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CN110907653B - 一种检测促甲状腺激素的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测促甲状腺激素的试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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CN110907653B CN201911244704.2A CN201911244704A CN110907653B CN 110907653 B CN110907653 B CN 110907653B CN 201911244704 A CN201911244704 A CN 201911244704A CN 110907653 B CN110907653 B CN 110907653B
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Abstract

本发明涉及体外试剂诊断技术领域，公开了一种检测促甲状腺激素抗的试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒包括固相载体包被促甲状腺激素抗体‑量子点1交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体‑量子点2交联物、碱性磷酸酶‑量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体和牛血清白蛋白‑量子点4交联物中的一种或两种以上组分。本发明选择量子点作为促甲状腺激素试剂盒主要组分的交联发光物质，所形成的交联物能够在不影响其检测准确性的前提下，方便、快捷和准确的通过施加激发光获得量子点荧光状态和强度，以此指示目标物在试剂中的分布状态和判断异常样本造成异常结果的原因，从而可以应用于促甲状腺素检测产品的制备中。

Description

一种检测促甲状腺激素的试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及体外试剂诊断技术领域，具体涉及一种检测促甲状腺激素抗的试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
不同于小批量生产，工业上进行大批量试剂生产时，其混匀状态的确定通常是由外观上进行肉眼观察。但实际的均一状态可能不能通过肉眼观察而得之，真正需要的混匀时间和混匀方式的确定需要多次试验或仅凭经验得出，具有不确定性，且极其浪费人力和物力。在生产过程中，如在不均一的状态下进行分装，可能会出现产品的质量问题，而一味的延长搅拌混匀的时间则会降低生产效率，甚至产生变质的风险。
诸如促甲状腺激素的这类体外诊断试剂中通常包含固相、标记结合物、稀释液等组分，各组分中活性材料、辅料在各试剂中存在的状态一般无法通过肉眼观察得出。由于受保存条件、环境因素或长时间存放的影响可能会出现试剂内状态不均一的结果，目前市面上并没有简单、方便的观察试剂中特定组分分布状态的办法。
此外，由于检测标本的复杂性，干扰在免疫诊断中是不可避免的。免疫诊断中干扰的类型包括与分析物类似物的交叉反应，内源性抗体的干扰，结合蛋白的干扰，标本前处理造成的干扰等方面。除此之外，标本中的分析物以外的基质组分也可能与试剂中的组分进行非特异性的结合，影响免疫检测信号值。对于免疫诊断中干扰的排查，首先要排除标本的分析前处理是否存在问题，继而在不同的制造商、不同平台或其他仪器上进行重复试验。使用异嗜性抗体阻塞管、PEG沉淀等技术进行标本的处理，或是通过梯度稀释、溶剂萃取等方式验证干扰原因。但通常来讲，对某种特定干扰因素的确证，或是通过添加过量猜测的试剂中受干扰物质或类似物，或是通过添加可与猜测的标本中干扰因素特异性或非特异性结合的物质，一般是通过检测标本处理后的检测信号值的变化来推测干扰原因或方式。然而这种方式方法并不能明确的“看到”干扰因素的情形，缺少对干扰状况的直观了解。
因此，如何快速、便捷的观察试剂内特定组分的分布状态以及如何直观的显示造成异常结果原因是目前体外诊断试剂亟待解决的两个主要问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测促甲状腺激素的试剂盒，在不影响所述试剂盒检测的前提下，能够快速、便捷、准确的观察试剂盒各组分在试剂中的分布状态，利于质量控制；
本发明的另外一个目的在于提供一种检测促甲状腺激素的试剂盒，使得所述试剂盒能够直观的显示异常标本造成的异常结果原因，并提供试剂盒在该方面的应用；
本发明的另外一个目的在于提供利用上述试剂盒在分析仪器加样针的试剂盒各组分污染状况中的应用；
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测促甲状腺激素的试剂盒，包括如下一个或两个以上组分：
固相载体包被促甲状腺激素抗体-量子点1交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物、碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体和牛血清白蛋白-量子点4交联物；所述各组分中的量子点的粒径均不相同。
