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CN111139200B - 一种双歧杆菌溶胞物及其制备方法 - Google Patents

一种双歧杆菌溶胞物及其制备方法 Download PDF

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CN111139200B CN202010035552.1A CN202010035552A CN111139200B CN 111139200 B CN111139200 B CN 111139200B CN 202010035552 A CN202010035552 A CN 202010035552A CN 111139200 B CN111139200 B CN 111139200B
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Guangzhou Ridgepole Biological Technology Co ltd
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Abstract

本申请属于溶胞物及护肤技术领域，具体涉及一种双歧杆菌溶胞物及其制备方法。本发明的提供了一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，包括以下步骤：将双歧杆菌在含有小米提取液的培养液中进行发酵、离心、破碎，即得。本发明的双歧杆菌溶胞物能有效促进角质形成细胞间的中间丝相关蛋白，包括丝聚蛋白FLG、兜甲蛋白LOR、外皮蛋白IVL、角蛋白KRT‑10、对转谷氨酰胺酶TGM‑1的表达，进而有助于角质形成细胞向角质层的转化，对于维持皮肤屏障的完整性至关重要。

Description

一种双歧杆菌溶胞物及其制备方法
技术领域
本申请属于溶胞物技术领域，具体涉及一种双歧杆菌溶胞物及其制备方法。
背景技术
敏感性肌肤简称“敏感肌”，又称为不耐受性皮肤、反应性皮肤、超反应皮肤，敏感性皮肤不是一种病而是一种状态。王学民老师在《皮肤性病学新进展2004》上将敏感性肌肤定义为：比正常皮肤具有更高反应性，并且对外界因素的微弱影响产生剧烈的反应特点的一类肌肤，它具有敏感度高、耐受性差、易反应性的特点。生活环境的恶化、工作压力的增加以及化妆品使用不当等因素，使得敏感肌人群的比例逐渐升高，据统计，敏感肌已经成为困扰消费者肌肤问题中上升最快速的一项。一项针对全球范围内的消费者调查数据显示，52％的消费者都认为自己是敏感肌。另一项专门针对中国人的一项调查数据表明，中国有45％的消费者被敏感肌问题困扰，并且从2014年至今，中国敏感肌人群一直呈高速增长的趋势。
敏感肌已经成为了困扰消费者的最常见肌肤问题，预期在未来深受敏感肌困扰的人群还会不断增加，同时市场对敏感肌修复类产品的需求会持续增长。科学研究表明，皮肤屏障功能缺失、免疫反应的增强、神经感受输入的增加三者之间的共同作用，造成敏感肌的形成，其中屏障功能的缺失是最重要的原因。皮肤屏障功能受损后，外界刺激因子可以直达表皮层，造成NMF、脂质和蛋白等的损伤，进而出现炎症反应及灼烧、刺痛等神经感受的输入。相反，当皮肤屏障厚实以后，外界的一些刺激就很难打到皮肤里面，而造成炎症和神经刺激。因此，敏感肌修复最重要事修复肌肤的屏障功能。
皮肤的天然屏障是指由角质层细胞和细胞之间的“脂质”和“天然保湿因子”组成的“砖墙结构”，及其表面附有的“皮脂膜”，由此共同形成了一道人体天然保护屏障。这就是由Peter于1983年提出的著名的“砖墙学说”。通常的皮肤屏障功能缺失主要是指皮肤“皮脂膜”及“砖墙结构”的破坏。目前，肌肤屏障功能的修复主要通过体外人工模拟“皮脂膜”，或者按比例补充角质层细胞间“脂质”和“天然保湿因子”来修复皮肤的“砖墙结构”。CN108338941A提供一种人工皮脂膜及其制造方法，人工皮脂膜包括：原料成分及相对质量比例为78.4％～2％的三酸甘油脂、1％～15％的蜡酯类、20％～35％的角鲨烷、0.1％～7％的游离脂肪酸、0.1％～6％的磷脂质、0.1％～10％的胆固醇酯、0.1％～10％的胆固醇、0.1％～10％的抗氧化物及0.1％～5％的细胞活性物。CN 102265153A提供一种皮肤角质层细胞间脂质模拟基板，该皮肤角质层细胞间脂质模拟基板包含基板和在该基板上形成的脂质膜，其中，该脂质膜由神经酰胺、棕榈酸和胆固醇形成，神经酰胺、棕榈酸和胆固醇以20～70％∶10～60％∶20～40％(神经酰胺∶棕榈酸∶胆固醇)的质量比存在。
敏感肌患者皮肤屏障功能薄弱，首先是由于角质层薄弱，也就是“砖墙结构”中的砖块不够强健。人体皮肤中的角质层是是表皮最外层的部分，主要由10至20层扁平、没有细胞核的死亡细胞组成。当这些细胞脱落时，表皮层细胞会被推上来，形成新的角质层。所以表皮细胞的强健是肌肤屏障功能完善的首要前提。目前，鲜有关于如何强健表皮细胞的相关研究。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的第一个方面提供了一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，包括以下步骤：将双歧杆菌在含有小米提取液的培养液中进行发酵、离心、破碎，即得。
