな類似性を有しているにすぎないことが明らかに
なった。その他の生物（たとえば酵母）からの公知のホスホセリン−ホスファタ
ーゼもしくはホスホセリン−アミノトランスフェラーゼに対して、判明したコリ
ネバクテリウムの遺伝子はごくわずかな類似性から相当の類似性を有している。
おそらくマイコバクテリウム ツベルクローシスからのｓｅｒＢ遺伝子およびｓ
ｅｒＣ遺伝子の誘導されたポリペプチド配列のみが、コリネバクテリウムの蛋白
質に対する高い類似性を示す。このような相同性の比較の結果を第２表に記載す
る。さらにコリネ型の遺伝子のヌクレオチド配列から、ＥＰ０９３１８３３で使
用されているＰＣＲ−プライマーがたしかに大腸菌からの遺伝子の増幅のために
適切であるが、しかし前記のわずかな配列の類似性に基づいてコリネ型のｓｅｒ
Ｂ遺伝子およびｓｅｒＣ遺伝子の単離のためには不適切であることが明らかにな
る。
【００６２】
このことはむしろ、コリネ型の細菌からの遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣのク
ローニングのためのトランスポゾン−突然変異誘発の、本発明による方法の利点
を明らかにしている。
ローニングのためのトランスポゾン−突然変異誘発の、本発明による方法の利点
を明らかにしている。
【００６３】
本発明はさらに、Ｌ−セリンを微生物により製造するための方法に関し、この
場合、コリネ型の細菌から単離された本発明による核酸の少なくとも１つを同種
の微生物に移送し、かつここで発現させ、その際、遺伝子発現および／または相
応してコードされたポリペプチドの活性は、遺伝子的に改変されていない相応す
る微生物に対して高められており、この遺伝子的に改変された微生物を、発酵に
よりＬ−セリンを製造するために使用し、かつ相応して形成されたＬ−セリンを
培地から単離する。
場合、コリネ型の細菌から単離された本発明による核酸の少なくとも１つを同種
の微生物に移送し、かつここで発現させ、その際、遺伝子発現および／または相
応してコードされたポリペプチドの活性は、遺伝子的に改変されていない相応す
る微生物に対して高められており、この遺伝子的に改変された微生物を、発酵に
よりＬ−セリンを製造するために使用し、かつ相応して形成されたＬ−セリンを
培地から単離する。
【００６４】
本発明のもう１つの変法は、Ｌ−セリンを微生物により製造するための改善さ
れた方法を含み、この場合、 ａ）コリネ型の細菌から単離された、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５および
／または７によるホスホセリン−ホスファターゼ（ｓｅｒＢ）および／またはホ
スホセリン−アミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）をコードする核酸少なくと
も１つ、および／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１による核酸を同種の
微生物に移送し、かつここで発現させ、その際、核酸の発現および／または寿命
、および／または相応してコードされたポリペプチドの活性および／または寿命
は、遺伝子的に改変されていない相応する微生物に対して高められており、 ｂ）工程ａ）からのこの遺伝子的に改変された微生物を、Ｌ−セリンを発酵に
より製造するために使用し、その際、Ｌ−セリンの培地への分泌は増大し、かつ ｃ）相応して形成されたＬ−セリンを培地から単離する。
れた方法を含み、この場合、 ａ）コリネ型の細菌から単離された、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５および
／または７によるホスホセリン−ホスファターゼ（ｓｅｒＢ）および／またはホ
スホセリン−アミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）をコードする核酸少なくと
も１つ、および／またはＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１による核酸を同種の
微生物に移送し、かつここで発現させ、その際、核酸の発現および／または寿命
、および／または相応してコードされたポリペプチドの活性および／または寿命
は、遺伝子的に改変されていない相応する微生物に対して高められており、 ｂ）工程ａ）からのこの遺伝子的に改変された微生物を、Ｌ−セリンを発酵に
より製造するために使用し、その際、Ｌ−セリンの培地への分泌は増大し、かつ ｃ）相応して形成されたＬ−セリンを培地から単離する。
【００６５】
遺伝子工学的に製造された生物中の高められた遺伝子発現（過剰発現）を達成
するために、相応する遺伝子の複製数を増大させることができる。さらに構造遺
伝子の上流に存在するプロモータ−および／または調節領域および／またはリボ
ソーム結合部位は、相応して、発現が高められた速度で行われるように変えられ
ていてもよい。構造遺伝子の上流に組み込まれている発現カセットは同様に作用
する。誘導可能なプロモーターによりさらに、発酵によるＬ−セリンの産生の過
程での発現を向上することが可能である。ｍＲＮＡの寿命を延長するための措置
により同様に発現が改善される。遺伝子または遺伝子構築は、異なった複製数で
プラスミド中に存在するか、またはクロモゾーム中に組み込みされ、かつ増幅さ
れていてもよい。さらに酵素の活性自体が高められていてもよいし、または酵素
蛋白質の分解を阻止することにより増強されていてもよい。あるいはさらに該当
する遺伝子の過剰発現を、培地の組成および培養の実施を変更することによって
行ってもよい。
するために、相応する遺伝子の複製数を増大させることができる。さらに構造遺
伝子の上流に存在するプロモータ−および／または調節領域および／またはリボ
ソーム結合部位は、相応して、発現が高められた速度で行われるように変えられ
ていてもよい。構造遺伝子の上流に組み込まれている発現カセットは同様に作用
する。誘導可能なプロモーターによりさらに、発酵によるＬ−セリンの産生の過
程での発現を向上することが可能である。ｍＲＮＡの寿命を延長するための措置
により同様に発現が改善される。遺伝子または遺伝子構築は、異なった複製数で
プラスミド中に存在するか、またはクロモゾーム中に組み込みされ、かつ増幅さ
れていてもよい。さらに酵素の活性自体が高められていてもよいし、または酵素
蛋白質の分解を阻止することにより増強されていてもよい。あるいはさらに該当
する遺伝子の過剰発現を、培地の組成および培養の実施を変更することによって
行ってもよい。
【００６６】
このための手引きは特に、Martin等（Bio/Technology ５、第１３７〜１４６
頁（１９８７年））、Guerrero等（Gene １３８、第３５〜４１頁（１９９４年
））、TsuchiyaおよびMorinaga（Bio/Technology ６、第４２８〜４３０頁（１
９８８年））、Eikmanns等（Gene １０２、第９３〜９８頁（１９９１年））、
欧州特許文献ＥＰ０４７２８６９、ＵＳ特許４，６０１，８９３、Schwarzerお
よびPuehler（Bio/Technology ９、第８４〜８７頁（１９９１年））、Reinsch
eid等（Applied and Environmental Microbiology ６０、第１２６〜１３２
頁（１９９４年））、LaBarre等（Journal of Bacteriology １７５、第１０
０１〜１００７頁（１９９３年）、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、Malumbres
等（Gene １３４、第１５〜２４頁（１９９３年））、日本の公開公報ＪＰ−Ａ
−１０−２２９８９１、JensenおよびHammer（Biotechnology and Bioenginee
ring ５８、第１９１〜１９５頁（１９９８年））、Makrides(Microbiological Reviews ６０：第５１２〜５３８頁（１９９６年））および遺伝子工学およ
び分子生物学の公知の教科書に見ることができる。
頁（１９８７年））、Guerrero等（Gene １３８、第３５〜４１頁（１９９４年
））、TsuchiyaおよびMorinaga（Bio/Technology ６、第４２８〜４３０頁（１
９８８年））、Eikmanns等（Gene １０２、第９３〜９８頁（１９９１年））、
欧州特許文献ＥＰ０４７２８６９、ＵＳ特許４，６０１，８９３、Schwarzerお
よびPuehler（Bio/Technology ９、第８４〜８７頁（１９９１年））、Reinsch
eid等（Applied and Environmental Microbiology ６０、第１２６〜１３２
頁（１９９４年））、LaBarre等（Journal of Bacteriology １７５、第１０
０１〜１００７頁（１９９３年）、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、Malumbres
等（Gene １３４、第１５〜２４頁（１９９３年））、日本の公開公報ＪＰ−Ａ
−１０−２２９８９１、JensenおよびHammer（Biotechnology and Bioenginee
ring ５８、第１９１〜１９５頁（１９９８年））、Makrides(Microbiological Reviews ６０：第５１２〜５３８頁（１９９６年））および遺伝子工学およ
び分子生物学の公知の教科書に見ることができる。
【００６７】
本発明により製造される遺伝子的に改変された微生物は、連続的もしくは不連
続的にバッチ法（バッチ培養）または供給バッチ法または反復される供給バッチ
法で、Ｌ−セリンの産生のために培養することができる。公知の培養法に関する
要約は、Chmielによる教科書（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik（Gustav Fischer Verlag、１９９１年））またはSto
rhasによる教科書（Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen（Vieweg V
erlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））に記載されている。
続的にバッチ法（バッチ培養）または供給バッチ法または反復される供給バッチ
法で、Ｌ−セリンの産生のために培養することができる。公知の培養法に関する
要約は、Chmielによる教科書（Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik（Gustav Fischer Verlag、１９９１年））またはSto
rhasによる教科書（Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen（Vieweg V
erlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））に記載されている。
【００６８】
使用すべき培地は適切な方法でそれぞれの株の要求を満足しなくてはならない
。種々の微生物の培地の記載は、American Society for Bacteriologyのハン
ドブック"Manual of Methods for General Bacteriology"（Washington D
.C.、ＵＳＡ、１９８１年）に記載されている。炭素源として糖および炭水化物
、たとえばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース
、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、たとえば大豆油、ヒマワリ油、ピー
ナッツ油およびココナッツ油、脂肪酸、たとえばパルミチン酸、ステアリン酸お
よびリノール酸、アルコール、たとえばグリセリンおよびエタノールおよび有機
酸、たとえば酢酸を使用することができる。これらの物質は単独で、または混合
物として使用することができる。窒素源として有機窒素を含有する化合物、たと
えばペプトン、イーストエキストラクト、肉エキストラクト、モルトエキストラ
クト、コーンスティープリカー、ダイズ粉末および尿素または無機化合物、たと
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウムおよび硝酸アンモニウムを使用することができる。窒素源は単独で、または
混合物として使用することができる。リン源としてリン酸、リン酸二水素カリウ
ムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有の塩を使用するこ
とができる。培地はさらに、成長のために必要な金属の塩、たとえば硫酸マグネ
シウムまたは硫酸鉄を含有していなくてはならない。最後に、本質的な成長物質
、たとえばアミノ酸およびビタミンを上記の物質に加えて使用することができる
。培地にはさらに適切な前駆物質を添加することができる。前記の使用物質は培
養のために単回のバッチの形で添加するか、または適切な方法で培養の間に供給
することができる。
。種々の微生物の培地の記載は、American Society for Bacteriologyのハン
ドブック"Manual of Methods for General Bacteriology"（Washington D
.C.、ＵＳＡ、１９８１年）に記載されている。炭素源として糖および炭水化物
、たとえばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース
、糖蜜、デンプンおよびセルロース、油脂、たとえば大豆油、ヒマワリ油、ピー
ナッツ油およびココナッツ油、脂肪酸、たとえばパルミチン酸、ステアリン酸お
よびリノール酸、アルコール、たとえばグリセリンおよびエタノールおよび有機
酸、たとえば酢酸を使用することができる。これらの物質は単独で、または混合
物として使用することができる。窒素源として有機窒素を含有する化合物、たと
えばペプトン、イーストエキストラクト、肉エキストラクト、モルトエキストラ
クト、コーンスティープリカー、ダイズ粉末および尿素または無機化合物、たと
えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウムおよび硝酸アンモニウムを使用することができる。窒素源は単独で、または
混合物として使用することができる。リン源としてリン酸、リン酸二水素カリウ
ムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有の塩を使用するこ
とができる。培地はさらに、成長のために必要な金属の塩、たとえば硫酸マグネ
シウムまたは硫酸鉄を含有していなくてはならない。最後に、本質的な成長物質
、たとえばアミノ酸およびビタミンを上記の物質に加えて使用することができる
。培地にはさらに適切な前駆物質を添加することができる。前記の使用物質は培
養のために単回のバッチの形で添加するか、または適切な方法で培養の間に供給
することができる。
【００６９】
培養のｐＨ値調節のために、塩基性化合物、たとえば水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、たとえばリン
酸または硫酸を適切な方法で使用する。起泡を制御するために、消泡剤、たとえ
ば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性
を維持するために、選択的に作用する適切な物質、たとえば抗生物質を培地に添
加することができる。好気性条件を維持するために酸素または酸素含有気体混合
物、たとえば空気を培養に導入する。培養の温度は通常、２０℃〜４５℃であり
、有利には２５℃〜４０℃である。培養はＬ−セリンが最大値まで形成されるま
で継続する。この目標値は通常、１０時間〜１６０時間のうちに達成される。
化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水または酸性化合物、たとえばリン
酸または硫酸を適切な方法で使用する。起泡を制御するために、消泡剤、たとえ
ば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性
を維持するために、選択的に作用する適切な物質、たとえば抗生物質を培地に添
加することができる。好気性条件を維持するために酸素または酸素含有気体混合
物、たとえば空気を培養に導入する。培養の温度は通常、２０℃〜４５℃であり
、有利には２５℃〜４０℃である。培養はＬ−セリンが最大値まで形成されるま
で継続する。この目標値は通常、１０時間〜１６０時間のうちに達成される。
【００７０】
Ｌ−セリン−形成の分析は、Spackman等（Analytical Chemistry、 ３０、
（１９５８年）、第１１９０頁）により記載されているように、アニオン交換ク
ロマトグラフィー、引き続きニンヒドリン誘導化により行うか、またはLindroth
等（Analytical Chemistry（１９７９年）５１：第１１６７〜１１７４頁）に
より記載されているように逆相ＨＰＬＣにより行うことができる。
（１９５８年）、第１１９０頁）により記載されているように、アニオン交換ク
ロマトグラフィー、引き続きニンヒドリン誘導化により行うか、またはLindroth
等（Analytical Chemistry（１９７９年）５１：第１１６７〜１１７４頁）に
より記載されているように逆相ＨＰＬＣにより行うことができる。
【００７１】
本発明の対象である微生物は、Ｌ−セリンをグルコース、サッカロース、ラク
トース、マンノース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロース
から、またはグリセリンおよびエタノールから製造することができる。該微生物
前記の詳細に記載した代表例であるコリネ型の細菌であってもよい。
トース、マンノース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロース
から、またはグリセリンおよびエタノールから製造することができる。該微生物
前記の詳細に記載した代表例であるコリネ型の細菌であってもよい。
【００７２】
発酵の結果における選択は第３表に記載されている。この場合、本発明により
遺伝子的に改変された微生物は、形質転換されていない相応する微生物（野生型
）または遺伝子のインサートを有していないベクターのみを含有する微生物に対
して実質的に改善されたＬ−セリン産生により優れている。
遺伝子的に改変された微生物は、形質転換されていない相応する微生物（野生型
）または遺伝子のインサートを有していないベクターのみを含有する微生物に対
して実質的に改善されたＬ−セリン産生により優れている。
【００７３】
本発明の特別な実施態様では、Ｃ．グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（１３０
３２（ｐＶＷＥ×１ｓｅｒＢ））における同種のｓｅｒＢ遺伝子の過剰発現は、
コントロール株と比較して培地中でＬ−セリンの蓄積が少なくとも４倍上昇する
ことにつながることが示されている。同種のｓｅｒＣ遺伝子（１３０３２（ｐＶ
ＷＥｘ２ｓｅｒＣ））の過剰発現によりＬ−セリンの蓄積が少なくとも２０倍向
上することができる。両方の遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣが１つの同種系中で
一緒に過剰発現することによりＬ−セリン−産生のさらなる向上が期待される。
３２（ｐＶＷＥ×１ｓｅｒＢ））における同種のｓｅｒＢ遺伝子の過剰発現は、
コントロール株と比較して培地中でＬ−セリンの蓄積が少なくとも４倍上昇する
ことにつながることが示されている。同種のｓｅｒＣ遺伝子（１３０３２（ｐＶ
ＷＥｘ２ｓｅｒＣ））の過剰発現によりＬ−セリンの蓄積が少なくとも２０倍向
上することができる。両方の遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣが１つの同種系中で
一緒に過剰発現することによりＬ−セリン−産生のさらなる向上が期待される。
【００７４】
ここで特に、Ｌ−セリンの蓄積の向上はすでに野生型コリネバクテリウム グ
ルタミクムＡＴＣＣ１３０３２により達成されていることに注目すべきである。
従って同種のアミノ酸−産生株を本発明により使用することによりＬ−セリンの
産生をさらに向上することができる。
ルタミクムＡＴＣＣ１３０３２により達成されていることに注目すべきである。
従って同種のアミノ酸−産生株を本発明により使用することによりＬ−セリンの
産生をさらに向上することができる。
【００７５】
アミノ酸産生株とは、本発明の範囲ではコリネバクテリウム グルタミクム株
または同種の微生物と理解するものであり、これらは古典的および／または分子
遺伝学的な方法により、その物質代謝流がアミノ酸もしくはその誘導体の生合成
の方向へ向かうよう改変されている（metabolic engineering）。たとえばこれ
らのアミノ酸産生株の場合、１つ以上の遺伝子および／または対応する酵素であ
り、これは物質代謝経路の決定的な、および相応する複雑に調節される重要な位
置（瓶形(bottle neck)）において改変されているか、または調節解除されてい
る。この場合、本発明はすでに公知のアミノ酸産生株、有利にはコリネバクテリ
ウム属または同種の生物を含む。さらに本発明によれば、当業者がその他の微生
物、たとえば腸内細菌、バチルスまたはイースト種から通例の方法により製造す
ることができる産生株が含まれる。
または同種の微生物と理解するものであり、これらは古典的および／または分子
遺伝学的な方法により、その物質代謝流がアミノ酸もしくはその誘導体の生合成
の方向へ向かうよう改変されている（metabolic engineering）。たとえばこれ
