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CN106574304A - 基于链侵入的dna扩增方法 - Google Patents

基于链侵入的dna扩增方法 Download PDF

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CN106574304A CN201580042341.8A CN201580042341A CN106574304A CN 106574304 A CN106574304 A CN 106574304A CN 201580042341 A CN201580042341 A CN 201580042341A CN 106574304 A CN106574304 A CN 106574304A
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Abstract

本申请提供了包括链侵入的用于扩增靶核酸序列的方法，其中链侵入发生于靶核酸序列的上游和下游区域。本申请还提供了适用于所述方法的试剂盒和组合物。所述方法可包括扩增包含未知序列区域的靶核酸序列，或确定包含未知序列区域的靶核酸的序列。

Description

基于链侵入的DNA扩增方法
技术领域
本发明涉及靶核酸序列的扩增方法，其包含链侵入。所述方法也涉及适用于这种方法的试剂盒和组合物。
背景技术
通过链侵入扩增靶核酸序列的方法已记载于例如WO2009/150467中。靶核酸序列的侵入是通过单链侵入寡核苷酸介导的，所述单链侵入寡核苷酸使靶双链体解开(openup)以允许上游和下游引物的结合。
附图说明
图1：使用具有平行侵入寡核苷酸构型、反向平行侵入寡核苷酸构型或逆反向平行构型的两种侵入寡核苷酸扩增靶DNA。IO1-第一链侵入寡核苷酸；IO2-第二链侵入寡核苷酸。F-引物-正向或上游引物；R-引物–反向或下游引物。IO1和IO2的不可延伸的末端以虚线表示。
图2：使用两种侵入寡核苷酸扩增靶DNA。示出下述构型的扩增曲线：(a)平行侵入寡核苷酸构型,(c)反向平行侵入寡核苷酸构型和(e)反向平行逆侵入寡核苷酸。示出了重复的反应。通过检测Sybr Green I对扩增进行监测。扩增曲线的X轴：时间(分钟)，Y轴：SybrGreen I荧光(荧光强度，任意单位)。采用熔解曲线分析进一步评估反应的特异性。示出下述构型的熔解曲线分析：(b)平行侵入寡核苷酸构型；(d)反向平行侵入寡核苷酸构型和(f)反向平行逆侵入寡核苷酸构型。熔解曲线分析的X轴：温度(摄氏度)，Y轴(-d(荧光)/d(温度)，(任意单位)。
图3：使用两种侵入寡核苷酸扩增靶DNA。使用两种互补的侵入寡核苷酸或使用一种互补的侵入寡核苷酸和一种非互补的侵入寡核苷酸进行反应。扩增曲线的X和Y轴如图2所述。(a)示出所使用的寡核苷酸的平行构型的结果。(b)示出寡核苷酸的反向平行构型的结果。示出了重复的反应。
图4：在使用两种侵入寡核苷酸的扩增反应中引物的特异性。使用互补的正向和反向引物或使用互补的正向引物和非互补的引物进行反应。靶DNA的浓度为1pM。扩增曲线的X和Y轴如图2所述。
图5：使用两种侵入寡核苷酸与靶特异性探针的反应的相容性。(a)示出支持使用靶特异性探针的构型的示意图。(b)和c)示出采用(b)两种侵入寡核苷酸或(c)单链侵入寡核苷酸(SIBA)进行的靶DNA的扩增和实时检测。如迹线的标记所示，使用Sybr green I或靶特异性探针实现了扩增的实时监测。每个图的X轴：时间(分钟)。Y轴：Sybr green I或探针的荧光(任意单位)。
图6：(a)使用两种侵入寡核苷酸的反应和(b)使用单链侵入寡核苷酸(SIBA)的标准反应对于非特异性扩增的检测的抗性(resistance)。与采用两种侵入寡核苷酸进行的扩增相比，标准SIBA对于通过短引物进行的非特异性扩增的检测具有较低的抗性。对于长引物，靶DNA的浓度为1pM，对于短引物为1fM。使用Sybr green I或探针(其具有与链侵入寡核苷酸或引物的结合位点不重叠的结合位点)监测扩增。对于每个图，X轴：时间(分钟)。Y轴：Sybr green I或探针的荧光(任意单位)。(a)示出在采用两种侵入寡核苷酸的扩增期间，使用Sybr green I或探针进行的扩增的监测。(b)示出在SIBA中，使用Sybr green I进行的扩增的监测。
图7：使用两种链侵入寡核苷酸对来自质粒DNA的靶DNA的扩增。可直接使用质粒DNA或用EcoRV-HF限制性酶处理质粒DNA。使用Sybr green I监测扩增。X轴：时间(分钟)。Y轴：Sybr green I的荧光(任意单位)。
图8：具有两个相同侵入位点的靶DNA的扩增。采用结合所述靶DNA的两个侵入位点的单一侵入寡核苷酸进行反应。(a)、(c)、(e)和(g)示出使用Sybr green I进行的靶DNA扩增的实时监测的扩增曲线。(b)、(d)、(f)和(h)示出对应的熔解曲线分析。(i)示出反应产物的非变性电泳。a)和b)：用于扩增324碱基对的双链靶DNA的侵入寡核苷酸的平行构型。(c)和(d)：用于扩增靶DNA的侵入寡核苷酸的平行构型。(e)和(f)：用于扩增靶DNA的侵入寡核苷酸的反向平行构型。(g)和(h)：用于扩增靶DNA的侵入寡核苷酸的逆反向平行构型。(i)用于扩增靶DNA的侵入寡核苷酸的反向平行构型。扩增曲线和熔解曲线分析的X和Y轴如图2所述。使用Sybr green I实现对靶DNA扩增的实时监测。(i)电泳图的泳道如下：泳道1，BioRadEZ Load 20 bp分子标准(Molecular Ruler)；泳道2-6，分别为107、106、105、104和103拷贝；泳道7，水对照。
图9：用于实时监测侵入和扩增的基于FERT的系统。(a)经标记的引物和侵入寡核苷酸的示意图。(b)使用平行构型的FRET标记的寡核苷酸实时监测靶DNA的侵入和扩增以及检测。(b)中的X轴：时间(分钟)。Y轴：探针的荧光(任意单位)。
图10：使用两种链侵入寡核苷酸的基于链侵入的扩增的灵敏度。使用106至1拷贝的靶DNA的系列稀释液，通过三次不同的测定评估灵敏度。使用Sybr green I实现对靶DNA扩增的实时监测。扩增曲线：(a)测定1、(b)测定2和(c)测定3。X-轴)：时间(分钟)。Y轴：Sybrgreen I的荧光(任意单位)。
序列描述
SEQ ID NO:1为侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:2为侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:6为非互补的侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7为非互补的DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:8为探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:9为探针的核苷酸序列。
SEQ ID NO:10为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:11为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:12为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:13为侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:14为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:17为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:18为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:20为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:21为经标记的侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:22为经标记的侵入寡核苷酸的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23为经标记的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24为经标记的引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:25为DNA引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO:26为靶模板的核苷酸序列。
SEQ ID NO:27为接头(adaptor)的核苷酸。
SEQ ID NO:28为接头的核苷酸。
SEQ ID NO:29为接头的核苷酸。
SEQ ID NO:30为接头的核苷酸。
SEQ ID NO:31为接头的核苷酸。
发明内容
本发明涉及在靶核酸序列的至少两个位置上的链侵入的体系。本发明的方法使用一种或多种链侵入寡核苷酸以结合且侵入靶核酸序列的上游和下游区域，允许上游和下游引物的结合以实现靶核酸序列的扩增。在靶核酸序列的上游和下游位置处的链侵入，将每种引物的结合事件与独立的链侵入事件结合起来，并且增加了使用与扩增引物不重叠的链侵入寡核苷酸序列的可能性。在两个不同位置介导的链侵入也提供了下述优点，其可用于扩增的靶核酸序列比通常由单一位点的链侵入而扩增的那些靶核酸序列更长。
此外，相同的链侵入种类(species)可侵入上游和下游位置处，只要靶序列的两个区域中存在合适的结合序列。类似地，在靶序列的两个区域中存在合适的结合序列的情况下，可使用单一的引物种类。在包含靶序列的模板中存在有已知的结合区域(如接头序列)时，这些实施方案允许扩增和测序未知序列，其中在包含靶序列的模板中存在已知的结合序列(例如接头序列)。也可将链侵入寡核苷酸设计为以替代性构型(alternativeconfiguration)结合于双链靶核酸序列的上游和下游结合区域。这为改变用于靶向特定扩增子的序列的设计以优化扩增参数提供了机会。此外，链侵入寡核苷酸和引物可被设计成具有不重叠的结合区域，使得扩增子的区域保持不与探针结合，从而减少在扩增期间寡核苷酸种类之间竞争结合扩增子，并且避免检测到非特异性扩增产物。
因此，本发明提供了一种用于扩增靶核酸序列的方法，所述方法包括在促进所述靶核酸扩增的条件下，将所述靶核酸序列与至少一种上游引物、至少一种下游引物以及第一和第二链侵入寡核苷酸接触，其中所述第一链侵入寡核苷酸使所述靶核酸序列的上游结合区域成为单链以允许上游引物的结合，并且所述第二链侵入寡核苷酸使所述靶核酸序列的下游结合区域成为单链以允许下游引物的结合。
本发明也提供用于扩增靶核酸序列的方法，所述靶核酸序列包含链侵入寡核苷酸的上游和下游结合区域，所述方法包括使所述核酸序列与链侵入寡核苷酸和一种或多种能够扩增所述靶核酸序列的引物接触，其中所述链侵入寡核苷酸使所述靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域成为单链，以允许所述一种或多种引物的结合。
本发明也提供一种试剂盒，其包括用于靶核酸序列的至少一种上游引物和至少一种下游引物，以及在靶核酸序列中分别具有上游和下游结合区域的第一和第二链侵入寡核苷酸。
本发明也提供一种试剂盒，其包括链侵入寡核苷酸和一种或多种引物，以及至少一种DNA接头，其中当所述DNA接头存在于靶核酸序列的上游结合区域和下游结合区域中时，所述链侵入寡核苷酸可结合DNA接头，并且其中所述一种或多种引物能够扩增所述靶核酸序列。
本发明另外提供一种扩增包含未知序列区域的靶核酸序列的方法，所述方法包括产生靶核酸序列(其包含位于所述未知序列区域上游和下游的链侵入寡核苷酸结合区域)，以及使用链侵入核苷酸和引物进行本发明方法以扩增所述靶核酸序列。
