CN111424102A

CN111424102A - 一种化妆品特定菌多重pcr快速检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN111424102A
Application number: CN202010286066.7A
Authority: CN
Inventors: 俞超; 胡茂秀; 王莎莎
Original assignee: Qingdao Zhibo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Zhitan Inspection And Testing Co ltd
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111424102B

Abstract

本发明公开了一种化妆品特性菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法，利用绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异基因保守区序列设计出适用于多重PCR的引物，用多重PCR技术一次性检测化妆品中的特定菌绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌。解决了化妆品中特定病原菌传统技术检测周期长，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题，设计的引物与多重PCR体系组装成试剂盒，用于化妆品特定菌的快速检测，该检测方法特异性好，与对照相似致病菌无交叉反应，且灵敏度高，对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到10⁰cfu/mL,满足了对化妆品特定菌零检出的要求，而且快速、方便。

Description

一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

特定菌(Specia microorganism)是化妆品中不得检出的特定微生物，包括致病菌和条件致病菌。有关特定菌的确定，目前世界尚无统一规定，各国有所不同。目前，中国则按照2007年修订的《化妆品卫生规范》，该规范规定的特定菌，即不得检出的致病微生物是3种：绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和粪大肠菌群。国外的化妆品质量保证主要是按照欧盟的消费品科学委员会(SCCP)或美国食品药品监督管理局(FDA)的规定执行，其中包括沙门氏菌。而粪大肠菌群与总大肠菌群组成相同，主要组成是埃希氏菌属，而此菌属中与人类生活密切相关的就只有大肠杆菌。

目前化妆品中微生物的检测手段除传统的微生物培养方法外，也应市场需求诞生了一些快速检测手段，如快速测试片技术、聚合酶链式反应技术、三磷酸腺苷生物发光检测技术、电阻抗技术、荧光光电法、微生物挥发性有机化合物检测技术等。传统微生物检测方法所需实验材料简单、价格便宜，但操作繁琐、耗时长，约4-7天。其它几项技术操作简单，快速高效，但成本高，且易受样品中杂质干扰，仅对微生物总数进行检测，无法辨别微生物的种属；PCR技术和LAMP技术也在化妆品检测中逐渐得到应用，但一个反应只能检测单个靶标病原菌。

发明内容

为了解决化妆品中特定病原菌传统技术检测周期长，操作繁琐复杂，特异性、敏感度均较低的问题，设计引物与多重PCR体系组装成试剂盒，提供一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法。

本发明提供了一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液。

进一步的，所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1。

进一步的，所述特异引物的核苷酸序列依次为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

进一步的，所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，dNTPs。

本发明还公布的一种利用所述试剂盒的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)不同剂型化妆品模拟污染样品DNA模板制备，包括：

(a)亲水性样品：将无菌的化妆水或乳液样品在钠盐培养基中混匀，添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸，

(b)疏水性样品：取唇膏或粉底液样品加入灭菌矿物油和灭菌tween80中匀浆，添加灭菌生理盐水，充分混匀加入到钠盐培养基中得混合液，取上述混合液添加四种靶标菌的混合菌液，依次倍比稀释，过夜增菌，增菌液化学裂解方法制备核酸；

(2)多重PCR反应体系配置，所述扩增体系包括PCR反应混合液5μL，四种靶标菌特异引物混合液2μL，步骤(1)提取的DNA模板1.0μL，ddH₂O补足25μL。

(3)采用多重PCR法进行扩增；

(4)将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，将5μL所述扩增反应产物用1％琼脂糖电泳分离，根据条带有无和大小判定结果。

进一步的，所述步骤(2)的多重反应体系配置每批次试验加入阳性质控品或阴性质控品代替模板做试验对照。

进一步的，所述步骤(3)中多重PCR法进行扩增的扩增条件为94℃，4min；94℃30s，64℃30s，72℃45s，共32循环；最后72℃后延伸5min。

进一步的，所述检测方法对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到10⁰cfu/mL。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：多重PCR技术的优势在于可以同时对成组病原物进行检测，且操作和普通PCR一样简单，所以可以大大提高检测效率、缩短检测周期、降低检测成本，具有显著地经济效益和社会效益，特别适合成组病原体的检测，在化妆品特定菌的检验方面具有极高的应用价值，本发明的试剂盒中化妆品特定菌的特异引物具有较高的检测灵敏度和特异性，无交叉扩增现象，且在化妆品不同剂型样本中检测均可达到个位数特定菌，满足化妆品检测标准中特定菌零检出的检测要求，属于国内首例。

