KR102405050B1

KR102405050B1 - 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법

Info

Publication number: KR102405050B1
Application number: KR1020210094241A
Authority: KR
Inventors: 김경민; 송지원; 이창완; 양서진; 이승훈
Original assignee: 주식회사 현대바이오랜드
Priority date: 2021-07-19
Filing date: 2021-07-19
Publication date: 2022-06-02
Anticipated expiration: 2041-07-19

Abstract

본 발명은 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법에 관한 것으로서, 본 발명은 열처리 공정이 필수적인 마이크로바이옴 원료가 함유된 화장품 제형 내의 더마바이오틱스를 히알루론산-용암해수 용매의 활용을 통해 정성/정량분석 할 수 있다. 더 나아가서는 본 발명은 개인 맞춤형 마이크로바이옴 원료 적용 시 균주-특이적 정성분석법의 응용을 통해 맞춤형 화장품에의 사용 균주를 검증하는 데에 활용될 수 있다.

Description

마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법 {Detection method for dermabiotics in microbiome of cosmetics sample}

본 발명은 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법에 관한 것이다.

최근에 피부 상재 균총의 피부건강에 미치는 영향을 고찰하는 마이크로바이옴 화장품 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 마이크로바이옴의 사전적 의미는 미생물(microbe)과 생태계(biome)의 합성어이다. 이 용어는 컬럼비아대학의 레더버그(Lederberg)교수와 하버드 의대의 맥크레이(McCray)교수의 2001년 사이언스지 기고를 통해 '마이크로바이옴은 인체에 존재하며 우리 몸을 함께 공유하며 살고 있지만 그 동안 건강이나 질병의 원인으로 거의 간과되어 온 상재균, 공생균, 병원균 등 모든 미생물들의 총합이라 정의하였다.

피부 마이크로바이옴의 형성과정은 아기가 엄마의 산도(vaginal tract)를 통해 태어날 때, 엄마의 질 마이크로바이옴(vaginal microbiome)을 구성하는 유익균인 유산균을 피부에 묻히고 나와 피부 마이크로바이옴을 형성하여 피부면역과 피부장벽형성에 기여를 하게 된다.

한편, 건강한 피부상태를 유지하는 연령대에서 미생물을 분리 보관하여 나이들었을 때 그 미생물을 활용하여 개인맞춤형 마이크로바이옴 화장품을 제조 개발하는 것이 4차 산업혁명의 한 이슈로 대두되고 있다. 이러한 배경에는 피부 상재 균총 비율을 분석할 수 있는 차세대염기서열(next generation sequencing, NGS)분석법이 개발됨으로써 가능하였다. 이 NGS 분석법 또한 피부에 존재하는 생균 집단을 면봉 등의 방법으로 수득하여 동정하는 방법은 앞의 16S rRNA 염기서열분석법과 대상이 동일하다. 이러한 개인맞춤형 마이크로바이옴 화장품은 피부 장벽을 개선하거나 피부건강을 유지시키는데 기여하는 특정 미생물을 분리하여 보관하였다가 필요시 사균 형태로 만들어 최종 화장품으로 제조하여 소비자에게 배송하는 시스템을 갖게 된다. 이러한 방법으로 만들어진 대표적인 화장품으로 랑콤의 제니피크이다. 그러나 이 제품은 어떠한 균으로 만들어졌는지 설명을 하고 있지 않으며 앞서 설명한 생균을 화장품 원료 또는 제품으로 만들 때 사균화에 따라 미생물 내부의 유전자가 손상되어 더마바이오틱스 균주가 포함된 것인지 오염균이 포함된 것인지 특정할 수 없어 마이크로바이옴 제품이 제대로 제조되었는지 사용자가 확인할 수 없다. 이는 완벽하게 사균화시키지 못하면 미생물 한도인 1,000개/ml 또는 1,000개/g를 넘게되어 원료 또는 제품의 부적합 판정을 받을 수 있기 때문에 가혹한 열처리로 제품 제조시 이 문제를 처리했기 때문이지만, 사용자의 입장에서는 유산균이 적절 함량 포함되어 피부 개선 효능을 제대로 수행할 수 있는지의 여부를 확인하는 것도 중요하기 때문에 화장품 시료 내의 마이크로바이옴 시료의 적정 함량을 확인하는 것도 필요하다. 또한, 실험실에서 유산균으로부터 온전하게 추출한 genomic DNA와 달리 마이크로바이옴 화장품 원료를 제조하거나 화장품 제형에 혼합 및 살균을 할 때, 각종 열처리 및 화학적 조성물들에 의해 균주 유래 핵산들이 분해되고 단백질 및 기타 조성물에 응집할 수 있다. 이러한 반응은 PCR에서 증폭을 개시하기 위한 주형가닥을 제공할 수 없게 만들어, 결국 균주에 대한 동정 분석이 불가능하게 된다.

