CN108026569A

CN108026569A - 用于催化性测定的方法和组合物

Info

Publication number: CN108026569A
Application number: CN201680052129.4A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·F·惠特曼; 特拉维斯·沃勒斯
Original assignee: Luminex Corp
Current assignee: Luminex Corp
Priority date: 2015-07-17
Filing date: 2016-07-18
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2036-07-18
Also published as: EP3708677A1; AU2016296594B2; EP3325666A1; US20170044596A1; CN108026569B; HK1254039A1; AU2016296594A1; EP3325666A4; WO2017015177A1; EP3325666B1

Abstract

提供了用于使用催化性DNA(例如，其可以核酸序列为底物)进行测定的方法和组合物。

Description

用于催化性测定的方法和组合物

本申请要求2015年7月17日提交的美国临时申请号62/193,649的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

1.技术领域

本发明一般涉及分子生物学领域。更具体地，涉及核酸的检测和定量。

2.相关技术

聚合酶链式反应(PCR)是医学和生物学研究实验室中常用的分子生物学技术，用于多种任务，例如遗传疾病的检测、遗传指纹的鉴定、传染病的诊断、基因的克隆、亲子鉴定和DNA计算。由于其无与伦比的扩增和精确能力，PCR已被分子生物学家接受为用于核酸检测的首选方法。DNA检测通常在PCR反应的终点或平台期进行，使得难以量化起始模板。实时PCR或动态PCR(kinetic PCR)通过记录随着反应进程的扩增子浓度改进了终点PCR分析的能力。扩增子浓度最经常通过与经扩增靶标相关的荧光信号变化来记录。实时PCR优于终点检测的方面还在于，由于其可以在封闭系统中进行，所以污染有限。其他优点包括更高的灵敏度、动态范围、速度以及需要更少操作。

最近，采用催化性核酸(catalytic nucleic acid)的检测化学已用于实时PCR。催化性核酸能够采用赋予可切割底物核酸序列的酶或催化活性的结构构型。然而，使用催化性核酸进行多重PCR(multiplex PCR)的能力受限于热循环仪中可用的荧光检测通道的数目。例如，设计来检测4种靶序列的多重反应要求仪器能够通过光谱差异区分不包括对照的4种不同的自由浮动的荧光染料。这些要求不仅限制了实际的复用能力，而且还增加了成本，因为这样的仪器通常需要多个激光器和滤波器。本发明的多个实施方案克服了利用催化性核酸的测定的有限的复用能力。

发明内容

一个实施方案提供了一种包括以下的方法：(a)使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；(b)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(c)使所述底物核酸的5’片段与捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含与所述底物核酸的5’-片段互补的第一区域，提供与所述底物核酸的5’-片段的3’-末端核苷酸之错配的第二区域，以及提供用于从所述底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成的模板序列的第三区域；(d)从所述底物核酸的5’-片段移除3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段；以及(e)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的可延伸5’-片段。在一些实施方案中，所述方法还包括对双链延伸产物进行解链分析(melt analysis)，所述双链延伸产物是通过沿着所述捕获探针延伸底物核酸的可延伸5’-片段形成的。

一个实施方案提供了一种包括以下的方法：(a)使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；(b)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(c)使所述底物核酸的5’片段与捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含与所述底物核酸的5’-片段互补的第一区域，以及提供用于从所述底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成的模板序列的第二区域；以及(d)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的5’-片段。在底物核酸的切割不在3’端留下可延伸核苷酸的一些实施方案中，所述方法还可包括从所述底物核酸的5’-片段移除3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段。在一些实施方案中，所述方法还包括对双链延伸产物进行解链分析，所述双链延伸产物是通过沿着所述捕获探针延伸底物核酸的可延伸5’-片段形成的。

另一个实施方案提供了一种包括以下的方法：(a)在第一温度下使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶，其中所述底物核酸包含在其3’端的不与所述第一组分寡核苷酸或第二组分寡核苷酸互补的尾部；(b)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(c)在低于所述第一温度的第二温度下，使引物与所述底物核酸的3’片段的尾部杂交；以及(d)在所述底物核酸、底物核酸的3’-片段或其两者上延伸所述引物。在某些实施方案中，所述方法还包括对通过延伸所述底物形成的双链延伸产物进行解链分析。所述解链分析可用于区分经切割底物核酸和未经切割底物核酸，以及区分不同的底物核酸(经切割或未经切割)。在一些实施方案中，标记所述底物核酸的3’-尾部和引物中的一者或两者。例如，可用荧光团标记所述底物核酸的3’-尾部，并且可用淬灭剂标记所述引物，使得当所述引物与所述3’尾部杂交时，来自所述荧光团的信号淬灭；或者可用淬灭剂标记所述底物核酸的3’-尾部，并且可用荧光团标记所述引物。

一个实施方案提供了一种组合物，其包含：(a)促进剂核酸；(b)底物核酸；(c)包含与所述底物核酸部分互补的序列的捕获探针；(d)具有3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶；(e)第一组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；以及(f)第二组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；其中所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸在与所述促进剂核酸和底物核酸杂交时形成催化活性核酸酶，并且另外其中所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段。在一些实施方案中，所述组合物还可包含引物对和靶核酸，其中所述引物对从所述靶核酸引发所述促进剂核酸的合成。

另一个实施方案提供了一种组合物，其包含：(a)促进剂核酸；(b)包含第一标记物(label)的底物核酸；(c)与所述底物核酸的一部分互补并包含第二标记物的第一引物；(d)第一组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；以及(e)第二组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；其中所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸在与所述促进剂核酸和底物核酸杂交时形成催化活性核酸酶，并且另外其中所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段。在一些实施方案中，所述组合物还可包含靶核酸和引物对，所述引物对包含第二引物和第三引物，其中所述引物对从所述靶核酸引发所述促进剂核酸的合成。在某些实施方案中，所述第二引物和第三引物两者的Tm高于预定Tm阈值，并且所述第一引物的Tm低于所述预定Tm阈值。

在某些实施方案中，所述促进剂核酸可以是扩增子。因此，本文公开的组合物可还包含一种或更多种引物，并且本文公开的方法可还包括在使所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与所述促进剂核酸和底物杂交以形成所述催化活性核酸酶之前或同时进行PCR或另一核酸扩增技术，以及用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段。