本发明提供的不同剂型化妆品增菌培养方法以及增菌培养后制备DNA的方法，可以有效缩短检测的时间，提高检测效率。同时，增菌培养后可使扩增体系中死菌的模板DNA所占比例大大降低，从而确保了对化妆品质量控制的可靠性。总之，本发明提供的一种化妆品特定菌多重PCR检测方法操作简单、高效、灵敏，为化妆品的质量控制提供了有效手段，可以推广应用于化妆品中特定菌的快速检测。

附图说明

图1是本发明所述模拟化妆水样品多重PCR检测灵敏度实验结果，M为DL1000 DNAMarker；1为四种靶标菌等量DNA混合样品阳性质控；2-8分别为菌液浓度分别为10⁶-10⁰cfu/mL的四种菌混合菌液制备的DNA样品；9为不添加靶标菌的化妆水或者乳液样品空白对照；10为ddH₂O阴性对照。

图2是本发明所述模拟乳液样品多重PCR检测灵敏度实验结果，M为DL1000 DNAMarker；1为四种靶标菌等量DNA混合样品阳性质控；2-8分别为菌液浓度分别为10⁶-10⁰cfu/mL的四种菌混合菌液制备的DNA样品；9为不添加靶标菌的化妆水或者乳液样品空白对照；10为ddH₂O阴性对照。

图3是本发明所述模拟霜膏类样品多重PCR检测灵敏度实验结果，M为DL1000 DNAMarker；1为四种靶标菌等量DNA混合样品阳性质控；2-8分别为100mg灭菌唇膏按上述增菌和DNA制备方法加入浓度为10⁶-10⁰cfu/mL四种特定菌混合菌液制备的DNA样品；9为不加菌唇膏样品空白对照；9为ddH₂O阴性对照。

图4是本发明所述单对引物特异性验证，其中A为nuc-F1/nuc-R1单引物特异性验证结果；B为ETA-F1/ETA-R1单引物特异性验证结果；C为invA-F1/invA-R1单引物特异性验证结果；D为LacZ-F1/LacZ-R1单引物特异性验证结果。1-4为金黄色葡萄球菌ATCC26003，ATCC26113，ATCC29213和1株MRSA；5-6为2株绿脓杆菌ATCC27853，ATCC15442，7-9为沙门菌属，分别为鸡肠炎沙门菌(Salmonella enterica，CICC21510)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium，CMCC50115)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis，ATCC13312)，9-14为大肠杆菌CMCC44102，CVCC1490，ATCC35401，CVCC1562和CVCC248。15-16为2株志贺氏菌：痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae，CMCC51252)和福氏志贺氏菌(S.flexneri，CMCC51572)；17为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii，CMCC45401)；18为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis，ATCC29212)；19-20为2株芽孢杆菌：蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，CMCC63301)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis，CMCC63501)；21为单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，GIM1.347)；22为副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus，ATCC17802)；23为白色念珠菌(Candida albican，ATCC10231)；24为清水对照。

图5是本发明所述多重PCR特异性扩增产物电泳分析，其中1-4分别为沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；5-10分别为2种不同菌等量DNA混合样品；11-14为3种不同菌等量DNA混合样品；15为上述四种菌等量DNA混合样品；16-17为2株志贺氏菌：痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae，CMCC51252)和福氏志贺氏菌(S.flexneri，CMCC51572)；18为阪崎肠杆菌(E.sakazakii，CMCC45401)；19为为粪肠球菌(E.faecalis，ATCC29212)；20-21为2株芽孢杆菌：蜡样芽胞杆菌(B.cereus，CMCC63301)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis，CMCC63501)；22为单增李斯特菌(L.monocytogenes，GIM1.347)；23为副溶血性弧菌(V.parahemolyticus，ATCC17802)；24为清水对照。。

图6是本发明所述多重PCR检测灵敏度实验结果，1为浓度分别为15ng/μL的四种靶标菌等量DNA混合样品；2-6分别为10倍比梯度稀释的DNA样品；7为ddH₂O阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案作进一步详细的说明。