선행기술로서 대한민국 등록특허 제10-2133689호는 마이크로바이옴 유래 균주를 이용한 화장품 원료로서 더마바이오틱스의 제조방법에서 주요 추출성분인 핵산(뉴클레오티드)의 열 추출 안정성을 높이기 위해 용암해수를 배양용수로서 사용하였으나, 해당 기술을 적용하여 제조된 화장품 원료를 직접, 또는 화장품 제형에 혼합된 상태에서 PCR을 수행하여 분석하는 기술은 제공하지 못하였다. 또 다른 선행기술로서 등록특허 제10-2072735호는 액체 시료 내 불안정한 세포유리 DNA를 검출하는 방법을 기술하였으나, 해당 검출방법은 균주의 동정을 위한 PCR 분석방법이 아닌, 타겟 유전자의 변이 여부를 확인하기 위한 상보적 결합을 적용한 방법이며, 열처리의 가혹한 조건에 의해 변성 및 분절된 핵산 단편을 증폭하여 실시하는 검출방법과는 차이가 있다.

이에, 본 발명에서는 개인맞춤형 마이크로바이옴 화장품을 제조하는데 있어 개인맞춤형 기능성 원료로써 특정 균주를 사용할 때에, 원료 제조를 위해 사용된 균주를 화장품 원료 및 제형에서 동정할 수 있는 분석 방법을 최초로 개발하였다. 구체적으로는 화장품 원료 및 제형에서의 살균/혼합을 위한 열처리 과정과 화학적 조성물의 함유에 의한 분자유전학적 동정 타겟인 핵산 가닥의 응집 현상을 히알루론산과 용암해수의 처리를 통해 해소하고 종-특이적 정성분석법을 위한 PCR 분석법의 적용이 가능한 분석 방법을 개발하였다.

대한민국 등록특허 제10-1193410호 (발명의 명칭: 락토바실러스 속 균종의 동정방법, 출원인: 일동제약(주), 등록일: 2012년10월16일) 대한민국 등록특허 제10-1046820호 (발명의 명칭: 비피도박테리움 속 균종의 동정방법, 출원인: 일동제약(주), 등록일: 2011년 06월 29일) 대한민국 등록특허 제10-2133689호 (발명의 명칭: 용암해수 유래 미네랄과 더마바이오틱스 유래 뉴클레오티드의 결합체 제조방법 및 이를 이용한 기능성 더마바이오틱스 화장품 조성물, 출원인: ㈜현대바이오랜드, 등록일: 2020년 07월 07일) 대한민국 등록특허 제10-2072735호 (발명의 명칭: 불안정한 세포유리 DNA 검출 방법 및 이를 이용한 장치, 출원인: 주식회사 제놉시, 등록일: 2020년 1월 28일)

Yu-Li Song, Naoki Kato, Cheng-Xu Liu, Yochiko Matsumiya, Haru Kato, and Kunitomo Watanabe. (2000). Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS Microbiology Letters. 187, 167-173. Tacahiro Matsuki, Koichi Watanabe, Ryuichiro Tanaka, Hiroshi Oyaizu. (1998). Rapid identification of human intestinal bifidobacteria by 16s rRNA-targeted species- and group-specific primers. FEMS Microbiology Letters. 167, 113-121.

본 발명의 목적은 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법을 제공하는 데에 있다.

보다 자세하게는, 본 발명은, (제1단계) 마이크로바이옴 균주 유래 원료 가 함유된 화장품 시료를 히알루론산 및 용암해수의 혼합용매에 현탁하여 원료 현탁액을 제조하는 단계;

(제2단계) 상기 원료 현탁액을 열처리하는 단계;

(제3단계) 열처리된 원료 현탁액을 1~10℃까지 냉각하는 단계;

(제4단계) 냉각된 원료 현탁액을 이용하여 종-특이적 PCR 분석을 수행하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 제1단계에서 마이크로바이옴 균주는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스크렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 바이셀라 속(Weissella sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 스테필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium sp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균주일 수 있다.