本发明也提供测定包含未知序列区域的靶核酸序列的方法，包括产生靶核酸序列(其包含位于所述未知序列区域上游和下游的链侵入寡核苷酸结合区域)，使用链侵入核苷酸和引物进行本发明方法以扩增靶核酸序列，以及测定所述未知序列区域的序列。
具体实施方式
应理解，所公开的方法的不同应用可根据本领域中的具体需要进行调整。还应理解，本文所使用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案的目的，并且不意欲进行限制。此外，除非上下文中另有明确说明，本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数指代对象。因此，例如，提及“一个多肽”包括两个或更多个这样的多肽，等等。本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论在上文或在下文中，都以引用的形式全文纳入本文。
靶核酸序列的扩增方法
本发明的方法确保了通过在两个单独位点处的核酸的链侵入来扩增靶核酸序列。由链侵入寡核苷酸介导的每个位点处的链侵入使得靶核酸序列成为单链以允许结合引物。在不存在链侵入寡核苷酸的情况下，所述引物在与靶核酸序列接触时通常不能扩增所述靶核酸序列。也就是说，所述引物不能与靶核酸序列中其结合区域结合，除非通过使其结合区域成为单链的链侵入寡核苷酸来暴露其结合区域。链侵入寡核苷酸也通常不能通过DNA聚合酶进行延伸。具体而言，本发明方法优选地在等温条件下扩增靶核酸序列，其中靶核酸序列以核酸双链体形式存在。在等温条件下，在所述双链体的至少两个位点处的链侵入使得靶核酸序列成为单链，允许进行基于引物的扩增。
靶核酸序列
所述靶核酸序列可为任何来源的或可为例如人工或天然存在的。靶核酸序列可包含已知序列或已知和未知序列的区域。靶核酸序列可为人、哺乳动物、细菌或病毒的核酸序列。靶核酸序列可为基因或染色体区域。靶核酸序列可以为待通过DNA扩增检测的基因型或有机体(如病原体)特异性的。靶核酸序列可以是特定物种的基因组独有的。因此，用于检测特定物种的靶核酸序列通常不同于相关物种中的任何同源核酸序列。通常，靶核酸序列会包含与相关物种中同源核酸序列的若干错配。靶核酸序列可以是细菌的特定菌株或者病毒的特定血清型、分离株或或进化枝的特异性序列。
待检测的靶核酸序列可为任意大小并且具有任意序列。所述靶核酸序列或扩增子具有足够的长度以确保上游和下游引物的杂交，以及提供链侵入寡核苷酸以适合的方式与所述靶序列的上游部分和下游部分的结合。如从上游引物的5’结合位点至下游引物的5’结合位点所测量的，所述扩增子的长度通常为至少60个核苷酸，更优选地至少65个或至少70个核苷酸。所述扩增子的长度可为约60至约80个核苷酸。在一些实施方案中，所述扩增子长度可大于80个，如大于100个核苷酸，如长度大于150、200、300、400、500、1000或更多个核苷酸。所述扩增子的长度可为约70个至约1000个核苷酸，如约70至约800个、约70至约600个、约70至约500个核苷酸，长度约70至约400个、约100至约400个、或约100至约200个核苷酸。
用于本发明方法的适合靶核酸序列的实例包括SEQ ID NO:11、12、16、17、18、19、20和26。
靶核酸序列包含上游(5’)和下游(3’)区域，其均包括链侵入寡核苷酸和引物的结合区域。链侵入寡核苷酸和引物的上游结合区域可以在序列上重叠或不重叠。类似地，链侵入寡核苷酸和引物的下游结合区域可以在序列上重叠或不重叠。靶核酸序列也可包含一个或多个寡核苷酸探针的结合区域。探针的结合区域在序列上与链侵入寡核苷酸和/或引物的上游或下游结合区域可以是重叠的，或者与任何链侵入寡核苷酸或引物的结合区域可以是不重叠的。探针的结合区域优选地位于靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域之间。下文中更详细地讨论了链侵入寡核苷酸、引物和探针的结合区域的选择，以及这些的合适序列的设计。
如在下文中更详细描述的，链侵入寡核苷酸、引物和探针的结合区域的长度是由其中所包含的与靶标互补的序列的长度来定义。如下所述，链侵入寡核苷酸通常包含至少25个核苷酸的与靶标互补的序列，并且引物包含至少10个核苷酸。因此靶序列的每个链侵入寡核苷酸结合区域的长度可为至少25个核苷酸，并且每个引物结合区域的长度为至少10个核苷酸。靶序列还可以包含通常长度为至少10个核苷酸的探针结合区域。
上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域可以存在于靶核酸序列的同一链上，或可以位于包含所述靶核酸序列的双链体的相对链上。因此链侵入寡核苷酸可在同一链上以平行方向结合所述靶核酸序列，在相同方向上以5’至3’排列。或者，链侵入寡核苷酸可以反向平行方向与靶核酸序列的相对链结合，在靶双链体上在相对方向上以5’至3’排列。在反向平行方向上，每条链侵入寡核苷酸的3’末端可以指向彼此或彼此远离。因此，每条链侵入寡核苷酸的3’末端均可以朝向扩增子的中心(反向平行构型)或朝向其各自的扩增子末端(逆反向平行构型)。链侵入寡核苷酸的3’末端或5’末端可以在各自引物的结合区域邻近的位置结合。上述结合构型示于图1。
具体结合构型的使用可以提供对扩增参数的替代性作用。例如，在链侵入寡核苷酸以其5’端位于各自引物结合区域邻近处而结合的情况下，与邻近链侵入寡核苷酸的3’末端的引物结合相比，所述引物的结合可具有不同的特异性和动力学特征。链侵入寡核苷酸的3’末端通常包含若干个经修饰的核苷酸(如2’-O-甲基RNA核苷酸)，所述经修饰的核苷酸可影响在其邻近结合的引物的结合相互作用。在平行和逆反向平行构型中，还认为可以提高扩增的特异性，因为在可能进行引物结合之前需要链侵入寡核苷酸的3’末端(其通常包含经修饰的核苷酸)的分支迁移(branch migration)。因此，本发明的方法通过链侵入寡核苷酸的结合构型的变化来确保扩增速率和扩增特异性的变化。
靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域可结合相同种类的链侵入寡核苷酸。因此，如下文中进一步讨论的，可以提供单一种类的链侵入寡核苷酸以在靶核酸序列的两个点处引发链侵入。在该实施方案中，上游和下游结合区域均包含与链侵入寡核苷酸的至少一部分互补的序列。上游和下游结合区域通常是彼此同源或相同的。上游和下游结合区域彼此之间可以为至少85％、至少90％、至少95％同源或相同，或完全相同。上游和下游结合区域可在相互之间具有1、2、3、4、5、6、7或8个错配，如1至5个或1至3个。此外，如下文中进一步讨论的，可以提供单一种类的引物以在靶核酸序列的两个点处引发扩增。在这种情况下，靶核酸序列将包含上游和下游结合区域，所述区域均包含与引物的至少一部分互补的序列，并且如上所述彼此之间可以是同源或相同的。
在本发明方法中，通过提供均特异性针对不同的靶核酸序列的链侵入寡核苷酸、引物(和任选的探针)的多种组合，可以检测多于一种靶核酸序列。通常，使用不同的荧光团/淬灭剂对结合不同靶核酸序列的链侵入寡核苷酸/引物对和/或探针进行标记，从而允许多路检测(multiplexing)。可以检测至少两种、三种、四种、五种、十种或更多种不同的靶序列。可以检测来自同一生物体的多于一种靶核酸序列。或者，可检测至少两种、三种、四种、五种、十种或更多种特异性针对不同基因型、生物体或病原体的靶核酸序列。
上游和下游引物
基于目的靶核酸序列选择合适的上游和下游引物，并且考虑到各链侵入寡核苷酸的结合位点，所述链侵入寡核苷酸使靶核酸序列的上游或下游结合区域成为单链以允许各引物的结合。
所述上游和下游引物包含与所述靶标部分或完全互补的序列，以及任选的5’和/或3’侧翼非互补序列。或者，所述上游和下游引物可完全由与所述靶标部分或完全互补的序列组成。与所述靶标互补的引物序列的长度足以提供与所述靶核酸序列的特异性杂交。互补序列的长度通常为至少10个核苷酸，更优选地至少15、至少16或至少17个核苷酸。互补序列的长度可以是10-25、15-25、10-30或15-30个核苷酸。
应理解，上述序列长度是指可与所述靶核酸序列部分或完全互补的引物的部分。在特定的位置可存在引物和靶序列之间的错配，但仍然允许对靶序列的特异性扩增和检测，特别是考虑到上游和下游引物的组合使用以及链侵入寡核苷酸与靶核酸序列的上游和下游区域的结合以实现扩增。在引物的互补区域与靶序列的相应区域之间可存在1、2、3、4或5个错配。
通常，所述上游和下游引物的总长度少于30个核苷酸，更优选地长度少于25个核苷酸，例如15至25或15至23个核苷酸。在将重组酶用于链侵入的情况下，特别优选地使用长度少于30个核苷酸的引物。所述引物不能够作为重组酶的底物。在一些实施方案中，可以使用长度少于15个核苷酸的引物，如长度为约8至约14、约10至约14、约12至约14个核苷酸的引物。优选地将这种短引物与在靶核酸序列中具有结合区域的探针结合使用，所述结合区域与引物或链侵入寡核苷酸的结合区域不重叠。由短引物产生的非特异性扩增产物的检测可通过使用具有不重叠结合位点的探针而得以减少或消除。
所述上游(或正向)引物结合于双链靶核酸序列中的一条链的3’区域，结合位置在所述链侵入寡核苷酸的结合位点邻近或与其重叠。所述下游(或反向)引物结合于双链靶核酸序列中上游引物的相对链的3’区域，结合位置在所述链侵入寡核苷酸的结合位点邻近或与其重叠。所述上游和下游引物的5’结合位点在双链体靶序列上间隔长度通常为至少60个核苷酸，更优选至少65个、至少70个核苷酸。
根据所述链侵入寡核苷酸的结合构型，如图1所示，所述上游引物可具有与各自链侵入寡核苷酸序列的序列的重叠区或互补区。所述序列重叠区或互补区的长度可以是1-8个核苷酸，长度可以是至少5个或至少6个核苷酸。所述下游引物可同样具有长度为1-8个核苷酸(如至少5个或至少6个核苷酸)的与各自链侵入寡核苷酸序列的序列重叠区或序列互补区。
或者，所述上游引物与各自链侵入寡核苷酸之间可没有序列重叠或互补，和/或所述下游引物与各自链侵入寡核苷酸之间可没有序列重叠或互补，相关引物转而结合于靶序列中在链侵入寡核苷酸的结合位点邻近的位置。
使用一种或多种以下引物可提供多种优点，即所述引物在靶标中的结合区域与链侵入寡核苷酸的结合区域不重叠。在其中本发明的方法利用寡核苷酸探针来检测DNA扩增的实施方案中，链侵入寡核苷酸与探针之间并且/或者上游和/或下游引物与探针之间也可没有序列重叠或互补。上游引物、下游引物、每条链侵入寡核苷酸与任意探针的靶核酸序列内的结合区域之间可没有序列重叠。在任何引物、链侵入寡核苷酸或探针之间也可以没有互补性。设计多种寡核苷酸种类的序列使得它们可以在靶标中独立的、不重叠的区域内结合靶核酸序列，可确保减少寡核苷酸种类之间竞争结合靶核酸序列，以及减少不需要的扩增产物的形成和/或避免检测到不需要的扩增产物。
更详细地，在使用单链侵入寡核苷酸的基于链侵入扩增方法(SIBA方法)中通常使用长度为16至23个碱基的引物。在引物的3’端的序列常常与链侵入寡核苷酸具有约8个碱基的重叠或互补(上游引物与链侵入寡核苷酸重叠，而下游引物与链侵入寡核苷酸互补)。这种构型确保了靶DNA的有效扩增并且使非特异性扩增的风险最小化。也可使用长度≤14个碱基的短引物，其与链侵入寡核苷酸不重叠。不具有与链侵入寡核苷酸重叠的序列的短引物能够比长的重叠引物更有效地扩增靶DNA。这是因为更长的重叠引物的3’端与链侵入寡核苷酸竞争靶模板上的结合位点。例如，上游引物在置换链侵入寡核苷酸之前首先需要分支迁移到双链体上。
然而，短引物(≤14个碱基)可产生非特异性扩增产物。为了避免该问题，在SIBA中通常使用具有与链侵入寡核苷酸重叠或互补的3’端的更长的引物(16-23个碱基)。在该构型中，链侵入寡核苷酸的外周(peripheral)区域仍然为约14个碱基长度。这仅保留了短外周区域，其在扩增靶DNA时解离。
在包括在靶标中两个位点处(上游和下游)的链侵入的本发明方法中，可使用比在SIBA中更短的引物。此外，可更有效地使用非重叠引物。这是因为可以在靶DNA上掺入独立于链侵入寡核苷酸和引物的探针结合位点。而且，在本发明的方法中，使用不同的引物和链侵入寡核苷酸构型(如逆反向平行构型)的能力使短引物引起的非特异性扩增的风险最小或消除该风险。
