CN111394444A - 使用凝聚核酸颗粒的装置制备 - Google Patents

Abstract

一种对核酸链进行测序的方法包括接收具有耦联到聚合物基质的核酸链的颗粒，将所述颗粒暴露于包括凝聚剂的溶液，以及将所述颗粒施加到表面，所述颗粒沉积在所述表面上。

Description

使用凝聚核酸颗粒的装置制备

本申请是中国发明专利申请(申请日：2014年9月12日；申请号：201480057632.X(国际申请号：PCT/US2014/055485)；发明名称：使用凝聚核酸颗粒的装置制备)的分案申请。

相关申请交叉参考

本申请要求于2013年9月13日提交的美国临时申请第61/877,745号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。

本申请要求于2014年7月2日提交的美国临时申请第62/020,292号的权益，所述申请以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本公开总体涉及用于制备适用于核酸测序的装置的系统和方法，具体地涉及用于制备利用含核酸的颗粒的此类装置的系统和方法。

背景技术

核酸链(尤其DNA)的测序在包括医学、农业和生物研究的先进领域中已变得愈来愈重要。然而，常规的用于对核酸链进行测序的凝胶技术已证实耗时且昂贵。最新的研发依赖于含核酸的样品沉积在衬底上。依据测序技术，可通过测量对核酸添加的离子响应或通过测量由核酸添加引起的萤光发射来确定核酸样品的序列。

然而，依赖于核酸样本沉积在衬底上的此类技术具有由一些核酸链结合到衬底表面的失败造成的缺陷或由链非常接近于彼此地结合造成的缺陷。此类缺陷可导致衬底的未充分利用、不精确的数据、损失或不完全的样品或其他不准确性。

因而，改进的用于制备测序装置的系统和方法将是合乎需要的。

附图说明

通过参考附图，可更好地理解本发明，并且使本领域的技术人员清楚其众多特征和优势。

图1包括用于沉积核酸样品的示例性方法的图解。

图2包括用于制备核酸颗粒和制备用于测序的装置的示例性装置的图示。

图3包括在暴露于六氨合钴期间珠粒或颗粒的图像。

图4、图5、图6、图7和图8包括珠粒或颗粒对暴露于六氨合钴的尺寸响应的图表图解。

图9包括在暴露于或不暴露于六氨合钴两者的情况下，核酸结合珠粒或颗粒的离解动力学的曲线图解。

图10和图11包括凝聚剂对珠粒尺寸影响的曲线图解。

在不同附图中使用相同参考符号指示相似或相同的物件。

具体实施方式

在一个实施例中，方法包括制备核酸珠粒或颗粒、凝聚核酸珠粒以及将凝聚的核酸珠粒沉积在传感器衬底上。在另一个实例中，该方法包括将核酸珠粒沉积在传感器衬底上以及凝聚沉积的核酸珠粒。核酸珠粒或颗粒包括结合到一个或多个核酸链的珠粒。凝聚核酸珠粒可包括凝聚结合到珠粒的核酸、收缩珠粒的聚合物，或其组合，有效地减小核酸珠粒的尺寸。沉积之后，可洗涤凝聚的核酸珠粒，这可展开凝聚的核酸珠粒。随后，带有沉积的核酸珠粒的传感器衬底可用于核酸试验，如测序，例如合成测序。凝聚核酸珠粒或颗粒可包括将核酸珠粒或颗粒暴露于凝聚剂。凝聚试剂可凝聚核酸珠粒或颗粒的方面，例如凝聚核酸、颗粒的聚合物基质或其组合。在一个实例中，凝聚剂包括具有3⁺电荷的金属络合物。举例来说，金属络合物可为钴络合物，如钴-胺络合物。在另一实例中，凝聚剂包括的碱金属盐或碱土金属盐，如镁盐。在另一个实例中，凝聚试剂包括非离子聚合物试剂，如聚乙二醇类试剂。

在另一个实施例中，系统实施一种用于制备适用于测序的装置的方法。该系统可包括溶液容器、样品接收口或样品室，以及耦联到溶液容器和样品接收口或室的混合器。混合器可耦联到衬底制备单元。在一个实例中，溶液容器中的溶液包括凝聚试剂，其包括凝聚剂。或者，本文所述的方法和过程可人工地进行或伴随使用搅拌板、涡旋器(vortexer)、移液管、离心机或其它实验室设备进行。

样品接收口或样品室用于接收核酸珠粒或颗粒，所述核酸珠粒或颗粒具有聚合物基质和耦联到聚合物基质的核酸链。如在混合器中，混合凝聚试剂和核酸颗粒。结果，核酸链或聚合物基质凝聚，产生减小的直径或更大密度的颗粒。将已处理的颗粒转移到衬底制备单元，其中颗粒沉积在衬底上。在特定实例中，衬底包括限定凹孔的层，并且颗粒沉积在凹孔内。衬底可用于对珠粒或颗粒的核酸链进行测序。在一个实例中，将衬底转移到执行引起核酸链的测序的功能的测序装置。

或者，核酸珠粒可被施加到传感器衬底，并且在沉积核酸珠粒之后，凝聚试剂施加在传感器衬底之上。在另一个实例中，核酸珠粒可在沉积之前用凝聚剂处理，沉积、洗涤并在沉积和洗涤之后用凝聚剂处理。

如图1中所示，核酸珠粒或颗粒102包括聚合物基质104和核酸链106。虽然核酸链102示出为从聚合物基质104的表面延伸，但聚合物基质104可为多孔的，例如水凝胶，并且核酸链102可耦联到聚合物基质104并且延伸贯穿聚合物基质104。核酸珠粒或颗粒102可被处理以形成已处理的核酸珠粒或颗粒108。已处理的核酸颗粒108可具有比核酸颗粒102更小的直径。