本发明通过将促甲状腺激素检测试剂盒各主要组分与量子点与交联，依靠施加激发光获得量子点的荧光强度，从而建立起荧光强度与目标物的关联程度，根据相对荧光强度直观获得各组分在相关试剂中的分布状态，也可根据相对荧光强度来判断仪器加样针是否存在相关的污染物，以及通过荧光位置、状态和强度的改变来直观分析异常标本造成的异常结果的原因。
量子点的光谱特性主要取决于半导体纳米粒子的半径，半径越小，能带越宽，吸收带则蓝移，粒子发出的蓝光荧光；半径越大，则吸收带红移，颗粒发出绿色、黄色、橙色、红色等荧光，不同的粒径大小的量子点可以由同一波长的光激发发出不同颜色的荧光。
作为优选，本发明选择羧基化的量子点，更优选为CdSe量子点；在本发明具体实施方式中，选择粒径分别为2.2nm、3.1nm、4.5nm、7.7nm四种粒径的CdSe量子点，它们在400nm的紫外灯激发光下的发射光分别为蓝光、绿光、橙色光和红色光，且其发射光光谱基本无重叠，可使用同一激发光源进行多通道的同步检测，不同颜色的荧光可有助于区分所要观察的目标。
作为优选，所述固相载体为磁微粒。
在本发明的验证试验中，以碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物为试验对象，选取具备相同功能的绿色荧光蛋白作为对照，验证不同荧光发光物质对实际检测结果的影响(主要看对碱性磷酸酶是否有影响，其发光值关联检测结果)，结果显示，相对于阴性对照，本发明所述交联物不影响促甲状腺激素的正常检测，对碱性磷酸酶的发光值没有影响，而绿色荧光蛋白的交联物的碱性磷酸酶发光值下降了近70％，明显低于阴性对照的发光值，这说明对于促甲状腺激素检测试剂盒，只有合适的荧光发光物质才能满足本发明所要求的效果。
本发明所述试剂盒的各组分是检测促甲状腺激素的主要物质，但是在试剂盒的试剂中，其往往还需要和一些辅料一同组成试剂，这些辅料主要用来防腐、缓冲、提供色素和维持蛋白的稳定等作用，在本发明具体实施方式中，这些辅料为：每1000升辅料溶液，内含PBS pH7.5，牛血清白蛋白3％，庆大霉素10mg，胭脂红色素20mg。快捷、方便和准确的观测到这些主要物质在试剂中的分布状态，有助于控制产品质量；因此，本发明提出了一种检测所述试剂盒的组分在试剂中分布状态的方法，对含有所述试剂盒的组分的试剂施加激发光，于不同时间点统计试剂的相对荧光强度结果，通过相对荧光强度的改变判断试剂盒各组分在试剂中分布状态。该方法可检测试剂在生产过程中或储存状态中的目标物的分布状态，从而针对分布状态决定是否进行混匀操作，以及统计混匀操作的所需时间。
在本发明具体实施方式中，本发明提供了一种检测生产过程中所述试剂盒各组分在试剂中分布状态的方法，将本发明所述试剂盒的个组分投入到试剂辅料中开始搅拌，在远离投料处设置一处激发光源和检测荧光装置，在不同的时间点外施激发光和检测荧光量。在投料初期，各组分还没有均匀的分布在试剂中，检测的荧光量会随时间的增加而增加，然后在某个时间点达到稳定的状态，从而判定目标物呈均匀分布状态，而稳定的荧光状态所对应的这个时间点，就是各组分达到均一状态所需的时间。
同时，本发明还提供了一种检测储存状态中所述试剂盒各组分在试剂中分布状态的方法，将包含本发明所述试剂盒各组分的试剂从储存状态转移至室温环境下，以激发光激发量子点荧光，观察利用拍照和荧光检测装置并记录。将上述试剂进行混匀，分别在不同时间点以激发光激发量子点荧光，观察利用拍照和荧光检测装置并记录。通过荧光强度的结果来判断试剂是否需要混匀以及混匀所用时间。其中，所述储存状态包括但不限于在-20--30℃和2-8℃间反复冻融多次、在37-40℃条件下长期存放、在2-8℃下长期存放。
当检测仪器试剂加样针为固定针时，通常是通过用纯化水的冲洗达作为试剂针清洗的方式，而这种清洗方式在长时间使用后或仪器保养不足时往往会出现效果不佳的状况，这种状况被称为试剂针的携带污染。通常对于试剂针的携带污染的判定需要通过对携带污染试剂盒的空白实验来推断，这种做法不能判定具体的携带物和携带量，有一定的局限性。通过量子点示踪试剂盒各组分，能快速简便的识别出试剂针中是否存在携带和携带的多少。
故本发明还提供一种检测仪器加样针物污染状况的方法，首先建立所述试剂盒中的组分的浓度与相对荧光强度的标准曲线；在使用所述试剂盒检测促甲状腺激素后，对加样针水清洗，然后施加激发光统计加样针的相对荧光强度和荧光颜色，和阴性对照的加样针相比较，判断污染物的类型和污染量。
通常来讲，当遇到检验的异常结果时，检验科或厂商需要对干扰原因进行一步步排查，并通过进一步的处理推测出干扰的原因，但不能明确的“看到”干扰因素的样子，而本发明对所述试剂盒各组分示踪，并将干扰样本与之混合，处理，便可在荧光显微镜下锁定特定干扰因素，以便于更准确的理解和判定干扰因素的结合方式和程度。故本发明还提出了一种分析促甲状腺激素异常标本造成的异常结果原因的方法，包括：
步骤1、从检测标本中筛选出异常标本，将异常样本离心取上清备用；
步骤2、从与步骤1中同批次的检测标本中筛选出促甲状腺激素浓度一致的多份正常样本，离心取上清备用；
步骤3、将本发明所述试剂盒中的组分与上述异常样本和正常样本分别混匀并孵育反应；
步骤4、分离步骤3反应液中的固相载体部分与液相部分，并置于荧光显微镜下观察，通过荧光位置和荧光量直观分析出造成的异常结果原因；
