CN108330185A - 双重pcr技术检测蜡样芽孢杆菌的引物对和方法 - Google Patents
双重pcr技术检测蜡样芽孢杆菌的引物对和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108330185A CN108330185A CN201710041994.5A CN201710041994A CN108330185A CN 108330185 A CN108330185 A CN 108330185A CN 201710041994 A CN201710041994 A CN 201710041994A CN 108330185 A CN108330185 A CN 108330185A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus cereus
- primer pair
- bacteria
- detection
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 23
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 claims abstract 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 241000588697 Enterobacter cloacae Species 0.000 description 5
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 5
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 5
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 5
- 101100439426 Bradyrhizobium diazoefficiens (strain JCM 10833 / BCRC 13528 / IAM 13628 / NBRC 14792 / USDA 110) groEL4 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 4
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 101150013736 gyrB gene Proteins 0.000 description 4
- 101150012629 parE gene Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 206010004022 Bacterial food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 101150012509 sub gene Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 101100069837 Bacillus cereus gyrB gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 1
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 1
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N deoxynivalenol Chemical compound C([C@@]12[C@@]3(C[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1C=C(C([C@@H](O)[C@@]13CO)=O)C)C)O2 LINOMUASTDIRTM-QGRHZQQGSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000005338 frosted glass Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N vomitoxin hydrate Natural products OCC12C(O)C(=O)C(C)=CC1OC1C(O)CC2(C)C11CO1 LINOMUASTDIRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及用于快速检测蜡样芽孢杆菌的引物和方法，其特征在于利用一对或多对引物和多重PCR的方法对蜡样芽孢杆菌属细菌的进行特异性检测。本发明还涉及所述引物组合或试剂盒在检测蜡样芽孢杆菌属细菌中的应用，使用本方法可以快速，简洁，高灵敏度，高特异性地检测蜡样芽孢杆菌。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及用于检测蜡样芽孢杆菌属细菌的高特异性和高灵敏度的2对核苷酸组合物，和使用该两对引物的组合物进行的检测方法及该组合物在实际样品检测中的应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌分布广泛，常见于土壤污水，在植物性食品和许多生熟食品也很常见。兼性好氧型的革兰氏阳性杆菌。蜡样芽孢杆菌大小为（1μm~1.3μm）×（3μm~5μm），能够形成芽孢，菌体两端较平整，多呈链状排列，；在普通琼脂上形成的菌落较大，灰白色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。蜡样芽孢杆菌是条件致病菌，最常见的通过腹泻毒素和呕吐毒素导致食品中毒。偶尔能通过菌体感染引起人的眼部疾病、心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病。在人们的日常生活中，大多数食物中毒都是由有害细菌引起的，在细菌性食物中毒中，蜡样芽孢杆菌食物中毒是比较常见的。据我国食品污染物和食源性疾病监测网络统计，2003年，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0%，为细菌性食物中毒的第四位，而实际数据很可能远大于各国官方报道，并且有增长的趋势。