表面部件116包括衬底110，所述衬底110包括限定凹孔114的层112。已处理的核酸颗粒108可沉积在凹孔114中。随后，可洗涤已处理的核酸颗粒108同时将其保留在凹孔114中。洗涤可产生具有增大的直径的核酸颗粒。可使用核酸珠粒或颗粒进行测序或其它实验同时将其保留在凹孔114中。

在一个实例中，核酸珠粒或颗粒102包括聚合物基质104和一个或多个耦联到聚合物基质104的核酸链106。聚合物基质104可由疏水性聚合物形成或可由亲水性聚合物(如水凝胶基质)形成。具体而言，聚合物基质104可包括聚合物，如多醣如琼脂糖、透明质酸或甲基纤维素；聚氧化烯烃如聚氧丁烯、聚氧乙烯或聚乙二醇，或聚氧丙烯；丙烯酰胺如二甲基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、N,N-聚二甲基丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚-N-羟基丙烯酰胺、聚-N-羟基烷基丙烯酰胺或其胺官能变异体；聚乙烯吡咯啶酮；聚苯乙烯；硅酮；聚(2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸)；其它丙烯酸酯聚合物；聚乙烯醇；其共聚物或衍生物；或其任何组合。在一个特定实例中，聚合物基质104可由聚苯乙烯形成。在另一实例中，聚合物基质104由聚氧乙烯形成。在另一个实例中，聚合物基质104由丙烯酰胺(如羟基烷基丙烯酰胺、胺封端的丙烯酰胺或其衍生物)形成。

举例来说，聚合物基质104可由单体形成，所述单体包括可自由基聚合单体如乙烯基类单体。在一个实例中，单体可包括丙烯酰胺、乙酸乙烯酯、羟烷基甲基丙烯酸酯或其任何组合。在一个特定实例中，亲水性单体为丙烯酰胺，如包括羟基末端基团、氨基末端基团、羧基末端基团或其组合的丙烯酰胺。在一个实例中，亲水性单体为氨基烷基丙烯酰胺、用胺封端的聚丙二醇官能化的丙烯酰胺(D，下文示出)、丙烯酰哌嗪(acrylopiperazine)(C，下文示出)或其组合。在另一实例中，丙烯酰胺可为羟基烷基丙烯酰胺，如羟基乙基丙烯酰胺。具体而言，羟基烷基丙烯酰胺可包括N-三(羟基甲基)甲基)丙烯酰胺(A，下文示出)、N-(羟基甲基)丙烯酰胺(B，下文示出)或其组合。在另一个实例中，可使用单体的混合物，如羟基烷基丙烯酰胺与胺官能化丙烯酰胺的混合物或丙烯酰胺与胺官能化丙烯酰胺的混合物。在一个实例中，胺官能化丙烯酰胺可包括在100:1至1:1范围，如100:1至2:1范围、50:1至3:1范围、50:1至5:1范围或甚至50:1至10:1范围内的羟基烷基丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺比率或丙烯酰胺:胺官能化丙烯酰胺比率。

在一个特定实例中，聚合物基质104为水凝胶珠粒衬底。

聚合物基质104可包括可杂交模板多核苷酸的耦联部位。耦联部位可包括末端基团，如羟基或氨基末端基团。举例来说，耦联部位可各自包括与模板多核苷酸的部分互补的耦联的寡核苷酸。模板多核苷酸可包括目标多核苷酸或与目标多核苷酸互补的片段，除此之外还有与耦联的寡核苷酸互补的片段。

耦联的寡核苷酸可结合到聚合物基质104。聚合物基质104的聚合物可被活化以促进与目标分析物(如寡核苷酸或多核苷酸)的结合。举例来说，可增强聚合物基质104上的官能团以允许与目标分析物或分析物受体结合。在一个特定实例中，可用能够将亲水性聚合物官能团转化成可进行亲核或亲电取代的反应性部分的试剂改性亲水性聚合物的官能团。举例来说，衬底上的羟基可通过用磺酸根基团或氯置换至少一部分羟基来活化。示例性磺酸根基团可衍生自三氟乙烷磺酰氯(tresyl chloride)、甲磺酰氯、甲苯磺酰氯或对甲苯磺酰氯(fosyl chloride)或其任何组合。磺酸根可用于使亲核试剂置换磺酸根。磺酸根可进一步与释放的氯反应以提供氯化官能团，其可用于结合颗粒的过程中。在另一实例中，可活化衬底上的胺基。

举例来说，目标分析物或分析物受体可通过与磺酸根的亲核取代结合到亲水性聚合物。在一个特定实例中，用如胺或硫醇的亲核试剂封端的目标分析物受体可进行亲核取代以置换聚合物聚合物基质104的表面上的磺酸根。

在另一实例中，磺化聚合物基质可与单官能或多官能单亲核或多亲核试剂(如顺丁烯二酰亚胺)进一步反应，所述试剂可形成与颗粒的附接同时维持针对包含亲电子基团的寡核苷酸的亲核活性，如马来酰亚胺)。另外，残余亲核活性可通过附接到包含多亲电子基团的试剂转化成亲电活性，所述多亲电子基团随后附接到包含亲核基团的寡核苷酸。

在另一实例中，在聚合期间可添加含官能团的单体。单体可包括(例如)含羧酸、酯、卤素或其它胺反应性基团的丙烯酰胺。酯基可在与胺封端的寡核苷酸反应之前被水解。

其它结合技术包括使用包含胺的单体。胺基为可用胺反应性双官能双亲电试剂进一步改性的亲核性基团，所述胺反应性双官能双亲电试剂在附接到珠粒或颗粒之后产生单官能亲电子基团。这种亲电子基团可与具有亲核性基团(例如胺或硫醇)的寡核苷酸反应，导致寡核苷酸通过与空缺亲电子试剂反应而附接。