其中，当出现抗碱性磷酸酶抗体干扰时，固相载体上存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物，相对于无此类干扰的样本，所述试剂盒中固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点1交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物和牛血清白蛋白-量子点4交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体发出的荧光的位置、状态和荧光强度明显变化；
当出现内源性抗体干扰时，分为两种情形，情形一是内源性抗体与固相载体包被的促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体结合形成复合物，造成假阳性结果；该情形下，固相载体上同时存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物1和包被促甲状腺激素抗体-内源性抗体-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物2，相对于无此类干扰的样本，固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点1交联物和牛血清白蛋白-量子点4交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物和碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体所发出的荧光的位置、状态变化，荧光量明显增加，相对的，在液相中其荧光量减少；
情形二是内源性抗体与固相载体包被的促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体分别结合，造成假阴性结果；该情形下，固相载体上同时存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物1和促甲状腺激素抗体-内源性抗体复合物2，相对于无此类干扰的样本，固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点1交联物和牛血清白蛋白-量子点4交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物和碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体所发出的荧光的位置、状态变化，荧光量明显减少，相对的，在液相中其荧光量增加。
其中，所述异常标本造成的异常结果为检验结果与临床症状不符或模式不符，或检测结果与高级参考方法不一致。
在本发明具体实施方式中，所述固相载体包被促甲状腺激素抗体-量子点1交联物中的量子点为CdSe，粒径为2.2nm，400nm的紫外灯激发光下的发射光为蓝光；
碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物中的量子点为CdSe，粒径为3.1nm，400nm的紫外灯激发光下的发射光为绿光；
碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体中的量子点为CdSe，粒径为4.5nm，400nm的紫外灯激发光下的发射光为橙色光；
牛血清白蛋白-量子点4交联物中的量子点为CdSe，粒径为7.7nm，400nm的紫外灯激发光下的发射光为红色光；
依照上述不同粒径量子点的实例，通过图1直观呈现异常结果原因的几种情形，其中A代表正常样本与试剂中固相载体包被促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体形成的双抗体夹心复合物；B代表异常标本中存在抗碱性磷酸酶抗体干扰示意图；C和D代表异常标本中存在内源性抗体干扰的两种情形；E代表固相载体，F代表固相载体包被促甲状腺激素抗体交联2.2nm CdSe，在400nm的紫外灯激发光下的发射光为蓝色荧光；G代表标本中的促甲状腺激素；H代表碱性磷酸酶标记促甲状腺激素抗体交联3.1nm CdSe，在400nm的紫外灯激发光下的发射光为绿色荧光；I代表促甲状腺激素抗体标记碱性磷酸酶交联4.5nm CdSe，在400nm的紫外灯激发光下的发射光为橙色荧光；J代表抗碱性磷酸酶抗体；K代表内源性抗体。
基于上述技术效果和原理的描述，本发明提出了所述试剂盒如下一个或多个方面的应用：
在制备检测促甲状腺激素的产品中的应用；
检测仪器加样针污染物状况中的应用，所述污染物为试剂盒各组分；
检测试剂盒各组分在试剂中分布状态的应用；
分析促甲状腺激素异常标本造成的异常结果原因的应用。
此外，本发明还提供了所述试剂盒的制备方法，采用EDC和NHS作为交联剂，选择不同粒径的量子点分别对促甲状腺激素抗体、碱性磷酸酶和牛血清白蛋白进行化学交联，获得促甲状腺激素抗体-量子点1交联物、促甲状腺激素抗体-量子点2交联物、碱性磷酸酶-量子点3交联物以及牛血清白蛋白-量子点4交联物；