在所述组合物包含引物或所述方法包括进行PCR或其他扩增技术的一些实施方案中，至少一种引物包含：(a)包含不与所述靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；(b)所述非杂交区5’的锚定区，其中所述锚定区与所述靶序列的第一部分互补；以及(c)所述非杂交区3’的脚部区(footer region)，其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分互补，并且另外其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分的Tm低于所述锚定区与所述靶序列的所述第一部分的Tm；以及(d)位于与所述脚部区的5’-端相邻、在所述脚部区内或在所述非杂交区内的非天然核苷酸区。在一些实施方案中，所述引物包含两个非天然核苷酸区，其中一个非天然核苷酸区位于与所述脚部区的5’-端相邻或在所述脚部区内，并且另一个非天然核苷酸区位于所述非杂交区内。在一些实施方案中，所述非天然核苷酸区由1或2个非天然核苷酸组成。在某些实施方案中，所述非天然核苷酸独立地选自isoC和isoG。在一些实施方案中，所述第一组分寡核苷酸或第二组分寡核苷酸的促进剂特异性序列包含与所述引物的非杂交区互补的序列。这可用于提高所述组分寡核苷酸对通过使用具有非杂交区的引物进行扩增来产生所述促进剂核酸的特异性。在引物对中的两种引物均包含非杂交区的一些实施方案中，第一或第二组分寡核苷酸之一包含与所述引物对的一种引物的非杂交区互补的序列，并且另一组分寡核苷酸包含与所述引物对的另一引物的非杂交区互补的序列。

本文公开的方法可作为多重测定来进行。例如，在一个实施方案中，所述方法包括：(a)提供至少两种不同的第一组分寡核苷酸、至少两种不同的第二组分寡核苷酸、至少两种不同的底物核酸和至少两种不同的捕获探针，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的捕获探针中的互补序列互补，并且其中通过在所述至少两种不同的捕获探针上延伸所述至少两种不同的底物核酸的5’-片段的3’-端形成的延伸产物可通过Tm区分；(b)如果样品中存在与所述至少两种不同的第一和第二组分寡核苷酸中的一种或更多种互补的一种或更多种促进剂核酸，则使所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与所述促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；(c)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述一种或更多种底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(d)使所述一种或更多种底物核酸的5’片段与一种或更多种不同的捕获探针杂交；(e)如果3’-末端核苷酸不可延伸(例如，其缺少3’-OH)，则从所述底物核酸的5’片段移除所述3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段；(f)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的5’-片段；以及(g)进行解链分析以鉴定所述样品中存在的一种或更多种促进剂核酸。

在一个多重实施方案的另一个实例中，所述方法包括：(a)提供至少两种不同的第一组分寡核苷酸、至少两种不同的第二组分寡核苷酸、至少两种不同的底物核酸和至少两种不同的引物，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的引物中的互补序列互补，并且其中通过在所述至少两种不同的底物核酸的3’-尾部上延伸所述引物形成的延伸产物可通过Tm区分；(b)如果样品中存在与所述至少两种不同的第一和第二组分寡核苷酸中的一种或更多种互补的一种或更多种促进剂核酸，则使所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与所述促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；(c)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述一种或更多种底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；(d)使所述一种或更多种底物核酸的3’尾部与一种或更多种不同的引物杂交；(e)沿着所述底物核酸、底物核酸的3’-片段或其两者延伸所述引物；以及(f)进行解链分析以鉴定所述样品中存在的一种或更多种促进剂核酸。

还提供了用于进行这种多重测定的组合物。例如，在一个实施方案中，组合物包含至少两种不同的促进剂核酸；至少两种不同的底物核酸；至少两种不同的捕获探针、至少两种不同的第一组分寡核苷酸和至少两种不同的第二组分寡核苷酸，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的捕获探针中的互补序列互补，并且其中所述至少两种不同的捕获探针可通过Tm来区分。在另一个实施方案中，组合物包含至少两种不同的促进剂核酸；至少两种不同的有尾(tailed)底物核酸；至少两种不同的引物、至少两种不同的第一组分寡核苷酸和至少两种不同的第二组分寡核苷酸，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的引物中的互补序列互补，并且其中所述至少两种不同引物的延伸产物可通过Tm来区分。

这样的多重测定可用于检测样品可能存在的以下种靶标或促进剂核酸中的一种或更多种：2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300种，或由其得到的任何范围。在一些特定实施方案中，特定靶标或促进剂核酸的鉴定基于来自标记物或标记物组合(例如荧光团、淬灭剂等)的信号与解链分析的组合。

组分寡核苷酸是包含部分催化核心序列的分子。功能性催化核心可以通过使两个或更多个组分寡核苷酸的部分催化核心序列彼此接近来重建。在某些实施方案中，本文公开的方法利用第一组分寡核苷酸，所述第一组分寡核苷酸包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列和底物特异性序列之间的部分催化核心序列。在某些实施方案中，本文公开的方法利用第二组分寡核苷酸，所述第二组分寡核苷酸包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列和底物特异性序列之间的部分催化性核心序列。促进剂特异性序列被设计为与促进剂核酸的一部分互补，并且可调节促进剂特异性序列的长度和组成以适应期望的杂交条件。在某些实施方案中，组分寡核苷酸具有与促进剂核酸互补的约6至30、6至26、6至24、6至20、6至12、8至30、8至24、8至16、10至30、10至24、10至20或10至15个核苷酸。

催化核心序列在两种或更多种组分寡核苷酸之间划分，使得每种组分寡核苷酸仅具有部分催化核心。催化核心可在组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交后由部分催化核心序列重建。在某些实施方案中，组分寡核苷酸的部分催化核心序列包含约2至20、2至16、2至12、4至12、6至12或4至10个核苷酸。

底物核酸包含与重建催化核心所需的每种组分寡核苷酸的底物特异性序列互补的区域和含有被催化核心切割的切割位点的区域。底物核酸可包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸或其组合。在一些实施方案中，底物核酸的切割位点包含一个或两个核糖核苷酸。在一些特定实施方案中，底物核酸包含选自异鸟嘌呤和异胞嘧啶的非天然核苷酸。

底物核酸可还包含一种或更多种标记物，其可用于辅助检测。例如，底物核酸可包含荧光团、淬灭剂、或者荧光团和淬灭剂二者，其中荧光团和淬灭剂位于切割位点的不同侧。

在一些实施方案中，底物核酸可还包含在其5’或3’端的尾部区。在某些实施方案中，尾部区可以是自互补、与捕获探针互补或与引物互补的，并且不与组分寡核苷酸互补。在尾部与捕获探针互补的一些实施方案中，尾部优选位于底物核酸的5’端。在尾部与引物互补的一些实施方案中，尾部优选位于底物核酸的3’端。尾部区可包含一个或更多个非天然核苷酸。在标记底物核酸的一些实施方案中，标记物可位于尾部区中。在一些方面，尾部区可用于控制底物核酸(或其片段)与其他分子的Tm。例如，尾部可位于底物核酸的5’-端，并且可配置尾部区的长度和/或组成以使得底物核酸与第一和第二组分寡核苷酸的Tm大于底物核酸的5’片段与捕获探针的Tm，底物核酸的5’片段与捕获探针的Tm大于底物核酸的5’片段与第一和第二组分寡核苷酸的Tm。因此，未经切割的底物核酸更有利于与组分寡核苷酸杂交，而经切割的底物核酸的5’-片段相对于组分寡核苷酸更有利于与捕获探针杂交。