传统的检测方法依赖于生化鉴定和形态学特点，主要包括培养法、血清分析法等，这些检测存在步骤繁琐、费时费力、不易分辨、特异性差、灵敏度不高等缺点。基于蜡样芽孢杆菌特异性基因的PCR检测方法的快速灵敏，特异性强等的特点被广泛应用，而快速灵敏和准确的多基因检测是蜡样芽孢杆菌发展的主要方向。蜡样芽孢杆菌的污染在乳制品中也经常检出，已经成为影响乳制品质量的主要微生物。众所周知，原料乳品质的优劣对加工乳品的影响很大，鉴于上述情况，建立对蜡样芽孢杆菌的快速、灵敏、高特异的检测方法尤为重要。
聚合酶链式反应(PCR)是Kary Mullis在1985年发明的一种体外快速扩增目的基因的技术，该技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，包括模板DNA的变性、模板DNA与引物的退火和引物的延伸。扩增过程中以单链DNA为模板，人工合成的核苷酸为引物，并在DNA聚合酶的作用下沿着5’à3’方向扩增DNA片段，从而达到目的基因大量的复制。PCR的方法以用于多种多样的基因检测中。
多重PCR（Multiplex PCR）是在同一PCR反应体系里加上两对或以上引物，针对同一个DNA模板的不同区域或者多个DNA模板进行扩增，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR反应相同。其特点有：①高效性，在同一反应管内同时检测多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可以检测多种病原体。②系统性，mPCR很适宜成组病原体的检测。③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大节省时间，节省试剂，节约经费开支。
目前，国内少见报道能快速、简单、特异且灵敏地针对蜡样芽孢杆菌属细菌检测的双重PCR方法。
因此，本领域亟需建立一种方便、特异性好、灵敏度高的蜡样芽孢杆菌属细菌的检测方法，用于蜡样芽孢杆菌的定性检测。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供检测蜡样芽孢杆菌属细菌的核苷酸引物。
本发明的另一个目的在于，提供检测蜡样芽孢杆菌属细菌的多重PCR检测方法。
针对以上发明目的，本发明提供了以下技术方案。
一方面，本发明提供了两对检测蜡样芽孢杆菌属细菌的核苷酸引物，所述两对引物为gyrB能编码蜡样芽孢杆菌具有高拷贝的旋转酶的B亚基因，groEL能编码分子伴侣蛋白。
在一个实施方式中，针对蜡样芽孢杆菌gyrB基因的特异性引物对为：
gyrB-F：ATTGGTGACACCGATCAAACA
gyrB-R：TCATACGTATGGATGTTATTC
扩增产物为365bp；
针对groEL基因的特异性引物对：
groEL-F：AGCTATGATTCGTGAAGGT
groEL-R：AGGTAATAACGCCGTCGT
扩增产物为236bp。
一方面，本发明提供了用于通过多重PCR方法检测蜡样芽孢杆菌属细菌的试剂盒，其中所述试剂盒包括本发明的两对引物。
在一个实施方式中，所属试剂盒还包括用于提取蜡样芽孢杆菌属细菌的DNA试剂、用于多重PCR的试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照以及使用说明书。
另一方面，本发明提供了通过多重PCR检测蜡样芽孢杆菌属细菌的方法，所述方法包括使用本发明的引物对或者本发明的试剂盒。
在一个实施方式中，多重PCR反应体系（25μL）包括：10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5μL；dNTPs Mixture（2.5μM）2μL；Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.3μL；引物-F/R均为1μL；DNA模板2μL；余量为ddH2O。
在一个实施方式中，所述多重PCR反应条件为94℃10min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min。
在一个实施方式中，所属检测方法包括步骤：
（a）从待测样品中提取DNA样品；
（b）提供多重PCR反应条件；
（c）使用本发明的引物对或试剂盒，通过PCR扩增方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
附图说明
图1,2显示两对引物gyrB与groEL特异性扩增11株蜡样芽孢杆菌属细菌的电泳阳性结果，其中包含11个蜡样芽孢杆菌属ATCC细菌：Bacillus cereus Frankland andFrankland (ATCC® 10702™，ATCC® 10987™，ATCC® 13061™，ATCC® 14579™，ATCC®14737™，ATCC® 15816™，ATCC® 19637™，ATCC® 27348™，ATCC® 27877™，ATCC® 33019™，ATCC® 49063™)及阴性对照阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），产气肠杆菌（Enterobacter areogenes），宋内志贺氏菌（Shigella sonnei），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocu saureus），单増李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），沙门氏菌（Salmonella ssp.）与空白对照。
图3是以上述两对引物混合后构建的双重PCR体系扩增11株蜡样芽孢杆菌属细菌的电泳阳性结果，其中包含上述11株蜡样芽孢杆菌属ATCC标准菌株及阴性对照6株与空白对照。
