CN115317431A - 一种婴儿双歧杆菌ylgb-1496的制备物及其在皮肤健康中的新用途 - Google Patents
一种婴儿双歧杆菌ylgb-1496的制备物及其在皮肤健康中的新用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种婴儿双歧杆菌YLGB‑1496的制备物及其在皮肤健康中的新用途，具体提供了一种婴儿双歧杆菌在制备具有护肤功效的护肤品中的应用，所述婴儿双歧杆菌包括保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌。本发明发现该婴儿双歧杆菌具有较为良好的保湿、增强皮肤屏障、促进皮肤抗菌肽表达等方向的功效，可应用于制备护肤品。
Description
技术领域
本发明是关于一种婴儿双歧杆菌的护肤应用及护肤品，具体而言，是关于一种保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌或其发酵液在制备具有护肤功效的护肤品中的应用。
背景技术
传统护肤品通常使用化学类制剂作为主要成分，但是化学制剂常会引发各种皮肤问题，而且，长期使用以化学类制剂为主要成分的护肤品最终会导致皮肤受损。随着对护肤品自然亲肤的要求越来越强烈，目前有以植物提取物作为主要成分的护肤品。但是植物提取物通常也是以化学制剂作为助剂提取出来的，难免存在化学制剂残留，有些化学制剂即使是微量残留也会引起皮肤问题，甚至皮渗至血液中引发疾病。
皮肤的屏障功能是维持皮肤正常生理功能的重要结构，其结构被形象的比喻为“砖墙结构”。其中砖墙结构的“砖块”是指角质细胞，而填充于砖块间并将砖块紧密连接的“灰浆”是指细胞间的脂质。皮肤屏障功能有两个方面：防止外界化学、物理或生物性有害因素的入侵；防止体内营养物质及水分的流失。敏感性肌肤形成的主要原因是皮肤屏障功能的受损。与正常皮肤相比，敏感性皮肤角质层的屏障功能相对较弱。角质形成细胞减少会导致皮肤的角质层变薄，经皮渗透速率增加，皮肤敏感性较高。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种婴儿双歧杆菌及其制备物的护肤应用。
本发明的另一目的在于提供一种以婴儿双歧杆菌和/或其发酵产物制备的护肤品。
本发明提供了保藏编号为CGMCC No.21109的长双歧杆菌婴儿亚种(即婴儿双歧杆菌)(Bifidobacterium longum subsp.infantis)及其制备物的护肤应用。所述保藏编号为CGMCC No.21109的长双歧杆菌婴儿亚种已于2020年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2020年12月05日；保藏编号：CGMCC No.21109；分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)。该菌株还曾于2011年04月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072；保藏日期：2011年04月10日；保藏编号：CCTCC NO：M2011122，分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)。本发明中将该菌株也称为YLGB-1496或GB-1496。
本发明的发明人在研究中发现，保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的发酵液具有护肤功能，其中含有丰富的有机酸、氨基酸和多糖类化合物，所述发酵液能够增强皮肤细胞中屏障相关基因的表达，提高抗菌肽基因CAMP的表达量，具有改善皮肤屏障的功效。
从而，一方面，本发明提供了一种婴儿双歧杆菌在制备具有护肤功效的护肤品中的应用，所述婴儿双歧杆菌包括保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌。本发明还提供了保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌的制备物及其护肤应用。本发明中，所述婴儿双歧杆菌的制备物是指以该婴儿双歧杆菌为原料制备得到的物品，例如，在一些具体的实施方案中，所述婴儿双歧杆菌的制备物是婴儿双歧杆菌经发酵得到的发酵产物，例如发酵液；在另一些具体的实施方案中，所述婴儿双歧杆菌的制备物为婴儿双歧杆菌或其发酵液进一步制备得到的护肤品。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌是经发酵后的发酵液用于制备护肤品。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述发酵液中，乳酸含量1％-3％，乙酸含量1％-4％，总多糖含量8mg/mL-12mg/mL，总氨基酸含量2mg/mL-6mg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述护肤功效包括改善皮肤屏障功能。
优选地，所述改善皮肤屏障功能包括：促进屏障相关基因例如FLG、LOR、IVL和/或AQP-3的表达，促进皮肤抗菌肽例如CAMP、hBD-2和/或hBD-3的表达，和/或减少皮肤水分流失。
另一方面，本发明还提供了一种护肤品，其原料组成中包括保藏编号为CGMCCNo.21109的婴儿双歧杆菌和/或其发酵产物。
根据本发明的具体实施方案，本发明的护肤品中，所述发酵产物为发酵液。
优选地，所述发酵液是按照以下方法制备得到的：