将固相载体用促甲状腺激素抗体-量子点1交联物包被，获得包被有促甲状腺激素抗体-量子点1交联物的固相载体，将碱性磷酸酶标记促甲状腺激素抗体-量子点2交联物获得性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物，将碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体获得碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体。
作为优选，各组分交联量子点的方法为：
将羧基化量子点加入反应容器中，将各组分分别加入反应容器中缓慢的震荡混匀；称取EDC和NHS加入反应容器中室温震荡混匀，反应结束后，用滤膜进行过滤并对交联物进行纯化。
在本发明具体实施方式中，各组分交联量子点的方法为：
将1uM的羧基化量子点加入反应容器中，将0.5mg各组分分别加入反应容器中缓慢的震荡混匀30min；称取1mg EDC和1mg NHS加入反应容器中室温震荡混匀2h，反应结束后，用0.22um滤膜进行过滤；交联产物需通过超滤管或色谱柱进行进一步纯化。
作为优选，所述交联物还包括在获得促甲状腺激素抗体-量子点2交联物后用碱性磷酸酶进行标记，获得碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-量子点2交联物；其中，碱性磷酸酶标记在促甲状腺激素抗体上。
作为优选，标记碱性磷酸酶的操作如下：
称取碱性磷酸酶溶于戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后溶液经层析柱，洗脱，收集棕色流出液；将促甲状腺激素抗体-量子点2交联物用PBS稀释，在搅拌的条件下缓慢加入碱性磷酸酶溶液(收集的棕色流出液)中，加入碳酸缓冲液室温反应；然后加入NaBH4溶液，混匀，再置于低温下反应，反应后溶液透析过夜，使用滤膜进行过滤，滤出液为碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-量子点2交联物。
在本发明具体实施方式中，上述标记碱性磷酸酶的操作如下：
称取50mg碱性磷酸酶溶于1％的戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后溶液经Sephadex G-25层析柱，洗脱，收集棕色流出液；将促甲状腺激素抗体-量子点2交联物10ul用PBS稀释至3ml，在搅拌的条件下缓慢加入碱性磷酸酶溶液中，持续1小时；加入PH9.5碳酸缓冲液0.3ml，室温反应2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，再置于2-8℃反应2小时；将反应后溶液装入透析袋中，用PH＝7.4的PBS缓冲液透析过夜；使用0.22uM滤膜进行过滤，滤出液为碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-量子点2交联物。
作为优选，固相载体包被促甲状腺激素抗体-量子点1交联物的方法如下：
固相载体用EDC和NHS活化，再将促甲状腺激素抗体-量子点1交联物加入活化后的固相载体中震荡混匀，抽出上清液，加入含蛋白的保护液震荡混匀，最后用保护液定容。
在本发明具体实施方式中，上述固相载体包被促甲状腺激素抗体-量子点1交联物的方法如下：
抽取500uL羧基磁珠原液使用pH＝7.5的PBS缓冲液清洗5-10次，加入20mg/ml EDC和20mg/ml NHS活化1h，再使用pH＝7.5的PBS缓冲液清洗5-10次；将促甲状腺激素抗体-量子点1交联物加入活化后的磁珠中，震荡混匀2h；抽出上清液，加入含蛋白的保护液震荡混匀1h，重复4次，用保护液定容至30ml。
作为优选，碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体的方法如下：
称取碱性磷酸酶-量子点3交联物溶于戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后溶液经层析柱，洗脱，收集棕色流出液；将促甲状腺激素抗体用PBS稀释，在搅拌的条件下缓慢加入碱性磷酸酶-量子点3交联物溶液(收集的棕色流出液)中，加入碳酸缓冲液室温反应；然后加入NaBH4溶液，混匀，再置于低温下反应，反应后溶液透析过夜，使用滤膜进行过滤，滤出液为碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体。
在本发明具体实施方式中，上述碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体的方法如下：
称取50mg碱性磷酸酶-量子点3交联物溶于1％的戊二醛溶液中，于室温静置过夜；反应后溶液经Sephadex G-25层析柱，洗脱，收集棕色流出液；将促甲状腺激素抗体10ul用PBS稀释至3ml，在搅拌的条件下缓慢加入碱性磷酸酶-量子点3交联物溶液中，持续1小时；加入PH9.5碳酸缓冲液0.3ml，室温反应2小时；加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，再置于2-8℃反应2小时；将反应后溶液装入透析袋中，用PH＝7.4的PBS缓冲液透析过夜；使用0.22uM滤膜进行过滤，滤出液为碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体。