상기 제1단계의 화장품 제형은 특별히 한정되지 않고, 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 앰플, 로션, 세정료, 오일 등의 스킨케어 화장료, 립스틱, 파운데이션 등의 메이크업 화장료, 두발용 화장료 등을 포함할 수 있다.

상기 제1단계의 화장품 제형은 최종 6 μg/mL 농도 이상, 바람직하게는 최종 6~8 μg/mL 의 핵산을 함유하는 것을 특징으로 한다. 이를 위해, 600 μg/mL 농도 이상의 핵산을 함유하는 마이크로바이옴 균주 유래 원료를 1중량% 이상 함유한다.

상기 제1단계의 히알루론산 및 용암해수 혼합 용매는 히알루론산이 0.01~0.2%(w/v) 함유된 10~70%(v/v) 용암해수 수용액을 멸균한 용매인 것을 특징으로 한다.

상기 제1단계의 용암해수는 1 L 당 마그네슘 1,100 mg 이상, 칼슘 300 mg 이상, 칼륨 300 mg 이상 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 제1단계에서 마이크로바이옴 균주 유래 원료는 각 균주의 균체 파쇄물이며, 상기 제1단계에서 원료 또는 화장품 시료를 히알루론산 및 용암해수 혼합용매에 현탁함으로써, 분절된 핵산가닥의 응집반응을 해소할 수 있다. 상기 균체 파쇄물은 120~125℃, 0.12~0.15 Mpa의 압력 조건으로 100~150분간 열압 추출하여 균주 세포를 파쇄시키고 2~10℃로 냉각한 후에 균주 파쇄액을 원심분리(5,000~8,000 rpm, 10~30분)하여 최종 상등액을 얻은 것일 수 있다.

상기 제2단계의 열처리는 80~100℃에서 15~120분간 수행할 수 있다.

상기 제2단계에서 원료 현탁액을 열처리하는 단계는 핵산가닥의 응집반응을 해소하고 화장품 제형 내 기타조성물의 화학성분을 불활성화시키는 단계이다.

상기 제3단계의 냉각은 10℃를 1~5분 간격으로 하강시키는 단계별 시간차 온도조절을 통해 수행되는 것을 특징으로 한다. 또한, 냉각하면서 분절된 핵산가닥의 재응집 반응이 최소화되고, 복원(renaturation)되며, 용암해수 양이온의 이온성 결합반응을 통해 핵산가닥을 안정화될 수 있다.

상기 제4단계의 PCR 반응 혼합물은 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 염화마그네슘, Tris-HCl, BSA(bovine serum albumin), 염화칼륨 및 폴리소르베이트 20(제품명:Tween 20)을 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 제4단계의 종-특이적 PCR 조건은 마이크로바이옴 원료 제조에 사용된 균주의 종-특이적인 서열을 타겟으로 하여 제작한 primer 서열의 annealing 온도 조건(50℃ 내지 65℃ 범위)를 적용하는 일반적인 PCR 조건을 특징으로 한다.

상기 제4단계에서의 종-특이적 PCR 산물은 겔 전기영동, 또는 형광 측정 등을 통해 수행될 수 있으며, 각 primer를 이용하여 염기서열을 해독한 결과를 사용 균주의 기존 염기서열과 대조하여 동정할 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 2종 이상의 마이크로바이옴 원료 또는 상기 원료를 함유하는 화장품 제형에서도 이와 동일한 제1단계~제4단계를 수행함으로써 화장품 시료 내의 균주를 확인할 수 있는 분석방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 히알루론산-용암해수 용매를 이용한 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료 또는 이를 함유하는 화장품 제형 시료 더마바이오틱스 분석 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 화장품 제조 전의 마이크로바이옴 균주인 락토바실러스 람노서스 원료를 히알루론산 농도별 수용액에 현탁한 후 이를 이용하여 PCR 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 화장품 제조 전의 마이크로바이옴 균주인 락토바실러스 람노서스 원료를 용암해수 농도별 용액에 현탁한 후 이를 이용하여 PCR 수행한 결과를 나타낸다.
도 4는 화장품 제조 전의 마이크로바이옴 균주인 락토바실러스 람노서스 원료를 히알루론산 0.1%(v/v) 및 용암해수 농도별 수용액에 현탁한 후 이를 이용하여 PCR 수행한 결과를 나타낸다.
도 5는 마이크로바이옴 균주로서 락토바실러스 람노서스 원료를 함유하는 화장품 제형(에센스)을 각 조건의 용매에 현탁한 후, 이를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 마이크로바이옴 균주로서 락토바실러스 람노서스와 락토바실러스 2종 균주 원료를 함유하는 화장품 제형(에센스)을 용매에 현탁한 후, 이를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<제조예 1: 마이크로바이옴(락토바실러스 람노서스) 균주 유래 원료 제조 i>