将保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌接种于含乳清蛋白的培养液中，发酵培养，得到发酵液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液，在制备时，所述含乳清蛋白的培养液中乳清蛋白含量为2％-10％。该培养液中还可含有3％-12％的白砂糖。培养液中的其余组分可为水。保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌(种子液)接种量可为2％-5％。通常于37℃左右培养18h-72h以后，所得制备物(可根据需要离心除去菌体得到上清液)即可用于本发明的护肤应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明的护肤品中，所述发酵液中，乳酸含量1％-3％，乙酸含量1％-4％，总多糖含量8mg/mL-12mg/mL，总氨基酸含量2mg/mL-6mg/mL。具体地，其中的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸(甲硫氨酸)胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、色氨酸中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，本发明的护肤品中，所述发酵液在化妆品中的添加量为0.1％-30％。
根据本发明的具体实施方案，本发明的护肤品可以为护肤液或护肤霜。
根据本发明的具体实施方案，本发明的护肤品可以为化妆水或面膜。
本发明的护肤品具有良好的改善皮肤屏障的功效。
附图说明
图1显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中屏障相关基因FLG的表达量的促进结果。
图2显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中屏障相关基因LOR的表达量的促进结果。
图3显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中屏障相关基因IVL的表达量的促进结果。
图4显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中屏障相关基因AQP3的表达量的促进结果。
图5显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中抗菌肽基因CAMP的表达量的促进结果。
图6显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中抗菌肽基因hBD-2的表达量的促进结果。
图7显示本发明的婴儿双歧杆菌的发酵液对HaCaT细胞中抗菌肽基因hBD-3的表达量的促进结果。
图8显示使用本发明的护肤品后的乳酸刺痛试验结果。
图中：“*”表示有显著性差异，0.01≤p<0.05，“**”表示有显著性差异，0.001≤p<0.01；“***”表示有显著性差异，p<0.001。
用于专利程序的微生物保藏：
婴儿双歧杆菌YLGB-1496(或GB-1496)菌株：
保藏日期：2020年12月05日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
保藏编号：CGMCC No.21109；
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1：益生菌发酵液制备
一种婴儿双歧杆菌YLGB-1496(来源为中国健康妈妈母乳，已于2020年12月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2020年12月05日；保藏编号：CGMCC No.21109；分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis))，接种于乳清蛋白培养基(乳清蛋白含量为8％，白砂糖含量6％，其余为水)，接种量为3％，于37℃培养18h，离心沉淀取上清液，并用0.45μm无菌过滤膜过滤，灭菌，所得益生菌发酵液4℃下放置待用。
实施例2：有机酸、氨基酸和多糖含量检测
采用高效液相色谱法测定实施例1中所得益生菌发酵液中的有机酸含量；苯酚-硫酸法测定多糖含量；氨基酸自动分析仪法测定氨基酸含量。其中，有机酸的含量检测结果如表1所示。
表1益生菌发酵液有机酸含量检测
总多糖测试结果：9.792mg/mL。
氨基酸测试结果包括：天冬氨酸0.194mg/mL；谷氨酸0.201mg/mL；丝氨酸0.064mg/mL；甘氨酸0.049mg/mL；组氨酸0.080mg/mL；精氨酸0.157mg/mL；苏氨酸0.154mg/mL；丙氨酸0.222mg/mL；脯氨酸0.213mg/mL；酪氨酸0.168mg/mL；缬氨酸0.190mg/mL；蛋氨酸(甲硫氨酸)胱氨酸0.110mg/mL；异亮氨酸0.202mg/mL；亮氨酸0.295mg/mL；苯丙氨酸0.129mg/mL；赖氨酸0.168mg/mL；色氨酸0.083mg/mL。
实施例3：益生菌发酵液对皮肤屏障功能的增强作用
实验分组具体设置如表2所示。
表2实验分组
细胞培养：
1、种板：将细胞消化，计数，每孔3×105个，每孔2mL细胞培养液置于六孔板内；其中细胞培养液的成分为MEM培养基(89％)+FBS(血清10％)+双抗(1％)；培养基：国家实验细胞资源共享平台MEM、血清：Gibco货号：10099-141C、双抗：HyClone货号：SV30010；
2、置于37℃培养箱培养24h后，使细胞贴壁，弃上清，每孔加入2mL不同浓度(5％、3％、1％)的发酵液样品和竞品，空白对照添加细胞培养液；
3、培养24h后，弃上清，每孔加入1mLTrizol裂解液，用移液枪吹打并移至EP管中；