在一些实施方案中，捕获探针具有与底物核酸的5’-片段的一部分互补的第一区域以及提供用于从底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成之模板序列的第二区域。在另一些实施方案中，捕获探针具有与底物核酸的5’-片段互补的第一区域，提供与底物核酸的5’-片段的3’-末端核苷酸之错配的第二区域，以及提供用于从底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成之模板序列的第三区域。可设计与底物核酸的5’-片段互补的第一区域的长度以适应期望的杂交条件。在一些实施方案中，捕获探针包含标记物，例如荧光团或淬灭剂。捕获探针上的荧光团或淬灭剂的位置可以使得当两个序列杂交时，其与底物核酸的5’-片段上的淬灭剂或荧光团相互作用，导致当形成双链时荧光信号淬灭，当形成单链时信号不淬灭。

在许多情况下，用催化活性核酸酶在切割位点切割底物核酸产生缺少3’-OH基团的5’片段。因此，除非从底物的5’-片段移除3’-末端核苷酸，否则5’片段不能引发核酸合成。在一个实施方案中，通过DNA聚合酶的3’-外切核酸酶活性(或校对活性(proof readingactivity))从底物核酸的5’-片段移除3’-末端核苷酸。在该实施方案中，捕获探针被设计为与5’-片段的3’-末端核苷酸具有错配，聚合酶的校对活性将从5’-片段移除错配的核苷酸，这将得到可引发核酸合成的具有3’-OH基团的新的3’-末端核苷酸。3’-末端错配通常是1、2或3个核苷酸的错配。可使用5’-片段的3’-端的更长错配区域，但是这些可能更有效地被其他机制如flap内切核酸酶移除。有多种具有3’-外切核酸酶活性的市售DNA聚合酶，包括例如OneDeep和在某些实施方案中，DNA聚合酶可还具有5’-外切核酸酶活性。在另一些实施方案中，DNA聚合酶缺少5’-外切核酸酶活性。在一些实施方案中，DNA聚合酶是热启动DNA聚合酶。

另一个实施方案提供了引物，其包含：(a)包含不与靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；(b)所述非杂交区5’的锚定区，其中所述锚定区与所述靶序列的第一部分互补；(c)所述非杂交区3’的脚部区，其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分互补，并且另外其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分的Tm低于所述锚定区与所述靶序列的第一部分的Tm；以及(d)位于与所述脚部区的5’-端相邻、在所述脚部区内或在所述非杂交区内的非天然核苷酸区。在一些实施方案中，所述非天然核苷酸区位于距离所述脚部区的3’-末端核苷酸一个、两个或三个核苷酸处。

在某些实施方案中，所述引物包含两个非天然核苷酸区，其中一个非天然核苷酸区位于与所述脚部区的5’-端相邻或在所述脚部区内，并且另一个非天然核苷酸区位于所述非杂交区内。在某些方面，非天然核苷酸区包含1个或更多个连续或非连续的非天然核苷酸。在某些方面，非天然核苷酸区由1或2个非天然核苷酸组成。在一些实施方案中，非天然核苷酸独立地选自isoC和isoG。

上述引物可用于降低引物二聚体形成，降低脱靶扩增，以及在靶核酸序列上的引物结合位点容纳多态性序列，以及以不会有助于引发非保守区域内的任何特定序列组成的方式跳过靶基因组内的非保守区域。

在一个实施方案中，提供了在核酸扩增期间降低引物二聚体形成的方法，其包括在两种或更多种引物的存在下扩增靶序列，其中所述两种或更多种引物中的至少一种是包含以下的引物：(a)包含不与所述靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；(b)所述非杂交区5’的锚定区，其中所述锚定区与所述靶序列的第一部分互补；(c)所述非杂交区3’的脚部区，其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分互补，并且另外其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分的Tm低于所述锚定区与所述靶序列的第一部分的Tm；以及(d)位于与所述脚部区的5’-端相邻、在所述脚部区内或在所述非杂交区内的非天然核苷酸区。

在一个实施方案中，提供了在核酸扩增期间降低脱靶扩增的方法，其包括使用至少一种引物扩增靶序列，所述引物包含：(a)包含不与所述靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；(b)所述非杂交区5’的锚定区，其中所述锚定区与所述靶序列的第一部分互补；(c)所述非杂交区3’的脚部区，其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分互补，并且另外其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分的Tm低于所述锚定区与所述靶序列的第一部分的Tm；以及(d)位于与所述脚部区的5’-端相邻、在所述脚部区内或在所述非杂交区内的非天然核苷酸区。

在一个实施方案中，提供了在靶核酸序列上的引物结合位点容纳多态性序列的方法，其包括使用至少一种引物扩增靶序列，所述引物包含：(a)包含不与所述靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；(b)所述非杂交区5’的锚定区，其中所述锚定区与所述靶序列的第一部分互补；(c)所述非杂交区3’的脚部区，其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分互补，并且另外其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分的Tm低于所述锚定区与所述靶序列的第一部分的Tm；以及(d)位于与所述脚部区的5’-端相邻、在所述脚部区内或在所述非杂交区内的非天然核苷酸区，其中所述引物的非杂交区跨越所述多态性序列。

靶核酸可以是任何目的序列。在一些实施方案中，核酸是DNA。在一些实施方案中，核酸是RNA。包含靶核酸的样品可以是包含核酸的任何样品。在本发明的某些方面，样品例如来自正在筛选一种或更多种基因突变或多态性之存在或不存在的对象。在本发明的另一方面，样品可来自正在测试病原体之存在或不存在的对象。在从对象获得样品的情况下，可通过本领域技术人员已知的方法如抽吸、活组织检查、拭子、静脉穿刺、脊髓抽液、粪便样品或尿液样品来获得样品。在本发明的一些方面，样品是环境样品，例如水、土壤或空气样品。在本发明的另一些方面，样品来自植物、细菌、病毒、真菌、原生动物或后生动物。术语靶核酸包括未经扩增的序列及其扩增子两者。