作为一种优选的技术方案，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量的小米，按重量份数加入12-18倍去离子水，然后加热回流提取1.5-2.5小时，冷却至55-75℃得提取液；然后在提取液中加入酶水解10-14h，离心得上清液；取上清液按40-60g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液；
(2)菌株活化：将双歧杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35-39℃培养45-50h，再将斜面活化后的菌种按0.5-1.5％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、35-39℃培养16-24h，作为种子培养基；
(3)将菌株进行发酵，离心，破碎，即得。
步骤(1)中，5000-7000r/min离心10-20min得上清液；
作为一种优选的技术方案，所述酶为淀粉酶和/或蛋白酶。
作为一种优选的技术方案，所述淀粉酶为耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、异淀粉酶中的一种。
作为一种优选的技术方案，所述蛋白酶为复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种。
作为一种优选的技术方案，淀粉酶在提取液中所占的重量百分数为0.1％～0.5％，蛋白酶在提取液中所占的重量百分数为0.05％～0.1％。
作为一种优选的技术方案，所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌中的至少一种。
作为一种优选的技术方案，发酵的具体步骤为，将步骤(2)得到的种子培养基以4-6％的添加量加入步骤(1)制得的培养液中，使发酵初始菌浓度为105-108CFU/ml，同时调节培养液的pH为4.5-7，温度35-39℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液。
本发明的第二个方面提供了所述的制备方法得到的溶胞物。
本发明的第三个方面提供了一种护肤组合物，按重量百分比计，包括5-15％所述的溶胞物。
有益效果：本申请通过加入特定处理过的小米提取液对MRS培养基进行改良，经过酶处理的小米提取液提供了原MRS培养基中没有的低聚糖、小分子肽、维生素及其他矿质元素，大大提高了双歧杆菌的发酵效率，缩短了其发酵时间，提高发酵溶胞物的得率。
本发明的双歧杆菌溶胞物能有效促进角质形成细胞间的中间丝相关蛋白，包括丝聚蛋白FLG、兜甲蛋白LOR、外皮蛋白IVL、角蛋白KRT-10、对转谷氨酰胺酶TGM-1的表达，进而有助于角质形成细胞向角质层的转化，对于维持皮肤屏障的完整性至关重要。
具体实施方式
为了下面的详细描述的目的，应当理解，本发明可采用各种替代的变化和步骤顺序，除非明确规定相反。此外，除了在任何操作实例中，或者以其他方式指出的情况下，表示例如说明书和权利要求中使用的成分的量的所有数字应被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则在以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是根据本发明所要获得的期望性能而变化的近似值。至少并不是试图将等同原则的适用限制在权利要求的范围内，每个数值参数至少应该根据报告的有效数字的个数并通过应用普通舍入技术来解释。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实例中列出的数值尽可能精确地报告。然而，任何数值固有地包含由其各自测试测量中发现的标准偏差必然产生的某些误差。
当本文中公开一个数值范围时，上述范围视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。例如，从“1至10”的指定范围应视为包括最小值1与最大值10之间的任何及所有的子范围。范围1至10的示例性子范围包括但不限于1至6.1、3.5至7.8、5.5至10等。
为了解决上述问题，本发明提供了一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，包括以下步骤：将双歧杆菌在含有小米提取液的培养液中进行发酵、离心、破碎，即得。
