CN116106559A - 一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒及其应用，包括抗体捕捉载体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H和化学发光标记的链霉亲和素,抗体捕捉载体为Protein A/G磁珠或Protein A与Protein G混合物磁珠，生物素化抗体质控品L和H的生物素和抗体偶联摩尔比分别为1:1‑5:1和15:1‑30:1。该检测试剂盒检测生物素与抗体偶联比例范围宽，可检测出生物素与抗体偶联比为1—40，灵敏度高，样本用量小于5μL，可用于控制每一批工艺中生物素与抗体的偶联比例。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒及其应用。
背景技术
生物素又称为维生素H，分子量244.31，分子中有2个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与链霉亲和素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧链，其末端羧基经常被化学修饰或改性，增加生物素的亲水性，或减少位阻效应，变为长链酰肼生物素或N—羟基琥珀酰亚胺酯生物素，用于标记抗体的巯基和氨基，以增加生物素-链霉素亲和系统的灵敏度和特异性。
一般情况，1个抗体分子可以偶联1-20个生物素，其反应步骤简单、但反应过程不易控制。在直接化学发光体系中，生物素与抗体偶联比太小，会直接影响生物素化抗体与SA微粒子的结合效率(1个SA可以和4个生物素结合)，多余的抗体会导致整个反应体系的信号值偏低；生物素与抗体偶联比太高，游离生物素不易处理不干净，而且还会影响抗体的稳定性。因此，选择合适的偶联比对于生物素-链霉亲和素体系尤为重要。为了控制每一批工艺中生物素与抗体的偶联比例以及研发化学发光试剂盒参数的确认，需要有专门的技术准确定量生物素与抗体的偶联比例。
市面上，测定生物素与抗体偶联比的厂家主要是Thermo Scientific公司。其生物素与抗体偶联比检测试剂盒原理是：将4′-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)和生物素化抗体溶液混合，由于生物素对亲和素的亲和力更高，生物素会取代4′- 羟基偶氮苯-2-羧酸，并且500nm处的吸光度会成比例地降低。通过这种方法，对单个比色皿或96孔板中存在的未知量的生物素化抗体的比例进行定量。优点是使用方便，设备简单(比色法)，可以测定任何蛋白与生物素的偶联比例；缺点是偶联比例测定不准确，范围窄；此外，由于一些蛋白或抗体成本较高，标记后的体积较少(尤其是100μL左右偶联物)，使用该方法测定，需要20-100μL样本，会导致不必要的成本损失。本发明基于以上分析，开发一种抗体偶联比例检测范围宽，灵敏度高，样本用量小于5μL的生物素与抗体偶联比检测试剂盒，用于控制每一批工艺中生物素与抗体的偶联比例。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物素与抗体偶联比例检测范围宽，灵敏度高，样本用量小于5μL的生物素与抗体偶联比检测试剂盒，用于控制每一批工艺中生物素与抗体的偶联比例。
本发明采用的技术方案如下：一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，包括抗体捕捉载体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H和化学发光标记的链霉亲和素，抗体捕捉载体为Protein A/G磁珠或Protein A与Protein G混合物磁珠，生物素化抗体质控品L和H的生物素和抗体偶联摩尔比分别为1:1-5:1 和15:1-30:1。
Protein A含有5个可与鼠抗体IgG Fc端特异性结合，可以与兔、鼠、马、人等种属抗体的Fc端结合，但不同种属来源的抗体与Protein A亲和力差异较大；Protein G为三型Fc受体，不仅能与兔、鼠、羊、人等种属抗体来源的单克隆或多克隆抗体Fc端结合，而且还能够与抗体的F(ab)端结合。因此，为提高抗体对不同种属不同抗体表位的捕捉能力，能够与不同种属抗体的Fc端和F(ab)端结合。本发明的抗体捕捉物为两种，一种为Protein A/G 磁珠，另一种为Protein A与Protein G混合物磁珠，这两种抗体捕捉物采用2种方法制备而成：一种是采用人工表达的Protein A/G复合物作为抗体捕捉物；另一种是人工表达的Protein A和Protein G按照一定比例混合制成抗体捕捉物，然后，以磁性微球为载体，将抗体捕捉物偶联到磁珠上制备成抗体捕捉载体。
优选地，所述Protein A/G磁珠制备中，磁性微球与Protein A/G复合物质量比为1:0.05-0.1，优选1:0.1。
优选地，所述Protein A与Protein G混合物磁珠制备中，磁性微球与 Protein A和Protein G混合物的质量比为1:0.05-0.1，优选1:0.1，其中，Protein A和Protein G混合物中Protein A和Protein G质量比为1:2-2:1，优选1：1。
优选地，所述磁性微球为羧基磁性微球或甲苯黄酰基磁性微球。
优选地，所述抗体捕捉载体的浓度为0.5-2.5mg/mL。
优选地，发光物质选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶中的一种或其他任一种可以和化学发光激发液作用产生化学发光的物质。进一步优选地，所述化学发光标记的链霉亲和素制备中，发光物质选自吖啶酯，链霉亲和素与吖啶酯的摩尔比为1:1- 1:20，优选为1:10。
优选地，所述化学发光标记的链霉亲和素浓度为0.1～1μg/mL。
优选地，生物素化抗体质控品L和生物素化抗体质控品H的浓度的浓度范围为0.05-0.5μg/mL，优选0.1μg/mL，使用时，生物素化抗体质控品L和生物素化抗体质控品H浓度相同，待测生物素抗体需与生物素化抗体质控品L和生物素化抗体质控品H的浓度相等。