如果聚合物基质由氨基-丙烯酰胺和羟基-丙烯酰胺的组合制备，那么衬底可包括亲核氨基和中性羟基的组合。氨基可用二官能双亲电部分(如二-异氰酸酯或双-NHS酯)改性，产生对亲核试剂具有反应性的亲水性颗粒。示例性双-NHS酯包括双丁二酰亚胺基C2-C12烷基酯，如双-丁二酰亚胺基辛二酸酯或双丁二酰亚胺基戊二酸酯。

其它活化化学反应包括并入转化指定官能团的多个步骤以供应特定所需键。举例来说，磺酸根改性的羟基可通过若干方法转化成亲核性基团。在一个实例中，磺酸根与叠氮根阴离子反应产生叠氮取代的亲水性聚合物。叠氮化物可直接用于通过“CLICK”化学方法与乙炔取代的生物分子结合，所述化学方法可使用或不使用铜催化剂进行。任选地，叠氮化物可通过例如用氢催化还原或用有机膦还原转化成胺。然后可用多种试剂(如二异氰酸酯、双-NHS酯、三聚氯化氰或其组合)将所得胺转化成亲电子基团。在一个实例中，使用二异氰酸酯产生在聚合物与连接基团之间的脲键，这产生了残余异氰酸酯基，其能够与氨基取代的生物分子反应从而产生在连接基团与生物分子之间的脲键。在另一实例中，使用双-NHS酯产生在聚合物与连接基团之间的酰胺键以及残余NHS酯基，残余酯基能够与氨基取代的生物分子反应从而产生在连接基团与生物分子之间的酰胺键。在另一实例中，使用三聚氯化氰产生在聚合物与连接基团之间的氨基-三嗪键以及两种残余氯-三嗪基团，其中的一个能够与氨基取代的生物分子反应以产生在连接基团与生物分子之间的氨基-三嗪键。其它亲核基团可通过磺酸根活化并入到颗粒中。举例来说，磺化颗粒与硫代苯甲酸阴离子的反应以及随后硫代苯甲酸酯的水解向颗粒中并入硫醇，其随后与顺丁烯二酰亚胺取代的生物分子反应从而产生与生物分子的硫基-丁二酰亚胺键。硫醇还可与溴基-乙酰基基团反应。

或者，在聚合期间可使用丙烯酰化寡核苷酸以并入寡核苷酸。示例性丙烯酰化寡核苷酸可包括离子交换寡核苷酸。

聚合物基质104的直径可在0.1μm至15μm的范围内。举例来说，聚合物基质104的直径可在0.1μm至10μm的范围内，如0.1μm至5.0μm的范围、0.1μm至3.0μm的范围或0.1μm至1μm的范围。在一个特定实例中，核104的直径可在0.1μm至0.8μm的范围内，如0.1μm至0.5μm的范围。

核酸链106的长度可为至少50个碱基。举例来说，核酸链的长度可为至少100个碱基。在一个特定实例中，核酸链的长度可在100个碱基与10,000个碱基之间，如在100个碱基与8,000个碱基之间、在100个碱基与5,000个碱基之间、在100个碱基与1,000个碱基之间或在150个碱基与500个碱基之间。核酸珠粒或颗粒102可包括多于一个结合到聚合物基质104的核酸链。在一个特定实例中，核酸颗粒上的核酸链相同。举例来说，颗粒可包括至少100个，如至少1000或甚至至少10,000个核酸链的相同拷贝。具体而言，核酸颗粒102可包括至少100,000个核酸链106的拷贝，如至少1,000,000个核酸链的拷贝。在一个实例中，核酸颗粒102包括不超过100,000,000个核酸链的拷贝。

当与包括凝聚剂的溶液混合时，核酸链或聚合物基质凝聚。在一个实例中，凝聚剂包括金属络合物。金属络合物可具有3⁺电荷并且可作为盐提供到溶液中。举例来说，金属络合物盐可为卤盐，如氯化盐或碘化盐具体而言，金属络合物包括钴，例如形成钴有机络合物，如钴-氨络合物。在一个实例中，金属络合物可包括六氨合钴。在另一实例中，金属络合物包括三(乙二胺)钴。在另一个实例中，金属络合物包括1,3,6,8,10,13,16,19-八氮杂二环-[6.6.6]二十烷钴。

具体而言，溶液可包括一定浓度的金属络合物，使得当与样品混合时，所得溶液中金属络合物的浓度为至少1μM，如至少10μM、至少20μM或至少50μM。在一个实例中，浓度可在10μM至1μM的范围内，如20μM至500μM的范围内或甚至20μM至350μM的范围内。在一个替代实例中，浓度为至少200μM，如至少500μM或至少1mM。举例来说，浓度可为至少4.7mM，如至少9.8mM、至少14.9mM或甚至至少19.7mM。具体而言，浓度不大于100mM，如不大于50mM。当相对于DNA的浓度表达时，在DNA的浓度以μg/ml表达的情况下，金属络合物的浓度与DNA的浓度的比率为至少0.5，如至少1.0、至少1.5、至少2.0或甚至至少3.0，但不大于100。

或者或另外，溶液可包括影响珠粒或颗粒102的聚合物基质104的密度的凝聚剂。举例来说，溶液可包括醇，如甲醇、乙醇或异丙醇(IPA)，其可影响颗粒102的聚合物基质104的密度。具体而言，溶液可包括浓度在0.1vol.％至60vol.％，如0.1vol.％至50vol.％、0.1vol.％至30vol.％、0.1vol.％至20vol.％或甚至0.1vol.％至10vol.％的范围内的醇(如甲醇)。举例来说，溶液内的醇的浓度可在0.1vol.％至5vol.％，如1vol.％至5vol.％的范围内。在另一实例中，溶液可包括浓度在0.1vol.％至60vol.％，如1.0vol.％至60vol.％、5.0vol.％至60vol.％、10vol.％至60vol.％或甚至40vol.％至60vol.％的范围内的醇(如乙醇或IPA)。