らのアミノ酸産生株の場合、１つ以上の遺伝子および／または対応する酵素であ
り、これは物質代謝経路の決定的な、および相応する複雑に調節される重要な位
置（瓶形(bottle neck)）において改変されているか、または調節解除されてい
る。この場合、本発明はすでに公知のアミノ酸産生株、有利にはコリネバクテリ
ウム属または同種の生物を含む。さらに本発明によれば、当業者がその他の微生
物、たとえば腸内細菌、バチルスまたはイースト種から通例の方法により製造す
ることができる産生株が含まれる。
【００７６】
さらに本発明は、Ｌ−セリンの分解が改変されている、有利には弱くなってい
るアミノ酸産生株もまた含まれている。これはたとえばＬ−セリンにおける適切
な遺伝子工学的改変により分解する酵素または対応する遺伝子により行うことが
できる。
るアミノ酸産生株もまた含まれている。これはたとえばＬ−セリンにおける適切
な遺伝子工学的改変により分解する酵素または対応する遺伝子により行うことが
できる。
【００７７】
最終生成物におけるＬ−セリンの収率のさらなる改善は、本発明によれば、Ｌ
−セリンを細胞から、周囲の培地に分泌することが著しく改善されることによっ
て達成される。このことは本発明によればＬ−トレオニン−エキスポートキャリ
アの増強された発現によって達成され、これにより意外にも、特に形成されるＬ
−セリンが、活性のまま細胞膜を通って輸送される。このことにより培地中のＬ
−セリンの含有率はさらに上昇し、かつ従来公知の生成物に対して、著しく改善
された品質を有する最終生成物につながる。
−セリンを細胞から、周囲の培地に分泌することが著しく改善されることによっ
て達成される。このことは本発明によればＬ−トレオニン−エキスポートキャリ
アの増強された発現によって達成され、これにより意外にも、特に形成されるＬ
−セリンが、活性のまま細胞膜を通って輸送される。このことにより培地中のＬ
−セリンの含有率はさらに上昇し、かつ従来公知の生成物に対して、著しく改善
された品質を有する最終生成物につながる。
【００７８】
本発明によればＬ−セリンの産生に関して有利な特性に加えて細胞から培地へ
のＬ−セリンの分泌の改善された能力を有する細菌株もまた含まれる。この場合
、有利には膜輸送蛋白質、たとえばＬ−アミノ酸に対して特異的なエキスポート
キャリア、特にＬ−トレオニン−エキスポートキャリアの含有率の高い細菌が有
利である。
のＬ−セリンの分泌の改善された能力を有する細菌株もまた含まれる。この場合
、有利には膜輸送蛋白質、たとえばＬ−アミノ酸に対して特異的なエキスポート
キャリア、特にＬ−トレオニン−エキスポートキャリアの含有率の高い細菌が有
利である。
【００７９】
本発明の対象はさらに、冒頭に記載した種類の方法によりＬ−セリンおよび／
またはその後続産物を製造するための前記の種類の遺伝子的に改変された微生物
の使用である。
またはその後続産物を製造するための前記の種類の遺伝子的に改変された微生物
の使用である。
【００８０】
本発明はさらに、食品、飼料および／または医薬工業において、またはヒト医
学において使用するための、前記の方法で製造されたＬ−アミノ酸の使用に関す
る。さらに本発明により製造されたアミノ酸Ｌ−セリンはＬ−グリシン、Ｌ−シ
ステインおよび／またはＬ−トリプトファンおよび／またはこれらから誘導され
る物質代謝産物を合成するための前駆物質として使用する。
学において使用するための、前記の方法で製造されたＬ−アミノ酸の使用に関す
る。さらに本発明により製造されたアミノ酸Ｌ−セリンはＬ−グリシン、Ｌ−シ
ステインおよび／またはＬ−トリプトファンおよび／またはこれらから誘導され
る物質代謝産物を合成するための前駆物質として使用する。
【００８１】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、しかしこれらは限定的なもの
ではない： 一般的な技術： 大腸菌からのプラスミド−ＤＮＡの単離ならびに制限、クレノウおよびアルカ
リ性ホスフェート処理のための全ての技術は、Sambrook等（Molecular cloning
. Ａ laboratory manual（１９８９年）、Cold Spring Harbour Laborato
ry Press）により実施した。大腸菌の形質転換は、その他の記載がない限り、C
hung等（Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America USA（１９８９年）８６： 第２１７２〜２１７
５頁）により実施した。
ではない： 一般的な技術： 大腸菌からのプラスミド−ＤＮＡの単離ならびに制限、クレノウおよびアルカ
リ性ホスフェート処理のための全ての技術は、Sambrook等（Molecular cloning
. Ａ laboratory manual（１９８９年）、Cold Spring Harbour Laborato
ry Press）により実施した。大腸菌の形質転換は、その他の記載がない限り、C
hung等（Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America USA（１９８９年）８６： 第２１７２〜２１７
５頁）により実施した。
【００８２】
コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４７５２のｓｅｒＢ遺伝子 およびｓｅｒＣ遺伝子のクローニングおよび配列決定
１．トランスポゾン突然変異誘発
コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４７５２株をトランスポゾ
ンＴｎ５５３１で突然変異誘発し、その配列はアクセッション番号Ｕ５３５８７
でNational Center for Biotechnology Information（Bethesda、USA）のヌ
クレオチド−データバンクに寄託されている。メチラーゼ−欠損の大腸菌株ＧＭ
２９２９ｐＣＧＬ００４０（Escherichia coli GM2929：Palmer等、Gene（１
９９４年）１４３：第１〜１２頁）から、トランスポゾンＴｎ５５３１を一緒に
含有しているプラスミドｐＣＧＬ００４０を単離した（Ankri等、Journal of
Bacteriology（１９９６年）１７８：第４４１２〜４４１９頁）。コリネバクテ
リウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４７５２株を電気穿孔（Haynes等、FEMS
Microbiology Letters（１９８９年）６１：第３２９〜３３４頁）によりプラ
スミドｐＣＧＬ００４０を用いて形質転換した。トランスポゾンＴｎ５５３１が
ゲノムに組み込みされているクローンを、そのカナマイシン耐性に基づいてカナ
マイシン１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢＨＩＳ−寒天プレート上で同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters（１９８９年）６５：第２９９〜３０４頁
）。この方法で１８００のクローンが得られ、これらをセリル−アラニンの存在
下で遅延される成長に関して試験した。このための全てのクローンをそれぞれ、
２ｍＭのセリル−アラニンを含有するＣＧＸＩＩ−最小培地−寒天プレートと、
含有しないものとの上に移した。培地はKeilhauer等により記載された培地ＣＧ
ＸＩＩ（Journal of Bacteriology（１９９３年）１７５：第５５９３〜５６
０３頁）と同一であったが、しかし付加的にカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよび
寒天１５ｇ／Ｌを含有していた。Keilhauer等により記載された培地の組成は第
１表に記載されている。
ンＴｎ５５３１で突然変異誘発し、その配列はアクセッション番号Ｕ５３５８７
でNational Center for Biotechnology Information（Bethesda、USA）のヌ
クレオチド−データバンクに寄託されている。メチラーゼ−欠損の大腸菌株ＧＭ
２９２９ｐＣＧＬ００４０（Escherichia coli GM2929：Palmer等、Gene（１
９９４年）１４３：第１〜１２頁）から、トランスポゾンＴｎ５５３１を一緒に
含有しているプラスミドｐＣＧＬ００４０を単離した（Ankri等、Journal of
Bacteriology（１９９６年）１７８：第４４１２〜４４１９頁）。コリネバクテ
リウム グルタミクム ＡＴＣＣ １４７５２株を電気穿孔（Haynes等、FEMS
Microbiology Letters（１９８９年）６１：第３２９〜３３４頁）によりプラ
スミドｐＣＧＬ００４０を用いて形質転換した。トランスポゾンＴｎ５５３１が
ゲノムに組み込みされているクローンを、そのカナマイシン耐性に基づいてカナ
マイシン１５μｇ／ｍＬを含有するＬＢＨＩＳ−寒天プレート上で同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters（１９８９年）６５：第２９９〜３０４頁
）。この方法で１８００のクローンが得られ、これらをセリル−アラニンの存在
下で遅延される成長に関して試験した。このための全てのクローンをそれぞれ、
２ｍＭのセリル−アラニンを含有するＣＧＸＩＩ−最小培地−寒天プレートと、
含有しないものとの上に移した。培地はKeilhauer等により記載された培地ＣＧ
ＸＩＩ（Journal of Bacteriology（１９９３年）１７５：第５５９３〜５６
０３頁）と同一であったが、しかし付加的にカナマイシン２５μｇ／ｍＬおよび
寒天１５ｇ／Ｌを含有していた。Keilhauer等により記載された培地の組成は第
１表に記載されている。
【００８３】
寒天プレートを３０℃で培養し、かつ成長を１２時間、１８時間および２４時
間後に検査した。２つのトランスポゾン突然変異体が得られ、これらはセリル−
アラニンの存在下でコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１４７５２出発
株と比較可能に成長したが、しかしセリル−アラニンの不在下では成長を示さな
かった。セリン単独でも突然変異体は成長したので、セリン−物質代謝における
欠損を有しているに違いないセリン−栄養要求性突然変異体であることが明らか
になった。これらの変異体をＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１およ
びＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１と呼んだ。
間後に検査した。２つのトランスポゾン突然変異体が得られ、これらはセリル−
アラニンの存在下でコリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１４７５２出発
株と比較可能に成長したが、しかしセリル−アラニンの不在下では成長を示さな