4、根据RNA试剂盒提取样品RNA；
5、根据试剂盒说明将提取得到的RNA进行逆转录，得到cDNA；引物序列如表3所示。
表3半定量RT-PCR检测屏障相关基因所用引物
统计方法
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05认为具有显著差异，p<0.01认为具有极显著差异。
试验结果：
丝聚蛋白(FLG，Filaggrin)主要起到连接角质细胞纤维的功能，并且可以维持角质细胞的形状，形成角质包膜。与对照组相比，发酵液样品在浓度为3％，5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因FLG的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)。与对照组相比，德国CLR公司二裂酵母发酵液Repair Complex CLR PF(简称
)竞品在浓度为5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因FLG的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)(图1)。
与对照组相比，发酵液样品在浓度为1％、3％、5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因LOR的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)。与对照组相比，
竞品在浓度为1％、3％、5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因LOR的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)，且该作用具有剂量依赖性(图2)。
与对照组相比，发酵液样品在浓度为3％、5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因IVL的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)。与对照组相比，
竞品在浓度为5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因IVL的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)(图3)。
与对照组相比，发酵液样品在浓度为3％、5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因AQP-3的表达量有显著的诱导作用(p<0.01)。与对照组相比，
竞品在浓度为3％、5％时对HaCaT细胞中屏障相关基因AQP3的表达量有显著的诱导作用(p<0.01)。角质细胞中水通道蛋白-3(AQP-3,Aquaporia-3)主要参与细胞的物质吸收与分泌过程，有助于保持皮肤弹性，修复损伤(图4)。
实施例4：细胞水平评价益生菌发酵物对皮肤抗菌肽表达的作用
实验分组具体设置如表4所示。
表4实验分组
细胞水平抗菌肽实验方法
1、种板：将细胞消化，计数，每孔3×105个，每孔2mL细胞培养液(同实施例3)置于六孔板内；
2、置于37℃培养箱培养24h后，使细胞贴壁，弃上清，每孔加入2mL不同浓度(5％、3％、1％)的发酵液样品和竞品，空白对照添加细胞培养液；
3、培养24h后，弃上清，每孔加入1mL Trizol裂解液，用移液枪吹打并移至EP管中；
4、根据RNA试剂盒提取样品RNA；
5、根据试剂盒说明将提取得到的RNA进行逆转录，得到cDNA；
6、将cDNA与引物结合，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明进行操作。
统计方法
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05认为具有显著差异，p<0.01认为具有极显著差异。
试验结果：
与对照组相比，发酵液样品在浓度为3％、5％时对HaCaT细胞中抗菌肽基因CAMP的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)，且该作用具有剂量依赖性。与对照组相比，CLR竞品在浓度为3％、5％时对HaCaT细胞中抗菌肽基因CAMP的表达量有显著的诱导作用(p<0.01)(图5)。
人β-防御素(hBD-2)在皮肤的固有免疫中占据重要地位，同时由于其广谱的抗菌活性，从而成为抗感染临床研究中的热点。与对照组相比，发酵液样品在浓度为1％、3％、5％时对HaCaT细胞中抗菌肽基因hBD-2的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)，且该作用具有剂量依赖性。与对照组相比
竞品在浓度为3％、5％时对HaCaT细胞中抗菌肽基因hBD-2的表达量有显著的诱导作用(p<0.05)，且该作用具有剂量依赖性(图6)。与对照组相比，发酵液样品在浓度为1％、3％、5％时对HaCaT细胞中抗菌肽基因hBD-3的表达量有显著的诱导作用(p<0.01)，且该作用具有剂量依赖性。与对照组相比，
竞品在浓度为1％、3％、5％时对HaCaT细胞中抗菌肽基因hBD-3的表达量未见显著的诱导作用(p>0.05)(图7)。
实施例5：含益生菌发酵物的面膜制备及功能评价
面膜产品配方：水、丁二醇、实施例1制备的婴儿双歧杆菌YLGB-1496发酵液(3％)、燕麦β-葡聚糖、金钗石斛茎提取物、库拉索芦荟叶提取物、苦参根提取物、宁夏枸杞果提取物、紫松果菊提取物、羟乙基哌嗪乙烷磺酸、对羟基苯乙酮、水解小核菌胶、透明质酸钠、1，2-乙二醇、肌肽、EDTA二钠。产品信息如表5所示。