由以上技术方案可知，本发明选择量子点作为促甲状腺激素试剂盒主要组分的交联发光物质，所形成的交联物能够在不影响其检测准确性的前提下，方便、快捷和准确的通过施加激发光获得量子点荧光状态和强度，以此指示目标物在试剂中的分布状态和判断异常样本造成异常结果的原因，从而可以应用于促甲状腺素检测产品的制备中。
附图说明
图1所示为促甲状腺激素正常样本、抗碱性磷酸酶抗体异常样本和内源性抗体异常样本干扰原理示意图；其中A代表正常样本与试剂中固相载体包被促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体形成的双抗体夹心复合物；B代表异常标本中存在抗碱性磷酸酶抗体干扰示意图；C和D代表异常标本中存在内源性抗体干扰的两种情形；E代表固相载体，F代表固相载体包被促甲状腺激素抗体交联2.2nm CdSe，在400nm的紫外灯激发光下的发射光为蓝色荧光；G代表标本中的促甲状腺激素；H代表碱性磷酸酶标记促甲状腺激素抗体交联3.1nm CdSe，在400nm的紫外灯激发光下的发射光为绿色荧光；I代表促甲状腺激素抗体标记碱性磷酸酶交联4.5nm CdSe，在400nm的紫外灯激发光下的发射光为橙色荧光；J代表抗碱性磷酸酶抗体；K代表内源性抗体；
图2所示为碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物的浓度与荧光强度的标准曲线；其中，A表示碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物，B表示碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物，C表示碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体；
图3所示为通过量子点示踪促碱性磷酸酶标记的甲状腺素抗体检测仪器携带污染状况；其中，A表示碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物，B表示碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物，C表示碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体。
具体实施方式
本发明公开了一种检测促甲状腺激素抗的试剂盒及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述试剂盒及其制备方法和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述试剂盒及其制备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的一种检测促甲状腺激素抗的试剂盒及其制备方法和应用做进一步说明。
实施例1：促甲状腺激素抗体和CdSe量子点交联方法
利用EDC和NHS进行羧基端的活化和对氨基端的交联技术的一般程序是现有技术中熟知的，即
将10uM的羧基化量子点CdSe加入反应容器中；将5mg促甲状腺激素抗体蛋白加入反应容器中缓慢的震荡混匀30min；称取10mg/mlEDC和10mg/mlNHS加入反应容器中室温震荡混匀2h；反应结束后，用0.22um滤膜进行过滤；交联产物需通过超滤管或色谱柱进行进一步纯化。
其他试剂和组分与CdSe量子点的化学交联均参照上述方法。
实施例2：试剂盒各组分的制备
1、磁微粒包被促甲状腺激素抗体交联CdSe
选取2.2nm的CdSe量子点进行交联，方法同实施例1中促甲状腺激素抗体与量子点的化学交联方法。
抽取500uL羧基磁珠原液使用pH＝7.5的PBS缓冲液清洗5-10次，加入20mg/ml EDC和20mg/ml NHS活化1h，再使用pH＝7.5的PBS缓冲液清洗5-10次。
将标记有CdSe量子点的促甲状腺激素抗体加入活化后的磁珠中，震荡混匀2h。
抽出上清液，加入含蛋白的保护液震荡混匀1h，重复4次，用保护液定容至30ml。
2、碱性磷酸酶标记促甲状腺激素抗体交联CdSe
选取3.1nm的CdSe量子点进行交联，标记方法同实施例1中促甲状腺激素抗体与量子点的化学交联方法。
称取50mg碱性磷酸酶溶于1％的戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
反应后溶液经Sephadex G-25层析柱，洗脱，收集棕色流出液。
将量子点交联的抗体10ul用PBS稀释至3ml，在搅拌的条件下缓慢加入碱性磷酸酶酶溶液中，持续1小时。
加入PH9.5碳酸缓冲液0.3ml，室温反应2小时。
加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，再置于2-8℃反应2小时。
将上述溶液装入透析袋中，用PH＝7.4的PBS缓冲液透析过夜。
使用0.22uM滤膜进行过滤，滤出液为碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体交联CdSe 3.1um。
3、碱性磷酸酶交联CdSe标记促甲状腺激素抗体
选取4.5nm的CdSe量子点对碱性磷酸酶进行交联，得到碱性磷酸酶交联CdSe4.5um量子点复合物，交联方法同实施例1中促甲状腺激素抗体与量子点的化学交联方法。