优选的，其制备方法包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量的小米，按重量份数加入12-18倍去离子水，然后加热回流提取1.5-2.5小时，冷却至55-75℃得提取液；然后在提取液中加入酶水解10-14h，离心得上清液；取上清液按40-60g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液；
(2)菌株活化：将双歧杆菌接于MRS斜面培养基上活化，35-39℃培养45-50h，再将斜面活化后的菌种按0.5-1.5％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、35-39℃培养16-24h，作为种子培养基；
(3)将菌株进行发酵，离心，破碎，即得。
步骤(1)
小米又名粟米，它清香甘甜，色金黄酥糯。在每100克小米中含蛋白质9.7克，脂肪3.5克，淀粉72～76克，钙29毫克，磷240毫克，铁4.7～7.8毫克。跟南方地区喜食的大米相比，小米不仅产生的热量高，而且铁、胡萝卜素、维生素B1、B2的含量均高于大米。小米性味甘咸，微寒，具有和中健脾除热，益肾气补虚损，利尿消肿的作用。而用小米制成的锅巴性味甘平，功能补气健脾，消积止泻。用小米糠制成的小米糠油又有祛风、杀虫、止痒、收敛的功效。
本申请中，所述酶为淀粉酶和/或蛋白酶。
所述淀粉酶为耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、异淀粉酶中的一种，优选为耐高温α-淀粉酶。
所述蛋白酶为复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种，优选为复合蛋白酶。
所述小米酶解过程中：淀粉酶在提取液中所占的重量百分数为0.1％～0.5％，蛋白酶在提取液中所占的重量百分数为0.05％～0.1％；优选的，淀粉酶在提取液中所占的重量百分数为0.2％，蛋白酶在提取液中所占的重量百分数为0.1％。
所述MRS培养基无特别限制，可以自制也可以购买。
本申请中，MRS培养基组分为酪蛋白胰酶消化物10.0g；牛肉膏粉10.0g；酵母膏粉5.0g；柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g；葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g；吐温80 1.08g；乙酸钠5.0g；磷酸氢二钾2.0g；硫酸镁0.20g；硫酸锰0.05g；琼脂18.0g；蒸馏水1 000mL；pH 5.7±0.2。
所述灭菌的条件无特别限制，可以消除微生物而又不影响本发明目的即可。本申请中，所述灭菌的条件为121℃，15min。
步骤(1)进一步优选为，取一定重量的小米，按重量份数加入15倍去离子水，然后加热回流提取2小时，冷却至65-70℃得提取液；然后在提取液中加入酶水解12h，离心得上清液；取上清液按54g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液，灭菌的条件为121℃，15min。
步骤(2)
所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌中的至少一种，优选为两歧双歧杆菌。
本申请中，所述两歧双歧杆菌型号为ATCC 29521。
步骤(2)进一步优选为，将双歧杆菌接于MRS斜面培养基上活化，37℃培养48h，再将斜面活化后的菌种按1％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶220rpm、37℃培养20h，作为种子培养基。
步骤(3)
步骤(3)中发酵的具体步骤为，将步骤(2)得到的种子培养基以4-6％的添加量加入步骤(1)制得的培养液中，使发酵初始菌浓度为105-108CFU/ml，同时调节培养液的pH为4.5-7，温度35-39℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液；
优选的，步骤(3)中发酵的具体步骤为，将步骤(2)得到的种子培养基以5％的添加量加入步骤(1)制得的培养液中，使发酵初始菌浓度为107CFU/ml，同时调节培养液的pH为6，温度37℃，搅拌转速100rpm，发酵时间24h，得发酵液；
所述发酵过程在严格厌氧条件下进行。
步骤(3)中离心的具体步骤为，将发酵液冷却至4-8℃，然后离心，离心进料速度75-85L/h，转速15000-18000rpm，得到沉淀的湿菌体；
优选的，步骤(3)中离心的具体步骤为，将发酵液冷却至6℃，然后离心，离心进料速度80L/h，转速16000rpm，得到沉淀的湿菌体；
所述离心方式没有特别限制，本申请为管式离心。
步骤(3)中破碎的具体步骤为，将湿菌体和水分散均匀后进行破碎，破碎压力为1500-1700bar，连续破碎3次，得到菌体胞溶物。
优选的，步骤(3)中破碎的具体步骤为，将湿菌体和水分散均匀后进行破碎，破碎压力为1600bar，连续破碎3次，得到菌体胞溶物。
所述湿菌体和水的重量比为1：(3-5)；优选为1：4。