引物是能够在模板依赖性过程中引发新生核酸合成的核酸。靶特异性引物是指被设计为引发特定靶核酸合成的引物。引物对是指被通常称为正向引物和反向引物或上游引物和下游引物的两个引物，其被设计为扩增模板核酸分子上两个引物的结合位点之间的靶序列。在某些实施方案中，引物具有长度为10至40、15至30或18至26个核苷酸的靶特异性序列。探针是能够与互补核酸杂交的核酸。靶特异性探针是指被设计为与特定靶核酸杂交的探针。反应中存在的探针可包含封闭的3’羟基以防止通过聚合酶延伸探针。3’羟基可用例如磷酸基、3’反向dT或报道子(reporter)封闭。可以选择仅允许完全互补的序列之间的杂交的高度严格杂交条件。

本发明的多个方面使用底物核酸上与引物或捕获探针上的序列互补的尾部。在某些实施方案中，这种尾部的序列及其互补序列可选自互补的标签(tag)和反标签(anti-tag)序列的组。互补对中哪条序列称为“标签”哪条称为“反标签”是任意的。标签和反标签优选非交叉杂交，即在相同反应中，每个标签和反标签应仅与其互补伴侣杂交，而不与其他标签或反标签杂交。优选地，在反应期间，标签和反标签也不与样品中的其他核酸杂交。标签和反标签序列还优选地被设计为等温的，即具有类似的最佳杂交温度，因此多重反应中的所有标签和反标签序列将具有大致相同的Tm。在测定中，特别是在需要严格的非交叉杂交行为的高度平行杂交环境中的测定中，非交叉杂交标签和反标签序列的适当选择是有用的。在某些实施方案中，标签和反标签序列的长度为6至60、8至50、10至40、10至20、12至24或20至30个核苷酸。在一些实施方案中，标签和反标签序列的长度为12、14、16或24个核苷酸。许多标签和标签互补(即反标签)序列是本领域已知的并且可用于本发明。例如，通过引用并入本文的美国专利7,226,737描述了210个非交叉杂交标签和反标签的组。此外，通过引用并入本文的美国专利7,645,868公开了1168个标签序列家族，其被证明能够以最小的交叉杂交与其互补序列正确杂交。“通用”标签或反标签是指在多重反应的所有反应中具有相同序列的标签或反标签。

在本文公开的多个实施方案中使用了标记物，其也被称为报道子。标签或报道子是有利于其连接的另一分子(例如，核酸)的检测的分子。可用于标记核酸的多种报道分子是已知的。直接报道分子包括荧光团、发色团和放射团(radiophore)。间接报道分子包括生物素，其必须与另一分子如链霉亲和素-藻红蛋白结合用于检测。也可以使用标记对，例如荧光共振能量转移对或荧光团-淬灭剂对。

在一些实施方案中，在氢键联模式中与天然存在的碱基(A、T、C、G和U)不同的非天然碱基可并入到本文所述的引物、探针、组分寡核苷酸、底物核酸和促进剂核酸中。一个例子是isoC和isoG碱基，其彼此氢键联，但不与天然碱基氢键联。引物和/或探针中这些非天然碱基的并入可用于降低非特异性杂交。使用这些非天然碱基测定靶核酸的方法公开在美国专利号6,977,161中，其通过引用并入本文。

在本发明的某些方面，使用固体支持物。特别地，本文所述的引物、探针、组分寡核苷酸、底物核酸和/或促进剂核酸中的一种或更多种可附接到固体支持物上以辅助检测和/或区室化。用于固定生物分子的多种固体支持物是已知的。例如，固体支持物可以是硝化纤维素、尼龙膜、玻璃、活化石英、活化玻璃、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、聚苯乙烯基底、基于聚丙烯酰胺的基底，其他聚合物、共聚物或交联聚合物，例如聚(氯乙烯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(二甲基硅氧烷)、光聚合物(其包含能够与靶分子形成共价键的光反应性物质，例如氮烯(nitrene)、碳烯(carbene)和羰自由基(ketyl radical)。固体支持物可以是例如珠(微球)、柱或芯片的形式。固定在平面固体支持物上的分子通常通过其在支持物上的空间位置来鉴定。固定在非平面固体支持物如颗粒或珠上的分子通常如下所述通过支持物的一些编码形式来鉴定。在一些实施方案中，接头位于靶特异性探针或反标签与其所连接的固体支持物之间。

珠和颗粒可被编码，使得珠或颗粒的一个亚群可与另一个亚群区分开。编码可以通过多种技术。例如，可用具有不同发射光谱和/或不同信号强度的荧光染料对珠进行荧光标记。在某些实施方案中，珠是Luminex 微球或Luminex微球。亚群中珠的大小也可用来区分一个亚群和另一个亚群。另一种修饰珠的方法是向结构中引入磁响应物质，如Fe₃O₄。顺磁性和超顺磁性微球在没有磁场的情况下具有可忽略的磁性，但施加磁场会诱导微球中磁畴的对齐，导致将微球吸引到场源。将荧光染料、珠大小和/或磁响应物质组合到珠中可以进一步提高可以产生的珠的不同亚群的数目。

在本发明的某些方面，使用乳液。特别地，数字PCR、微滴PCR(droplet PCR)或乳液PCR(emulsion PCR)可结合所述的实施方案的检测、信号生成和多重信号生成组分来使用。在没有PCR扩增的情况下，乳液也可与所述的实施方案一起使用。

在本发明的某些方面，通过等温扩增进行扩增。底物的切割将导致经切割链的解链温度降低，允许其与组分寡核苷酸解链。这可允许新底物结合和切割。这些步骤可在单一反应温度下进行。除了所述实施方案的等温信号生成能力之外，还可以使用其他等温扩增方法。这些可包括以下非限制性实例：链置换扩增、切口酶扩增反应、滚环扩增、解旋酶依赖性扩增等。其他扩增方法，例如通过引用并入本文的US20140017669中描述的那些也可用于乳液中，其通过将信号包含到局部区域提高了灵敏度。通过引用并入本文的US20140017669中描述的方法也可用于产生可与捕获序列杂交、延伸并产生指示靶标存在或不存在的特定解链特征(melt signature)的序列。其也可以产生5’和3’切割产物，所述切割产物可与另一引物杂交并延伸以产生指示靶标存在或不存在的特定解链特征。