在另一实例中，凝聚剂包括浓缩的碱金属盐或碱土金属盐，如卤盐。在附加实例中，凝聚剂可包括例如浓度在1mM至1M的范围，如30mM至1M的范围、50mM至1M的范围、50mM至800mM的范围或甚至50mM至500mM的范围内的氯化镁。

凝聚剂还可为非离子聚合物，如聚乙二醇类聚合物。在一个特定实例中，聚乙二醇类聚合物的分子量在1000与100000之间的范围内，如在2000与20000之间的范围、在5000与15000之间或在8000与12000之间的范围内。非离子聚合物可以以0.1wt％至20.0wt％的范围，如0.5wt％至15.0wt％的范围、0.5wt％至10wt％的范围或2.5wt％至7.5wt％的范围内的浓度包括在内。

溶液的其余部分可包括缓冲溶液，如缓冲盐水溶液。举例来说，溶液的其余部分可包括磷酸盐缓冲盐水溶液。具体而言，溶液可包括卤化钠盐或卤化钾盐、磷酸钠盐或磷酸钾盐和聚山梨醇酯。此类盐可以(例如)以在1mM至500mM，如50mM至350mM或甚至150mM至250mM的范围内的量包括在内。在一个实例中，氯化钾可以以在0.5M至2M的范围内，如0.8M至1.5M的范围或甚至0.8M至1.2M的范围内的浓度包括在内。另外或或者，可使用其它缓冲剂，如胺类缓冲剂，例如三(羟基甲基)氨基甲烷。此类胺缓冲剂可以以50mM至1M的范围，如100mM至1M的范围、100mM至800mM的范围或甚至150mM至500mM的范围内的浓度使用。任选地，溶液可包括其它离子组分如来源于盐的钙或镁。此外，溶液的pH可在6与9之间，如6.5与8.5之间或7与8.5之间。

溶液可包括表面活性剂。举例来说，表面活性剂可为非离子聚合物表面活性剂，如聚乙二醇的醚，例如聚乙二醇的辛基苯基醚。非离子聚合物表面活性剂可以以0.01％至1.0％的范围，如0.05％至0.8％的范围、0.05％至0.5％的范围或甚至0.08％至0.15％的范围包括在内。示例性表面活性剂为TritonX-100。

在一个实例中，凝聚溶液包括凝聚剂，如在30mM至500mM范围内的MgCl₂；盐，如在0.8M至1M范围内的KCl；缓冲剂，如在150mM至500mM范围内的三(羟基甲基)氨基甲烷；以及表面活性剂，如在0.05％至0.5％范围内的TritonX-100。pH处于7至9的范围内。

在另一实例中，凝聚溶液包括凝聚剂的组合，如在30mM至500mM范围内的MgCl₂和在0.5wt％至10.0wt％范围内的聚乙二醇。聚乙二醇的分子量可在5000至15000的范围内。凝聚溶液还可包括盐，如在0.8M至1M范围内的KCl；缓冲剂，如在150mM至500mM范围内的三(羟基甲基)氨基甲烷；或表面活性剂，如在0.05％至0.5％范围内的TritonX-100。pH处于7至9的范围内。

响应于暴露于溶液，包括核酸链106的核酸珠粒或颗粒102的直径可减小。举例来说，响应于暴露于溶液，珠粒或颗粒的直径可减小至少1％。在一个实例中，直径减小至少5％，如至少10％、至少15％或甚至至少19％。在一个特定实例中，直径减小不超过75％。此外，响应于暴露于凝聚剂，珠粒或颗粒的密度可增大。举例来说，密度可增大至少2％，如至少8％、至少14％、至少21％或甚至至少25％。具体而言，密度增大不超过75％。

尽管响应于暴露于凝聚溶液或凝聚试剂，核酸链106或聚合物基质104凝聚，但当相比于核酸链在暴露之前的酶解离常数恒定值，核酸链在暴露于溶液之后可呈现类似的酶解离常数。举例来说，当与暴露之前的核酸链相比时，暴露之后核酸链可呈现当在聚合酶存在下类似的解离常数。

返回到图1，在暴露于溶液之后，已处理的核酸颗粒108可被施加到传感器衬底的表面部件116，如测序装置。举例来说，包括已处理的核酸颗粒108的悬浮液可被施加在表面部件116的表面之上，如通过使悬浮液流过表面，通过使悬浮液发泡并将泡沫穿过表面施加，或通过施加悬浮液并离心部件116。在一个特定实例中，表面包括固着、固定或粘结颗粒的区域。举例来说，表面可包括响应于珠粒或颗粒上的表面剂的已处理的区域。具体而言，表面部件116可包括已处理的区域的图案，如金属沉积的图案。

在另一实例中，表面部件116包括限定凹孔114的层112，已处理的核酸珠粒或颗粒108可沉积到凹孔114中。或者，表面部件116可包括分散部位，如凹点、凹槽、通道、凹陷或其它凹孔状部位。在一个特定实例中，表面部件116可限定对应于用于测量离子浓度如pH的有源电路的凹孔114。或者，有源电路可测量热量、荧光或磷酸酯浓度。在另一实例中，凹孔114可沉积在表面部件116的透明层之上，用于接收或传递电磁辐射或萤光发射。