小米是一种营养价值极高的谷物，本发明通过加热回流提取，将其中一些水溶性的多糖、蛋白质、维生素、矿物质提取出来；然后用淀粉酶及蛋白酶处理，将其中的多糖水解成低聚糖，蛋白质水解成小分子肽；然后离心，取上清液按比例加入MRS培养基混匀、灭菌，作为双歧杆菌的培养基。本申请通过加入特定处理过的小米提取液对MRS培养基进行改良，酶处理过的小米提取液提供了原MRS培养基中没有的低聚糖、小分子肽、维生素及其他矿质元素，大大提高了双歧杆菌的发酵效率，缩短了其发酵时间，提高发酵溶胞物的得率。
角质层是肌肤屏障的“砖墙结构”中的砖块，是皮肤屏障的主要组成部分。角质层是由角质形成细胞通过分裂、分化演变而来，表皮细胞向终末分化过程中，形成了一系列的中间丝相关蛋白，如丝聚合蛋白(filaggrin，FLG)、兜甲蛋白(loricrin，LOR)、内皮蛋白(involucrin，IVL)、角质形成蛋白转谷酰胺酶(transglutaminase keratinocyte，TGK)等。在角质形成细胞正常分化的最后阶段，排列有序的角蛋白通过与中间丝相关蛋白相互作用构成了一种浓缩阵列。其中，中间丝相关蛋白聚合成束状角蛋白细丝，进而促进了该细胞死亡后扁平形态的形成，这对维持皮肤屏障的结构稳态具有重要作用。本发明的双歧杆菌溶胞物能有效促进角质形成细胞间的中间丝相关蛋白，包括丝聚蛋白FLG、兜甲蛋白LOR、外皮蛋白IVL、角蛋白KRT-10、对转谷氨酰胺酶TGM-1的表达，进而有助于角质形成细胞向角质层的转化，对于维持皮肤屏障的完整性至关重要。
本申请的第二方面提供了所述制备方法得到的溶胞物。
本申请的第三方面提供了一种护肤组合物，按重量百分比计，包括所述溶胞物。
所述护肤组合物包括但不限于护肤水、面膜、面霜、精华水、喷雾、防晒霜。
下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售得到的。
实施例
实施例1
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量的小米，按重量份数加入15倍去离子水，然后加热回流提取2小时，冷却至65-70℃得提取液；然后在提取液中加入酶水解12h，6000r/min离心15min得上清液；取上清液按54g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液，灭菌的条件为121℃，15min；
所述酶为耐高温α-淀粉酶和复合蛋白酶；耐高温α-淀粉酶在提取液中所占的重量百分数为0.2％，复合蛋白酶在提取液中所占的重量百分数为0.1％。
(2)菌株活化：将两歧双歧杆菌接于MRS斜面培养基上活化，37℃培养48h，再将斜面活化后的菌种按1％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶220rpm、37℃培养20h，作为种子培养基；
(3)将菌株进行发酵，离心，破碎，即得。
发酵的具体步骤为，将步骤(2)得到的种子培养基以5％的添加量加入步骤(1)制得的培养液中，使发酵初始菌浓度为107CFU/ml，同时调节培养液的pH为6，温度37℃，搅拌转速100rpm，发酵时间24h，得发酵液；所述发酵过程在严格厌氧条件下进行。
所述两歧双歧杆菌型号为ATCC 29521。
离心的具体步骤为，将发酵液冷却至6℃，然后管式离心，离心进料速度为80L/h，转速16000rpm，得到沉淀的湿菌体；
破碎的具体步骤为，将湿菌体和水(所述湿菌体和水的重量比为1：4)分散均匀后进行破碎，破碎压力为1600bar，连续破碎3次，得到菌体胞溶物。
一种由上述方法得到的菌体胞溶物。
对比例1
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述小米替换为大米。
对比例2
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，所述小米替换为薏米。
对比例3
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，(1)培养液制备：取去离子水按54g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液，灭菌的条件为121℃，15min；
对比例4
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，(1)培养液制备：在去离子水中按20g/L加入葡萄糖，然后按54g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液，灭菌的条件为121℃，15min。
对比例5
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，(1)培养液制备：取一定重量的小米，按重量份数加入15倍去离子水，然后加热回流提取2小时，冷却至65-70℃得提取液；将提取液离心得上清液；取上清液按54g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液，灭菌的条件为121℃，15min。