如本文所用，“杂交”、“进行杂交”或“能够杂交”应理解为意指形成双链或三链分子或者具有部分双链或三链性质的分子。本文使用的术语“退火”与“杂交”同义。如本文所用，“严格条件”或“高度严格”是允许包含互补序列的一条或更多条核酸链之间或内部的杂交但排除非互补序列的杂交的那些条件。这样的条件是本领域普通技术人员所熟知的，并且对于需要高选择性的应用是优选的。严格条件可包括低盐和/或高温条件。应理解，期望严格性的温度和离子强度部分取决于特定核酸的长度、靶序列的长度和核碱基含量、核酸的电荷组成，以及杂交混合物中甲酰胺、四甲基氯化铵或其他溶剂的存在或浓度。

预期本文所述的任何方法或组合物可关于本文所述的任何其他方法或组合物来实施。

术语“包含”(以及任何形式的“包含”)、“具有”(以及任何形式的“具有”)、“含有”(以及任何形式的“含有”)和“包括”(以及任何形式的“包括”)是开放式连接动词。因此，“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或更多个列举的步骤或要素的方法、组合物、试剂盒或系统具有那些所列出的步骤或要素，但不限于仅具有那些步骤或要素；其可具有(即，覆盖)未列举的要素或步骤。同样地，，“包含”、“具有”、“含有”或“包括”一个或更多个所列举的特征的方法、组合物、试剂盒或系统的要素具有那些特征，但不限于仅具有那些特征；其可具有未列举的特征。

任何本发明方法、组合物、试剂盒和系统的任何实施方案可以由所述的步骤和/或特征组成或基本由所述的步骤和/或特征组成，而不是包含/包括/含有/具有所述的步骤和/或特征。因此，在任何权利要求中，术语“由......组成”或“基本上由......组成”可代替上述任何开放式连接动词，以便改变给定权利要求在使用开放式连接动词时的范围。

权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代物或替代物是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代物和“和/或”的定义。

在整个申请中，术语“约”用于指示值包括用于确定该值的设备或方法之误差的标准偏差。

根据长期的专利法，在权利要求书或说明书中与“包含”一起使用时，未用数量词限定的名词表示一个/种或更多个/种，除非特别指出。

从以下详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的具体实施方案，但是其仅以示例的方式给出，因为根据详细描述，本发明精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过结合本文给出的具体实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或更多个，可以更好地理解本发明。

图1示出了多重检测方法的一个实施方案。

图2示出了多重检测方法的一个实施方案。

示例性实施方案的描述

本文公开的多个方法和组合物使用催化性核酸。已经通过体外演化技术发现或开发了许多能够采用赋予酶或催化活性的结构构型的核酸分子。这些催化性核酸分子通常被称为“DNA酶(DNAzyme)”、“核酶(ribozyme)”或“MNA酶(MNAzyme)”。催化性核酸如锤头状核酶(hammerhead ribozyme)、10：23DNA酶和8：17DNA酶具有多个结构域-侧翼是两个非保守的底物结合结构域的保守的催化结构域(催化核心)。10：23和8：17DNA酶能够在特定RNA磷酸二酯键处切割核酸底物(Santoro，S.和Joyce，G.(1997)A general purpose RNAcleaving DNA enzyme.Proc Natl Acad Sci USA.94：4262-4266)。10：23DNA酶具有侧翼是两个底物识别臂的15个脱氧核苷酸的催化结构域。8：17DNA酶具有侧翼是两个底物识别臂的14个脱氧核苷酸的催化结构域。

催化性核酸可切割具有符合最低要求的靶序列的核酸底物(即，底物核酸)。底物序列必须与催化性核酸的底物识别区域基本上互补，并且底物必须在切割位点包含特定序列。切割位点的特定序列要求包括：例如，通过10：23DNA酶切割的嘌呤：嘧啶核糖核苷酸序列(Santoro和Joyce，1997)，通过锤头状核酶切割的序列尿苷：X，其中X可等于A、C或U，但不是G(Perriman，R.，Delves，A.和Gerlach，W.L.(1992)Extended target-site specificityfor a hammerhead ribozyme.Gene.113(2)：157-63)。

US 8,394,946(通过引用并入本文)中描述的MNA酶将催化性核酸分子的催化核心分离成两个或更多个单独的分子。这种分离的显著结果是现在可通过两个独立的分子-促进剂分子和底物分子实现靶识别和底物切割。MNA酶已被用于实时PCR，并取得了一些成功(Mokany等，(2013)MNAzyme qPCR with Superior Multiplexing Capacity.MolecularDiagnostics and Genetics.59(2)：419-426)。然而，使用MNA酶进行多重PCR的能力受限于热循环仪中可用的荧光检测通道的数目。例如，Mokany等将多重PCR测定限于不超过5种靶标。

本发明的某些实施方案通过在目标核酸的检测和/或鉴定中采用解链分析克服了利用催化性核酸之测定的有限的复用能力。解链分析测定利用解链或退火峰来区分不同的双链核酸。通过产生具有独特解链谱(melt profile)的序列，可以在单个颜色通道中实现复用，从而允许利用多个颜色通道的甚至更高复用。例如，通过利用5个可区分的解链谱，每个具有6个光谱上不同的荧光团，可在单个反应中测定多达30种不同靶标。

可通过将扩增子或核酸复合物暴露于温度梯度并观察来自一种或多种标记的信号来确定解链温度。任选地，可通过(a)在温度梯度下使扩增子与插入剂反应以及(b)观察来自插入剂的可检测信号来确定解链温度。可区分的双链核酸分子的解链温度可与任何其他双链核酸分子的解链温度相差1-10℃，例如至少约1℃，更优选至少约2℃，或甚至更优选至少约4℃。

如图1所示，例如，促进剂核酸(在这种情况下，标记为靶标A、B和C的单链扩增子)各自与以下三种其他核酸分子形成杂交结构：第一组分寡核苷酸(10a、10b或10c)、第二组分寡核苷酸(20a、20b或20c)和底物核酸(30a、30b或30c)。

每种组分寡核苷酸包含与促进剂核酸互补的促进剂特异性序列、与底物核酸互补的底物特异性序列和位于这两个序列之间的部分催化核心。当通过与促进剂核酸和底物核酸杂交将两个部分催化序列放到一起时，切割底物核酸(通常在图1中用X标记的核糖核苷酸处)。在该实施方案中，底物在切割位点(X)的任一侧用荧光团(F)和淬灭剂(Q)标记。因此，一旦底物被催化性核酸切割，荧光不淬灭。在图1中，底物30a、30b和30c具有不同的序列但具有相同的荧光。虽然图中未示出，但底物核酸的5’端可包含与捕获探针互补但不与组分寡核苷酸互补的尾部，使得荧光标记的5’底物片段(40a、40b或40c)优先与捕获探针杂交。然而，，未经切割的底物核酸具有针对组分寡核苷酸的相比于针对捕获探针的更大的亲和力。换句话说，从最高Tm到最低的Tm应是：未切割的底物核酸+两种组分寡核苷酸＞5’底物片段+捕获探针＞5’底物片段+组分寡核苷酸。用于延伸和解链分析的组分寡核苷酸片段与捕获探针的退火可任选地根据PCR在较低温度下进行。