凹孔114的有效直径可不大于10μm，如不大于7μm、不大于4μm、不大于3μm、不大于2μm、不大于1.5μm、不大于1.0μm或甚至不大于0.8μm。有效直径为四倍截面面积除以π(pi)的结果的平方根(即d_有效＝sqrt(4A/π))。具体而言，有效直径可不大于1.0μm或不大于0.8μm。有效直径可为至少0.3μm。此外，凹孔114的深度可不大于10μm，如不大于5μm、不大于3μm、不大于1.5μm或甚至不大于1μm。举例来说，深度可不大于500nm，如不大于200nm或甚至不大于150nm。深度可为至少100nm。

凹孔114可限定不大于1微升，如不大于100纳升、不大于10纳升或不大于1纳升的体积。举例来说，凹孔可限定不大于100皮升，如不大于10皮升或甚至不大于1皮升的体积。具体而言，凹孔可限定不大于100飞升(femtoliter)，如不大于50飞升，如不大于20飞升、不大于10飞升、不大于5飞升、不大于1飞升或甚至不大于0.6飞升但可为至少0.01飞升的体积。

在颗粒沉积在表面上之后，表面部件116可放入测序系统中。任选地，可洗涤表面部件116以在将其放入测序系统中之前去除凝聚剂或可一旦放入测序系统中便洗涤。作为响应，核酸珠粒或颗粒的直径可增大或核酸链可从凝聚状态展开。举例来说，可用缓冲溶液(如缓冲盐水溶液)洗涤珠粒或颗粒。具体而言，溶液可为类似于含凝聚剂的溶液、不存在凝聚剂的溶液。

或者，可在暴露于凝聚剂之前装载核酸珠粒。举例来说，核酸珠粒可被施加到传感器衬底并且包括凝聚剂的溶液可被施加在沉积的核酸珠粒之上。在另一个替代实例中，核酸珠粒可在沉积之前用凝聚剂处理、沉积、洗涤并且在被沉积之后用凝聚剂处理。

一旦放入测序系统中，可对附接到沉积在表面部件上的颗粒上的核酸链进行测序。在一个实例中，测序可包括测定响应于核苷酸添加的离子浓度。在这种实例中，使包括单一类型核苷酸的溶液与核酸链接触并且测序系统监测离子浓度的变化，如pH的变化。随后，具有不同类型核苷酸的溶液可被施加到表面并且再次监测离子浓度。以这种方式，可监测并检测单独的核苷酸的添加，从而以确定附接何种核苷酸以及以什么样的顺序附接。在一个替代实例中，测序可包括测定响应于核苷酸添加的萤光发射。对于每种核苷酸或对于具有不同萤光物质的核苷酸，所述不同萤光物质在不同波长下发荧光，这与每种类型的核苷酸相关，核苷酸可在单独溶液中连续供给，核苷酸可在合并溶液中供给到测序系统中。

这种方法可在系统中实施，如图2中所示的系统200。举例来说，系统200可包括溶液容器202。此外，系统200包括样品口或样品接收室204。溶液容器202和样品口或接收室204两者均供给到混合器206中。混合器206可为搅拌混合器、超声波混合器或在延伸到表面制备单元208的管内的串联混合器。具体而言，混合装置206将在样品口或室204处接收的已处理的颗粒供给到供测序装置使用的待制备的表面部件。或者，溶液容器202和样品口或接收室204可供给到表面制备单元208中而无需进入混合器或被混合。

表面制备单元208可包括室，在其中传感器衬底形成主表面并且包括凝聚剂的溶液和包括核酸链的核酸珠粒或颗粒通过所述室流过表面以促进珠粒或颗粒沉积在传感器衬底上。在一个特定实例中，传感器衬底可包括限定在包括凹孔的传感器表面上的流槽。表面制备单元还可包括搅拌器、抽吸器、离心机、移液管或涡旋器，以进一步促进珠粒或颗粒沉积到传感器衬底的凹孔中。或者，可使用上述设备人工地进行该过程。

作为该方法的结果，颗粒可沉积在表面部件上至所需的表面密度。举例来说，这种方法可提供具有至少60％，如至少80％、至少85％、至少87％或甚至至少89％的占有率的表面部件，所述占有率被定义为包括含DNA的颗粒的凹孔的百分比。具体而言，占有率可为至少90％，如至少93％或甚至至少95％。

普遍认为，密度的增大和直径的减小有助于颗粒聚集的沉积在表面上。在沉积之后，可在表面制备装置208中洗涤颗粒或一旦放入测序系统中便洗涤颗粒。

实例

实例1

将由含DNA的聚合物颗粒形成的颗粒(PCR扩增之后的ION Spheres^TM)暴露于浓度范围为300μM至20mM的六氨合钴。图3示出响应于六氨合钴的浓度变化的颗粒直径的变化。最初，颗粒在具有Tween-20(PBST)溶液的磷酸盐缓冲盐水(例如包括8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄和2ml的Tween-20的1升水溶液)中。随着六氨合钴的浓度增大，颗粒的直径减小。用PBST溶液洗涤之后，颗粒直径增大。

按制备时原样或与聚合酶接触来测试含DNA的颗粒。如图4中所示，含DNA的颗粒的直径随六氨合钴浓度的增大而减小。如图5中所示，当处于与酶接触时，直径增大。当将与酶接触的颗粒暴露于六氨合钴(5mM Co-络合物)时，直径减小并且随后当用缓冲溶液(PBST)洗涤时直径增大。

图6、图7、图8示出使用核酸文库形成的含DNA的颗粒与不同酶接触的响应。在每种情况下，当与酶接触时含DNA的颗粒的直径增大，并且随后响应于六氨合钴的浓度增大含DNA的颗粒的直径减小。此外，当用缓冲溶液第一次和第二次洗涤时以及当与核酸磷酸盐接触时，颗粒的直径增大。