称取碱性磷酸酶交联CdSe 4.5um量子点复合物50mg溶于1％的戊二醛溶液中，于室温静置过夜。
反应后溶液经Sephadex G-25层析柱，洗脱，收集棕色流出液。
加入10ul促甲状腺激素抗体用PBS稀释至3ml，在搅拌的条件下缓慢加入碱性磷酸酶酶溶液中，持续1小时。
加入PH9.5碳酸缓冲液0.3ml，室温反应2小时。
加入0.1ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，再置于2-8℃反应2小时。
将上述溶液装入透析袋中，用PH＝7.4的PBS缓冲液透析过夜。
使用0.22uM滤膜进行过滤，滤出液为碱性磷酸酶交联CdSe标记促甲状腺激素抗体。
4、牛血清白蛋白交联CdSe
将10uM的羧基化量子点CdSe 7.7nm加入反应容器中；
将5mg牛血清白蛋白加入反应容器中缓慢的震荡混匀30min；
称取10mg/ml EDC和10mg/ml NHS加入反应容器中室温震荡混匀2h；
反应结束后，用0.22um滤膜进行过滤；
交联产物需通过超滤管或色谱柱进行进一步纯化。
实施例3：碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物的浓度与荧光强度的标准曲线
配制0.05M PBS pH7.40缓冲液；
用上述缓冲液分别配制0.5、1、2、4、8、16mg/ml的碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体(用于阴性对照)、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-CdSe 3.1um交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物(交联方法参照实施例1量子点交联方法，同样采用EDC和NHS为交联剂)。
以360nm波长紫外激发各浓度溶液产生荧光，观察利用拍照和荧光检测装置并记录，数据见表1，对应的标准曲线见图2。
表1
Figure BDA0002307210260000121
结合表1和图2的结果可以看出，交联量子点和绿色荧光蛋白的交联物相对荧光强度均可以随浓度的变化而变化，即交联产物均可利用荧光强度指示浓度高低。
实施例3：碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物的检测准确性验证
配制含0.05M PBS pH7.40缓冲液、1％牛血清白蛋白、0.5％氯化钠和0.1％proclin-300的酶结合物稀释液；
用上述酶结合物稀释液分别配制1mg/ml的碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体(阴性对照)、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-CdSe 3.1um交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物作为酶结合物。
以含促甲状腺激素抗体的磁微粒混悬液作为固相组分，以上三种溶液作为酶结合物检测四十例临床样本，记录并分析信号值变化，数据见表2。
表2
Figure BDA0002307210260000131
Figure BDA0002307210260000141
由表2数据中的“碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-量子点交联物/阴性对照”一栏数据可以明显看出，用于检测的碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体在交联了量子点后对碱性磷酸酶发光值影响不大，而碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物中的碱性磷酸酶的发光值降低将近70％，这会明显影响实际检测的准确性；虽然根据实施例2结果可以得出荧光发光物质可以用来指示试剂盒组分的浓度大小，但是本实施例结果说明只有适宜的物质才能不影响碱性磷酸酶的发光值。
实施例4：检测全自动仪器加样针的携带污染状况
配制0.05M PBS pH7.40缓冲液；
用上述缓冲液分别配制0、5、10、50、100、200mg/ml的碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体(阴性对照)、碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-CdSe 3.1um交联物、碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物。
将以上试剂各浓度溶液以试剂组分在全自动仪器上进行上样，设定程序试剂针在上样后以纯化水冲洗两次。
冲洗后以360nm波长紫外照射试剂针，观察利用拍照和荧光检测装置并记录，数据见表3，对应附图见图3。
表3
Figure BDA0002307210260000151
由表3和图3结果可以看出，在试剂针中加入极端的高浓度的50mg/ml碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-CdSe 3.1um交联物、碱性磷酸酶-促甲状腺激素抗体-绿色荧光蛋白交联物时，试剂针出现携带污染，并且携带程度随试剂中交联物浓度的增加而增加。