当引物结合于各自链侵入寡核苷酸(没有序列重叠或互补)附近时，链侵入寡核苷酸的结合区域与各自引物的结合区域的最近边界之间通常存在15个核苷酸或更少，优选10个核苷酸或更少，如约1至约15个核苷酸、约5至约15个核苷酸、约5至约10个核苷酸、或约3至约8个核苷酸。这保证所述引物能够与通过链侵入寡核苷酸的结合而产生的单链区域杂交。
优选地，设计每种引物以允许对特定靶核酸序列(如特定基因型)或特定靶标(如特定有机体或特定病原体)中存在的核酸序列的特异性检测。因此，每种引物通常特异性或选择性地与仅在靶标中发现的互补序列杂交。然而，每种引物也可与其他序列(如在其他物种中发现的序列)杂交，只要当其与第二种引物、链侵入寡核苷酸和任选的寡核苷酸探针结合使用时，就可获得对靶核酸序列的特异性检测。
本发明中使用的任何上游或下游引物可包含一个或多个经修饰的核苷酸和/或可检测的标记，例如荧光染料。在一些实施方案中，上游或下游引物可与各自链侵入寡核苷酸形成FRET对，因此包含荧光团或淬灭剂，如下文中所讨论的。
应理解，本发明方法可包括使用多于一对的上游和下游引物，这通常是在多路系统中平行检测多于一种靶核酸序列的情况下。
链侵入寡核苷酸
基于目的靶核酸序列选择一种或多种合适的链侵入寡核苷酸，并且考虑到上游和下游引物的结合位点，以及需要链侵入寡核苷酸来使靶核酸序列在相关区域中成为单链以允许结合上游引物和下游引物。在所述靶核酸序列包含同源或相同的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域的情况下，可提供单一种类的链侵入寡核苷酸以实现扩增。或者，可提供两种不同种类的链侵入寡核苷酸(第一和第二)，其与靶核酸序列的上游和下游部分中的不同序列结合。当使用第一和第二链侵入寡核苷酸时，以下对链侵入寡核苷酸的特征的描述均适用。
每种链侵入寡核苷酸包含与靶标互补的序列和任选的额外的侧翼非互补序列。与所述靶标互补的序列的长度可由技术人员根据经验确定并且足以确保对所述靶核酸序列的有效链侵入，任选地在等温条件下。所述互补序列可包含RNA-DNA互补碱基配对和经修饰的核苷酸。通常，互补序列的长度为至少25个或至少27个核苷酸，通常为至少30个核苷酸，例如至少32个、至少33个或至少35个核苷酸，更优选地长度为至少36、37、38、39或40个核苷酸或更多。互补序列的长度可以为30-50、32-50、35-50、40-50、35-48、35-46、38-45或40-45个核苷酸。
应理解，以上序列长度是指与靶核酸序列部分或完全互补的链侵入寡核苷酸的一部分。在特定的位置可存在链侵入寡核苷酸与靶序列之间的错配，但仍然允许对靶序列的特异性扩增和检测，特别是考虑到组合使用上游和下游引物以及链侵入寡核苷酸以实现扩增。链侵入寡核苷酸的互补区与靶序列的相应区域之间可存在1、2、3、4、5、6、7或8个，如1至5个或1至3个错配，这取决于互补序列的总长度。
链侵入寡核苷酸的互补序列与靶序列的一部分杂交，所述靶序列的一部分与靶序列的形成引物结合区域的一部分可以重叠或不重叠。所述链侵入寡核苷酸可具有与各自上游或下游引物的长度为1-8个核苷酸的重叠或互补区域，例如长度为至少5个或至少6个核苷酸的区域。或者，链侵入寡核苷酸的序列可不具有与上游或下游引物的序列重叠的区域。在该实施方案中，如以上所讨论的，链侵入寡核苷酸将结合于上游或下游引物的结合区域邻近的位置，从而使得其可使所述引物的结合区域成为单链。
靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域的最接近的边界可在靶核酸序列中间隔至少15个(如至少20个或至少25个)核苷酸，但是在一些实施方案中，也使用所述结合区域之间的更短距离。
链侵入寡核苷酸的互补序列的5’部分通常在距离待熔解的双链靶核苷酸序列(扩增子)的相关边界的25个或更少核苷酸、更优选地20个或更少核苷酸以内结合。
链侵入寡核苷酸任选地还包含位于互补序列区侧翼的所述靶标的非互补序列区。链侵入寡核苷酸可包含非互补5’区，其可以具有任意核苷酸序列。所述5’非互补区的长度通常为至少3个核苷酸，更通常为至少6个、至少8个，优选地长度为至少10个、至少12个或至少14个核苷酸。所述5’非互补区域可辅助重组酶的结合，由于重组酶协同地结合。链侵入寡核苷酸可包含长度通常为1-3个核苷酸的3’非互补区，其包含阻断聚合酶延伸的核苷酸，如3’-引发反向dT。
当重组酶与链侵入寡核苷酸联合用于扩增方法中的链侵入时，链侵入寡核苷酸的长度通常为至少30个核苷酸。链侵入寡核苷酸的长度优选地为至少35个、至少40个或至少45个核苷酸，更优选地至少50个核苷酸，并且长度可以为至少55个核苷酸或更多。所述链侵入寡核苷酸的长度可以是40-70、45-70、45-70、50-70、55-70、45-65、50-65、50-60或55-65个核苷酸。
通常，链侵入寡核苷酸具有不可延伸的3’末端，使得其不能用作DNA聚合酶的底物，然后仅在特异性的上游和下游引物进一步结合时才扩增所述靶序列。这避免了非特异性扩增产物的形成。链侵入寡核苷酸在其3’区(例如在距离3’末端的10-15或10-20个核苷酸中)可包含1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个经修饰的核苷酸。链侵入寡核苷酸可包含对3’末端核苷酸的3’修饰，并且可以是双脱氧核苷酸，或可包含3’氨基-烯丙基基团、3’碳间隔基(spacer)、3’磷酸、3’生物素、3’唾液酰基(sialyl)或3’巯基。所述3’核苷酸可以是通过3’-3’键反向掺入的核苷酸。替代地或额外地，所述链侵入寡核苷酸的3’区可包含具有较差的针对DNA聚合酶的底物能力的核苷酸，例如PNA(肽核酸)核苷酸、LNA(锁核酸)、2’-5’连接的DNA、2’-氟代RNA或2’-O-甲基RNA，或其组合。
当所述链侵入寡核苷酸为PNA寡聚物(其包含PNA核苷酸、由PNA核苷酸或基本上由PNA核苷酸组成)时，这类寡核苷酸能够在不存在重组酶的情况下使双链体DNA不稳定并侵入双链体DNA。因此，当使用PNA寡核苷酸时，可在不存在重组酶的情况下进行本发明的方法。PNA寡核苷酸可以包含PNA核苷酸和其它核苷酸，例如DNA核苷酸，只要所述寡核苷酸包含了足够的PNA核苷酸以介导对双链体的链侵入。本领域技术人员可以通过测试其实现链侵入并允许DNA扩增的能力来根据经验确定待掺入寡核苷酸中的PNA水平。
链侵入寡核苷酸可以包含可检测的标记，例如荧光染料。在一些实施方案中，链侵入寡核苷酸可以与上游或下游引物形成FRET对，因此包含荧光团或淬灭剂，如下文中所讨论的。
本发明方法包括在靶核酸序列的至少两个位点处的链侵入，其通过第一和第二链侵入寡核苷酸介导，或在靶核酸序列包含针对相同链侵入寡核苷酸的两个结合位点的情况下通过相同种类的链侵入寡核苷酸介导。应理解，本发明方法还可包括通过靶核酸序列的额外位点处(如3或更多、4或更多、5或更多、8或更多、10或更多个位点)的额外链侵入寡核苷酸的链侵入。此外，在多路系统中，本发明方法可包括使用额外的链侵入寡核苷酸，其靶向于额外的靶序列的上游和下游结合区域。
靶核酸序列的扩增
所述DNA扩增方法包括基于链侵入的扩增。所述链侵入扩增包括在靶核酸序列中至少两个位点处的链侵入。链侵入发生于靶核酸序列的上游和下游区域处。
在促进所述靶核酸序列的扩增的条件下，孵育所述靶核酸序列与上游引物、下游引物以及一种或多种(如第一和第二)链侵入寡核苷酸，所述链侵入寡核苷酸能够使各自引物的上游和下游结合区域成为单链。在一些实施方案中，单一种类的引物可用作上游和下游引物。
所述条件通常包括存在DNA聚合酶。适合的条件包括本领域已知的用于确保聚合酶活性的任何条件。所述条件通常包括存在dNTP，其选自dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP及其中任一种的类似物，适合的缓冲试剂/pH，以及酶性能或稳定性所需的其他因素。dATP、dTTP、dCTP、dGTP这四种通常将全部存在。所述条件可包括存在洗涤剂和稳定剂。所使用的温度通常是等温的，即在整个扩增过程中是恒定的。所使用的温度通常取决于聚合酶和其他酶组分的性质，也反映引物和链侵入寡核苷酸所需的杂交温度。
所使用的聚合酶通常具有链置换活性。本文使用术语“链置换”来描述在DNA合成过程中，DNA聚合酶(任选地与辅助蛋白联合)在遇到双链DNA区域时置换互补链的能力。适合的DNA聚合酶包括来自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的polI及其功能性片段或变体，以及T4和T7DNA聚合酶及其功能性片段或变体。优选的聚合酶为Bsu DNA聚合酶或其功能性片段或变体。
所述扩增条件优选地包括存在重组酶。任何重组酶系统均可用在本发明的方法中。所述重组酶系统可以是原核或真核来源的，并且可以是细菌、酵母、噬菌体或哺乳动物的。所述重组酶可以5’-3’或3’-5’方向聚合到单链寡核苷酸上。所述重组酶可以源自肌病毒科(myoviridae)噬菌体，例如T4、T2、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、不动杆菌(Acinetobacter)噬菌体133、气单胞菌(Aeromonas)噬菌体65、蓝藻噬菌体(cyanophage)P-SSM2、蓝藻噬菌体PSSM4、蓝藻噬菌体S-PM2、Rb14、Rb32、气单胞菌噬菌体25、弧菌(Vibrio)噬菌体nt-1、phi-1、Rb16、Rb43、噬菌体31、噬菌体44RR2.8t、Rb49、噬菌体Rb3或噬菌体LZ2。在一个优选的实施方案中，使用T4重组酶UvsX(登录号：P04529)或者其功能性变体或片段。也可使用真核细胞的Rad系统或大肠杆菌的recA-Reco系统或其他原核系统。所述重组酶可为大肠杆菌RecA。
所述条件还可包括存在重组酶辅助蛋白，例如单链结合蛋白(例如，T4gp32，登录号P03695)和重组酶载剂(loading agent)(例如，UvsY，登录号NP_049799.2)。在一个优选的实施方案中，所述条件包括存在T4gp32、UvsX和UvsY蛋白。所述重组酶(如UvsX)，并且在使用重组酶载剂(如UvsY)和单链DNA结合蛋白(如gp32)的情况下，均可为来自相同或不同肌病毒科噬菌体来源的天然、杂合或突变蛋白。天然蛋白可为蛋白的野生型或天然变体。
所述条件还可包括用于增强重组酶效率的其他因素，例如用于调控DNA相互作用的化合物，例如脯氨酸、DMSO、BSA、PEG或已知增强重组酶向DNA上加载的拥挤试剂(crowding agent)(Lavery P.et al.J.Biol.Chem.1992,267,(13),9307-9314)。
所述条件还可包括存在ATP再生系统。多种ATP再生系统是本领域技术人员已知的，并且包括糖酵解酶。ATP再生系统的适合组分可包括磷酸肌酸、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖和蔗糖磷酸化酶(sucrose phosporylase)中的一种或多种。所述条件还可包括存在ATP。
也可包括额外的组分，例如镁离子、DTT或其他还原剂、盐。
其他组分可包含一种或多种限制性酶(如一种或多种限制性内切核酸酶)以便在使靶核酸序列与其他扩增试剂接触之前或同时，消化包含靶核酸序列的核酸。包含于DNA质粒中的靶核酸序列的扩增速率可通过以下方式来增加，使用限制性酶消化所述质粒从而使起始模板线性化。因此，本发明的方法可包括使包含有待扩增的靶核酸的核酸与限制性酶接触。在包含靶核酸序列的核酸中具有适合的识别位点的任意适合的限制性酶均可用于消化。所述识别位点通常位于所述核酸中除靶核酸序列以外的区域中。
可以以不同浓度提供以上所述的多种组分以确保实现DNA扩增。技术人员能够在实践中选择所述多种组分的适合的工作浓度。
所扩增的DNA的存在情况的检测
可通过任何适合的方法监测所扩增的DNA的存在，所述扩增的DNA是在促进DNA扩增的条件下使靶核酸序列与引物和链侵入寡核苷酸接触而产生。