测试包括FAM-标记发夹结构的颗粒，以测量与酶Bst1的离解动力学。如图9中所示，对于暴露于六氨合钴的样品和不暴露于六氨合钴的样品，离解动力学作为离子强度的函数是相似的。

平均核直径为0.7微米的含DNA的颗粒在无金属络合物的悬浮液和包括六氨合钴的悬浮液两者中提供。将限定有效直径小于1微米的凹孔的衬底暴露于两种悬浮液中的一种中。用PBST溶液洗涤衬底并且观察衬底以确定多少凹孔被含DNA的颗粒占据。那些暴露于包括含DNA的颗粒无金属络合物的悬浮液的衬底呈现小于60％的占有率，所述占有率被定义为包括含DNA的颗粒的凹孔的百分比。那些暴露于包括含DNA的颗粒和六氨合钴的悬浮液的衬底呈现大于85％的占有率，一些衬底呈现大于90％的占有率。

实例2

含水凝聚试剂可包括1M KCl、230mM MgCl₂、200mM tris-HCl和0.1％Triton X-100。试剂的pH可为约8.0。当在将结合到多核苷酸的聚丙烯酰胺珠粒(获自Ion Torrent^TM)装载到Priton I^TM芯片(获自ION Torrent^TM)上期间使用凝聚剂时，已发现镁盐促进珠粒装载到凹孔中。虽然不将溶液限制于特定理论，但普遍认为，溶液造成水凝胶聚合物基质的凝聚。

实例3

含水凝聚试剂包括凝聚剂100mM MgCl₂和5wt％聚乙二醇。聚乙二醇的平均分子量为10000。凝聚溶液还包括0.7M KCl和200mM三(羟基甲基)氨基甲烷。pH为8.0。

实例4

用染色剂(SBYR)处理水凝胶珠粒(获自ION Torrent的ION Spheres^TM)，并且使用显微法观察对包括镁和聚乙二醇(PEG)的凝聚剂响应的水凝胶珠粒。珠粒尺寸表示为相对于低离子强度盐水溶液中珠粒尺寸的比率。

图10示出在5％PEG存在下，珠粒尺寸对不同浓度的镁的响应。如所示，相对尺寸最初随镁浓度增大而快速降低。随着镁浓度增大，降低速率减缓。

图11示出在100mM MgCl₂或50mM MgCl₂存在下，珠粒尺寸对不同浓度的PEG的响应。如所示，相对尺寸随PEG浓度增大而减小。聚乙二醇可在水凝胶珠粒和外部溶液之间形成渗透压差，导致水离开珠粒。PEG可不进入珠粒，而是可保持在珠粒外部，导致渗透压差。

在第一方面中，对核酸链进行测序的方法包括接收具有结合到核酸链的聚合物基质的颗粒、将颗粒暴露于包括凝聚剂的溶液，以及将颗粒施加到表面，所述颗粒沉积在表面上。

在第一方面的实例中，凝聚剂包括具有3+电荷的金属络合物。举例来说，金属络合物可包括钴。在第一方面的另一个实例和上述实例中，金属络合物为金属-胺络合物。举例来说，金属络合物可包括六氨合钴。在另一实例中，金属络合物包括三(乙二胺)钴。在另一个实例中，金属络合物包括1,3,6,8,10,13,16,19-八氮杂二环-[6.6.6]二十烷钴(cobaltsepulchrate)。在附加实例中，金属络合物来源于氯化物盐。在第一方面的附加实例和上述实例中，溶液包括浓度为至少1μM的金属络合物。举例来说，浓度可为至少10μM，如至少1mM、至少4.7mM或甚至至少14.9mM。具体而言，浓度不大于100mM，如不大于50mM。

在第一方面的另一实例和上述实例中，表面包括限定凹孔的层并且其中将颗粒施加到表面包括将颗粒施加到凹孔中。

在第一方面的另一实例和上述实例中，凝聚剂包括非离子聚合物。举例来说，非离子聚合物包括聚乙二醇类聚合物。聚乙二醇类聚合物的分子量可在2000至20000的范围内。在一个实例中，非离子聚合物表面活性剂以0.1wt％至10.0wt％的浓度包括在内。

在另一实例中，凝聚剂包括碱金属盐或碱土金属盐。举例来说，凝聚剂包括浓度为0.5M至2.0M的钾盐。在另一实例中，凝聚剂包括浓度为30mM至1.0M的镁盐。

在第一方面的附加实例和上述实例中，凝聚剂包括碱金属盐或碱土金属盐和非离子聚合物表面活性剂。

在第一方面的另一实例和上述实例中，响应于暴露，颗粒的直径减小至少1％。举例来说，直径可减小至少5％，如至少10％、至少15％或至少19％。具体而言，直径可减小不超过75％。

在第一方面的另一实例和上述实例中，响应于暴露，颗粒的密度增大至少2％。举例来说，密度可增大至少8％，如至少14％或至少21％。具体而言，密度可增大不超过75％。

在第一方面的附加实例和上述实例中，暴露之后核酸链呈现类似于核酸链在暴露之前的离解。

在第一方面的另一实例和上述实例中，聚合物基质包括聚合物，其包括琼脂糖、聚氧丁烯、二甲基丙烯酰胺、聚氧乙烯或聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚氧丙烯、N,N-聚二甲基丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯啶酮、聚-N-羟基丙烯酰胺、聚-N-羟基烷基丙烯酰胺、聚苯乙烯、其共聚物或衍生物，或其任何组合。