实施例5：促甲状腺激素异常标本造成异常结果的分析方法
从检测标本中筛选出异常样本，将异常样本从采血管中取出，在14000rpm转速下离心10min，取上清备用。
从与异常标本中同批次的检测标本中筛选出分析物浓度一致的已知未受干扰的10份正常样本，从采血管中取出，在14000rpm转速下离心10min，取上清备用。
将本发明所述试剂盒中的磁微粒包被促甲状腺激素抗体交联CdSe交联物20ul，其余试剂各50ul与100ul上述正常和异常样本分别混匀并在37℃下孵育30min。
将上述孵育的混合物中液相部分和固相部分(磁微粒)利用磁力分离，分别取20ul置于载玻片上。
将荧光显微镜激发光波长调至400nm，四通道观察四种荧光，荧光位置和荧光量代表了与之结合的目标物的状态。以下列举了几种标本中存在异常因素导致的状态变化(图1)。
当出现抗碱性磷酸酶抗体干扰时，固相载体上存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物，相对于无此类干扰的样本，所述试剂盒中固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和牛血清白蛋白-量子点交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶-量子点交联物标记的促甲状腺激素抗体发出的荧光的位置、状态和荧光强度明显变化；
当出现内源性抗体干扰时，分为两种情形，情形一是内源性抗体与固相载体包被的促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体结合形成复合物，造成假阳性结果；该情形下，固相载体上同时存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物1和包被促甲状腺激素抗体-内源性抗体-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物2，相对于无此类干扰的样本，固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和牛血清白蛋白-量子点交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和碱性磷酸酶-量子点交联物标记的促甲状腺激素抗体所发出的荧光的位置、状态变化，荧光量明显增加，相对的，在液相中其荧光量减少；
情形二是内源性抗体与固相载体包被的促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体分别结合，造成假阴性结果；该情形下，固相载体上同时存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物1和促甲状腺激素抗体-内源性抗体复合物2，相对于无此类干扰的样本，固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和牛血清白蛋白-量子点交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和碱性磷酸酶-量子点交联物标记的促甲状腺激素抗体所发出的荧光的位置、状态变化，荧光量明显减少，相对的，在液相中其荧光量增加。
其中，所述异常标本造成的异常结果为检验结果与临床症状不符或模式不符，或检测结果与高级参考方法不一致。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测促甲状腺激素的试剂盒，其特征在于，包括如下组分：
固相载体包被促甲状腺激素抗体-量子点1交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物、碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体和牛血清白蛋白-量子点4交联物；
所述各组分中的量子点的粒径均不相同；
其制备方法为：
采用EDC和NHS作为交联剂，选择不同粒径的量子点分别对促甲状腺激素抗体、碱性磷酸酶和牛血清白蛋白进行化学交联，获得促甲状腺激素抗体-量子点1交联物、促甲状腺激素抗体-量子点2交联物、碱性磷酸酶-量子点3交联物以及牛血清白蛋白-量子点4交联物；
将固相载体用促甲状腺激素抗体-量子点1交联物包被，获得包被有促甲状腺激素抗体-量子点1交联物的固相载体，将碱性磷酸酶标记促甲状腺激素抗体-量子点2交联物获得性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物，将碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体获得碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述量子点为羧基化量子点。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述羧基化量子点为CdSe。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁微粒。