所述引物中的一个或二个或者所述链侵入寡核苷酸中的一个或多个(如第一和/或第二链侵入寡核苷酸)均可掺入标记物或其他可检测部分。可使用任何标记物或可检测部分。适合的标记物的实例包括荧光部分，以及荧光团和受体部分的FRET对。例如，上游引物可与在靶核酸序列中具有上游结合区域的链侵入寡核苷酸形成FRET对，和/或下游引物可与在靶核酸序列中具有下游结合区域的链侵入寡核苷酸形成FRET对。所述引物可用荧光团或淬灭剂标记，所述链侵入寡核苷酸是用FRET对的相应部分(淬灭剂或荧光团)标记。适合的标记物和连接位点如下所述。使用这种FRET对能够确保检测对靶核酸序列的链侵入和扩增的方法。也可使用检测两种可检测部分的相互作用的变化的其他淬灭系统，包括接触性淬灭。
更优选地，或额外地，可使用一种或多种检测所扩增的DNA的探针，其同样掺入标记物或其他可检测部分。优选地，实时监测来自探针的信号以及靶核酸序列的扩增。探针可结合于靶核酸序列中任意适合的位置。探针可特别优选地结合于靶核酸序列中与引物和/或链侵入寡核苷酸的结合区域不重叠的区域。因此，探针可特别优选地在靶核酸序列内具有结合位点，该结合位点独立于一种或多种其他寡核苷酸种类的结合位点。选择探针的非重叠结合区域可减少在扩增期间对探针结合的竞争。使用结合于靶核酸序列中独立位置的探针也可减少或消除对非特异性扩增产物如引物二聚体的检测，提供对靶核酸序列扩增的更加准确的检测。
检测不同的扩增靶序列的探针可在不同的荧光波长下发出信号以确保多路检测。在单个反应中可使用两种或更多种(如3、4、5、6、8、10或更多种)不同的探针进行对若干不同的靶序列的多路检测。用于本发明方法中的寡核苷酸探针的长度通常为约8至约25个核苷酸，如长度为约10至约20、约12至约25、约15至约25个核苷酸。在一些实施方案中，所述探针也可作为链侵入寡核苷酸起作用(因此具有针对上述链侵入寡核苷酸所描述的特征)。例如，可提供用作探针的额外的经标记的链侵入寡核苷酸，其在靶核酸序列中具有邻近于上游或下游链侵入寡核苷酸结合区域的结合区域，使得它可以与结合于上游或下游区域的各自链侵入寡核苷酸形成FRET对。在该实施方案中，所述结合于上游或下游区域的链侵入寡核苷酸可采用荧光团或淬灭剂进行标记，并且所述额外的链侵入寡核苷酸是采用相应的相互作用的可检测部分(淬灭剂或荧光团)进行标记。
所述探针可包含在序列上与靶核酸序列完全互补的序列，或可以与靶序列有一个或多个错配，如2或3个错配，只要其与链侵入寡核苷酸和引物的组合能够特异性地检测靶序列即可。用于本发明中的寡核苷酸探针可为杂交探针，其能在靶标结合时显示出构象变化(例如US7241596中所述)，分子信标(例如US5925517中所述)，或可切割探针，如内切核酸酶-可切割的探针(例如US7435561和US20050214809中所述)，或限制性酶-可切割探针。
用于本发明方法中的引物、链侵入寡核苷酸或探针可用任何荧光团或淬灭剂标记。选择荧光团和淬灭剂以使得淬灭剂的吸收光谱与荧光团的发射光谱重叠。荧光团和淬灭剂还可以被进一步地选择和定位，使得与靶模板杂交时荧光团由于降低的淬灭效应而产生增加的信号。
所述淬灭剂可为非荧光性的，例如非荧光生色团。所述淬灭剂可为暗淬灭剂。或者，所述淬灭剂可发出具有不同于荧光团的发射光谱的荧光，使得在特异性监测荧光团或淬灭剂的荧光时，任一信号的变化均可以报告与靶模板的杂交。荧光团或淬灭剂可位于经标记的寡核苷酸种类的5’或3’末端。在不需要聚合酶依赖性延伸的实施方案中，3’末端位置是特别有用的。荧光团或淬灭剂也可位于内部位置，如距离经标记种类的5’或3’末端10个或更少的核苷酸的位置。
所述荧光团可为任何荧光部分，通常为荧光有机染料。所述淬灭剂可为能淬灭荧光团荧光的任何部分，并且通常为发色分子，如有机染料。技术人员基于其公知常识能够选择用于寡核苷酸探针的适当的荧光团-淬灭剂对。例如在以下参考文献中讨论了适合的配对：Marras SE:Selection of Fluorophore and Quencher Pairs for FluorescentNucleic Acid Hybridization Probes.In:Fluorescent Energy Transfer Nucleic AcidProbes.Edited by Didenko V,第335卷:Humana Press；2006:3-16，以及Didenko VV:DNAprobes using fluorescence resonance energy transfer(FRET):designs andapplications.Biotechniques 2001,31(5):1106-1116,1118,1120-1101。
适合的荧光团包括但不限于，荧光素和荧光素衍生物，如羧基荧光素(FAM,包括6-FAM、5-FAM、dT FAM)、VIC、六氯-6-羧基荧光素(HEX)和JOE，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，香豆素和香豆素衍生物如3-苯基-7-异氰酸酯基香豆素、Lucifer黄、NED、Texas红、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明、N-(p-2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺，花青染料如CY5，罗丹明染料，呫吨(xanthene)染料，萘酰胺(naphthlyamines)，吖啶，苯并噁二唑，茋和芘。适合的淬灭剂包括但不限于，DABSYL、4'-(4-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-马来酰亚胺(DABMI)、四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、黑洞淬灭剂1、黑洞淬灭剂2、黑洞淬灭剂3、暗淬灭剂1、暗淬灭剂2、Iowa Black RQ、Iowa Black FQ。
优选的荧光团/淬灭剂对包括：
-TAMRA和黑洞淬灭剂2；
-ROX和黑洞淬灭剂2；
-ROX和DABCYL；
-FAM(如dT-FAM)和Iowa Black FQ；
-FAM(如dT-FAM)和DABCYL；
-ROX和Iowa Black FQ；
-CY5和Iowa Black RQ。
所述荧光团或淬灭剂通常与经标记的寡核苷酸种类共价连接。所述荧光团或淬灭剂可通过适合的接头(linker)与所述寡核苷酸种类的序列中存在的一个或多个寡核苷酸连接。技术人员能够根据其公知常识来选择任何适当的接头。适合的接头例如在Agrawal S(ed.):Protocols for Oligonucleotides and Analogs:Synthesis and Properties:Humana Press；1993中讨论。
在一些实施方案中，本发明方法可包括一种或多种探针的使用，所述探针包含与靶核酸序列互补的区域、荧光团和淬灭剂。这种寡核苷酸探针的序列可包含至少20％RNA核苷酸、经修饰的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。使用这种探针具有下述优点：在不存在互补模板序列且存在能够结合单链DNA的蛋白质(如重组酶)的情况下，阻止来自探针的荧光信号。换句话说，存在于寡核苷酸探针中的至少20％的核苷酸为RNA核苷酸、经修饰的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。更优选地，所述寡核苷酸探针的序列可包含至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的RNA核苷酸、经修饰的RNA核苷酸和/或PNA核苷酸。当探针中包含有RNA碱基时，本发明方法可提供RNase H酶(例如RNase H2)以通过裂解探针-靶双链体和减少淬灭来增强来自探针的信号。优选的RNase H2酶为Thermococcus gammatolerans RNase H2。或者，如上所述，可使用其他形式的可切割探针，如限制性酶或内切核酸酶可切割的探针。
在使用以荧光团和淬灭剂标记的探针时，所述荧光团和淬灭剂在探针序列中的位置通常间隔至少8个核苷酸，更优选间隔至少10个，或间隔至少12个核苷酸，这取决于所述探针的长度。所述荧光团和淬灭剂可位于5’和3’末端，因此是探针中可能存在的最大间隔距离。选择荧光团和淬灭剂之间的距离，使得在所述探针与靶核酸序列(以开放(openconformation)或线性构象)杂交时，淬灭剂对荧光团的淬灭作用降低，产生靶核酸序列的存在情况的可检测信号。所述荧光团和淬灭剂之间的适当距离可根据经验进行优化。
也可使用嵌入所扩增的DNA中的染料来检测所扩增的DNA，所述染料如Sybr greenI和噻唑橙(thiazole orange)。
对来自扩增DNA的信号的检测可通过任何合适的系统进行，包括实时检测方法。
扩增方法的应用
本发明的扩增方法可用于其中需要特异性扩增靶核酸序列的任何应用。
本发明的方法可用于检测靶核酸序列，以及例如用于诊断临床样品中是否包含靶核酸序列。本发明在医学环境中特别具有优势。本发明的检测方法提供了高度特异性测试以允许确定靶核酸序列的存在。所述方法可应用于一系列的疾病情况。本发明提供了一种用于诊断受试者中疾病的方法，其包括在来自所述受试者的样品中实施本发明的扩增靶核酸序列的方法以检测与所述疾病相关的靶核酸序列。
任何样品均可用于靶核酸序列的检测，只要可以从样品中获得或衍生出所述核酸。所述样品可为例如环境样品、参照样品或临床样品。当本发明的方法用于通过检测靶核酸序列而诊断疾病时，所述样品通常为临床样品，例如从疑似患有或患有所述疾病的患者中获得的样品。临床样品的合适类型根据受试者中存在的或疑似存在的疾病或感染的具体类型而改变。所述样品可为唾液、痰、血液、血浆、血清、尿或粪便样品。所述样品可为细胞或组织样品。在优选的实施方案中，所述样品取自动物受试者，如哺乳动物受试者。所述样品通常取自人受试者，但本发明一般也适用于家畜、牲畜、鸟和鱼。例如，本发明可适用于兽医或农业环境。所述样品包含核酸，其可为DNA或RNA。如果所述核酸以允许进行本发明的检测的合适形式存在于样品中，则所述样品可直接使用。然而，通常核酸源自、获得自或提取自所述样品。用于处理包含核酸的样品、提取核酸和/或纯化核酸以用于检测方法中的方法为本领域中所公知的。可分离总核酸或单独分离DNA或RNA。
通常，以适当的方式处理样品，使得以方便与引物和链侵入寡核苷酸和任选的其他试剂接触的形式提供核酸。当所述核酸为DNA时，通常以双链形式提供所述DNA。当所述核酸为RNA时，通常使用逆转录酶或具有逆转录酶活性的聚合酶将其转换成cDNA。RNA可用于细菌检测，这是由于细菌细胞中存在非常大量的核糖体，其可有效地扩增靶序列的浓度。除了核糖体RNA(rRNA)之外，其他形式的RNA，例如转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核核糖核酸(snRNA)、小RNA(miRNA)也可用于原核生物和真核生物检测中。
本发明的方法可用于在受试者中诊断病原体的感染，其包括检测来自所述病原体的靶核酸序列。可以在存在于或疑似存在于患者中的任何疾病或病痛的情况下进行对病原体是否存在的确定。这些疾病可包括因病原体的存在而引起、与其存在相关或因其存在而恶化的那些疾病。因此，患者可表现出指示病原体的存在的症状，并且可从所述患者中获得样品以通过上述方法确定病原体的存在。