かった。セリン単独でも突然変異体は成長したので、セリン−物質代謝における
欠損を有しているに違いないセリン−栄養要求性突然変異体であることが明らか
になった。これらの変異体をＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１およ
びＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１と呼んだ。
【００８４】
２．ＡＴＣＣ１４７５２ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１およびＡＴＣＣ１４７５２
ｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１へのＴｎ５５３１の挿入部位のクローニングおよび配
列決定 前記の突然変異体中のトランスポゾンＴｎ５５３１の上流におかれた挿入部位
をクローニングするためにまず、たとえばSchwarzer等（Bio/Technology（１９
９０年）９：第８４〜８７頁）により記載されたこの突然変異株のクロモゾーム
ＤＮＡを単離し、かつそのうち４００ｎｇを制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌに
より切断した。完全な制限バッチは同様に、Roche Diagnostics社（マンハイム
、ドイツ）のＸｂａｌにより直鎖状にしたベクターｐＵＣ１８（Norander等、Ge
ne（１９８３年）２６：第１０１〜１０６頁）でライゲーションした。全ライゲ
ーションバッチで大腸菌ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant等、Proceedings of the N
ational Academy of Sciences of the United States of America US
A（１９９０年）８７：第４６４５〜４６４９頁を電気穿孔により形質転換した
（Dower等、Nucleic Acid Research（１９８８年）１６：第６１２７〜６１４
５頁）。ベクターｐＵＣ１８上にトランスポゾンＴｎ５５３１の挿入部位がクロ
ーニングされて存在していた形質転換体を、そのカルベニシリン耐性およびカナ
マイシン耐性に基づいてカルベニシリン５０μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５
μｇ／ｍＬを含有するＬＢ−寒天プレート上で同定した。その都度、形質転換体
の３つからプラスミドを調製し、かつ制限分析によりクローニングしたインサー
トの大きさを決定した。ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１の場合には約１０ｋｂの大き
さのインサートを有する、もしくはｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１の場合には４．５
ｋｂの大きさのインサートを有するプラスミド上の挿入部位のヌクレオチド配列
を、Sanger等のジデオキシ−連鎖中断法により決定した（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA（１９７７年）７４：第５４６３〜５４６７頁）。このためにその都度、
まず両方のインサートの約６００ｂｐを、次のオリゴヌクレオチド−プライマー
から出発して配列決定した：５′−ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＧＣＴ
ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＧ−３′。次いでプライマーの歩行によりその都度配列延長
を実施し、合計でｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１からなるインサート約１．４ｋｂも
しくはｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１からなるインサート１．２ｋｂを配列決定する
ことができた。プログラムパッケージのLasergene（Biocomputing Software f
or Windows、DNASTAR、Madison、USA）を使用した分析から、両方のケースでト
ランスポゾンがオープンリーディングフレームの開始点に挿入されたことが明ら
かになった。
ｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１へのＴｎ５５３１の挿入部位のクローニングおよび配
列決定 前記の突然変異体中のトランスポゾンＴｎ５５３１の上流におかれた挿入部位
をクローニングするためにまず、たとえばSchwarzer等（Bio/Technology（１９
９０年）９：第８４〜８７頁）により記載されたこの突然変異株のクロモゾーム
ＤＮＡを単離し、かつそのうち４００ｎｇを制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌに
より切断した。完全な制限バッチは同様に、Roche Diagnostics社（マンハイム
、ドイツ）のＸｂａｌにより直鎖状にしたベクターｐＵＣ１８（Norander等、Ge
ne（１９８３年）２６：第１０１〜１０６頁）でライゲーションした。全ライゲ
ーションバッチで大腸菌ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant等、Proceedings of the N
ational Academy of Sciences of the United States of America US
A（１９９０年）８７：第４６４５〜４６４９頁を電気穿孔により形質転換した
（Dower等、Nucleic Acid Research（１９８８年）１６：第６１２７〜６１４
５頁）。ベクターｐＵＣ１８上にトランスポゾンＴｎ５５３１の挿入部位がクロ
ーニングされて存在していた形質転換体を、そのカルベニシリン耐性およびカナ
マイシン耐性に基づいてカルベニシリン５０μｇ／ｍＬおよびカナマイシン２５
μｇ／ｍＬを含有するＬＢ−寒天プレート上で同定した。その都度、形質転換体
の３つからプラスミドを調製し、かつ制限分析によりクローニングしたインサー
トの大きさを決定した。ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１の場合には約１０ｋｂの大き
さのインサートを有する、もしくはｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１の場合には４．５
ｋｂの大きさのインサートを有するプラスミド上の挿入部位のヌクレオチド配列
を、Sanger等のジデオキシ−連鎖中断法により決定した（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA（１９７７年）７４：第５４６３〜５４６７頁）。このためにその都度、
まず両方のインサートの約６００ｂｐを、次のオリゴヌクレオチド−プライマー
から出発して配列決定した：５′−ＣＧＧ ＧＴＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＧＣＴ
ＡＧＣ ＣＣＡ ＧＧ−３′。次いでプライマーの歩行によりその都度配列延長
を実施し、合計でｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１からなるインサート約１．４ｋｂも
しくはｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１からなるインサート１．２ｋｂを配列決定する
ことができた。プログラムパッケージのLasergene（Biocomputing Software f
or Windows、DNASTAR、Madison、USA）を使用した分析から、両方のケースでト
ランスポゾンがオープンリーディングフレームの開始点に挿入されたことが明ら
かになった。
【００８５】
トランスポゾンの下流にある挿入部位を同定するために、突然変異体のクロモ
ゾームＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより切断し、かつＥｃｏＲ
Ｉにより直鎖状にされたベクターｐＵＣ１８をライゲーションした。さらなるク
ローニングを上記のとおり実施した。約６．５ｋｂの大きさのインサートを有す
るｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１から出発するプラスミド上もしくは約５．０ｋｂの
大きさのインサートを有するｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１から出発するプラスミド
上の挿入部位のヌクレオチド配列を、Sanger等のジデオキシ−連鎖中断法（Proc
eedings of the National Academy of Sciences of the United Stat
es of America USA（１９７７年）７４：第５４６３〜５４６７頁）により決
定した。このためにｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１からなるインサートの約４００ｂ
ｐもしくはｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１からなるインサートの約２２０ｂｐを次の
オリゴヌクレオチド−プライマーから出発して配列決定した：５′−ＣＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＧ−３′。
ゾームＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩにより切断し、かつＥｃｏＲ
Ｉにより直鎖状にされたベクターｐＵＣ１８をライゲーションした。さらなるク
ローニングを上記のとおり実施した。約６．５ｋｂの大きさのインサートを有す
るｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１から出発するプラスミド上もしくは約５．０ｋｂの
大きさのインサートを有するｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１から出発するプラスミド
上の挿入部位のヌクレオチド配列を、Sanger等のジデオキシ−連鎖中断法（Proc
eedings of the National Academy of Sciences of the United Stat
es of America USA（１９７７年）７４：第５４６３〜５４６７頁）により決
定した。このためにｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１からなるインサートの約４００ｂ
ｐもしくはｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１からなるインサートの約２２０ｂｐを次の
オリゴヌクレオチド−プライマーから出発して配列決定した：５′−ＣＧＧ Ｔ
ＧＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＧ−３′。
【００８６】
得られるヌクレオチド配列をプログラムパッケージLasergene（Biocomputing
Software for Windows、DNASTAR、Madison、USA）を使用して分析し、かつ
組み立てた。ヌクレオチド配列はＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．１およびＳＥＱ−ＩＤ−
Ｎｏ．３として記載した。分析からその都度、ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１に関し
て１２０９のオープンリーディングラスターの同定が生じ、かつ相応する遺伝子
をｓｅｒＢと呼び、かつｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１に関して長さ１１２８ｂｐが
生じ、かつ相応する遺伝子をｓｅｒＣ遺伝子と呼んだ。ここに属する遺伝子産物
は、アミノ酸４０３および３７６を含み、かつＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．２およびＳ
ＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．４として記載した。
組み立てた。ヌクレオチド配列はＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．１およびＳＥＱ−ＩＤ−
Ｎｏ．３として記載した。分析からその都度、ｓｅｒ１：：Ｔｎ５５３１に関し
て１２０９のオープンリーディングラスターの同定が生じ、かつ相応する遺伝子
をｓｅｒＢと呼び、かつｓｅｒ２：：Ｔｎ５５３１に関して長さ１１２８ｂｐが
生じ、かつ相応する遺伝子をｓｅｒＣ遺伝子と呼んだ。ここに属する遺伝子産物
は、アミノ酸４０３および３７６を含み、かつＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．２およびＳ
ＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．４として記載した。
【００８７】
コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２からのｓｅｒＢ遺 伝子およびｓｅｒＣ遺伝子のクローニングおよび配列決定
遺伝子ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣを大腸菌クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（
Zhou M-Y、Clark SEおよびGomez-Sanchez CE（１９９５年）、Bio Techniqu
es １９：３４；Kobs G（１９９５年）Promega Notes ５５：２８；Promega Cooperation、Madison 、USA）中でクローニングした。クローニングは２段
階で実施した。まずポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりその都度コリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からの遺伝子を、ＳＥＱ−ＩＤ−Ｎ
ｏ．１もしくはＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．３から誘導される次のオリゴヌクレオチド
−プライマーを用いて増幅した。
Zhou M-Y、Clark SEおよびGomez-Sanchez CE（１９９５年）、Bio Techniqu
es １９：３４；Kobs G（１９９５年）Promega Notes ５５：２８；Promega Cooperation、Madison 、USA）中でクローニングした。クローニングは２段
階で実施した。まずポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりその都度コリネバク
テリウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からの遺伝子を、ＳＥＱ−ＩＤ−Ｎ
ｏ．１もしくはＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．３から誘導される次のオリゴヌクレオチド
−プライマーを用いて増幅した。
【００８８】
ｓｅｒＢ−フォワード：
５′−ＧＣＡＧＡＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＡＣ−３′、
ｓｅｒＢ−リバース：
５′−ＣＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＣ−３′、
ｓｅｒＣ−フォワード：
５′−ＣＡＴＣＧＴＴＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＣＧ−３′、
ｓｅｒＣ−リバース：
５′−ＣＧＴＡＣＴＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＡＣＧＧＧ−３′。
【００８９】
ＰＣＲ−反応を、デオキシヌクレオチド−トリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２００μＭの存在下に、それぞれ相応するオリゴヌ
クレオチド１μＭ、コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２
の染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０倍の反応緩衝液１／１０体積および熱安定性Ｔ
ａｑ−／Ｐｗｏ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ−混合物（Roche Diagnostics社のExpa
nd High Fidelity PCR System、マンハイム、ドイツ）２．６ユニットの存
在下に、サーモサイクラー(Thermocycler)（ＰＴＣ−１００、MJ Research、In
c.、Watertown、USA）中で、次の条件下に３０サイクルで実施した：９４℃で６
０秒間、５６℃で９０秒間および７２℃で２分間。
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２００μＭの存在下に、それぞれ相応するオリゴヌ
クレオチド１μＭ、コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２
の染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０倍の反応緩衝液１／１０体積および熱安定性Ｔ
ａｑ−／Ｐｗｏ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ−混合物（Roche Diagnostics社のExpa
nd High Fidelity PCR System、マンハイム、ドイツ）２．６ユニットの存
在下に、サーモサイクラー(Thermocycler)（ＰＴＣ−１００、MJ Research、In
c.、Watertown、USA）中で、次の条件下に３０サイクルで実施した：９４℃で６
０秒間、５６℃で９０秒間および７２℃で２分間。
【００９０】
次いで、増幅され、大きさが約１．７ｋｂのｓｅｒＢ−フラグメントならびに
増幅され、大きさが約１．３ｋｂのｓｅｒＣ−フラグメントをその後、Promega PCR Cloning Kitsを用いて製造元の指示に従ってベクターｐＧＥＭ−Ｔとラ
イゲーションした。両方のライゲーションバッチを用いて大腸菌ＤＨ５αｍｃｒ
株（Grant等、Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America USA（１９９０年）８７：第４６４５〜４
６４９頁）を形質転換した。形質転換はそのアンピシリン耐性に基づいてアンピ
シリン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ−寒天プレート上で同定した。その都度１
０の形質転換体からプラスミドを調製し、かつ制限分析によりインサートとして
の１．ｋｂもしくは１．３ｋｂのＰＣＲ−フラグメントの存在を試験した。こう
して得られた組み換えプラスミドを以下ではｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢおよびｐＧＥ
Ｍ−ＴｓｅｒＣと呼ぶ。
増幅され、大きさが約１．３ｋｂのｓｅｒＣ−フラグメントをその後、Promega PCR Cloning Kitsを用いて製造元の指示に従ってベクターｐＧＥＭ−Ｔとラ
イゲーションした。両方のライゲーションバッチを用いて大腸菌ＤＨ５αｍｃｒ
株（Grant等、Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America USA（１９９０年）８７：第４６４５〜４
６４９頁）を形質転換した。形質転換はそのアンピシリン耐性に基づいてアンピ
シリン５０μｇ／ｍＬを含有するＬＢ−寒天プレート上で同定した。その都度１
０の形質転換体からプラスミドを調製し、かつ制限分析によりインサートとして
の１．ｋｂもしくは１．３ｋｂのＰＣＲ−フラグメントの存在を試験した。こう
して得られた組み換えプラスミドを以下ではｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢおよびｐＧＥ
Ｍ−ＴｓｅｒＣと呼ぶ。
【００９１】
プラスミドｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢｅｘｐもしくはプラスミドｐＧＥＭ−Ｔｓｅ
ｒＣｅｘｐ中の１．７ｋｂもしくは１．３ｋｂＰＣＲ−フラグメントのヌクレオ
チド配列の確認をSanger等（Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America USA（１９７７年）７４：第
５４６３〜５４６７頁）のジデオキシ−連鎖中断法により実施した。このために
ｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢおよびｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＣの完全なインサートを、Roch
e Diagnostics社（マンハイム、ドイツ）の次のプライマーを用いて配列決定し