더마바이오틱스 화장품 원료를 준비하기 위해, 다음과 같이 대한민국 등록특허 제10-2133689호의 방법에 개시된 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료를 제조하였다. 균주를 배양하기 위한 기본배지로서 1 L당 포도당 3%(w/v), 효모추출물 2%(w/v), 소이펩톤 2(w/v), 카제인 1%(w/v)가 되도록 각 성분을 물에 용해하여 121℃, 30분간 멸균하였다. 멸균된 배지에 마이크로바이옴 균주로서 락토바실러스 람노서스 균주의 종배양액(Lactobacilli MRS broth(BD)에서 37℃, 24시간 배양한 것)을 접종하고 100rpm, 37℃ 조건으로 20시간동안 배양하되, 40%(w/v) 포도당 및 40%(w/v) 수산화나트륨이 1:1의 부피비로 혼합된 수용액을 일정시간 간격으로 점적하면서 pH를 5.0~7.5로 유지하며 배양하였다.

마이크로바이옴 균주 배양액을 원심분리(6,000 rpm, 20분)하고 균체만을 회수하여 멸균 상수로 세척하고 이를 1회 반복하였다. 이후 균체를 멸균된 상수에 현탁하여 37℃, 16시간 동안 2차 배양하였다. 이후 121℃, 0.15 Mpa의 압력 조건으로 120분간 열압 추출하여 균주 세포를 파쇄시키고 4℃로 냉각한 후에 균주 파쇄액을 원심분리(6,000 rpm, 20분)하여 최종 상등액만을 회수하였다. 회수한 상등액은 200 nm 이하의 나노막 필터로 최종 여과하여 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료를 제조하였다. 제조된 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료는 핵산 함량을 측정하여 600 μg/mL 농도로 멸균수에 최종 희석하였다.

<제조예 2: 마이크로바이옴(락토바실러스 플란타룸) 균주 유래 원료 제조 ii>

제조예 1에서와 같이 락토바실러스 플랜타럼 종배양액으로 락토바실러스 람노서스 유래 화장품 원료도 제조하였다.

<제형예 1: 마이크로바이옴 균주 유래 원료를 함유하는 화장품 제조>

하기 표 1의 조성과 같이, 제조예 1의 마이크로바이옴 균주로서 락토바실러스 람노서스 유래 원료를 함유한 에센스(100 g)를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

원료	함량 (g)
제조예 1의 락토바실러스 람노서스 유래 원료	1.0
시토스테롤	1.5
폴리글리세릴 2-올레이트	1.3
세테아레스-4	2.0
콜레스테롤	2.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.5
선플라워오일	21.0
카르복시비닐폴리머	0.5
트리에탄올아민	0.5
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

< 제형예 2: 마이크로바이옴 균주 유래 원료를 2종 함유하는 화장품 제조>

마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료로서 락토바실러스 플랜타럼 유래 원료(제조예 2)를 추가 사용하여 제형예 1의 제조방법과 동일하게 에센스를 제조하였다. 즉, 제조예 2의 락토바실러스 플랜타럼 원료와 제조예 1의 락토바실러스 람노서스 유래 원료를 각 1.0 g씩 동시에 함유하는 에센스(100 g)을 제조예 1의 조건과 같이 제조하였다.

<원료예 1: 마이크로바이옴 균주 유래 원료 및 이를 함유하는 화장품 제형의 현탁액 제조>

제조예 1에서 최종 제조된 마이크로바이옴 균주 원료(600 μg/mL)를 멸균수에 1%농도로 희석한 원료 희석액, 제형예 1과 제형예 2의 에센스를 각각 5 g 취하여 50 mL 볼륨플라스크에 분주하고 현탁용 용매들을 준비하여 이를 50 mL까지 채운 후 상온, 100 rpm으로 5분간 교반하였다. 이후 95℃의 물이 담긴 비커에 볼륨플라스크를 넣어 온도를 유지하면서 30분간 100 rpm으로 교반하여 열처리 하였다. 열처리액을 꺼내어 냉각처리를 하여 최종 5℃로 냉각된 현탁액을 제조하였다.