可检测任何病原体。所述病原体可为病毒或细菌或寄生物。所述病原体可为这样的病原体，例如但不限于，真菌，病毒，其包括人乳头瘤病毒(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、流感病毒(A型、B型和C型)、脊髓灰质炎病毒、RSV病毒、鼻病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、诺沃克病毒组、肠道病毒、星状病毒、麻疹病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、风疹病毒、人类T细胞淋巴瘤I型病毒(HTLV-I)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒、痘病毒、马尔堡(Marburg)和埃博拉(Ebola)病毒；细菌包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、衣原体属(Chlamydia)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、志贺氏菌属(Shigella)、沙门氏菌属(Salmonella)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、假单胞菌属(Pseudomonas)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌属(Brucella)、土拉弗朗西斯菌(Franciscella tularensis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、链球菌属(Streptococcus)(A型和B型)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、脑膜炎球菌(Meningococcus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)(b型)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、弯曲杆菌(Campylobacteriosis)、粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、多诺瓦病(Donovanosis)和放线菌病；真菌性病原体包括念珠菌病(Candidiasis)和曲霉病(Aspergillosis)；寄生性病原体包括绦虫(Taenia)、吸虫(Flukes)、蛔虫(Roundworms)、阿米巴病(Amoebiasis)、贾第虫病(Giardiasis)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、血吸虫(Schistosoma)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、毛滴虫病(Trichomoniasis)和旋毛虫病(Trichinosis)。
本发明方法的其他应用包括片段分析、克隆和单核苷酸多态性(SNP)检测。
本发明的另一个方面，可扩增靶核酸序列以允许确定其序列。在这种实施方案中，可通过提供一种或多种链侵入寡核苷酸的适合结合区域——位于其序列待测定的区域的侧翼——来扩增其序列部分或完全未知的核酸序列。因此本发明提供了一种确定包含未知序列区域的靶核酸序列的方法，所述方法包括产生靶核酸序列，其包含在所述未知序列区域的上游和下游的链侵入寡核苷酸结合区域，根据上述本发明的扩增方法扩增所述靶核酸序列，以及确定所述未知序列区域的序列。本发明还提供了一种扩增包含未知序列区域的靶核酸序列的方法，所述方法包括产生靶核酸序列，其包含在所述未知序列区域的上游和下游的链侵入寡核苷酸结合区域，以及根据上述本发明的扩增方法扩增所述靶核酸序列。包含上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域的靶核苷酸可通过以下方式产生：连接包含链侵入寡核苷酸结合区域的寡核苷酸与目的核酸序列的5’和/或3’端。或者，可将目的核酸序列插入或连接于适合的核酸载体(如质粒)中，其包含位于待引入所述核酸序列的位点侧翼的链侵入寡核苷酸结合区域，从而产生所述的靶核酸序列。在其它实施方案中，待确定的序列可为部分已知的，使得可以设计一种链侵入寡核苷酸(及其各自的引物)以结合已知序列区域，并且设计另一种链侵入寡核苷酸和引物以结合在未知序列区域侧翼引入的接头序列。然后可以使用已知序列上游和未知序列下游的基于链侵入的扩增来扩增未知序列区域，以便可以确定其序列。
包含链侵入寡核苷酸结合区域的寡核苷酸为合适的DNA接头，通常以具有或不具有悬垂端(overhang)的双链形式提供。当所述接头以双链寡核苷酸形式提供时，其通常为平端的，以允许其连接至目的DNA片段。所述包含链侵入寡核苷酸结合区域的寡核苷酸还可以包含引物结合区域。当将相同种类的链侵入寡核苷酸(和任选的相同种类的引物)用于在上游和下游位置侵入靶核酸时，可提供单一种类的包含链侵入寡核苷酸结合区域(以及任选的引物结合区域)的寡核苷酸。
可以使用任何适合的测序方法来进行靶核酸序列的测定。适合的测序方法包括Sanger测序或下一代测序方法如Ion Torrent、SOLiD、Illumina和454测序。待测序的片段可以由其连接的接头直接进预扩增或可以首先被克隆到测序质粒中。在后一种情况下，被克隆的片段可包含接头序列或者这些可通过其中连接了所述片段的质粒提供。
可使用任何适合的接头序列，所述接头序列在被掺入于靶核酸序列的侧翼位置或内部时允许链侵入寡核苷酸和/或引物的结合，以允许所述靶核酸序列的扩增。掺入于靶核酸序列上游区域的侧翼位置或内部的接头序列通常会与掺入于靶核酸序列下游区域的侧翼位置或内部的接头序列相同。然而，不同的接头序列可用于靶核酸序列的上游端和下游端，只要提供了能够基于不同的接头扩增靶核酸序列的一种或多种链侵入寡核苷酸和一种或多种引物。技术人员能够选择用于具体的靶序列的适当的接头序列。可以自由选择接头序列，以便不干扰可能存在的任何序列。还可以选择接头序列以满足重组酶对嘧啶的偏好。接头序列可包括用于扩增之前或之后的纯化或分离的标签。可以加入限制性位点或切口酶识别位点以帮助进一步加工扩增子。
试剂盒和组合物
本发明提供一种试剂盒或组合物，其包含用于靶核酸序列的至少一种上游和至少一种下游引物，以及在所述靶核酸序列中具有上游和下游结合区域的第一和第二链侵入寡核苷酸。
本发明还提供一种试剂盒或组合物，其包含可结合于靶核酸序列中上游结合区域和下游结合区域的链侵入寡核苷酸，一种或多种能够扩增所述靶核酸序列的引物，以及至少一种DNA接头。所述DNA接头通常为双链形式。所述试剂盒或组合物还可包含DNA连接酶，其可用于将所述DNA接头与目的核酸连接。所述试剂盒或组合物还可包含一种或多种限制性酶。通常，链侵入寡核苷酸的上游和下游结合区域包含DNA接头的序列，因此所述链侵入寡核苷酸能够结合所述DNA接头的至少一部分。所述链侵入寡核苷酸能使一种或多种引物的上游和下游结合区域成为单链。因此，所述一种或多种引物结合于靶核酸序列中链侵入寡核苷酸结合区域邻近的区域。所述一种或多种引物也可以结合DNA接头的序列，使得所述DNA接头提供用于链侵入和未知序列的扩增的机制。所述试剂盒或组合物可包含单一种类的引物，其可结合于靶核酸序列中的上游和下游结合区域(通常为接头序列)，或所述靶核酸序列的上游和下游引物。
在相关方面中，本发明提供一种试剂盒或组合物，其包含可结合于靶核酸序列中的上游结合区域和下游结合区域的链侵入寡核苷酸，以及一种或多种能够扩增所述靶核酸序列的引物，其中所述链侵入寡核苷酸能够使所述一种或多种引物的上游和下游结合区域成为单链，并且其中所述链侵入寡核苷酸和所述一种或多种引物均结合DNA接头序列。因此，所述链侵入寡核苷酸和所述一种或多种引物均能够结合靶核酸序列的上游和下游位置中存在的相同DNA接头序列。所述试剂盒或组合物可包含核酸载体，其包含位于克隆位点侧翼的接头序列。
在上述试剂盒或组合物中所提供的引物和链侵入寡核苷酸可为上述用于本发明相关方法中的任何引物和链侵入寡核苷酸。本发明的试剂盒和组合物还可包含一种或多种额外的链侵入寡核苷酸。
所述组合物可为例如溶液、冻干物、悬液或者在油性或水性载体中的乳剂。
在本发明的试剂盒中，可以将不同的寡核苷酸种类(如所述引物和链侵入寡核苷酸)以混合物形式提供或在分开的容器中提供。所述试剂盒任选地还包括用于本发明方法的说明书。因此，包含第一和第二链侵入寡核苷酸的试剂盒可包括用于扩增靶核酸序列的本发明的方法的说明书，所述方法包括使用第一和第二链侵入寡核苷酸。所述试剂盒包括用于检测所扩增的DNA的装置(means)。所述试剂盒可包括用于对DNA进行测序的试剂。
本发明的试剂盒或组合物可任选地包括检测所扩增DNA的一种或多种探针。所述试剂盒或组合物中提供的探针可为上述用于本发明方法中的任何探针。
所述试剂盒或组合物可任选地包括DNA聚合酶、重组酶和重组酶辅助蛋白中的一种或多种。优选地，所述DNA聚合酶为Bsu聚合酶。优选地，所述重组酶为细菌噬菌体T4UvsX，其任选地与重组酶辅助蛋白UvsY和gp32组合。所述试剂盒或组合物可还包括dNTPs、适合的缓冲液，以及上述本发明方法中的用于DNA扩增所需的其他因素。
以下实施例举例说明本发明。
实施例
实施例1使用两种侵入寡核苷酸的靶DNA的扩增
图1和2中示出了在人工靶DNA的扩增中使用两种侵入寡核苷酸。所用的所有寡核苷酸购自MWG Eurofins(德国)或IDT DNA Technologies(比利时)。所有试剂和缓冲液(包括肌酸激酶和蔗糖磷酸化酶)购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。T4单链结合蛋白(gp32)和BSU聚合酶购自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)。如先前所述纯化UvsX和UvsY[1,2]。Thermococcus gammatolerans RNase HII购自GeneSys Ltd(UnitedKingdom)。
在40℃下进行等温DNA扩增反应至少90分钟。除非另有说明，反应体积为20μl。用于反应的缓冲溶液为10mM Tris-乙酸盐pH 8.0、10mM乙酸镁、5％DMSO、5％PEG 1000、4mMDTT、0.5mM EDTA、0.1mg/ml BSA、150mM蔗糖、2mM ATP、200μM DNTPs、1:100000SybrGreenI、60mM Tris-磷酸肌酸。缓冲液中包含的蛋白质为250ng/μl gp32、5μM UvsX、0.0625U/μlBSU、0.0125U/μl蔗糖磷酸化酶，以及0.025U/μl肌酸激酶。除非另有说明，每种引物和侵入寡核苷酸的浓度均为200nM。将所述侵入寡核苷酸设计为以平行或反向平行构型结合于靶双链体(图1)。通过一起加入或分开加入乙酸镁和靶DNA，使反应开始，所述靶DNA以10fM或1pM存在。通过使用Agilent MX pro-仪器进行扩增的实时检测。对所述仪器进行编程：在40℃下运行60秒的循环，同时检测每次循环的荧光。通过在循环之后立即进行熔解分析来评估反应产物的特异性。这是通过下述步骤完成：将反应快速加热至95℃并持续15秒，随后通过快速冷却步骤冷却至25℃并持续60秒。然后，将所述反应从25℃慢慢地加热至85℃，以0.5℃的间隔测量荧光。
对于平行构型，使用两种侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2)以及正向引物(SEQ IDNO:3)和反向(SEQ ID NO:4)引物。仅在含有包含了SEQ ID NO:11序列的靶DNA的反应中检测到扩增。不含所述靶DNA的反应(无模板对照，NTC)中不产生扩增，这是通过Sybr Green I信号的缺失检测的(图2a)。所述平行构型的特异性也可通过加入来自不含靶DNA的15个细菌物种的基因组DNA的混合物(每个物种，加入1000拷贝的基因组DNA/反应)来进一步证明。在该混合物中没有检测到扩增，这进一步证明了该构型仅检测靶DNA。采用Sybr Green I的熔解分析进一步证实了在含有靶DNA的反应管中发生了特异性的扩增反应(图2b)。
对于反向平行构型，使用两种侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2)以及正向引物(SEQID NO:3)和反向引物(SEQ ID NO:5)。仅在将包含有SEQ ID NO:12靶序列的靶DNA加入到所述反应中时检测到扩增(图2c)。此外，使用该构型，NTC和来自细菌物种的基因组DNA的混合物都不会产生扩增。采用Sybr Green I的熔解分析证实了在含有靶DNA的反应管中发生了特异性反应(图2d)。