对比例6
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，步骤(2)中的两歧双歧杆菌替换为婴儿双歧杆菌。
对比例7
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，步骤(2)中的两歧双歧杆菌替换为短双歧杆菌。
对比例8
一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，具体步骤同实施例1，不同点在于，步骤(2)中的两歧双歧杆菌替换为长双歧杆菌。
性能测试
(1)发酵效率检测：针对各实施例和对比例，将步骤(2)得到的种子培养基以5％的添加量加入步骤(1)制得的培养液中，使发酵初始菌浓度为107CFU/ml，同时调节培养液的pH为6，温度37℃，搅拌转速100rpm，进行发酵，以OD600值不变化为发酵终点，计算发酵时间。发酵结束后离心，然后检测各实施例和对比例的湿菌重量。
发酵时间/h 湿菌重量/g
实施例1 20 55.3
对比例1 22 48.6
对比例2 22 46.5
对比例3 24 44.8
对比例4 24 41
对比例5 24 45.3
对比例6 20 52.4
对比例7 20 53.2
对比例8 20 51.5
在工业化生产过程中，发酵的效率尤为重要。本发明通过加入特定处理过的小米提取液对MRS培养基进行改良，大大提高了双歧杆菌的发酵效率，缩短了其发酵时间，提高发酵溶胞物的得率。进一步研究发现，在提高双歧杆菌发酵效率方面，小米相较于大米、薏米等其他谷物也更好的表现，这可能是基于小米成分的独特性，经过提取、酶解之后的提取物提供了独特的低聚糖、小分子肽、维生素及其他矿质元素，这些成分能有效促进双歧杆菌的生长。
(2)溶胞物屏障修复功效检测：取生长状态良好的HaCaT细胞铺6孔板培养24h后，更换为含有受检样品的培养基，24h后用TRIzon提取总RNA，并采用NanoDrop进行RNA纯度和浓度检测。随后通过cDNA合成试剂得到cDNA链并进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分析确认有目的基因条带。最后将cDNA链用于Real-Time PCR定量检测，得出受检样品对皮肤屏障相关基因表达的影响(备注：溶胞物按体积稀释100倍然后进行测试)。
Figure BDA0002365862510000101
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种双歧杆菌溶胞物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养液制备：取一定重量的小米，按重量份数加入12-18倍去离子水，然后加热回流提取1.5-2.5小时，冷却至55-75℃得提取液；然后在提取液中加入酶水解10-14h，离心得上清液；取上清液按40-60g/L加入MRS培养基，混合均匀后灭菌得培养液；
(2)菌株活化：将双歧杆菌接于MRS斜面培养基上活化，25-30℃培养45-50h，再将斜面活化后的菌种按0.5-1.5％的添加量接于MRS液体试管培养基中，摇瓶200-250rpm、35-39℃培养16-24h，作为种子培养基；
(3)将菌株进行发酵，离心，破碎，即得；
所述酶为淀粉酶和/或蛋白酶；
所述淀粉酶为耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、异淀粉酶中的一种；
所述蛋白酶为复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶中的一种。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，淀粉酶在提取液中所占的重量百分数为0.1％～0.5％，蛋白酶在提取液中所占的重量百分数为0.05％～0.1％。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌中的至少一种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，发酵的具体步骤为，将步骤(2)得到的种子培养基以4-6％的添加量加入步骤(1)制得的培养液中，使发酵初始菌浓度为105-108CFU/ml，同时调节培养液的pH为4.5-7，温度35-39℃，搅拌转速50-150rpm，发酵时间22-26h，得发酵液。
5.一种由权利要求1-4任一项所述的制备方法得到的溶胞物。
6.一种护肤组合物，其特征在于，按重量百分比计，包括5-15％权利要求5所述的溶胞物。
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