然后，荧光标记的5’底物片段(40a、40b或40c)可与包含淬灭剂的捕获探针杂交。捕获探针的长度和组成被设计为在5’底物片段引发互补链的延伸之后产生独特的解链谱。然而，上述切割反应在探针片段上留下了缺少3’-OH因此不能延伸的3’-核苷酸。因此，捕获探针被设计为在对应于探针片段的3’-核苷酸的位置处具有错配。在具有3’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下，将识别这种错配并从探针片段切除ddNTP。然后可从探针片段开始进行延伸。最后，解链分析确定反应中存在哪些靶标。在图1中，显示靶标A、B和C分别具有70℃、75℃和80℃的解链峰。

图2示出了一个替代实施方案，其中底物核酸包含与组分寡核苷酸杂交的区域和与低Tm引物互补的3’突出端区域。突出端区域的3’端包含荧光团或淬灭剂之一。低Tm引物的5’端包含荧光团或淬灭剂，以与报道底物的3’端形成荧光团/淬灭剂对。在图2中，突出端区域的3’端包含荧光团，低Tm引物包含淬灭剂。低Tm引物的Tm低于扩增反应中产生靶标A和靶标B的最低温度，使得其不在报道底物上杂交和延伸，直到靶标A和靶标B的PCR扩增之后，此时温度降低至允许低Tm引物与底物核酸杂交并延伸的点。低Tm引物在底物上的延伸将产生双链产物，如果底物被切割，则双链产物较短，如果底物未被切割，则双链产物较长。这导致包含组分寡核苷酸与之反应的靶标的样品的特定解链特征。具有不同Tm的多种底物可用在单个光学通道中以用于检测超过一种靶标。双链产物的Tm可通过改变底物的3’突出部分的组成来优化。低Tm引物可以是所有报道底物的所有突出端部分的通用引物。

通常，PCR应用使用热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。该DNA聚合酶使用单链DNA作为模板以及DNA引物从核苷酸(dNTP)酶促组装新DNA链以启动DNA合成。基本PCR反应需要多种组分和试剂，包括：含有待扩增靶序列的DNA模板；一种或更多种引物，其在靶序列的5’和3’端与DNA区域互补；DNA聚合酶，其优选具有约70℃的最适温度；三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)；为DNA聚合酶的最佳活性和稳定性提供合适化学环境的缓冲溶液；二价阳离子，通常是镁离子(Mg²⁺)；以及一价阳离子钾离子。如上所述，当使用底物核酸的5’-片段作为引物时，使用具有3’外切核酸酶活性的聚合酶移除3’末端ddNTP。

大多数PCR方法使用热循环来使PCR样品经受限定的温度步骤系列。每个循环通常具有2或3个不连续的温度步骤。循环通过高温(＞90℃)下的单一温度步骤(“起始”)开始，然后是结束时的一个或两个温度步骤，用于最终产物延伸(“最终延伸”)或短暂保存(“最终保持”)。每个循环中使用的温度和施加温度的时长取决于多个参数。这些包括用于DNA合成的酶，反应中二价离子和dNTP的浓度以及引物的解链温度(Tm)。PCR方法中各步骤的常用温度为：起始步骤-94至96℃；变性步骤-94至98℃；退火步骤-50至65℃；延伸/伸长步骤-70至74℃；最终延伸-70至74℃；最终保持-4至10℃。

实时聚合酶链式反应也称为定量实时聚合酶链式反应(qPCR)或动态聚合酶链式反应，用于扩增并同时定量靶DNA分子。其能够对DNA样品中的特定序列进行检测和定量(作为绝对拷贝数或相对于DNA输入或其他归一化基因进行归一化时的相对量)两者。实时PCR可与逆转录聚合酶链反应组合来定量低丰度RNA。实时PCR的指数阶段期间存在的DNA的相对浓度通过在对数尺度上将荧光相对于循环数作图来确定。然后可通过将结果与通过已知量DNA的系列稀释物的实时PCR产生的标准曲线进行比较来确定DNA的量。

数字PCR(dPCR)涉及分割样品，使得样品中包含的单个核酸分子位于许多独立区域，例如微孔板中的单个孔中、乳液的分散相中或核酸结合表面阵列中。每个分区包含0或1个分子，分别提供阴性或阳性反应。与常规PCR不同，dPCR不依赖于扩增循环数来确定样品中靶核酸的初始量。因此，dPCR消除依赖于指数数据来定量靶核酸，并提供绝对定量。

多重PCR和多重实时PCR在单个PCR反应中使用多个独特的引物组以产生不同DNA序列的扩增子。通过一次靶向多种基因，可从单次测试运行中获得额外信息，否则将需要几倍的试剂和更多的时间来进行。应优化每个引物组的退火温度以在单一反应中工作。

本发明的某些实施方案还提供了引物，其(1)使引物对引物二聚体或其他脱靶扩增较不敏感，(2)提高针对上述组分寡核苷酸的促进剂特异性序列的扩增子特异性，以及(3)可作用于一些靶序列中的多态性区域。所述引物包含：在引物的5’端的锚定区，其具有能够在给定退火温度下与靶序列的第一部分杂交的Tm；包含天然核苷酸的非杂交区，其中所述非杂交区不与靶序列互补；在引物的3’端的脚部区，其能够在给定退火温度下与靶序列的第二部分杂交，其中脚部区与靶序列的第二部分的Tm低于锚定区与靶序列的第一部分的Tm；以及非天然核苷酸区。非天然核苷酸区可位于与脚部区的5’-端相邻、在脚部区内或在非杂交区内，以防止引物二聚体形成。在一些实施方案中，可存在两个非天然核苷酸区，一个在脚部中或与脚部相邻，另一个在非杂交区中。非天然核苷酸区通常包含1或2个非天然核苷酸，其可以是例如isoC或isoG。组分寡核苷酸的促进剂特异性序列可被设计为与扩增子序列互补，所述扩增子序列与引物的非杂交区和非天然核苷酸区互补，从而提高组分寡核苷酸对促进剂核酸的特异性。

本文公开和要求保护的所有组合物和方法可根据本公开内容制备和执行，而无需过度实验。虽然已经根据某些实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员来说明显的是，可以对本文描述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显的是，在化学和生理学上相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，并获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims

1.包括以下的方法：

(a)使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶；

(b)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；

(c)使所述底物核酸的5’片段与捕获探针杂交，其中所述捕获探针包含与所述底物核酸的5’-片段互补的第一区域、提供与所述底物核酸的5’-片段的3’-末端核苷酸之错配的第二区域、以及提供用于从所述底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成之模板序列的第三区域；

(d)从所述底物核酸的5’-片段移除所述3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段；以及

(e)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的可延伸5’-片段。

2.权利要求1所述的方法，其中第一组分寡核苷酸包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列。

3.权利要求1所述的方法，其中所述第二组分寡核苷酸包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列。

4.权利要求1所述的方法，其中所述底物核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。

5.权利要求1所述的方法，其中所述底物核酸包含一个或更多个非天然核苷酸。

6.权利要求1所述的方法，其中所述底物核酸包含荧光团和淬灭剂，其中所述荧光团和淬灭剂位于所述切割位点的不同侧。

7.权利要求1所述的方法，其中所述底物核酸还包含在其5’端的尾部区，其中所述尾部区与所述捕获探针互补并且不与所述第一或第二组分寡核苷酸互补。

8.权利要求7所述的方法，其中所述尾部区包含一个或更多个非天然核苷酸。

9.权利要求7所述的方法，其中所述底物核酸与所述第一和第二组分寡核苷酸的Tm大于所述底物核酸的5’片段与所述捕获探针的Tm，所述底物核酸的5’片段与所述捕获探针的Tm大于所述底物核酸的5’片段与所述第一和第二组分寡核苷酸的Tm。

10.权利要求1所述的方法，其中所述底物核酸的切割位点包含一个或两个核糖核苷酸。

11.权利要求1所述的方法，其中所述第一组分寡核苷酸的促进剂特异性序列包含与所述促进剂核酸互补的约10至20个核苷酸或6至24个核苷酸。

12.权利要求1所述的方法，其中所述第二组分寡核苷酸的促进剂特异性序列包含与所述促进剂核酸互补的约10至20个核苷酸或6至24个核苷酸。

13.权利要求1所述的方法，其中所述第一组分寡核苷酸的部分催化核心序列包含约2至12个核苷酸。

14.权利要求1所述的方法，其中所述第二组分寡核苷酸的部分催化核心序列包含约2至12个核苷酸。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸或其任何组合。

16.权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针包含荧光团或淬灭剂。

17.权利要求1所述的方法，其中通过DNA聚合酶的3’-外切核酸酶活性从所述底物核酸的5’-片段移除所述3’-末端核苷酸。

18.权利要求1所述的方法，其还包括对双链延伸产物进行解链分析，所述双链延伸产物是通过沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的所述可延伸5’-片段形成的。

19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

(a)提供至少两种不同的第一组分寡核苷酸、至少两种不同的第二组分寡核苷酸、至少两种不同的底物核酸和至少两种不同的捕获探针，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的捕获探针中的互补序列互补，并且其中通过在所述至少两种不同的捕获探针上延伸所述至少两种不同的底物核酸的5’-片段形成的延伸产物可通过Tm区分；

(b)如果样品中存在与所述至少两种不同的第一和第二组分寡核苷酸中的一种或更多种互补的一种或更多种促进剂核酸，则使所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与所述促进剂核酸和底物核酸杂交以形成所述催化活性核酸酶；

(c)用所述催化活性核酸酶在切割位点切割一种或更多种底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段；

(d)使所述一种或更多种底物核酸的5’片段与一种或更多种不同的捕获探针杂交；

(e)从所述底物核酸的5’-片段移除所述3’-末端核苷酸以形成所述底物核酸的可延伸5’-片段；

(f)沿着所述捕获探针延伸所述底物核酸的可延伸5’-片段；以及

(g)进行解链分析以鉴定所述样品中存在的所述一种或更多种促进剂核酸。

20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述促进剂核酸是扩增子，并且所述方法还包括在使所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与所述促进剂核酸和底物核酸杂交以形成所述催化活性核酸酶之前或同时进行PCR，以及用所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段。

21.包括以下的方法：

(a)在第一温度下使第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸与促进剂核酸和底物核酸杂交以形成催化活性核酸酶，其中所述底物核酸包含在其3’端的不与所述第一组分寡核苷酸或第二组分寡核苷酸互补的尾部；

(c)在低于所述第一温度的第二温度下，使引物与所述底物核酸的3’尾部杂交；以及

(d)在所述底物核酸或其片段上延伸所述引物。

22.权利要求21所述的方法，其还包括对通过延伸所述引物形成的双链延伸产物进行解链分析。

23.权利要求21或22所述的方法，其中用荧光团标记所述底物核酸的3’尾部，并且用淬灭剂标记所述引物的5’端。

24.权利要求20或21所述的方法，其中用淬灭剂标记所述底物核酸的3’尾部，并且用荧光团标记所述引物的5’端。

25.权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

(a)提供至少两种不同的第一组分寡核苷酸、至少两种不同的第二组分寡核苷酸、至少两种不同的底物核酸和至少两种不同的引物，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的引物中的互补序列互补，并且其中通过在所述至少两种不同的底物核酸上延伸所述引物形成的延伸产物可通过Tm区分；

(d)使所述一种或更多种底物核酸的3’尾部与其各自的引物杂交；

(e)沿着所述底物核酸、底物核酸的3’-片段或其两者延伸所述引物；以及

(f)进行解链分析，其中通过鉴定与已沿着经切割底物延伸的引物相关的解链特征，可检测所述促进剂的存在。

26.组合物，其包含：

(a)促进剂核酸；

(b)底物核酸；

(c)包含与所述底物核酸部分互补之序列的捕获探针；

(d)具有3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶；

(e)第一组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；以及

(f)第二组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；

其中所述第一组分寡核苷酸和第二组分寡核苷酸在与所述促进剂核酸和底物核酸杂交时形成催化活性核酸酶，并且另外其中所述催化活性核酸酶在切割位点切割所述底物核酸以形成所述底物核酸的5’片段和3’片段。