也测试了如图1c所示的逆反向平行构型。使用两种侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:1和13)以及正向引物(SEQ ID NO:14)和反向引物(SEQ ID NO:25)以扩增包含SEQ ID NO:26的序列的靶DNA模板。仅在将靶DNA加入到所述反应中时检测到扩增(图2e)。在不存在靶DNA的情况下，样品中没有观察到可检测的信号。采用Sybr Green I的熔解分析进一步证实了在含有靶DNA的反应管发生了特异性反应(图2f)。
实施例2需要侵入寡核苷酸来进行扩增
对于靶DNA的指数式扩增，需要两种侵入寡核苷酸。这通过使用两种与靶DNA序列互补的侵入寡核苷酸，或使用一种互补及一种非互补的侵入寡核苷酸来证明。在平行(图3a)和反向平行(图3b)构型中，与靶DNA序列互补的另一种侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:1)被非互补的侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:6)替代。用于这两种构型的引物和试剂如实施例1中所述。扩增反应是在存在1pM的靶DNA的情况下进行。仅在两种侵入寡核苷酸均与靶DNA序列互补时才扩增所述靶DNA(图3)。这也表明所扩增的产物包含了全长的靶模板。此外，所述NTC或者用非互补的侵入寡核苷酸替换互补的侵入寡核苷酸，均不产生扩增。这证明了在缺少侵入寡核苷酸的情况下，引物不能扩增靶DNA。
实施例3需要引物来进行扩增
需要正向和反向引物来进行对靶DNA的扩增，。这是通过用被非互补的引物替换与靶DNA互补的引物之一来证明。扩增反应是在存在反向引物(SEQ ID NO:4)的情况下或在存在与靶DNA非互补的反向引物(SEQ ID NO:7)的情况下进行。靶DNA的浓度为1pM。仅在含有与靶DNA互补的反向引物(SEQ ID NO:4)的反应中检测到扩增(图4)。在其中互补的反向引物(SEQ ID NO:4)被非互补的反向引物(SEQ ID NO:7)替换的反应中，没有检测到扩增。这表明侵入寡核苷酸不能独立地扩增靶DNA序列，因为它们不能被用作聚合酶底物。此外，这证明了为使扩增发生，需要所有的寡核苷酸。
实施例4靶特异性探针与两种侵入寡核苷酸的相容性
采用两种侵入寡核苷酸的基于链侵入的扩增使设计出靶DNA特异性探针的可能性得到提高。在平行和反向平行的这两种构型中，所述靶DNA上有既不与所述侵入寡核苷酸互补，也不与所述引物互补的区域。这表明可以设计额外的探针以结合这些区域，而不与所述链侵入寡核苷酸或所述引物竞争(图5a)。在存在靶特异性探针的情况下，测试以反向平行构型的扩增。所述探针包含了由RNA碱基分隔的荧光团和淬灭剂。也将所述探针在3’端封闭，以进一步确保不发生非特异性延伸。所述侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:1和2)的浓度为200nM，同时所述引物(SEQ ID NO:3和4)和所述探针(SEQ ID NO:8)的浓度为400nM。如实施例1中所述，标准的扩增反应是在存在10μg/ml的Thermococcus gammatolerans RNase H2情况下进行。使用Sybr Green I或使用经荧光团和淬灭剂标记的探针对实时扩增进行检测(图5b)。这表明在反应期间所述探针有效地与靶DNA结合，并且产生可检测的信号。
在先前所述的仅使用一种侵入寡核苷酸的基于链侵入的扩增(SIBA)中，探针化学的设计是复杂的，因为所述构型不易于支持探针在靶DNA区域上的自由结合。这是由于靶DNA的所有区域通常用作所述侵入寡核苷酸或所述引物的结合位点。因此除非特别地设计，所述靶特异性探针将不得不与所述侵入寡核苷酸或所述引物竞争结合。图5c中所示的结果举例说明了在SIBA中与使用靶特异性探针相关的问题，所述探针所特异性针对的靶区域与侵入寡核苷酸所特异性针对的靶区域相同。在所述SIBA测定法中，侵入寡核苷酸(SEQ IDNO:1)、正向引物(SEQ ID NO:3)、及反向引物(SEQ ID NO:5)的浓度为200nM，同时探针(SEQID NO:9)浓度为400nM。使用Sybr Green I或使用探针对实时扩增进行监测(图5c)。在含有靶DNA的反应中，Sybr Green I信号的增加表明发生扩增。然而，使用与侵入寡核苷酸结合位点重叠的探针时，没有检测到信号，这表明所述探针不能与靶DNA结合。这可能是因为所述侵入寡核苷酸与所述引物之间的竞争。
实施例5在采用两种侵入寡核苷酸的构型中使用靶特异性探针降低了因短引物而产生的非特异性扩增的信号
在SIBA中由于侵入寡核苷酸的可能延伸，使用非常短的引物可产生非特异性扩增。使用某些短引物(14个碱基)检测到这种非特异性扩增，所述引物可能延伸侵入寡核苷酸的DNA区域(图6b)。因此，在标准SIBA中，将引物设计成长度约为16-23个碱基，并且它们的3’端与侵入寡核苷酸部分同源。在使用两种侵入寡核苷酸的构型中，所述扩增方法较不易于检测到来自短引物的非特异性扩增产物。这是因为可使用与所述侵入寡核苷酸或所述引物的结合位点均不重叠的探针结合位点。
图6证明使用反向平行构型的两种侵入寡核苷酸或使用常规SIBA而进行的扩增反应。在这两种基于链侵入的扩增方法中，使用短引物(在该实施例中为14个碱基)和长引物(在该实施例中为21个碱基)均能导致靶模板的Sybr Green I信号的增加。然而，使用短引物时，也可从NTC检测到小信号；而长引物在NTC中不产生信号。然而，具有两种侵入寡核苷酸的构型允许探针结合于靶序列，而不与所述侵入寡核苷酸和所述引物竞争。这种构型消除了对在NTC中使用短引物产生的信号的检测(图6a)。
实施例6使用两种侵入寡核苷酸的质粒DNA的扩增
所述两种侵入寡核苷酸扩增方法可用于扩增不同的类型的DNA模板。将靶DNA双链体(反向/平行构型的靶标，SEQ ID NO:20)克隆到市售的pCR2.1载体MWG Eurofins(德国)中。所述插入片段的侧翼为EcoRI限制性位点。然后将所述质粒用作如实施例1所述的两种侵入寡核苷酸的反向平行构型方法中的模板。每种侵入寡核苷酸、引物和探针的浓度分别为200、400和600nM。如图7所示，将适量(100fM-10pM)的消化或未消化的质粒加入到所述反应中。通过在37℃下，将靶质粒与EcoRV-HF限制性酶(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)孵育3小时来制备消化的质粒。如图7所示，所述方法能够从消化的或未消化的质粒扩增所述靶DNA。然而，经限制性酶消化的质粒DNA比未消化的质粒更早被检测到。这可能是因为当环化质粒被用作靶模板时与第一轮扩增相关的延迟。这也表明当将复杂DNA用作模板时，限制性酶可用于使第一轮扩增期间的滞后时间最小化。这可通过首先孵育复杂的DNA与合适的限制性酶或通过在扩增试剂中包含限制性酶来完成。
实施例7具有多个侵入位点的靶DNA的扩增
可将靶双链体设计为具有包含相同的侵入寡核苷酸的结合位点的末端区域。这表明仅需要一种侵入寡核苷酸来解离靶双链体的两端。这种靶双链体模拟已经与接头(已知序列)连接的未知DNA片段的文库或其中仅有一部分DNA片段序列是已知的。然后，可通过使用接头特异性引物扩增这些未知的DNA片段。随后将所扩增的产物用作下游应用(如DNA测序)中的模板。这种系统也可用于其他下游应用如片段分析、克隆、单核苷酸多态性(SNP)检测。使用平行、反向平行或逆反向平行构型的单一侵入寡核苷酸的两个相同靶序列，可有效地扩增DNA片段(图8)。在该实施例中，如实施例1所述，进行标准扩增反应，不同的是用7.5％PEG400代替5％PEG 1000。
对于平行构型，使用400nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:13)、200nM正向引物(SEQ IDNO:14)和200nM反向引物(SEQ ID NO:15)来扩增适量的324bp靶双链DNA(SEQ ID NO:16)。所述靶双链体(SEQ ID NO:16)含有200bp人乳糖酶(LCT)基因片段，该基因片段的侧翼为用作侵入寡核苷酸(SEQ ID NOs 28和29)的结合位点的序列。仅在含有靶双链DNA(SEQ IDNO:16)的反应中检测到扩增，并且不含靶双链DNA(无模板的对照，NTC)的反应不产生任何可检测的Sybr Green I信号(图8A)。扩增的速率非常快且非常有效，在开始反应的20分钟内检测到1000拷贝的靶DNA。采用Sybr Green I的熔解分析进一步证实了所述反应是特异性的(图8B)。
通过使用400nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:2)、200nM正向引物(SEQ ID NO:5)和200nM反向引物(SEQ ID NO:4)以扩增另一种靶DNA(SEQ ID NO:17)来进一步证明平行构型，所述靶DNA包含用作侵入寡核苷酸(SEQ ID NOs 30和31)的结合位点的侧翼序列。所述反应显示出与之前在图8A中所见的性能类似的性能。靶DNA(SEQ ID NO:17)的扩增也被发现是非常有效的，在反应开始20分钟内检测到1000拷贝(图8C)。采用Sybr Green I的熔解分析进一步证实了在含有靶DNA的反应管中发生特异性的扩增反应(图8D)。
对于反向平行构型，使用400nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:2)和400nM引物(SEQ IDNO:5)来扩增包含接头序列(SEQ ID NO:27)的靶DNA(SEQ ID NO:18)。所述引物(SEQ IDNO:5)同时用作正向和反向引物。因此，可以仅使用一种IO和一个种类的引物来扩增其中提供了合适的结合序列的靶DNA。仅在含有靶DNA(SEQ ID NO:18)的反应中检测到扩增。不含靶DNA的反应(没有模板的对照，NTC)不产生任何具有Sybr Green I信号的可检测的信号(图8E)。采用Sybr Green I的熔解分析进一步证实所述反应是靶特异性的(图8F)。
使用逆反向平行构型进行类似的研究。使用400nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:13)和400nM引物(SEQ ID NO:15)来扩增靶DNA(SEQ ID NO:19)。将所述引物(SEQ ID NO:15)同时用作正向和反向引物。这种构型也能特异性扩增靶DNA，并且在NTC中未观察到非特异性反应(图8G)。采用Sybr Green I的熔解分析进一步证实所述反应是靶特异性的(图8H)。
使用逆反向平行构型的扩增速率显然比平行和反向平行构型的慢。所述平行构型看上去显示出最快的扩增速率。扩增速率的差异可由多种因素介导。例如，尽管这三种系统全部都使用了类似的侵入寡核苷酸，但是它们的引物是不同的。这可以解释扩增速率的一些差异，因为引物的熔解温度和长度可影响扩增速率。
对使用反向平行构型的反应进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(图8i)。如实施例1所述，进行标准的扩增反应，不同的是使用20mM的乙酸镁、用7.5％PEG 400代替5％PEG 1000，并且通过使用Bio Rad CFX 96PCR设备在44℃下进行反应120分钟。使用200nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:2)和400nM引物(SEQ ID NO:5)以扩增适量的靶DNA(SEQID NO:18)。将所述引物(SEQ ID NO:5)同时用作正向和反向引物。因此，因为靶DNA提供了合适结合序列，所以仅使用一种IO和一个种类的引物就可以扩增靶DNA。对于PAGE，将反应混合物的5μl等分试样上样于8％TBE凝胶中(Invitrogen,United Kingdom)，并且在150V(恒压)下电泳60min。用荧光核酸凝胶染料(GelRed；Biotium,United States)对凝胶进行染色，并且使用Gel DocTMEZ系统(BioRad,United Kingdom)进行显影。对应于预期长度的扩增产物的明显的条带仅出现于含有靶模板的反应中。在不含靶模板的样品中，没有检测到条带，这证明不存在非特异性扩增。