在第一方面的附加实例和上述实例中，所述方法还包括洗涤表面以去除凝聚剂。

在第一方面的另一实例和上述实例中，所述方法还包括对核酸链进行测序。举例来说，测序可包括测定响应于核苷酸添加的离子浓度。在另一实例中，测序可包括测定响应于核苷酸添加的辐射发射。

在第二方面中，制备表面的方法包括将溶液施加到表面，所述溶液包括颗粒和凝聚剂，所述颗粒沉积到表面上。所述方法还包括用无金属络合物的溶液洗涤表面。

在第三方面中，装置包括包括含凝聚剂的溶液的溶液容器、用以接收包括核酸链的颗粒的样品接收口，以及与溶液容器和样品接收口流体连通的混合器。

在第三方面的一个实例中，所述装置还包括表面制备单元，用以制备测序装置的表面部件并且用以接收来自混合器的已处理的颗粒。

在第四方面中，含水试剂溶液包括在30mM至500mM范围内的镁盐；在0.8M至1.0M范围内的钾盐；在150mM至500mM范围内的缓冲剂；以及在0.05％至0.5％范围内的表面活性剂。

在第四方面的一个实例中，pH处于7至9的范围。在第四方面的另一实例和上述实例中，缓冲剂包括三(羟基甲基)氨基甲烷。在第四方面的另一实例和上述实例中，表面活性剂包括聚乙二醇类表面活性剂。

在第五方面中，含水试剂溶液包括在30mM至500mM范围内的镁盐；在0.5wt％至10.0wt％范围内的聚乙二醇；在0.8M至1.0M范围内的钾盐；以及在150mM至500mM范围内的缓冲剂。

在第五方面的一个实例中，pH处于7至9的范围。在第五方面发另一实例和上述实例中，缓冲剂包括三(羟基甲基)氨基甲烷。

应注意，并非所有在以上总说明书或实例中所描述的活动都是需要的，一部分特定活动可能是不需要的，并且可以执行除所描述的那些活动之外的一种或多种其它活动。再者，活动所列的顺序不一定是执行它们的顺序。

在前文说明书中，已经参考具体实施例来描述所述概念。然而，本领域的技术人员认为，在不脱离如权利要求书中所阐述的本发明范围的情况下，可以做出各种修改和变化。因此，所述说明书和附图应以说明性而不是限制性意义来看待，并且所有这些修改都旨在包括在本发明的范围内。

如本文中所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”或其任何其它变型旨在涵盖非排它性的包含。举例来说，包含一列特征的工艺、方法、制品或设备不一定仅限于那些特征，而是可包括没有明确列出的其它特征或所述工艺、方法、制品或设备所固有的其它特征。此外，除非明确指出例外，否则“或”是指包容性的或，而非排他性的或。举例来说，条件A或条件B通过以下中的任一项来得到满足：A是真的(或存在的)并且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)并且B是真的(或存在的)，以及A和B都是真的(或存在的)。

另外，使用“一(a/an)”是用来描述本文中所述的要素和部件。这样做只是为了方便起见且给出本发明范围的一般性意义。除非明显意指其它情况，否则这一描述应该被理解为包括一个或至少一个，且单数也包括复数。

上文关于具体实施例已描述了益处、其它优势和对问题的解决方案。然而，这些益处、优势、问题解决方案以及任何可能使任何益处、优势或解决方案发生或变得更显著的(一个或多个)特征不应被解释为任何或所有权利要求的重要的、必要的或必需的特征。

阅读本说明书之后，本领域技术人员将了解，为了清楚起见，在独立实施例的情况下本文所描述的某些特征也可以按在单个实施例中以组合形式提供。相反，为了简洁起见，在单个实施例的情况下所描述的多种特征也可以单独地或以任何亚组合形式提供。此外，以范围表示的数值包括在所述范围内的各个值或每个值。