图4是以蜡样芽孢杆菌为例，检测本发明的蜡样芽孢杆菌特异性引物对的灵敏度的结果，其中1-5为加入双重PCR体系模板的十倍浓度稀释样，6为空白对照，重复3次。
图5,6,7是对20株市售食品样品分离菌株的两对引物检测验证及双重PCR检测结果。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不仅仅局限于以下实例。
实施例1 PCR体系构建
本实施例通过如下实验对蜡样芽孢杆菌属细菌的2个引物对进行了特异性验证。
通过对包括11株蜡样芽孢杆菌属细菌的ATCC标准菌株及6株阴性对照菌阴性对照阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae），产气肠杆菌（Enterobacter areogenes），宋内志贺氏菌（Shigella sonnei），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocu saureus），单増李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），沙门氏菌（Salmonella ssp.）及空白对照扩增其编码蜡样芽孢杆菌具有高拷贝的旋转酶的B亚基因及编码分子伴侣蛋白基因的部分序列，来验证本发明的蜡样芽孢杆菌属细菌的特异性引物对。
所使用的主要检测仪器：
微量移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL，Eppendorf），高速台式离心机（Pico17，Thermo），核酸蛋白分析仪（DU640，德国Beckman公司），PCR仪（ABI VERITI96WellApplied Biosystems，USA），电泳仪，凝胶成像仪（德国Gene Genius公司）等。
检测所使用主要试剂：
Wizard Genomic DNA纯化试剂盒（Promega，美国）；宝生物PCR扩增试剂盒（Takara，日本）；脑心浸出液（Brain heart infusion，北京陆桥技术股份有限公司）；无水乙醇（北京六合通公司）。
检测主要步骤：
将上述11株蜡样芽孢杆菌（ATCC® 10702™，ATCC® 10987™，ATCC® 13061™，ATCC®14579™，ATCC® 14737™，ATCC® 15816™，ATCC® 19637™，ATCC® 27348™，ATCC® 27877™，ATCC® 33019™，ATCC® 49063™）及阴性对照6株菌阴性对照阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae），产气肠杆菌（Enterobacter areogenes），宋内志贺氏菌（Shigella sonnei），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocu saureus），单増李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），沙门氏菌（Salmonella ssp.）与空白对照接种于脑心浸出液BHI中36℃过夜培养。取1mL过夜培养的菌液于1.5mL的离心管里用DNA提取试剂盒Wizard Genomic DNA按其说明书提取。用核算蛋白分析仪测试所提DNA浓度与纯度，调试模板浓度至合适值，4℃冷藏待扩增。
用宝生物的PCR扩增试剂盒（Takara，日本）进行PCR扩增。
25μL的PCR体系：
10×PCR buffer Mix（含Mg2+）3μL
dNTPs 2.5μL
TaqDNA聚合酶0.3μL
gyrB-F/R或groEL-F/R各1μL
DNA2μL
加ddH2O定量至25μL
注：每次PCR扩增检测均设立相应的空白对照（ddH2O代替DNA模板），检测反应体系是否受到污染。
扩增条件：
94℃ 10min
94℃ 30s
58℃ 30s
72℃ 30s
30个循环
72℃ 10min。
扩增产物4℃保存。将双重PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果如图1,2所示。用两对基因扩增DNA模板时，11株蜡样芽孢杆菌属细菌（1-11号泳道）都在对应条带大小处明显有亮色条带，而6株阴性对照（12-17号泳道）与空白对照（18号泳道）均无对应条带显示。将两对引物加入同一个体系，如图3所示，11株蜡样芽孢杆菌属细菌（1-11号泳道）均在对应两基因大小处出现亮带，阴性对照（12-17号泳道）与空白对照（18号泳道）均未出现亮带，表示两对引物gyrB与groEL对蜡样芽孢检出的特异性良好，且在同一体系中互相的扩增表达未受到彼此抑制。
实施例2 灵敏度
本实施例为通过如下实验对蜡样芽孢杆菌多重PCR体系进行了灵敏度验证。
为确定蜡样芽孢杆菌特异性及其特异引物对组合的绝对检出限，将该模板（以ATCC® 10702™为例）用无菌水分别稀释为20ng/μL、2 ng/μL、200pg/μL、20pg/μL、2 pg/μL的浓度（1-5号泳道）作为PCR模板，分别按实施例1中多重PCR体系和反应条件进行扩增，6号泳道为空白对照，结果如图4所示。
20ng/μL、2 ng/μL、200pg/μL、20pg/μL浓度时电泳图显示2条对应大小条带，2 pg/μL浓度只出现一条条带。实验结果证明建立的多重PCR体系检测方法能够检测出蜡样芽孢杆菌属细菌的终浓度为20 pg/μL（下限浓度）。
实施例3 市售样品分离株检测
本发明的发明人通过如下实验对市售样品分离株的蜡样芽孢杆菌属细菌进行检测验证。
选取20株分离菌株，按照上述多重PCR体系和反应条件进行多重PCR检测，以确定所建立的多重PCR方法是否具有可行性。
每个菌株重复3次。结果如图5,6,7所示，20株样品分离株（1-20号泳道）中，全部为蜡样芽孢杆菌属细菌能检出gyrB及groEL基因，空白对照（21号泳道）无法检出，表明该方法能有效检出蜡样芽孢杆菌属细菌，并可用于其快速检测。