た： ユニバーサル−プライマー： ５′−ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴ−３′、 リバース−プライマー： ５′−ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ Ｇ−３′、 プラスミドｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢ中のインサートのヌクレオチド配列をＳＥＱ
−ＩＤ−Ｎｏ．５として、プラスミドｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＣ中のインサートをＳ
ＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．７として記載する。得られるヌクレオチド配列をプログラム
パッケージLasergene（Biocomputing Software for Windows、DNASTAR、Madi
son、USA）を使用して分析した。分析によりその都度、長さ１２０９ｂｐおよび
１１２８ｂｐのオープンリーディングラスターの同定が生じた。相応する遺伝子
をｓｅｒＢおよびｓｅｒＣと呼んだ。ここに属する遺伝子産物は、４０３もしく
は３７６のアミノ酸の長さであるポリペプチドをコードし、かつＳＥＱ−ＩＤ−
Ｎｏ．６およびＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．８として記載されている。
ｒＣｅｘｐ中の１．７ｋｂもしくは１．３ｋｂＰＣＲ−フラグメントのヌクレオ
チド配列の確認をSanger等（Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America USA（１９７７年）７４：第
５４６３〜５４６７頁）のジデオキシ−連鎖中断法により実施した。このために
ｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢおよびｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＣの完全なインサートを、Roch
e Diagnostics社（マンハイム、ドイツ）の次のプライマーを用いて配列決定し
た： ユニバーサル−プライマー： ５′−ＧＴＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＧＴ−３′、 リバース−プライマー： ５′−ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＡＴ Ｇ−３′、 プラスミドｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢ中のインサートのヌクレオチド配列をＳＥＱ
−ＩＤ−Ｎｏ．５として、プラスミドｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＣ中のインサートをＳ
ＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．７として記載する。得られるヌクレオチド配列をプログラム
パッケージLasergene（Biocomputing Software for Windows、DNASTAR、Madi
son、USA）を使用して分析した。分析によりその都度、長さ１２０９ｂｐおよび
１１２８ｂｐのオープンリーディングラスターの同定が生じた。相応する遺伝子
をｓｅｒＢおよびｓｅｒＣと呼んだ。ここに属する遺伝子産物は、４０３もしく
は３７６のアミノ酸の長さであるポリペプチドをコードし、かつＳＥＱ−ＩＤ−
Ｎｏ．６およびＳＥＱ−ＩＤ−Ｎｏ．８として記載されている。
【００９２】
ホスホセリン−ホスファターゼｓｅｒＢおよびホスホセリン−アミノトランス フェラーゼｓｅｒＣのための遺伝子の過剰発現
セリン産生に関して、ホスホセリン−ホスファターゼｓｅｒＢおよびホスホセ
リン−アミノトランスフェラーゼｓｅｒＣの遺伝子の過剰発現の作用を試験する
ために、ＩＰＴＧ誘導可能な発現（Molecular Cloning、Ａ laboratory manu
al（１９８９）、Cold Spring Harbour Laboratory Press）を可能にする発
現ベクターｐＶＷＥＸ１（Wendisch, V.、Dissertation Heinrich-Heine Uni
versitaet、デュッセルドルフ、１９９７年：カナマイシン耐性を媒介）および
ｐＶＷＥＸ２（Wendisch, V.、Dissertation Heinrich-Heine Universitaet
、デュッセルドルフ、１９９７年：テトラサイクリン−耐性を媒介）を使用した
。ベクターｐＶＷＥＸ１中へｓｅｒＢ遺伝子を、およびベクターｐＶＷＥＸ２中
へｓｅｒＣ遺伝子をプロモータなしでクローニングした。このために次のプライ
マーを合成した： ｓｅｒＢ−ｅｘｐ−フォワード： ５′−ＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＴＡＡＡＧ−３′、 ｓｅｒＢ−ｅｘｐ−リバース： ５′−ＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＧＣ−３′
、 ｓｅｒＣ−ｅｘｐ−フォワード： ５′−ＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧ−３′、 ｓｅｒＣ−ｅｘｐ−リバース： ５′−ＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＣＧＣ−３′。
リン−アミノトランスフェラーゼｓｅｒＣの遺伝子の過剰発現の作用を試験する
ために、ＩＰＴＧ誘導可能な発現（Molecular Cloning、Ａ laboratory manu
al（１９８９）、Cold Spring Harbour Laboratory Press）を可能にする発
現ベクターｐＶＷＥＸ１（Wendisch, V.、Dissertation Heinrich-Heine Uni
versitaet、デュッセルドルフ、１９９７年：カナマイシン耐性を媒介）および
ｐＶＷＥＸ２（Wendisch, V.、Dissertation Heinrich-Heine Universitaet
、デュッセルドルフ、１９９７年：テトラサイクリン−耐性を媒介）を使用した
。ベクターｐＶＷＥＸ１中へｓｅｒＢ遺伝子を、およびベクターｐＶＷＥＸ２中
へｓｅｒＣ遺伝子をプロモータなしでクローニングした。このために次のプライ
マーを合成した： ｓｅｒＢ−ｅｘｐ−フォワード： ５′−ＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＴＡＡＡＧ−３′、 ｓｅｒＢ−ｅｘｐ−リバース： ５′−ＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＡＴＴＴＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＣＧＣ−３′
、 ｓｅｒＣ−ｅｘｐ−フォワード： ５′−ＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＣＣＧ−３′、 ｓｅｒＣ−ｅｘｐ−リバース： ５′−ＡＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡＡＣＣＧＣ−３′。
【００９３】
ＰＣＲを用いてコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２の
染色体ＤＮＡからのプロモータのないｓｅｒＢ遺伝子を１２２６ｂｐの大きさの
フラグメント（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５塩基３８２〜１５９４）として、および
プロモータのないｓｅｒＣ遺伝子を１１５７ｂｐのフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．７塩基１３２〜１２６１）として増幅した。プライマーは、プライマー
ｓｅｒＢ−ｅｘｐ−フォワードがＸｂａｌ切断部位を、プライマーｓｅｒＢ−ｅ
ｘｐ−リバースがＢａｍＨＩ−切断部位を、プライマーｓｅｒＣ−ｅｘｐ−フォ
ワードがＳｐｈｌ−切断部位を、およびプライマーｓｅｒＣ−ｅｘｐ−リバース
がＸｂａｌ切断部位を媒介するように選択する。単離したＰＣＲ−産物をまず、
上記のとおり、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ中でクローニングし、かつプラスミドｐＧ
ＥＭ−ＴｓｅｒＢ−ｅｘｐおよびｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＣ−ｅｘｐが得られた。引
き続きプロモータのないｓｅｒＢ−遺伝子をＸｂａｌ−ＢａｍＨＩ−制限により
ベクターｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢｅｘｐから切断し、かつ相応してＸｂａｌ−Ｂａ
ｍＨＩにより直鎖状にしたベクターｐＶＷＥＸ１をライゲーションした。プロモ
ータのないｓｅｒＣ−遺伝子をＳｐｅｌ−Ｘｂａｌ−制限によりベクターｐＧＥ
Ｍ−ＴｓｅｒＢｅｘｐから切断し、かつＸｂａｌにより直鎖状にしたベクターｐ
ＶＷＥＸ２中にライゲーションした。得られた構築物ｐＶＷＥＸ１ｓｅｒＢ（図
２）およびｐＶＷＥＸ２ｓｅｒＣ（図３）を制限により試験した。
染色体ＤＮＡからのプロモータのないｓｅｒＢ遺伝子を１２２６ｂｐの大きさの
フラグメント（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５塩基３８２〜１５９４）として、および
プロモータのないｓｅｒＣ遺伝子を１１５７ｂｐのフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．７塩基１３２〜１２６１）として増幅した。プライマーは、プライマー
ｓｅｒＢ−ｅｘｐ−フォワードがＸｂａｌ切断部位を、プライマーｓｅｒＢ−ｅ
ｘｐ−リバースがＢａｍＨＩ−切断部位を、プライマーｓｅｒＣ−ｅｘｐ−フォ
ワードがＳｐｈｌ−切断部位を、およびプライマーｓｅｒＣ−ｅｘｐ−リバース
がＸｂａｌ切断部位を媒介するように選択する。単離したＰＣＲ−産物をまず、
上記のとおり、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ中でクローニングし、かつプラスミドｐＧ
ＥＭ−ＴｓｅｒＢ−ｅｘｐおよびｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＣ−ｅｘｐが得られた。引
き続きプロモータのないｓｅｒＢ−遺伝子をＸｂａｌ−ＢａｍＨＩ−制限により
ベクターｐＧＥＭ−ＴｓｅｒＢｅｘｐから切断し、かつ相応してＸｂａｌ−Ｂａ