本实施例所用病原菌分别购自中国工业微生物所、中国兽医菌种保藏中心和广州微生物所菌种保藏中心：鸡肠炎沙门菌(S.enterica)：CICC21510，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)：CMCC50115，猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)：ATCC13312；绿脓杆菌(P.aeruginosa)：ATCC27853，ATCC15442；金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC26003，ATCC26113，ATCC29213；大肠杆菌(E.coli)：CMCC44102，CVCC1562，CVCC248，CVCC1490，ATCC35401。

本实施例所用主要试剂：

Taq DNA聚合酶，dNTPs，2000bp DNA Marker[宝生物工程(大连)有限公司]，引物(北京华大基因科技有限公司)，LB(青岛海博生物科技有限公司)。

本实施例所用主要仪器：

Life Touch TC-XP基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)；

DYCP-31DN水平电泳仪(北京六一仪器厂)；

Tanon-2500R全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司)。

实施例1、亲水性化妆品中特定菌多重PCR快速检测试剂盒及方法

本实施例用于说明本发明所述一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒检测亲水性化妆品中特定菌的方法。一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒：包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液，所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，dNTPs，根据试剂盒中的引物及其PCR反应体系，采用多重PCR技术一次性扩增沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的特异基因，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，下文中将沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌统称为四种靶标菌，即沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均为靶标菌。

所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1，所述引物的核苷酸序列为：

ETA-F1：5’-GCGTGCTGCACTACTCCATG-3’；

ETA-R1：5’-CGATGACTGATGACCGTGGG-3’；

nuc-F1：5’-AGCGATTGATGGTGATACGG-3’；

nuc-R1：5’-TAGCCAAGCCTTGACGAACT-3’；

LacZ-F1：5’-TTTACAGGGCGGCTTCGT-3’；

LacZ-R1：5’-CGTTCGGTTGCACTACGC-3’；

invA-F1：5’-GGGTCGTTCTACATTGACAG-3’；

invA-R1：5’-AAGGGTCGTCGTTAGGACTG-3’；

在无菌化妆水或者乳液中添加四种化妆品检测特定菌混合菌液后增菌培养，提取样品中总DNA，利用所述试剂盒中的引物和反应体系进行多重PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，具体步骤如下：

(1)亲水性化妆品模拟污染样品DNA模板制备

将1ml无菌的化妆水或乳液样品与99ml高温高压灭菌的1.5％钠盐培养基混匀，添加四种靶标菌混合菌液至上述混合液1ml中，使每种菌终浓度均为10⁶cfu/ml，依次倍比稀释至10⁰cfu/ml，并设置空白培养基为对照。37℃，250rpm,过夜增菌。然后，取500μL增菌液化学裂解方法制备核酸。

(2)多重PCR反应体系配置

所述扩增体系包括PCR反应混合液5μL，四种靶标菌特异引物混合液2μL，步骤(1)提取的DNA模板1.0μL，ddH₂O补足25μL。

(3)多重PCR扩增反应

PCR扩增条件为：94℃，4min；94℃30s，64℃30s，72℃45s，共32循环；最后72℃后延伸5min。PCR反应可在杭州博日Life Touch PCR仪上完成。然后用1.2％琼脂糖凝胶加样5μLPCR产物电泳，紫外灯下观察，用凝胶成像分析系统照像。

(4)结果检测

将5μL PCR产物用1％琼脂糖电泳分离，电泳结果见附图1，附图2。结果表明：多重PCR体系扩增四种靶标菌均可产生约750bp、600bp、400bp和300bp的扩增条带，与阳性质控片段大小一致，而不加菌化妆品空白对照和PCR阴性对照均无扩增条带产生，无假阳性或假阴性结果出现。此结果说明过夜增菌培养，化妆水或乳液中四种靶标菌均可检测到10⁰cfu/mL，呈现较好的检测灵敏度，达到化妆品中特定菌不得检出的检测标准，可用于化妆水或乳液等亲水性化妆品中特定菌的检测。

实施例2、疏水性化妆品种特定菌多重PCR快速检测试剂盒及方法

本实施例所用主要试剂和仪器同实施例1。

本实施例用于说明本发明所述一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒检测疏水性化妆品中特定菌的方法。在无菌唇膏中添加四种靶标菌混合液后增菌培养，提取样品总DNA，利用实施例1中所述试剂盒进行多重PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，上述疏水性化妆品中特定菌多重PCR快速检测方法具体包括以下步骤：