상기 현탁용 용매로는 1) 순수한 정제수; 2) 0.01~0.5%(w/v) 히알루론산 수용액; 3) 10~100%(v/v) 용암해수 수용액(용액); 4) 0.1%(w/v) 히알루론산 및 10~100%(v/v) 용암해수가 함유된 혼합 수용액;을 준비하여 위와 같이 시료의 현탁액을 제조하였다.

<실험예 1: 현탁 용매 조건에 따른 마이크로바이옴 균주 유래 원료 및 이를 함유하는 화장품 제형의 종-특이적 PCR 수행>

원료예 1에서 제조된 각 시료의 현탁액을 PCR 조성물에 처리하여 통상의 방법에 따라 PCR을 수행하였다.

PCR 분석을 위해, PCR용 tube에 표 2와 같이 2X AmpMaster^TM Taq mix (Taq polymerase, dNTP mix, reaction buffer(MgCl₂₎, loading dye, stabilizer(Tris-HCl(pH8.0), KCl, EDTA, DTT, Triton X-100, Glycerol) / (주)진올바이오테크놀로지) 10 μL, Forward primer (10 pmol/μL) 1 μL, Reverse primer (10 pmol/μL) 1 μL, 상기 원료예 1에서 준비된 각각의 현탁액 1 μL, Nuclease free water 7 μL를 함유하게 하고 증류수를 혼합하여 총 20 μL 부피가 되게 하여 샘플을 준비하였다. PCR에 사용된 종-특이적 primer는 표 3에 표기한 바와 같이, 종래의 방법 (Song et al., 2000; Matsuki et al., 1998)에서 디자인된 락토바실러스 람노서스(서열번호 1 및 2) 또는 락토바실러스 플란타룸 종-특이적 primer(서열번호 3 및 4) 또는 비피도박테리움 브레브 종-특이적 primer(서열번호 5 및 6)를 사용하였다. PCR cycle 조건은 표 4에 기재하였다. 락토바실러스 람노서스의 종-특이적 PCR 산물은 표 5에 개시된 바와 같이 112 bp의 크기이고 락토바실러스 플랜타럼은 248 bp 크기, 비피도박테리움 브레브는 288 bp 크기 의 PCR 산물을 만든다. 한편, 프라이머 서열은 본 방법에서 일 예로서 사용한 것일 뿐, 각 균주의 종-특이적 primer라면 어떤 것이던지 본 발명에서 적용가능하다.

Single PCR 조건	조성
2X AmpMaster^TM Taq mix	10 μL
Forward primer-rham (또는 Forward primer-plan)	1 μL
Reverse primer-rham (또는 Reverse primer-plan)	1 μL
각 시료의 현탁액	1 μL
Nuclease free water	7 μL
총 부피	20 μL

Multiplex PCR 조건	조성
2X AmpMaster^TM Taq mix	10 μL
Forward primer-rham	0.5 μL
Forward primer-plan	0.5 μL
Reverse primer-rham	0.5 μL
Reverse primer-plan	0.5 μL
각 시료의 현탁액	1 μL
Nuclease free water	7 μL
총 부피	20 μL

락토바실러스 람노서스 Primer	5'→3' 염기서열
Forward (LU-5)	서열번호 1 : ctagcgggtgcgactttgtt
Reverse (RhaII)	서열번호 2 : gcgatgcgaatttctattatta

락토바실러스 플란타룸 Primer	5'→3' 염기서열
Forward (Lpla-3)	서열번호 3 : attcatagtctagttggaggt
Reverse (Lpla-2)	서열번호 4 : cctgaactgagagaatttga

비피도박테리움 브레브 Primer	5'→3' 염기서열
Forward (BiBRE-1)	서열번호 5: ccggatgctccatcacac
Reverse (BiBRE-2)	서열번호 6: acaaagtgccttgctccct

Step	온도	시간	사이클
Pre-denaturation	95℃	3 분
Denaturation	95℃	30 초	35 cycles
Annealing	61℃ 또는 55℃	30 초
Elongation	72℃	30 초
Final elongation	72℃	5 분