ｍＨＩにより直鎖状にしたベクターｐＶＷＥＸ１をライゲーションした。プロモ
ータのないｓｅｒＣ−遺伝子をＳｐｅｌ−Ｘｂａｌ−制限によりベクターｐＧＥ
Ｍ−ＴｓｅｒＢｅｘｐから切断し、かつＸｂａｌにより直鎖状にしたベクターｐ
ＶＷＥＸ２中にライゲーションした。得られた構築物ｐＶＷＥＸ１ｓｅｒＢ（図
２）およびｐＶＷＥＸ２ｓｅｒＣ（図３）を制限により試験した。
【００９４】
ホスホセリン−ホスファターゼｓｅｒＢおよびホスホセリン−アミノトランス フェラーゼｓｅｒＣのための遺伝子の過剰発現によるＬ−セリンの向上した蓄積
プラスミドｐＶＷＥＸ１−ｓｅｒＢおよびｐＶＷＥＸ２−ｓｅｒＣをその都度
、単独で電気穿孔により野生型のコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２株に導入し、Ｃ．グルタミクム１３０３２（ｐＶＷＥＸ１ｓｅｒＢ
）およびＣ．グルタミクム１３０３２（ｐＶＷＥＸ２ｓｅｒＣ）が得られた。ネ
ガティブコントロールとして野生型コリネバクテリウム グルタミクム１３０３
２ならびにインサートのないベクターｐＶＷＥＸ１を有するＣ．グルタミクム株
ＡＴＣＣを培養した。Ｌ−セリンの分泌を引き続き前記の全ての株から測定し、
かつ第３表にまとめて比較した。
、単独で電気穿孔により野生型のコリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ １３０３２株に導入し、Ｃ．グルタミクム１３０３２（ｐＶＷＥＸ１ｓｅｒＢ
）およびＣ．グルタミクム１３０３２（ｐＶＷＥＸ２ｓｅｒＣ）が得られた。ネ
ガティブコントロールとして野生型コリネバクテリウム グルタミクム１３０３
２ならびにインサートのないベクターｐＶＷＥＸ１を有するＣ．グルタミクム株
ＡＴＣＣを培養した。Ｌ−セリンの分泌を引き続き前記の全ての株から測定し、
かつ第３表にまとめて比較した。
【００９５】
このために天然培地（２×ＴＹ；Molecular Cloning、A laboratory manua
l（１９８９年）Cold Spring Harbour Laboratory Press；カナマイシン５
０μｇ／ｌ、テトラサイクリン２５μｇ／ｌもしくはカナマイシン５０μｇ／ｌ
およびテトラサイクリン２５μｇ／ｌ）中の株を育成し、かつ発酵培地ＣＧＸＩ
Ｉ（J Bacteriol（１９９３年）１７５：第５５９５〜５６０３頁）をその都度
、前培養から別々に接種した。培地は付加的に相応する抗生物質ならびにＩＰＴ
Ｇ２００μｇ／ｍｌを含有していた。３０℃で２４時間培養した後、回転振とう
器上、毎分１２０回転で、培地中で蓄積されたＬ−セリン量を測定した。アミノ
酸濃度の測定は、高圧液体クロマトグラフィー（J Chromat（１９８３年）２６
６：第４７１〜４８２頁）により行った。
l（１９８９年）Cold Spring Harbour Laboratory Press；カナマイシン５
０μｇ／ｌ、テトラサイクリン２５μｇ／ｌもしくはカナマイシン５０μｇ／ｌ
およびテトラサイクリン２５μｇ／ｌ）中の株を育成し、かつ発酵培地ＣＧＸＩ
Ｉ（J Bacteriol（１９９３年）１７５：第５５９５〜５６０３頁）をその都度
、前培養から別々に接種した。培地は付加的に相応する抗生物質ならびにＩＰＴ
Ｇ２００μｇ／ｍｌを含有していた。３０℃で２４時間培養した後、回転振とう
器上、毎分１２０回転で、培地中で蓄積されたＬ−セリン量を測定した。アミノ
酸濃度の測定は、高圧液体クロマトグラフィー（J Chromat（１９８３年）２６
６：第４７１〜４８２頁）により行った。
【００９６】
配列プロトコル、図および表の説明
配列プロトコル：
コリネバクテリウム グルタミクムＡＴＣＣ１４７５２およびコリネバクテリ
ウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、７、６、８
、１１および１２に相応）からの遺伝子ｓｅｒＢ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、
ｓｅｒＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）およびｔｈｒＥ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９
）ならびにこれらから誘導されるアミノ酸配列ＳｅｒＢ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）、ＳｅｒＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）およびＴｈｒＥ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１０）を含有する核酸配列の記載。
ウム グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５、７、６、８
、１１および１２に相応）からの遺伝子ｓｅｒＢ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、
ｓｅｒＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）およびｔｈｒＥ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９
）ならびにこれらから誘導されるアミノ酸配列ＳｅｒＢ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）、ＳｅｒＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）およびＴｈｒＥ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１０）を含有する核酸配列の記載。
【００９７】
図１：ベクターｐＣＧＬ００４０の概略図。
【００９８】
使用されている略号の意味は次の通りである：
Ａｍｐ＝β−ラクタマーゼ遺伝子、これはアンピシリン耐性を媒介する。
【００９９】
Ｋａｎ＝ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、これはカナマイシン耐性を媒介する
。
。
【０１００】
さらに制限エンドヌクレアーゼのための切断部位が記載されている。
【０１０１】
図２：ベクターｐＶＷＥｘｓｅｒＢの概略図。
【０１０２】
使用されている略号の意味は次の通りである：
Ｋａｎ＝ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、これはカナマイシン耐性を媒介する
。
。
【０１０３】
ｌａｃｌｑ＝大腸菌からのラクトース−オペロンの定量的に発現したリプレッサ
ー。
ー。
【０１０４】
Ｐｔａｃ＝大腸菌のｔｒｐ−プロモーターおよびｌａｃ−プロモーターからなる
ＩＰＴＧ−誘導可能な人工的なプロモーター。
ＩＰＴＧ−誘導可能な人工的なプロモーター。
【０１０５】
さらに制限エンドヌクレアーゼのための切断部位が記載されている。
【０１０６】
図３：ベクターｐＶＷＥｘ１ｓｅｒＣ−１の概略図
使用されている略号の意味は次の通りである：
Ｋａｎ＝ホスホトランスフェラーゼ−遺伝子、これはカナマイシン耐性を媒介す
る。
る。
【０１０７】
Ｔｅｔ＝プラスミドｐＨＹ１６３ＰＬＫからのｔｅｔα１−遺伝子（Ishiwa &
Shibahara、１９８５年、Jpn. J. Genet. ６０：第４８５〜４９８頁）、
これはテトラサイクリン耐性を媒介する。
これはテトラサイクリン耐性を媒介する。
【０１０８】
ｌａｃｌｑ＝大腸菌からのラクトース−オペロンの定量的に発現したリプレッサ
ー。
ー。
【０１０９】
Ｐｔａｃ＝大腸菌のｔｒｐ−プロモーターおよびｌａｃ−プロモーターからなる
ＩＰＴＧ−誘導可能な人工的なプロモーター。
ＩＰＴＧ−誘導可能な人工的なプロモーター。
【０１１０】
さらに制限エンドヌクレアーゼのための切断部位が記載されている。
【０１１１】
第１表：コリネ型の細菌を培養するための無機塩培地ＣＧＸＩＩの組成。
【０１１２】
第２表：その他の生物の公知のホスホセリン−アミノトランスフェラーゼおよ
びホスホセリン−ホスファターゼに対するコリネバクテリウム グルタミクムの
ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ；ｓｅｒＣ）およびホスホ
セリン−ホスファターゼ（ＰＳＰ；ｓｅｒＢ）の類似性の比較。
びホスホセリン−ホスファターゼに対するコリネバクテリウム グルタミクムの
ホスホセリン−アミノトランスフェラーゼ（ＰＳＡＴ；ｓｅｒＣ）およびホスホ
セリン−ホスファターゼ（ＰＳＰ；ｓｅｒＢ）の類似性の比較。
【０１１３】
第３表：コリネバクテリウム グルタミクム野生型ＡＴＣＣ１３０３２ならび
に相応するプラスミドにより形質転換されたコリネバクテリウム グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２（ｐＶＷＥＸ１）株、ＡＴＣＣ１３０３２（ｐＶＷＥＸ１ｓ
ｅｒＢ）株およびＡＴＣＣ１３０３２（ｐＶＷＥＸ２ｓｅｒＣ）株の培養上澄み
液中のＬ−セリンの蓄積の比較の概要。
に相応するプラスミドにより形質転換されたコリネバクテリウム グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２（ｐＶＷＥＸ１）株、ＡＴＣＣ１３０３２（ｐＶＷＥＸ１ｓ
ｅｒＢ）株およびＡＴＣＣ１３０３２（ｐＶＷＥＸ２ｓｅｒＣ）株の培養上澄み
液中のＬ−セリンの蓄積の比較の概要。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
【表２】
【０１１６】
【表３】
【図１】
ベクターｐＣＧＬ００４０の概略を示す
【図２】
ベクターｐＶＷＥｘｓｅｒＢの概略を示す
【図３】
ベクターｐＶＷＥｘ１ｓｅｒＣ−１の概略を示す
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｂ ４Ｃ２０６
9/16 Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｄ
Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15
//(Ｃ１２Ｎ 1/21 1:13
Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(Ｃ１２Ｐ 13/06
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(Ｃ１２Ｐ 13/06
Ｃ１２Ｒ 1:13）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＪＰ，Ｕ
Ｓ
(72)発明者 ヘルマン ザーム
ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ
リヌスシュトラーセ 71