Claims (7)
1.用于通过PCR方法检测蜡样芽孢杆菌属细菌的双重核苷酸引物对，其中所述引物对的序列为SEQ ID No.s 1和2。
2.权利要求1所述的引物对。
3.用于通过双重PCR方法检测蜡样芽孢杆菌属细菌的试剂盒，其中所述试剂盒包括权利要求1-2所述任一项所述的引物对。
4.权利4所述试剂盒，还包括用于提取蜡样芽孢杆菌属细菌DNA的试剂，用于双重PCR的试剂、阳性对照、阴性对照、空白对照以及使用说明书。
5.通过双重PCR方法检测蜡样芽孢杆菌属细菌的方法包括权利要求1-2中任一项所述引物对及权利要求3-4中任一项所述试剂盒。
6.权利要求5所述方法，包括步骤：从待测样品中提取DNA样品；提供双重PCR方法反应条件；使用权利要求1-2中任一项所述引物对及权利要求3-4中任一项所述试剂盒，通过双重PCR方法进行核酸扩增反应和检测扩增产物。
7.权利要求1-2任一项所述引物对及权利要求3-4任一项所述试剂盒在检测蜡样芽孢杆菌属细菌中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710041994.5A CN108330185A (zh) | 2017-01-20 | 2017-01-20 | 双重pcr技术检测蜡样芽孢杆菌的引物对和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710041994.5A CN108330185A (zh) | 2017-01-20 | 2017-01-20 | 双重pcr技术检测蜡样芽孢杆菌的引物对和方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108330185A true CN108330185A (zh) | 2018-07-27 |
Family
ID=62922971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710041994.5A Pending CN108330185A (zh) | 2017-01-20 | 2017-01-20 | 双重pcr技术检测蜡样芽孢杆菌的引物对和方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108330185A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111996266A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-11-27 | 江苏海洋大学 | 一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 |
| CN116769937A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-09-19 | 浙江省食品药品检验研究院 | 一种中药饮片常见致病菌检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100809547B1 (ko) * | 2006-10-24 | 2008-03-04 | 경희대학교 산학협력단 | 다중효소연쇄중합반응을 이용한 바실러스 세레우스 그룹의동시 검출방법 |
| CN103451308A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-18 | 北京卓诚惠生生物科技有限公司 | 检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒 |
-
2017
- 2017-01-20 CN CN201710041994.5A patent/CN108330185A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100809547B1 (ko) * | 2006-10-24 | 2008-03-04 | 경희대학교 산학협력단 | 다중효소연쇄중합반응을 이용한 바실러스 세레우스 그룹의동시 검출방법 |
| CN103451308A (zh) * | 2013-09-17 | 2013-12-18 | 北京卓诚惠生生物科技有限公司 | 检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的引物、探针及方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CLERCK E.D.ET AL: "Isolation, characterization, and identification of bacterial contaminants in semifinal gelatin extracts", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| FORGHANI F.ET AL: "Improved multiplex polymerase chain reaction (PCR) detection of bacillus cereus group and its toxic strains in food and environmental samples", 《AFR.J.MICROBIOL.RES》 * |
| SI-HONG PARK ET AL: "Simultaneous detection and identification of Bacillus cereus group bacteria using multiplex PCR", 《J.MICROBIOL.BIOTECHNOL》 * |