종 특이적 PCR 증폭 산물의 sequencing 결과	5'→3' 염기서열
락토바실러스 람노서스	서열번호 7 : GCGATGCGAATTTCTATTATTAGAAACTCATACAAATA CGCTGTGTTCTCGGCAATTTAAAACATTTACAACAATG ATATCCAGTTTTCAAAGAACAAAGTCGCACCCGCTAG
락토바실러스 플란타룸	서열번호 8 : CCTGAACTGAGAGAATTTGATTTAATCTACTGGGCTAT CACCATCTATGGCGGATTTTCCCAAATCCTTCGACTAT CAAGTTCTTTGGTAACTCAAATGTTCAGTCCTACAACC CCAAAGTGCAAGCACTTTGGTTTGGGCTGTTCCCCGTT CGCTCGCCGCTACTTAGGGAATCGAAATTTCTTTATAT TCCTGCTGCTAATGAGATGTTTCAGTTCACAGCGTTTA CCTCCAACTAGACTATGAAT
비피도박테리움 브레브	서열번호 9 : CCGGATGCTCCATCACACTGCATGGTGTGTTGGGAAAG CCTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTT GATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTA GCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAG ATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA TATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCG CGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTT GTTAGGGAGCAAGGCATTTTGT

각 실험결과는 도 2 내지 도 6에 나타내었다.

도 2는 화장품 제조 전의 마이크로바이옴 균주인 락토바실러스 람노서스 원료를 히알루론산 농도별 수용액에 현탁하여 제조한 후 가열처리한 것을 PCR 수행한 것의 결과로서, 정제수에만 현탁한 시료(히알루론산 0%, 용암해수 0%)는 112 bp에서 PCR 산물이 증폭되었으나 같은 조건에서 전기영동 상의 밴드 감도가 매우 낮게 나타났고, 히알루론산 농도별로 band의 굵기가 증가하였다. 이 때, 히알루론산 농도가 0.05~0.2(w/v)인 용액을 사용하여 시료를 현탁하였을 때 DNA의 분석 결과가 가장 좋은 것으로 나타났다.

한편, 히알루론산 농도가 높아질수록 PCR 산물의 전기영동 감도가 높아지는 경향을 보이지만, 히알루론산 0.5%(w/v)를 사용했을 때는 히알루론산 0.1%(w/v) 용매에서보다 감도가 오히려 떨어졌다.

다음으로는 화장품 제조 전의 마이크로바이옴 균주인 락토바실러스 람노서스 원료를 PCR용 시료로 사용하되, 히알루론산 첨가 없이 용암해수 농도별 용액에 현탁하여 제조한 후 가열처리한 것을 PCR 수행하여 도 3에 나타내었다. 도 2에서의 결과와 유사하게 정제수에만 현탁한 시료 대비 용암해수 농도 별로 band의 굵기가 증가하였다. 단, 정제수 없이 용암해수만을 100% 사용하여 현탁한 시료에서는 정제수에 현탁한 시료보다 band의 감도가 현저히 감소하였다.

다음으로는 도 4와 같이 히알루론산 농도 0.1%(v/v)를 고정하고 용암해수를 농도별로 제조하여 시료 현탁액을 제조한 것으로 PCR을 수행하여 이 결과를 나타내었다. 시료의 현탁액에 히알루론산이 고정 포함되었을 경우, 용암해수의 농도와 비례하여 112 bp의 PCR 밴드 감도가 짙어졌으나, 정제수를 전혀 넣지 않고 순수하게 용암해수 100%에 히알루론산을 첨가하여 사용하였을 때 PCR 감도가 오히려 현저하게 떨어지는 것을 알 수 있다. 이를 통해, 히알루론산 또는 히알루론산-용암해수 용매를 사용한 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료의 현탁 방법이 정제수를 사용하여 PCR용 시료를 현탁하는 것보다 PCR 감도를 높일 수 있지만 적절한 농도 조절이 필요한 것을 확인할 수 있다.

화장품 제조 전의 원료 시료에서의 DNA 증폭 결과를 확인한 후, 이후로는 본 발명의 목적인, 화장품 제형 제조 후의 시료를 통해서도 각 유산균의 검출 DNA 확인이 가능한지를 다음의 실험을 통해 확인하였다. 이와 같은 방법은 더마바이오틱스 화장품의 품질 관리를 위해 꼭 필요한 것에 해당된다.