(1)疏水性化妆品模拟污染样品DNA模板制备

取100mg唇膏样品加入1ml灭菌矿物油和1ml灭菌tween80中匀浆，然后添加8ml灭菌生理盐水，充分混匀后取1ml加入到99ml 1.5％钠盐培养基中。取上述混合液1ml添加四种菌混合菌液并使每种菌终浓度均为10⁶cfu/ml，依次倍比稀释至10⁰cfu/ml，并设置空白培养基为对照。37℃，250rpm,过夜增菌。然后，取500μL增菌液化学裂解方法制备核酸。

(2)多重PCR体系配制同实施例1。

(3)多重PCR反应条件同实施例1。

(4)结果检测：将PCR扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，方法同实施例1，电泳结果见附图3，扩增结果表明：加入同等浓度10⁶-10⁰cfu/mL混合化妆品特定菌的唇膏样品，采用化学裂解制备的DNA样品多重PCR扩增均可产生约750bp、600bp、400bp和300bp四条扩增条带；培养基空白对照和PCR阴性对照均无扩增条带产生，无假阳性或假阴性结果出现。

此结果说明过夜增菌培养，唇膏样品中四种靶标菌均可检测到10⁰cfu/mL，呈现较好的检测灵敏度，达到化妆品中特定菌不得检出的检测标准，可用于唇膏、粉底液等疏水性化妆品中特定菌的检测。

实施例3、试剂盒中引物的特异性检测

本实施例用以说明本试剂盒所设计引物的特异性，包括单引物对的特异性以及四种靶标菌特异引物组合成试剂盒中引物混合液的特异性。上述引物特异性验证方法包括以下步骤：

(1)首先将设计合成所述实施例1中的引物在BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)网上比对，引物对ETA-F1/ETA-R1只和绿脓杆菌相似度100％，和其它菌株相似度都不足50％；nuc-F1/nuc-R1只和金黄色葡萄球菌相似度100％，和其它菌株相似度都较低；发现引物对LacZ-F1/LacZ-R1和大肠杆菌不同血清型菌株、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.CP010574)、阿氏肠杆菌(E.asburiae，CP011591)、阴沟肠杆菌(E.cloacae，CP011584)有97％以上的覆盖度和100％的相似度，与其它非靶标菌株的相似度较低；invA-F1/invA-R1只和沙门氏菌相似度100％，和其它菌株相似度都较低。

(2)单引物对特异性验证

将实施例1中所述4对引物ETA-F1/ETA-R1、LacZ-F1/LacZ-R1、nuc-F1/nuc-R1和invA-F308/invA-R1128分别进行PCR扩增，以3株沙门氏菌、2株绿脓杆菌、4株金黄色葡萄球菌、5株不同血清型大肠杆菌和9株其它常见肠道致病菌组成的非目标菌基因组DNA为模板，验证单引物对的特异性。

(3)试剂盒中引物混合液特异性验证

将步骤(2)中的4对引物组合在一起进行多重PCR扩增以验证引物混合液的特异性。根据单重PCR结果选取对多重PCR有较大影响的因素：退火温度、引物浓度、模板量进行单因素优化实验，以摸索确定最佳的多重PCR反应体系。反应组分和反应条件优化如下：退火温度从55℃到68℃，扩增延伸时间分别为30s，60s和90s，引物浓度从0.02mM到0.4mM，dNTP浓度从0.02mM到0.5mM。优化后按下列体系配置PCR反应体系：PCR反应混合液5μL，四种靶标菌特异引物混合液2μL，步骤(2)中所述DNA模板1.0μL，ddH2O补足25μL。

PCR条件为：预变性94℃3min；94℃变性30s，64℃退火30s和72℃延伸45s，共30循环；终延伸72℃5min。

将5μL PCR产物用1％琼脂糖电泳分离，单引物对电泳结果如附图4所示，结果表明引物对LacZ-F1/LacZ-R1扩增大肠杆菌不同血清型菌株均产生约400bp左右的条带，扩增沙门菌、其他非目标菌菌株均无条带产生；引物对ETA-F1/ETA-R1扩增绿脓杆菌不同菌株均可得到约600bp大小的条带，扩增其他菌均无条带产生；引物对nuc-F1/nuc-R1扩增金黄色葡萄球菌不同菌株均可得到约300bp大小的条带，扩增其他菌均无条带产生。引物对invA-F1/invA-R1扩增沙门氏菌不同菌株均可获得约800bp大小的条带，扩增其他菌均无条带产生，此结果说明所设计化妆品特定菌引物具有高度特异性。对化妆品特定菌的特异扩增条带进行回收测序，大肠杆菌扩增特异条带实际大小为431bp，绿脓杆菌特异扩增条带大小为619bp，金黄色葡萄球菌特异扩增条带大小为281bp，与引物设计预期一致，说明所设计引物特异性好。