| YAMADA S.ET AL: "Cloning and nucleotide sequence analysis of gryB of Bacillus cereus, B.thuringiensis, B.mycoides, and B.anthracis and their application to the detection of B.cereus in rice", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| 刘秀峰 等: "多重PCR检测蜡样芽胞杆菌的研究", 《中国热带医学》 * |
| 罗寿军: "蜡样芽胞杆菌实验室诊断技术进展", 《职业与健康》 * |
| 闫韶飞 等: "我国市售婴儿配方乳粉中蜡样芽胞杆菌污染及其毒力基因调查", 《中国食品卫生杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111996266A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-11-27 | 江苏海洋大学 | 一种致吐型蜡样芽孢杆菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用 |
| CN116769937A (zh) * | 2023-03-28 | 2023-09-19 | 浙江省食品药品检验研究院 | 一种中药饮片常见致病菌检测试剂盒 |
| CN116769937B (zh) * | 2023-03-28 | 2024-11-12 | 浙江省食品药品检验研究院 | 一种中药饮片常见致病菌检测试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cocolin et al. | Molecular detection and identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis and Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines | |
| CN109593868B (zh) | 一种用于检测假单胞菌属细菌的特征性核苷酸序列及其特异性引物、试剂盒和检测方法 | |
| CN104059977B (zh) | 一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒 | |
| Appelt et al. | Development and comparison of loop-mediated isothermal amplification and quantitative polymerase chain reaction assays for the detection of Mycoplasma bovis in milk | |
| Yuan et al. | Development of the saltatory rolling circle amplification assay for rapid and visual detection of Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice | |
| CN107058511A (zh) | 一种建立快速检测呼吸道样本中肺炎克雷伯菌三重qPCR方法 | |
| CN104212901A (zh) | 用于金黄色葡萄球菌耐药性检测的组合物 | |
| CN107541509B (zh) | 用于检测奶牛乳房炎6种传染性病原体的lamp引物组合及其应用 | |
| CN111154900B (zh) | 铜绿假单胞菌特异性新分子靶标及其快速检测方法 | |
| Fanelli et al. | Selective detection of Pseudomonas syringae pv. tomato using dot blot hybridization and real‐time PCR | |
| CN104480203A (zh) | 一种快速检测乳酸乳球菌的引物及其检测方法和试剂盒 | |
| CN108330185A (zh) | 双重pcr技术检测蜡样芽孢杆菌的引物对和方法 | |
| CN116987802B (zh) | 一种用于检测呕吐型蜡样芽孢杆菌的rpa引物对及其应用 | |
| CN104726550A (zh) | 一种检测食品中金黄色葡萄球菌活细胞的试剂盒 | |
| CN105154538B (zh) | 一种军团菌快速检测与分型的引物及方法 | |
| CN112176080A (zh) | 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法 | |
| JP5048622B2 (ja) | 乳酸菌検出用ｐｃｒプライマー | |
| CN110846423A (zh) | 荧光假单胞菌荧光定量pcr快速检测方法及试剂盒和应用 | |
| CN104611459A (zh) | 一种一次性卫生用品中5种常见致病菌多重pcr快速检测的试剂盒及检测方法 | |
| CN115992274A (zh) | 荧光定量pcr检测bcc的引物探针及其设计方法和试剂盒 | |
| CN111424102B (zh) | 一种化妆品特定菌多重pcr快速检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN103122383A (zh) | 猪链球菌种水平荧光定量pcr检测方法 | |
| CN102936621A (zh) | 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 | |
| CN111826453A (zh) | 艰难梭菌检测引物或双重检测引物组及其试剂盒和快速检测方法 | |
| CN104975017A (zh) | 能扩增多种食品微生物的引物对及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20180727 |