도 4를 확인하면, 정제수를 이용하여 에센스 시료를 현탁한 후 PCR을 한 시료는 band가 전혀 생성되지 않았다. 반면, 히알루론산 0.1%(w/v) 용매로 현탁한 에센스 시료와, 히알루론산 0.1%-용암해수 40% 용매로 현탁한 에센스 시료는 모두 112 bp의 산물이 잘 증폭되어 락토바실러스 람노서스 균주의 유전자 검출이 가능함을 확인할 수 있다. 특히 히알루론산과 용암해수 혼합용매에서 PCR 감도가 더욱 좋아지는 것을 확인할 수 있었다.

도 5는 마이크로바이옴 균주로서 락토바실러스 람노서스 원료를 함유하는 화장품 제형(에센스)을 각 조건의 용매에 현탁한 후, 이를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 보여주며, 에센스 제형 시료를 이용하여 PCR을 하여도 DNA 정제용 키트로 정제한 genomic DNA 시료 못지않게 DNA가 증폭됨을 확인할 수 있다.

도 6은 락토바실러스 람노서스와 락토바실러스 2종 균주 시료로 제조한 에센스에 대한 PCR 수행 결과를 보여준다. 도 6의 분석 결과, 이와 같이 화장품 제형 현탁액에 두 균종의 특이적 primer set를 모두 넣어 multiplex PCR을 수행하였을 때 역시 락토바실러스 람노서스의 112 bp와 락토바실러스 플랜타럼의 248 bp 밴드가 동시에 확인된다.

이 결과는 히알루론산-용암해수 용매를 이용한 현탁 및 전처리 조건을 적용함으로써 2종 이상의 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료를 함유하는 화장품 제형에서 각 균종에 대한 종-특이적 PCR 분석이 가능하며, 또한 동시에 multiplex PCR로써의 분석도 가능함을 보여주며, 이를 토대로 마이크로바이옴 균주 유래 화장품 원료 및 이를 함유하는 화장품 제형에서의 사용 균주를 분석하기 위한 히알루론산-용암해수 용매를 이용한 현탁 및 전처리 단계가 확립됨을 확인할 수 있다.

<실험예 2: 증폭산물의 sequencing>

다음으로, 증폭된 산물들의 겔 전기영동 부위 중 락토바실러스 람노서스 증폭 산물을 멸균된 칼로 도려내어 정제를 수행하였다. GeneAll Gel SV kit ((주)진올바이오테크놀로지)를 사용하여 매뉴얼에 따라 증폭산물을 추출하고, 최종 30 μL의 Elution 버퍼에 회수하였다. 회수된 증폭 산물은 염기서열 분석 업체인 ㈜마크로젠에 의뢰하여, 락토바실러스 람노서스의 종-특이적 PCR primer인 Forward (LU-5)와 Reverse (RhaII)로 각각 양방향을 읽고, overlap되는 서열을 연결하여 최종 112 bp의 염기서열을 완성하였다. 완성된 염기서열은 NCBI BLAST 프로그램을 사용하여 비교하였다. 유전체로부터 증폭된 산물의 염기서열과 화장품 제형으로부터 증폭된 산물의 염기서열은 NCBI BLAST 분석 결과, 99% (111/112 match) 이상 일치했고, 서열번호 7의 유전자 서열과 같다. 개체별로 차이가 나는 부분은 서열번호 7에서 밑줄로 표시하였는데(화장품 시료에서 A의 deletion이 일어남), 이는 화장품 원료 제조를 위한 열처리 공정 및 화장품 제형 제조를 위한 살균에 의한 열처리와 각종 화학적 조성물에 의해 핵산 내 변이가 나타나거나, 오차범위 이내의 분석 장비 자체의 오류일 수 있어 본 결과는 종-특이적 타겟 서열에 primer가 특이적으로 잘 결합하여 성공적으로 PCR이 수행되었음을 의미한다.

이 결과는 락토바실러스 플란타룸, 비피도박테리움 브레브의 증폭산물을 이용하여 동일하게 실험을 수행해도 동일하게 나타났다.

이상의 실험 결과들을 최종 분석하면 다음과 같다.