表5检测产品信息
| 名称 | 产品批号 | 颜色和物态 | 规格 | 数量 | 包装 |
| 发酵面膜 | BR0105087 | 贴片式面膜 | 未标识 | 300片 | 袋装 |
测试方法：本测试结果是通过30例皮肤干燥、粗糙，面部有脱屑现象，眼周有细纹，自述肌肤敏感、乳酸反应呈阳性(总分≥3分)，年龄范围在25～40周岁的中国健康女性受试者使用测试产品28天后获得，测试结果表明该产品具有以下功效：
实验结果：
实验结果如表6所示，使用测试产品14天后，受试者脸颊角质层水分含量显著性升高20.34％，脸颊皮肤红斑指数EI值显著性降低10.84％，脸颊经皮水分流失量显著性降低8.21％，脸颊皮肤弹性R2值显著性升高3.01％，脸颊皮肤弹性Q1值显著性升高3.09％，脸颊皮肤粗糙度SEr显著性降低12.22％，脸颊皮肤平滑度SEsm显著性降低8.50％，眼下皮肤细纹面积显著性降低15.89％，鱼尾纹面积显著性降低12.67％。以上结果说明，使用测试产品14天后具有显著性补水保湿功效、显著性修复肌肤屏障功效、显著性舒缓肌肤功效、显著性提高肌肤弹性功效、显著性细腻肌肤功效、显著性平滑肌肤功效、显著性淡化细纹功效、显著性淡化鱼尾纹功效。
使用测试产品28天后，受试者脸颊角质层水分含量显著性升高24.11％，脸颊皮肤红斑指数EI值显著性降低15.60％，脸颊经皮水分流失量显著性降低12.80％，脸颊皮肤弹性R2值显著性升高6.38％，脸颊皮肤弹性Q1值显著性升高6.22％，脸颊皮肤粗糙度SEr显著性降低22.06％，脸颊皮肤平滑度SEsm显著性降低14.91％，眼下皮肤细纹面积显著性降低19.27％，鱼尾纹面积显著性降低12.48％。以上结果说明，使用测试产品28天后具有显著性补水保湿功效、显著性修复肌肤屏障功效、显著性舒缓肌肤功效、显著性提高肌肤弹性功效、显著性细腻肌肤功效、显著性平滑肌肤功效、显著性淡化细纹功效、显著性淡化鱼尾纹功效。
表6发酵面膜使用28天功效性数据
表6(续)
表中，*p<0.05,**p<0.001。
乳酸刺痛试验：
结果显示，使用测试产品14天后，鼻唇沟乳酸刺痛计分2.5min显著性降低51.28％，5min显著性降低52.54％，2.5min和5min的总分显著性降低52.04％。以上结果说明，使用测试产品14天后具有显著性增强肌肤耐受性功效。
使用测试产品28天后，鼻唇沟乳酸刺痛计分2.5min显著性降低56.41％，5min显著性降低55.93％，2.5min和5min的总分显著性降低56.12％，以上结果说明，使用测试产品28天后具有显著性增强肌肤耐受性功效(图8)。
产品安全性评价结果显示：
测试期间所有受试者均未出现皮肤红斑、浸润、水肿、丘疹、水疱等皮肤不良反应，未出现痤疮、毛孔变粗大、皮肤肤色变暗沉、屏障受损相关症状(包括但不限于皮肤瘙痒、刺痛、发热、紧绷、红肿、红血丝增多等)及过敏性症状等情况。
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Claims (10)
1.一种婴儿双歧杆菌在制备具有护肤功效的护肤品中的应用，所述婴儿双歧杆菌包括保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌是经发酵后的发酵液用于制备护肤品。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述发酵液中，乳酸含量1％-3％，乙酸含量1％-4％，总多糖含量8mg/mL-12mg/mL，总氨基酸含量2mg/mL-6mg/mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述护肤功效包括改善皮肤屏障功能；
优选地，所述改善皮肤屏障功能包括：促进屏障相关基因FLG、LOR、IVL和/或AQP-3的表达，促进皮肤抗菌肽的表达，和/或减少皮肤水分流失。
5.一种护肤品，其原料组成中包括保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌和/或其发酵产物。
6.根据权利要求5所述的护肤品，其中，所述发酵产物为发酵液；
优选地，所述发酵液是按照以下方法制备得到的：
将保藏编号为CGMCC No.21109的婴儿双歧杆菌接种于含乳清蛋白的培养液中，发酵培养，得到发酵液。
7.根据权利要求6所述的护肤品，其中，所述发酵液中，乳酸含量1％-3％，乙酸含量1％-4％，总多糖含量8mg/mL-12mg/mL，总氨基酸含量2mg/mL-6mg/mL。
8.根据权利要求6或7所述的护肤品，其中，所述发酵液在护肤品中的添加量为0.1％-30％。
9.根据权利要求5所述的护肤品，该护肤品为护肤液或护肤霜。
10.根据权利要求5所述的护肤品，该护肤品为化妆水或面膜。
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Cited By (1)
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| CN117551590A (zh) * | 2024-01-10 | 2024-02-13 | 广州集妍化妆品科技有限公司 | 长双歧杆菌婴儿亚种、微生物菌剂及其应用 |
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2021
- 2021-05-11 CN CN202110509420.2A patent/CN115317431A/zh active Pending
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