(72)発明者 ペトラ ペータース−ヴェンディッシュ
ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ アム ク
ニュッペルヒェン ４エー
Ｆターム(参考） 4B018 MD19 ME02
4B024 AA01 AA05 AA10 AA11 BA71
CA02 DA05 DA10 HA12 HA14
4B050 CC03 CC07 DD02 LL05
4B064 AE08 CA02 CA19 CC24 DA01
DA10 DA11
4B065 AA22 AA24 AB01 BA02 CA17
CA41 CA43 CA44
4C206 AA01 AA04 FA53 MA01 MA04
ZC21
Claims (25)
- 【請求項１】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１または５による配列から選択される
遺伝子ｓｅｒＢを有する、またはこれらのヌクレオチド配列のアレル、同族体ま
たは誘導体を有する、または該配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有
するホスホセリン−ホスファターゼをコードする単離された核酸。 - 【請求項２】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３または７による配列から選択される
遺伝子ｓｅｒＣを有する、またはこれらのヌクレオチド配列のアレル、同族体ま
たは誘導体を有する、または該配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有
するホスホセリン−アミノトランスフェラーゼをコードする単離された核酸。 - 【請求項３】 コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グルタミクム種またはブ
レビバクテリウム フラブム種から単離される、請求項１または２記載の核酸。 - 【請求項４】 請求項１から３までのいずれか１項記載の核酸配列によりコ
ードされるホスホセリン−ホスファターゼまたはその一部。 - 【請求項５】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２または６による配列から選択される
アミノ酸配列またはこれらのポリペプチド配列の改変された形を有する、請求項
４記載のホスホセリン−ホスファターゼまたはそのイソ型またはその混合物。 - 【請求項６】 請求項２または３記載の核酸配列によりコードされるホスホ
セリン−アミノトランスフェラーゼまたはその一部。 - 【請求項７】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４または８による配列から選択される
アミノ酸配列またはこれらのポリペプチド配列の改変された形を有する、請求項
６記載のホスホセリン−アミノトランスフェラーゼまたはそのイソ型またはその
混合物。 - 【請求項８】 コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属、特に有利にはコリネバクテリウム グルタミクム種またはブ
レビバクテリウム フラブム種に由来する、請求項４から７までのいずれか１項
記載のポリペプチド。 - 【請求項９】 請求項１から３までのいずれか１項記載のヌクレオチド配列
を少なくとも１つ、ならびに該配列と機能的に結合した調節配列を有する遺伝子
構造。 - 【請求項１０】 少なくとも請求項１から３までのいずれか１項記載のヌク
レオチド配列１つまたは請求項９記載の遺伝子構造を１つ有し、ならびに選択の
ため、宿主細胞中での複製のため、または宿主細胞のゲノムへの組み込みのため
の付加的なヌクレオチド配列を有するベクター。 - 【請求項１１】 遺伝子的に改変されていない相応する微生物と比較して、
発現が増強されている、かつ／またはその複製数が増大している請求項１から３
までのいずれか１項記載の核酸を複製可能な形で少なくとも１つ有する、遺伝子
的に改変された微生物。 - 【請求項１２】 請求項９記載の遺伝子構造または請求項１０記載のベクタ
ーを複製可能な形で含有する、請求項１１記載の遺伝子的に改変された微生物。 - 【請求項１３】 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５および／または７による
ホスホセリン−ホスファターゼ（ｓｅｒＢ）をコードする核酸および／またはホ
スホセリン−アミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）をコードする核酸、および
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１によるＬ−トレオニンエキスポートキャリア
（ｔｈｒＥ）をコードする核酸を複製可能な形で有し、遺伝子的に改変されてい
ない相応する微生物と比較して発現が増強されており、かつ／またはその複製数
が増大している、Ｌ−セリンを製造するための請求項１１または１２記載の遺伝
子的に改変された微生物。 - 【請求項１４】 請求項４から８までのいずれか１項記載のポリペプチドを
少なくとも１種含有し、遺伝子的に改変されていない相応する微生物と比較して
高められた活性を有する、請求項１１から１３までのいずれか１項記載の遺伝子
的に改変された微生物。 - 【請求項１５】 遺伝子ｓｅｒＢおよび／またはｓｅｒＣおよびｔｈｒＥに
よりコードされるポリペプチドを有し、遺伝子的に改変されていない相応する微
生物と比較して高められた活性および／または寿命および／またはより少ない最
終産物の阻害を有する、請求項１１から１４までのいずれか１項記載の遺伝子的
に改変された微生物。 - 【請求項１６】 少なくとも１つの高められたＬ−セリン産生率および１つ
の高められたＬ−セリン−および／またはＬ−トレオニン−分泌率を有する、請
求項１１から１５までのいずれか１項記載の遺伝子的に改変された微生物。 - 【請求項１７】 コリネ型の細菌、有利にはコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属である、請求項１１から１６までのいずれか１項記載の遺伝
子的に改変された微生物。 - 【請求項１８】 コリネバクテリウム グルタミクム種またはブレビバクテ
リウム フラブム種の細菌である、請求項１１から１７までのいずれか１項記載
の遺伝子的に改変された微生物。 - 【請求項１９】 Ｌ−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードする遺伝子
を同定および／または単離するためのプローブにおいて、請求項１から３までの
いずれか１項記載の核酸配列から出発して製造され、かつ検出のために適切な標
識を有することを特徴とする、Ｌ−セリンの生合成に関与する蛋白質をコードす
る遺伝子を同定および／または単離するためのプローブ。 - 【請求項２０】 請求項１から３までのいずれか１項記載の核酸を単離する
ための方法において、トランスポゾン−突然変異誘発により生じた欠損を遺伝子
ｓｅｒＢおよびｓｅｒＣ中に有するコリネ型の細菌を作製する、請求項１から３
までのいずれか１項記載の核酸を単離するための方法。 - 【請求項２１】 Ｌ−セリンを微生物により製造するための方法において、 ａ）コリネ型の細菌から単離された、請求項１から３までのいずれか１項記載
の核酸少なくとも１つを、同種の微生物に移送し、かつここで発現させ、その際
、遺伝子発現および／または相応してコードされたポリペプチドの活性は、遺伝
子的に改変されていない相応する微生物に対して高められており、 ｂ）工程ａ）からの、この遺伝子的に改変された微生物を発酵によるＬ−セリ
ンの製造のために使用し、かつ ｃ）相応して形成されたＬ−セリンを培地から単離する ことを特徴とする、Ｌ−セリンを微生物により製造するための方法。 - 【請求項２２】 Ｌ−セリンを微生物により製造するための方法において、 ａ）コリネ型の細菌から単離された、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１、３、５および
／または７によるホスホセリン−ホスファターゼ（ｓｅｒＢ）および／またはホ
スホセリン−アミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）をコードする核酸少なくと
も１つおよびＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９または１１によるＬ−トレオニンエキスポ
ートキャリアをコードする核酸またはこれらのアレルまたは誘導体１つを同種の
微生物に移送し、かつここで発現させ、その際、核酸の発現および／または寿命
、および／または相応してコードされたポリペプチドの活性および／または寿命
は、遺伝子的に改変されていない相応する微生物に対して高められており、 ｂ）工程ａ）からの、この遺伝子的に改変された微生物を、発酵によりＬ−セ
リンを製造するために使用し、その際、Ｌ−セリンの培地への分泌は増大され、
かつ ｃ）相応して形成されたＬ−セリンを培地から単離する ことを特徴とする、Ｌ−セリンを微生物により製造するための方法。 - 【請求項２３】 Ｌ−セリンおよび／または後続産物を製造するための請求
項１１から１８までのいずれか１項記載の遺伝子的に改変された微生物の使用。 - 【請求項２４】 食品、飼料および／または医薬工業において、またはヒト
医学において使用するための、請求項２１または２２に記載の方法により製造さ
れたアミノ酸Ｌ−セリンの使用。 - 【請求項２５】 Ｌ−グリシン、Ｌ−システインおよび／またはＬ−トリプ
トファンおよび／またはこれらから誘導される物質代謝産物を合成するための前
駆物質としての、請求項２１または２２に記載の方法により製造されたアミノ酸
Ｌ−セリンの使用。
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| DE10044831A DE10044831A1 (de) | 2000-03-01 | 2000-09-11 | Verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sowie ein dazu geeigneter genetisch veränderter Mikroorganismus |
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| A621 | Written request for application examination |
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| A761 | Written withdrawal of application |
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