27.组合物，包含：

(a)促进剂核酸；

(b)包含第一标记物的底物核酸；

(c)与所述底物核酸的一部分互补并包含第二标记物的第一引物；

(d)第一组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；以及

(e)第二组分寡核苷酸，其包含促进剂特异性序列、底物特异性序列和位于靶特异性序列与所述底物特异性序列之间的部分催化核心序列；

28.权利要求26所述的组合物，其中所述促进剂核酸是扩增子。

29.权利要求28所述的组合物，其还包含引物对和靶核酸，其中所述引物对从所述靶核酸引发所述扩增子的合成。

30.权利要求27所述的组合物，其中所述促进剂核酸是扩增子。

31.权利要求30所述的组合物，其还包含靶核酸和引物对，所述引物对包含第二引物和第三引物，其中所述引物对从所述靶核酸引发所述扩增子的合成。

32.权利要求31所述的组合物，其中所述第二和第三引物两者的Tm高于预定Tm阈值，并且所述第一引物的Tm低于所述预定Tm阈值。

33.权利要求26或27所述的组合物，其中所述底物核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。

34.权利要求26或27所述的组合物，其中所述底物核酸包含一个或更多个非天然核苷酸。

35.权利要求26或27所述的组合物，其中所述底物核酸包含荧光团和淬灭剂，其中所述荧光团和淬灭剂位于所述切割位点的不同侧。

36.权利要求26所述的组合物，其中所述底物核酸还包含在其5’端的尾部区，其中所述尾部区与所述捕获探针互补并且不与所述第一或第二组分寡核苷酸互补。

37.权利要求36所述的组合物，其中所述尾部区包含一个或更多个非天然核苷酸。

38.权利要求36所述的组合物，其中所述底物核酸与所述第一和第二组分寡核苷酸的Tm大于所述底物核酸的5’片段与所述捕获探针的Tm，所述底物核酸的5’片段与所述捕获探针的Tm大于所述底物核酸的5’片段与所述第一和第二组分寡核苷酸的Tm。

39.权利要求26或27所述的组合物，其中所述底物核酸的切割位点包含一个或两个核糖核苷酸。

40.权利要求26或27所述的组合物，其中所述第一组分寡核苷酸的促进剂特异性序列包含与所述促进剂核酸互补的约10至20个核苷酸。

41.权利要求26或27所述的组合物，其中所述第二组分寡核苷酸的促进剂特异性序列包含与所述促进剂核酸互补的约10至20个核苷酸。

42.权利要求26或27所述的组合物，其中所述第一组分寡核苷酸的底物特异性序列包含与所述底物核酸互补的约6至24个核苷酸。

43.权利要求26或27所述的组合物，其中所述第二组分寡核苷酸的底物特异性序列包含与所述底物核酸互补的约6至24个核苷酸。

44.权利要求26或27所述的组合物，其中所述第一组分寡核苷酸的部分催化核心序列包含约2至12个核苷酸。

45.权利要求26或27所述的组合物，其中所述第二组分寡核苷酸的部分催化核心序列包含约2至12个核苷酸。

46.权利要求40至45中任一项所述的组合物，其中所述核苷酸是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、非天然核苷酸或其任何组合。

47.权利要求26所述的组合物，其中所述捕获探针包含与所述底物核酸的5’-片段互补的第一区域，提供与所述底物核酸的5’-片段的3’-末端核苷酸之错配的第二区域，以及提供用于从所述底物核酸的5’-片段的3’-端进行核酸合成之模板序列的第三区域。

48.权利要求26所述的组合物，其中所述捕获探针包含荧光团或淬灭剂。

49.权利要求26所述的组合物，其中所述组合物包含至少两种不同的促进剂核酸；至少两种不同的底物核酸；至少两种不同的捕获探针、至少两种不同的第一组分寡核苷酸和至少两种不同的第二组分寡核苷酸，其中所述至少两种不同的底物核酸用相同的标记物进行标记，但具有彼此不同的核酸序列，并且与其各自在所述至少两种不同的捕获探针中的互补序列互补，并且其中所述至少两种不同的捕获探针可通过Tm来区分。

50.权利要求29或31所述的组合物，其中所述引物对的至少一种引物包含：

(a)包含不与所述靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；

(b)所述非杂交区5’的锚定区，其中所述锚定区与所述靶序列的第一部分互补；以及

(c)所述非杂交区3’的脚部区，其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分互补，并且另外其中所述脚部区与所述靶序列的第二部分的Tm低于所述锚定区与所述靶序列的第一部分的Tm；以及

(d)位于与所述脚部区的5’-端相邻、在所述脚部区内或在所述非杂交区内的非天然核苷酸区。

51.权利要求50所述的组合物，其中所述引物包含两个非天然核苷酸区，其中一个所述非天然核苷酸区位于与所述脚部区的5’-端相邻或在所述脚部区内，并且另一个所述非天然核苷酸区位于所述非杂交区内。

52.权利要求50所述的组合物，其中所述非天然核苷酸区由1或2个非天然核苷酸组成。

53.权利要求52所述的组合物，其中所述非天然核苷酸独立地选自isoC和isoG。

54.权利要求50所述的组合物，其中所述第一或第二组分寡核苷酸的靶特异性序列包含与所述引物的非杂交区互补的序列。

55.权利要求27所述的组合物，其中所述第一标记物是荧光团，并且所述第二标记物是淬灭剂。

56.权利要求27所述的组合物，其中所述第一标记物是淬灭剂，并且所述第二标记物是荧光团。

57.引物，其包含：

(a)包含不与靶核酸互补的天然核苷酸的非杂交区；

58.权利要求57所述的引物，其中所述非天然核苷酸区位于与所述脚部区的5’-端相邻。

59.权利要求57所述的引物，其中所述非天然核苷酸区位于所述脚部区内。

60.权利要求59所述的引物，其中所述非天然核苷酸区位于距离所述脚部区的3’-末端核苷酸为一个、两个或三个核苷酸处。

61.权利要求57所述的引物，其中所述非天然核苷酸区位于所述非杂交区内。

62.权利要求57所述的引物，其中所述引物包含两个非天然核苷酸区，其中一个所述非天然核苷酸区位于与所述脚部区的5’-端相邻或在所述脚部区内，并且另一个所述非天然核苷酸区位于所述非杂交区内。

63.权利要求57所述的组合物，其中所述非天然核苷酸区由1或2个非天然核苷酸组成。

64.权利要求57所述的组合物，其中所述非天然核苷酸独立地选自isoC和isoG。

65.在核酸扩增期间降低引物二聚体形成的方法，其包括在两种或更多种引物的存在下扩增靶序列，其中所述两种或更多种引物中的至少一种是根据权利要求57至64中任一项所述的引物。

66.在核酸扩增期间降低脱靶扩增的方法，其包括使用至少一种根据权利要求57至64中任一项所述的引物扩增靶序列。

67.在靶核酸序列上的引物结合位点容纳多态性序列的方法，其包括使用至少一种根据权利要求57至64中任一项所述的引物扩增靶序列，其中所述引物的非杂交区跨越所述多态性序列。