本申请涉及如下方面：

1.一种对核酸链进行测序的方法，所述方法包含：

接收具有结合到核酸链的聚合物基质的颗粒；

将所述颗粒暴露于包括凝聚剂的溶液；以及

将所述颗粒施加到表面，所述颗粒沉积在所述表面上。

2.根据1所述的方法，其中所述凝聚剂包括具有3+电荷的金属络合物。

3.根据2所述的方法，其中所述金属络合物包含钴。

4.根据2所述的方法，其中所述金属络合物为金属-胺络合物。

5.根据2所述的方法，其中所述金属络合物包括六氨合钴。

6.根据2所述的方法，其中所述金属络合物包括三(乙二胺)钴。

7.根据2所述的方法，其中所述金属络合物包括1,3,6,8,10,13,16,19-八氮杂二环-[6.6.6]二十烷钴(cobalt sepulchrate)。

8.根据2所述的方法，其中所述金属络合物来源于氯化物盐。

9.根据2所述的方法，其中所述溶液包括浓度为至少1μM的所述金属络合物。

10.根据9所述的方法，其中所述浓度为至少10μM。

11.根据10所述的方法，其中所述浓度为至少1mM。

12.根据11所述的方法，其中所述浓度为至少4.7mM。

13.根据12所述的方法，其中所述浓度为至少14.9mM。

14.根据9所述的方法，其中所述浓度不大于100mM。

15.根据14所述的方法，其中所述浓度不大于50mM。

16.根据1至15中任一项所述的方法，其中所述凝聚剂包括非离子聚合物。

17.根据16所述的方法，其中所述非离子聚合物包括聚乙二醇类聚合物。

18.根据17所述的方法，其中所述聚乙二醇类聚合物的分子量在2000至20000的范围内。

19.根据16所述的方法，其中所述非离子聚合物以0.1重量％至10.0重量％的浓度包括在内。

20.根据1至19中任一项所述的方法，其中所述凝聚剂包括碱金属盐或碱土金属盐。

21.根据20所述的方法，其中所述凝聚剂包括浓度为50mM至1.0M的镁盐。

22.根据1至21中任一项所述的方法，其中所述凝聚剂包括碱金属盐或碱土金属盐和非离子聚合物。

23.根据1至22中任一项所述的方法，其中所述表面包括限定凹孔的层并且其中将所述颗粒施加到所述表面包括将所述颗粒施加到所述凹孔中。

24.根据1至23中任一项所述的方法，其中响应于所述暴露，所述颗粒的直径减小至少1％。

25.根据24所述的方法，其中所述直径减小至少5％。

26.根据25所述的方法，其中所述直径减小至少10％。

27.根据26所述的方法，其中所述直径减小至少15％。

28.根据27所述的方法，其中所述直径减小至少19％。

29.根据24所述的方法，其中所述直径减小不超过75％。

30.根据1至29中任一项所述的方法，其中响应于所述暴露，所述颗粒的密度增大至少2％。

31.根据30所述的方法，其中所述密度增大至少8％。

32.根据31所述的方法，其中所述密度增大至少14％。

33.根据32所述的方法，其中所述密度增大至少21％。

34.根据30所述的方法，其中所述密度增大不超过75％。

35.根据1至34中任一项所述的方法，其中暴露之后所述核酸链呈现出类似于所述核酸链在暴露之前的离解。

36.根据1至35中任一项所述的方法，其中所述聚合物基质包含聚合物，所述聚合物包含琼脂糖、聚氧丁烯、二甲基丙烯酰胺、聚氧乙烯或聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚氧丙烯、N,N-聚二甲基丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯啶酮、聚-N-羟基丙烯酰胺、聚-N-羟基烷基丙烯酰胺、聚苯乙烯、其共聚物或衍生物，或其任何组合。

37.根据1至36中任一项所述的方法，还包含：

洗涤所述表面以去除所述凝聚剂。

38.根据1至37中任一项所述的方法，还包含：

对所述核酸链进行测序。

39.根据38所述的方法，其中测序包含测定响应于核苷酸添加的离子浓度。

40.根据38所述的方法，其中测序包含测定响应于核苷酸添加的辐射发射。

41.一种制备表面的方法，所述方法包含：

将溶液施加到表面，所述溶液包括颗粒和凝聚剂，所述颗粒沉积到所述表面上；以及

用无所述金属络合物的溶液洗涤所述表面。

42.一种装置，其包含：

包括含凝聚剂的溶液的溶液容器；

用以接收包括核酸链的颗粒的样品接收口；以及

与所述溶液容器和所述样品接收口流体连通的混合器。

43.根据42所述的装置，还包含表面制备单元，用以制备测序装置的表面部件以及用以接收来自所述混合器的已处理的颗粒。

44.一种含水试剂溶液，其包含：

在30mM至500mM范围内的镁盐；

在0.8M至1.0M范围内的钾盐；

在150mM至500mM范围内的缓冲剂；以及

在0.05％至0.5％范围内的表面活性剂。

45.根据44所述的含水试剂溶液，其中所述pH处于7至9的范围。

46.根据44或45所述的含水试剂溶液，其中所述缓冲剂包括三(羟基甲基)氨基甲烷。

47.根据44至46中任一项所述的含水试剂溶液，其中所述表面活性剂包括聚乙二醇类表面活性剂。

48.一种含水试剂溶液，其包含：

在30mM至500mM范围内的镁盐；

在0.5wt％至10.0wt％范围内的聚乙二醇；

在0.8M至1.0M范围内的钾盐；以及

在150mM至500mM范围内的缓冲剂。

49.根据48所述的含水试剂溶液，其中所述pH处于7至9的范围。

50.根据48或49所述的含水试剂溶液，其中所述缓冲剂包括三(羟基甲基)氨基甲烷。

Claims (13)

1.一种对核酸链进行测序的方法，所述方法包含：

接收具有结合到核酸链的聚合物基质的颗粒，其中所述聚合物基质包含聚合物，所述聚合物包括琼脂糖、聚氧丁烯、二甲基丙烯酰胺、聚氧乙烯或聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚氧丙烯、N,N-聚二甲基丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯吡咯啶酮、聚-N-羟基丙烯酰胺、聚-N-羟基烷基丙烯酰胺、聚苯乙烯、其共聚物或衍生物，或其任何组合；

将所述颗粒暴露于含水溶液以减小所述颗粒的尺寸，所述溶液包含范围为30mM至500mM的镁盐和范围为0.5wt％至10.0wt％的非离子聚合物；

将所述颗粒施加到表面，该表面包括限定凹孔的层，所述颗粒沉积在凹孔中；和

洗涤所述表面以去除并将凝聚剂并在所述凹孔中展开所述颗粒。

2.权利要求1所述的方法，其中所述非离子聚合物包括聚乙二醇类聚合物。

3.权利要求2所述的方法，其中所述聚乙二醇类聚合物的分子量在2000至20000的范围内。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中响应于所述暴露，所述颗粒的直径减小至少1％。

5.权利要求4所述的方法,其中所述直径减小至少5％。

6.权利要求4所述的方法，其中所述直径减小不超过75％。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中响应于所述暴露，所述颗粒的密度增大至少2％。

8.权利要求7所述的方法，其中所述密度增大至少8％。

9.权利要求7所述的方法，其中所述密度增大不超过75％。

10.权利要求1-9中任一项的方法，其中暴露之后所述核酸链呈现出类似于所述核酸链在暴露之前的离解。

11.权利要求1-10中任一项的方法，还包含：对所述核酸链进行测序。

12.权利要求11所述的方法,其中测序包含测定响应于核苷酸添加的离子浓度。

13.权利要求12所述的方法,其中测序包含测定响应于核苷酸添加的辐射发射。

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