实施例8用于监测链侵入和扩增的基于FRET的探针
实施例8记载了用于监测靶DNA的侵入和扩增的FRET探针化学的开发。所述化学允许对在靶双链体的两端区域中所发生的侵入过程同时进行监测。这也是一种验证性方法以确保扩增全长的靶DNA。将引物和侵入寡核苷酸分别用荧光团和淬灭剂标记，以形成荧光共振能量转移(FRET)系统，如图9A所示。在5’端或内部用荧光团标记引物，所述引物确定靶双链体的末端区域(对于正向和反向引物使用不同的荧光团)。在3’端用淬灭剂标记与靶DNA的下游末端结合的侵入寡核苷酸，而在5’端用淬灭剂标记与靶DNA的下游末端结合的侵入寡核苷酸。
使用平行构型的标准扩增反应如实施例1所述而进行，不同的是用7.5％PEG 400代替5％PEG 1000。使用在其5’-端附近用淬灭剂标记的200nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:21)，和在其3’-端用淬灭剂标记的200nM侵入寡核苷酸(SEQ ID NO:22)。使用200nM的分别具有内部标记的荧光团ROX和Cy5的正向引物(SEQ ID NO:23)和反向引物(SEQ ID NO:24)。这些寡核苷酸被用于扩增靶DNA(SEQ ID NO:17)。通过使用Bio Rad CFX 96PCR设备进行对扩增的实时检测。在每次循环之后测量信号，测量120次循环(每次循环等于30秒)并且信号报告为相对荧光单位(RFU)。
图9B示出在靶模板(SEQ ID NO:17)的扩增期间，FRET系统的信号图谱(profile)。在反应期间，扩增子的末端区域被掺入不同的荧光团。在这种情况下，上游区域将掺入ROX荧光团，而下游区域掺入Cy5荧光团。在对所述扩增子的侵入期间，所发出的荧光团信号减弱(因为经淬灭剂标记的侵入寡核苷酸变得与扩增子的末端区域紧密接近)，如在图9B中所见。由正向和反向引物所发出的信号的同时减弱表明这两种引物均被掺入到扩增子中。
实施例9多重侵入系统的灵敏性
在该实施例中，对三种不同的测定法的分析灵敏性进行评估。如实施例1所述，进行标准的扩增反应，不同的是用7.5％PEG 400代替5％PEG1000。使用测定法1、2和3来分别扩增靶DNA1(SEQ ID NO:16)、靶DNA2(SEQ ID NO:17)和靶DNA3(SEQ ID NO:18)。所用的寡核苷酸及其浓度如实施例7所述。对于靶DNA的从106拷贝至1拷贝的十倍连续稀释物进行测试。结果示于图10。全部三种测定法均对至少100拷贝的DNA靶标具有灵敏性(测定法1、2和3分别示于图10A、10B和10C)。在一些实验中，测定法3显示出可检测出甚至单拷贝的靶DNA的灵敏性(图11C)。
序列表
<110> ORION DIAGNOSTICA OY
<120> 基于链侵入的DNA扩增方法
<130> N402749WO
<150> GB 1410022.6
<151> 2014-06-05
<160> 31
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 侵入寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(60)
<223> 2'-O-甲基RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (61)..(61)
<223> 反向dTTP
<400> 1
ttgtccatag actgctcgac ctgatacacg ttatcgtcca tacggatucg ggaucucaua 60
t 61
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 侵入寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(56)
<223> 2'-O-甲基RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(57)
<223> 反向dTTP
<400> 2
tcctcctgta cctcgttaca aacaggtgta tttagtacag aagauggauu uaaauat 57
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
aacaagaagg cgtactcgac c 21
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
tggggcaaaa tattta 16
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
aaccaaagtg gagtgttaca a 21
<210> 6
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非互补侵入寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (47)..(61)
<223> 2'-O-甲基RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (62)..(62)
<223> 反向dTTP
<400> 6
ttgtccatag actgctgaaa aaaccgcatc atttatgata tgcttcuccu cgcauaaucu 60
at 62
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非互补引物
<400> 7
gtgtacagag catttaagat t 21
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 羧基四甲基罗丹明标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 黑洞淬灭剂2标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> 反向dTTP
<400> 8
gtacacatca acugttagct ggggcat 27
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 羧基四甲基罗丹明标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 黑洞淬灭剂2标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> 反向dTTP
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> 反向dTTP
<400> 9
tgatacacgt tatcguccat acggattcgg t 31
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
aacaagaagg cgta 14
<210> 11
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<400> 11
aacaagaagg cgtactcgac ctgatacacg ttatcgtcca tacggattcg ggatctcagt 60
acacatcaac tggttacaaa caggtgtatt tagtacagaa gatggattta aatattttgc 120
cccagctaa 129
<210> 12
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<400> 12
aacaagaagg cgtactcgac ctgatacacg ttatcgtcca tacggattcg ggatctcagt 60
acacatcaac tgttagctgg ggcaaaatat ttaaatccat cttctgtact aaatacacct 120
gtttgtaaca ctccactttg gtt 143
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 侵入寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(59)
<223> 2'-O-甲基RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> 反向dTTP
<400> 13
ttgtccatag acacgcaaat gaaagacgtt cttaacaagt ttcagaaaga uuugauggct 60
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gctttaaccg aacagcaaat 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gcagtacgct tagccatca 19
<210> 16
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(63)
<223> 接头区域
<220>
<221> misc_feature
<222> (264)..(320)
<223> 接头区域
<400> 16
aaaagcttta accgaacagc aaatgaaaga cgttcttaac aagtttcaga aagatttgat 60
ggctgtctgt gcttctgtgg tgccgagcat tagccccagg aactgcacct cctcctgtct 120
cacggggctg atggtgggtc cagcatctag gagagtgtga cacagggtgg ttggtgctct 180
ggcgctgatt tgagttctca gatctctgag accccagcag aggctgcacg gtaccccaaa 240
tccgcacagc cattgacggg atggcaaatg aaagacgttc ttaacaagtt tcagaaagat 300
ttgatggcta agcgtactgc aaaa 324
<210> 17
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(60)
<223> 接头区域
<220>
<221> misc_feature
<222> (136)..(187)
<223> 接头区域
<400> 17
tcagaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt acagaagatg gatttaaata 60
acacatacat aacagacctt tatcttatat cccctcggca accctgaagc tgcaatgaat 120
tgatatctgt cgttcgttac aaacaggtgt atttagtaca gaagatggat ttaaatattt 180
tgccccatca g 191
<210> 18
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(60)
<223> 接头区域
<400> 18