5.权利要求1-4任意一项所述试剂盒在如下任意一个或多个方面的应用：
制备检测促甲状腺激素的产品中的应用；
检测仪器加样针污染物状况中的应用，所述污染物为试剂盒各组分；
检测试剂盒各组分在试剂中分布状态的应用；
分析促甲状腺激素异常标本造成的异常结果原因的应用。
6.权利要求1所述试剂盒的制备方法，其特征在于，采用EDC和NHS作为交联剂，选择不同粒径的量子点分别对促甲状腺激素抗体、碱性磷酸酶和牛血清白蛋白进行化学交联，获得促甲状腺激素抗体-量子点1交联物、促甲状腺激素抗体-量子点2交联物、碱性磷酸酶-量子点3交联物以及牛血清白蛋白-量子点4交联物；
将固相载体用促甲状腺激素抗体-量子点1交联物包被，获得包被有促甲状腺激素抗体-量子点1交联物的固相载体，将碱性磷酸酶标记促甲状腺激素抗体-量子点2交联物获得性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点2交联物，将碱性磷酸酶-量子点3交联物标记促甲状腺激素抗体获得碱性磷酸酶-量子点3交联物标记的促甲状腺激素抗体。
7.一种检测权利要求1-4任意一项所述试剂盒的组分在试剂中分布状态的方法，其特征在于，对含有权利要求1-4任意一项所述试剂盒的组分的试剂施加激发光，于不同时间点统计试剂的相对荧光强度结果，通过相对荧光强度的改变判断试剂盒各组分在试剂中分布状态。
8.一种检测仪器加样针污染物状况的方法，其特征在于，建立权利要求1-4任意一项所述试剂盒中的组分的浓度与相对荧光强度的标准曲线；
在使用权利要求1-4任意一项所述试剂盒检测促甲状腺激素后，对加样针水清洗，然后施加激发光统计加样针的相对荧光强度和荧光颜色，和阴性对照的加样针相比较，判断污染物的类型和污染量。
9.一种分析促甲状腺激素异常标本造成的异常结果原因的方法，其特征在于，包括：
步骤1、从检测标本中筛选出异常标本，将异常样本离心取上清备用；
步骤2、从与步骤1中同批次的检测标本中筛选出促甲状腺激素浓度一致的多份正常样本，离心取上清备用；
步骤3、将权利要求1-4任意一项所述试剂盒中的组分与上述异常样本和正常样本分别混匀并孵育反应；
步骤4、分离步骤3反应液中的固相载体部分与液相部分，并置于荧光显微镜下观察，通过荧光位置和荧光量直观分析出造成的异常结果原因；
其中，当出现抗碱性磷酸酶抗体干扰时，固相载体上存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物，相对于无此类干扰的样本，所述试剂盒中固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点交联物、碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和牛血清白蛋白-量子点交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶-量子点交联物标记的促甲状腺激素抗体发出的荧光的位置、状态和荧光强度明显变化；
当出现内源性抗体干扰时，分为两种情形，情形一是内源性抗体与固相载体包被的促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体结合形成复合物，造成假阳性结果；该情形下，固相载体上同时存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物1和包被促甲状腺激素抗体-内源性抗体-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物2，相对于无此类干扰的样本，固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和牛血清白蛋白-量子点交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和碱性磷酸酶-量子点交联物标记的促甲状腺激素抗体所发出的荧光的位置、状态变化，荧光量明显增加，相对的，在液相中其荧光量减少；
情形二是内源性抗体与固相载体包被的促甲状腺激素抗体和碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体分别结合，造成假阴性结果；该情形下，固相载体上同时存在包被促甲状腺激素抗体-促甲状腺激素-碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体复合物1和促甲状腺激素抗体-内源性抗体复合物2，相对于无此类干扰的样本，固相载体包被的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和牛血清白蛋白-量子点交联物所发出的荧光的位置、状态和荧光强度不受影响，而碱性磷酸酶标记的促甲状腺激素抗体-量子点交联物和碱性磷酸酶-量子点交联物标记的促甲状腺激素抗体所发出的荧光的位置、状态变化，荧光量明显减少，相对的，在液相中其荧光量增加。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述异常标本造成的异常结果为检验结果与临床症状不符或模式不符，或检测结果与高级参考方法不一致。
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