본 발명에서는 히알루론산-용암해수 용매를 이용함으로써, 열처리와 화학적 반응으로 인해 불안정화되고 응집된 핵산을 열처리 과정에서 풀어주고, 용암해수의 마그네슘, 칼슘, 칼륨의 양이온들이 denaturation된 핵산 단일가닥의 인산기 부위에 이온성 결합 반응하여 풀어진 핵산을 안정화시키거나 열처리 이후 냉각 단계에서 단일 가닥의 핵산들이 다시 상보적 결합을 개시할 때, 다른 단백질류와 응집되는 것을 억제함으로써 핵산가닥이 온전히 현탁액 내에 가닥으로 잔류할 수 있게 도와주게 하였다. 결과적으로 현탁액 내 해리된 핵산가닥은 PCR 조성물 내에서 온전히 denaturation됨으로써 primer가 결합하여 증폭을 개시하고 DNA 중합효소가 접근할 수 있게 함을 보여주었다.

<110> HYUNDAI BIOLAND Co.,Ltd. <120> Detection method for dermabiotics in microbiome of cosmetics sample <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 ctagcgggtg cgactttgtt 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 2 gcgatgcgaa tttctattat ta 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 3 attcatagtc tagttggagg t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 4 cctgaactga gagaatttga 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Bifidobacterium breve <400> 5 ccggatgctc catcacac 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Bifidobacterium breve <400> 6 acaaagtgcc ttgctccct 19 <210> 7 <211> 113 <212> DNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 7 gcgatgcgaa tttctattat tagaaactca tacaaatacg ctgtgttctc ggcaatttaa 60 aacatttaca acaatgatat ccagttttca aagaacaaag tcgcacccgc tag 113 <210> 8 <211> 248 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum <400> 8 cctgaactga gagaatttga tttaatctac tgggctatca ccatctatgg cggattttcc 60 caaatccttc gactatcaag ttctttggta actcaaatgt tcagtcctac aaccccaaag 120 tgcaagcact ttggtttggg ctgttccccg ttcgctcgcc gctacttagg gaatcgaaat 180 ttctttatat tcctgctgct aatgagatgt ttcagttcac agcgtttacc tccaactaga 240 ctatgaat 248 <210> 9 <211> 248 <212> DNA <213> Bifidobacterium breve <400> 9 cctgaactga gagaatttga tttaatctac tgggctatca ccatctatgg cggattttcc 60 caaatccttc gactatcaag ttctttggta actcaaatgt tcagtcctac aaccccaaag 120 tgcaagcact ttggtttggg ctgttccccg ttcgctcgcc gctacttagg gaatcgaaat 180 ttctttatat tcctgctgct aatgagatgt ttcagttcac agcgtttacc tccaactaga 240 ctatgaat 248

Claims

(제1단계) 마이크로바이옴 균주 유래 원료가 함유된 화장품 시료를 히알루론산 및 용암해수의 혼합용매에 현탁하여 원료 현탁액을 제조하는 단계;
(제2단계) 상기 원료 현탁액을 열처리하는 단계;
(제3단계) 열처리된 원료 현탁액을 1~10℃까지 냉각하는 단계;
(제4단계) 냉각된 원료 현탁액을 이용하여 종-특이적 PCR 분석을 수행하는 단계;
를 포함하는 분석방법으로서,
상기 제1단계의 화장품 시료는 6 μg/mL 이상의 핵산을 함유하는 것이고,
상기 제1단계의 혼합용매는 히알루론산이 0.01~0.2%(w/v) 함유된 10~70%(v/v) 용암해수 수용액을 멸균한 용매인 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1단계의 마이크로바이옴 균주는 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.), 스크렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 락토코커스 속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스 속(Enterococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 바이셀라 속(Weissella sp.), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 바실러스 속(Bacillus sp.), 스테필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 프로피오니박테리움 속(Propionibacterium sp.)으로 이루어진 군에서 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1단계의 화장품의 제형은 화장수, 유액, 젤, 크림, 에센스, 앰플, 로션, 오일, 파운데이션 및 두발용 화장료를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로바이옴 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법.
삭제
제1항에 있어서,
마이크로바이옴 균주 유래 원료는 균체 파쇄물로서, 120~125℃, 0.12~0.15 Mpa의 압력 조건으로 100~150분간 열압 추출하여 균주 세포를 파쇄시키고 2~10℃로 냉각한 후에 균주 파쇄액을 원심분리하여 얻은 상등액인 것을 특징으로 하는 화장품 시료 내의 더마바이오틱스 분석 방법.