试剂盒中引物混合液特异性检测电泳结果如附图5所示，结果表明四种靶标菌分别扩增产生约750bp、600bp、400bp和300bp的条带；四种不同靶标菌基因组DNA等量随机组合形成的混合DNA样品分别扩增出与所加样品对应的目的条带；8株其它对照细菌菌株和阴性对照无扩增条带。在上述不同组合的混合DNA样品中，各目标条带清晰，分子量与预期吻合，扩增结果与预期一致。此结果说明该多重PCR检测体系在优化的反应条件和反应体系下有很好的扩增特异性。

实施例4多重PCR灵敏度检测试验

本实施例用以说明该发明所述试剂盒的检测灵敏度。将所述实施例1步骤(2)中的多重PCR反应体系在优化的反应条件下进行灵敏度检测实验。取四种靶标菌的基因组DNA10倍梯度稀释后进行多重PCR扩增，每个处理3个重复，电泳结果见附图3。

结果表明：多重PCR体系扩增15ng/μL-1.5ng/μL混合DNA均可产生约750bp、600bp、400bp和300bp的扩增条带；扩增150pg/μL混合DNA可产生约750bp、400bp和300bp的扩增条带，绿脓杆菌约600bp的特异条带极弱，肉眼几乎不可见，说明该体系对绿脓杆菌扩增灵敏度为1.5ng；多重PCR体系扩增15pg/μL混合DNA样品产生约750bp和300bp的扩增条带，无大肠杆菌约400bp的特异条带，说明该体系对大肠杆菌的检测灵敏度为150pg；多重PCR体系扩增1.5pg/μL混合DNA样品只产生较弱的约750bp金黄色葡萄球菌的特异扩增条带，说明该多重PCR体系扩增金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为15pg；多重PCR体系扩增0.15pg/μL混合DNA样品无扩增条带产生，说明该体系对沙门菌的检测灵敏度为1.5pg；阴性对照无扩增条带产生。

综上所述，本发明所建立的多重PCR体系对沙门菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别为1.5pg、1.5ng、150pg和15pg，说明所建立的多重扩增体系呈现较好的检测灵敏度。

以上所述，仅是本发明的实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，利用上述揭示的方法内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，均属于权利要求书保护的范围。

序列表

<110> 青岛智博生物科技有限公司

<120> 一种化妆品特性菌多重PCR快速检测试剂盒及其检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgtgctgca ctactccatg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgatgactga tgaccgtggg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcgattgat ggtgatacgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagccaagcc ttgacgaact 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttacagggc ggcttcgt 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgttcggttg cactacgc 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggtcgttct acattgacag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagggtcgtc gttaggactg 20

Claims

1.一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：包括绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌四种靶标菌的特异引物、阳性质控品、阴性质控品、PCR反应混合液。

2.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的特异引物包括扩增绿脓杆菌的特异引物ETA-F1和ETA-R1、扩增金黄色葡萄球菌的特异引物nuc-F1和nuc-R1、扩增大肠杆菌的特异引物LacZ-F1和LacZ-R1、用于扩增沙门氏菌的特异引物invA-F1和invA-R1。

3.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述特异引物的核苷酸序列依次为：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的一种化妆品特定菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应混合液包括PCR缓冲液，Taq DNA聚合酶，dNTPs。

5.一种利用权利要求1-4中任一项所述试剂盒的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)不同剂型化妆品模拟污染样品DNA模板制备，包括：

(3)采用多重PCR法进行扩增；

6.根据权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(2)的多重反应体系配置每批次试验加入阳性质控品或阴性质控品代替模板做试验对照。

7.根据权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中多重PCR法进行扩增的扩增条件为94℃，4min；94℃30s，64℃30s，72℃45s，共32循环；最后72℃后延伸5min。

8.根据权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于：所述检测方法对不同剂型化妆品模拟污染样品增菌后检出限均可达到10⁰cfu/mL。