aaaaaaccaa agtggagtgt tacaaacagg tgtatttagt acagaagatg gatttaaata 60
cacccaaggc ctcacactcg atactgtttt gagcgcctct gtcatggttg atatggtcat 120
cagggccaag tggaatattt aaatccatct tctgtactaa atacacctgt ttgtaacact 180
ccactttggt taaaa 195
<210> 19
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<400> 19
tcaggcagta cgcttagcca tcaaatcttt ctgaaacttg ttaagaacgt ctttcatttg 60
cccggcaaat tgagtcacgg tcggtaacac tttcagcaaa gtccggattt gaagcgtaac 120
ccgcattaaa agaaatgcaa atgaaagacg ttcttaacaa gtttcagaaa gatttgatgg 180
ctaagcgtac tgctcag 197
<210> 20
<211> 140
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<400> 20
aagaaggcgt actcgacctg atacacgtta tcgtccatac ggattcggga tctcagtaca 60
catcaactgt tagctggggc aaaatattta aatccatctt ctgtactaaa tacacctgtt 120
tgtaacactc cactttggtt 140
<210> 21
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经标记的侵入寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 黑洞淬灭剂2标签
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(56)
<223> 2'-O-甲基RNA
<400> 21
tcctcctgta cctcgttaca aacaggtgta tttagtacag aagauggauu uaaaua 56
<210> 22
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经标记的侵入寡核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (44)..(56)
<223> 2'-O-甲基RNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(56)
<223> 黑洞淬灭剂3标签
<400> 22
tcctcctgta cctcgttaca aacaggtgta tttagtacag aagauggauu uaaaua 56
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经标记的引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 6-羧基-X-罗丹明标签
<400> 23
aaccaaagtg gagtgttaca a 21
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 经标记的引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Cy5标签
<400> 24
tggggcaaaa tattta 16
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
agttgatgtg tactgagatc 20
<210> 26
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶模板
<400> 26
cagttgatgt gtactgagat cccgaatccg tatggacgat aacgtgtatc aggtcgagaa 60
aagtacacat caactgttag ctggggcaaa aaagcaaatg aaagacgttc ttaacaagtt 120
tcagaaagat ttgatggcta gcgtactgct g 151
<210> 27
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 27
aaccaaagtg gagtgttaca aacaggtgta tttagtacag aagatggatt taaata 56
<210> 28
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 28
gctttaaccg aacagcaaat gaaagacgtt cttaacaagt ttcagaaaga tttgatggc 59
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 29
gcagtacgct tagccatcaa atctttctga aacttgttaa gaacgtcttt catttgc 57
<210> 30
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 30
aaccaaagtg gagtgttaca aacaggtgta tttagtacag aagatggatt taaata 56
<210> 31
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 31
tggggcaaaa tatttaaatc catcttctgt actaaataca cctgtttgta ac 52

Claims (31)

1.一种用于扩增靶核酸序列的方法，所述方法包括在促进所述靶核酸序列扩增的条件下，将所述靶核酸序列与至少一种上游引物、至少一种下游引物以及第一和第二链侵入寡核苷酸接触，其中所述第一链侵入寡核苷酸使得所述靶核酸序列的上游结合区域成为单链，以允许所述上游引物的结合，并且所述第二链侵入寡核苷酸使得靶核酸序列的下游结合区域成为单链，以允许所述下游引物的结合。
2.一种用于扩增靶核酸序列的方法，所述靶核酸序列包含链侵入寡核苷酸的上游和下游结合区域，所述方法包括使所述靶核酸序列与链侵入寡核苷酸及一种或多种能够扩增所述靶核酸序列的引物接触，其中所述链侵入寡核苷酸使得所述靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域成为单链，以允许所述一种或多种引物的结合。
3.权利要求1或2的方法，其中所述上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域存在于所述靶核酸序列的同一链上。
4.权利要求1或2的方法，其中所述上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域存在于所述靶核酸序列的相对链上。
5.权利要求4的方法，其中所述链侵入寡核苷酸结合于所述靶核酸序列的相对链上，并且它们的3’端指向彼此或彼此远离。
6.前述权利要求任一项的方法，其中所述靶核酸序列的上游和/或下游链侵入寡核苷酸结合区域与各自上游或下游引物的结合区域不重叠。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述促进所述靶核酸序列扩增的条件包括存在重组酶。
8.前述权利要求任一项的方法，其在促进所述靶核酸序列扩增的等温条件下进行。
9.前述权利要求任一项的方法，包括使所述靶核酸序列与一种或多种额外的链侵入寡核苷酸接触。
10.前述权利要求任一项的方法，还包括使所述靶核酸序列与寡核苷酸探针接触。
11.权利要求11或12的方法，其中所述靶核酸序列中探针的结合区域与所述链侵入寡核苷酸的结合区域和/或所述引物的结合区域不重叠。
12.权利要求11或12的方法，其中所述探针的结合区域在所述靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域之间。
13.前述权利要求任一项的方法，其中允许结合于所述靶核酸序列的链侵入寡核苷酸和引物形成荧光共振能量转移(FRET)系统。
14.权利要求2至13中任一项的方法，包括使所述靶核酸序列与至少一种上游引物和至少一种下游引物接触，其中所述链侵入寡核苷酸使得所述靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域成为单链，以允许所述上游和下游引物的结合。
15.权利要求2至13中任一项的方法，包括使所述靶核酸序列与能结合于所述靶核酸序列中上游和下游结合区域的单一种类的引物接触，其中所述链侵入寡核苷酸使得所述靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域成为单链，以允许单一种类的引物与其上游和下游结合区域的结合。
16.权利要求2至14中任一项的方法，其中所述链侵入寡核苷酸的上游和下游结合区域为接头序列。
17.一种试剂盒，其包含用于靶核酸序列的至少一种上游引物和至少一种下游引物，以及第一和第二链侵入寡核苷酸，所述链侵入寡核苷酸在靶核酸序列中分别具有上游和下游结合区域。
18.一种试剂盒，其包含链侵入寡核苷酸和一种或多种引物，以及至少一种DNA接头，其中当所述DNA接头存在于靶核酸序列的上游结合区域和下游结合区域中时，所述侵入寡核苷酸可结合所述DNA接头，并且其中所述一种或多种引物能够扩增所述靶核酸序列。
19.权利要求18的试剂盒，其包含用于所述靶核酸序列的至少一种上游和至少一种下游引物。
20.权利要求18的试剂盒，包含能结合于所述靶核酸序列中上游和下游结合区域的单一种类的引物。
21.权利要求17至20中任一项的试剂盒，其中在所述靶核酸序列中的上游和/或下游链侵入寡核苷酸结合区域与各自上游或下游引物的结合区域不重叠。
22.权利要求17至21中任一项的试剂盒，还包含至少一种寡核苷酸探针。
23.权利要求22的试剂盒，其中所述靶核酸序列中探针的结合区域与所述链侵入寡核苷酸的结合区域和/或所述引物的结合区域不重叠。
24.权利要求22或23的试剂盒，其中所述探针的结合区域在所述靶核酸序列的上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域之间。
25.权利要求17至24中任一项的试剂盒，其中结合于所述靶核酸序列的上游和/或下游区域的链侵入寡核苷酸和引物形成FRET系统。
26.权利要求17至25中任一项的试剂盒，还包含至少一种限制性内切核酸酶。
27.权利要求17至26中任一项的试剂盒，包含一种或多种额外的链侵入寡核苷酸。
28.权利要求18的试剂盒，或权利要求18的从属权利要求19至27中的试剂盒，还包含至少一种DNA连接酶。
29.一种扩增包含未知序列区域的靶核酸序列的方法，所述方法包括产生一种靶核酸序列，其包含在所述未知序列区域的上游和下游的链侵入寡核苷酸结合区域，以及通过实施权利要求1至16中任一项的方法来扩增所述靶核酸序列。
30.一种确定包含未知序列区域的靶核酸序列的方法，所述方法包括产生一种靶核酸序列，其包含在所述未知序列区域的上游和下游的链侵入寡核苷酸结合区域，通过实施权利要求1至16中任一项的方法来扩增所述靶核酸序列，以及确定所述未知序列区域的序列。
31.权利要求29或30的方法，其中所述上游和下游链侵入寡核苷酸结合区域均包含DNA接头序列，并且单一种类的链侵入寡核苷酸结合于上游结合区域和下游结合区域中的DNA接头序列。
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