本发明还提供了上述生物素与抗体偶联比检测试剂盒的应用，按照以下步骤使用：
1)将待检生物素化抗体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H 分别与抗体捕捉载体、化学发光标记的链霉亲和素在温浴条件反应，清洗后，加入化学发光激发液，经检测得出待检生物素化抗体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H的发光值，分别为RLUD、RLUL和RLUH；
2)计算待检生物素化抗体生物素与抗体偶联摩尔比：按公式(1)计算得出：
式(1)中，NL为生物素化抗体质控品L，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUL为生物素化抗体质控品L的发光值；
NH为生物素化抗体质控品H，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUH为生物素化抗体质控品H的发光值；
ND为待检生物素化抗体，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUD为待检生物素化抗体的发光值。
本发明检测试剂盒与某市售的试剂盒相比，有以下优点：
(1)本发明所需样本量较少，样本浓度为0.05-0.5μg/mL，不会导致贵重抗体的浪费。以cTnI试剂举例，待测生物素抗体一般需要稀释300-1000 倍使用，100μL生物素化抗体大约可配制备600-2000份试剂。
(2)本发明试剂盒采用梯度是某市售试剂盒梯度的3-4倍，灵敏度高，定量更准确，可检测出生物素与抗体偶联比为1—40，最低可检测生物素与抗体偶联比为1。
(3)标记用生物素为疏水物质，一般采用DMF或DMSO稀释，本发明与市售试剂盒相比，由于样本稀释后测试，因此，本试剂盒测不受DMF或 DMSO的影响。
表1 本发明试剂盒与Pierce Biotin Quantitation Kit(Thermo Scientific)性能比较
注：梯度是偶联比为40生物素抗体与偶联比为1生物素化抗体发光值的比值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为物素与抗体偶联比检测试剂盒检测示意图；
图2为不同生物素化抗体偶联比与发光信号值的关系。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下结合附图，详细说明本发明各实施例提供的技术方案。
实施例1 一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，包括抗体捕捉载体、生物素和抗体偶联摩尔比为2:1的生物素化抗体质控品L，生物素和抗体偶联摩尔比为20:1的生物素化抗体质控品H和化学发光标记的链霉亲和素，抗体捕捉载体为Protein A/G磁珠或ProteinA磁珠与Protein G磁珠的混合物。
可选地，所述的生物素与抗体偶联比检测试剂盒还包括样本稀释液，所述的样本稀释液配方为：0.1mol/L PBS(pH7.2)+0.05％(质量分数)双咪唑烷基脲。
优选地，所述的化学发光标记的链霉亲和素为吖啶酯标记的链霉亲和素。
所述的生物素与抗体偶联比检测试剂盒，各组分的浓度为：
1)抗体捕捉载体：终浓度为1mg/mL；
2)链霉亲和素信号标记物：采用稀释液(0.05mol/L MES(pH6.0)+1.5％(质量分数)BSA+0.05％(质量分数)双咪唑烷基脲)稀释到1μg/mL；
3)生物素化抗体质控品L(生物素和抗体的摩尔偶联比为2:1)，终浓度为 0.1μg/mL；
4)生物素化抗体质控品H(生物素和抗体的摩尔偶联比为20:1)，终浓度为 0.1μg/mL。
上述检测试剂盒各组分的制备方法为：
1、抗体捕捉载体的制备：
(1)Protein A/G磁珠的制备：
a)先将整瓶磁珠超声1min，使磁珠分散均匀，取5mL羧基磁性微球 (10mg/mL)于10mL离心管中，5000r/min离心5min，移液枪缓慢吸取，去除羧基磁性微球中的缓冲液，加入5mL 100mM MES(pH 6.0)重新分散，超声1min，5000r/min离心5min，移液枪缓慢吸取，去除缓冲液，再加入5mL 10-100mM MES(pH 6.0)缓冲液；
b)称取25-100mg EDC迅速加入到磁珠悬液中，并置于25-37℃， 250r/min反应30min。
c)将活化后的磁珠，加入5mL 10-100mM MES(pH 6.0)进行清洗；然后加入5mgProtein A/G复合物(来源于上海普欣),220转/分钟反应 3h；
d)加入20mL清洗液进行清洗，共计清洗3遍，离心弃缓冲液，加入 50mL磁珠储存液(0.1mol/L PBS(pH 7.5)+0.5％(质量分数)BSA+0.05％(质量分数)叠氮钠)，制备出抗体捕捉载体，终浓度为1mg/mL。
(2)Protein A与Protein G混合物磁珠的制备：
a)取Protein A(来源于上海普欣)和Protein G(来源于上海普欣)各2.5mg，按照1:1比例(质量比)混合，制备成Protein A和Protein G混合物。
b)将Tosyl磁性微球(甲苯黄酰基磁性微球)超声1min，使磁珠分散均匀，取5mLTosyl磁性微球(10mg/mL)于10mL离心管中，5000r/min离心 5min，移液枪缓慢吸取，去除Tosyl磁性微球中的缓冲液，加入5mL 0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.5)重新分散，超声1min，5000r/min离心5min，移液枪缓慢吸取，去除缓冲液，再加入5mL 0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.5)缓冲液；
c)取a)步骤的Protein A和Protein G的混合物5mg迅速加入到磁珠悬液中，并置于37℃，100-250r/min反应12h。
d)加入20mL清洗液进行清洗，共计清洗3遍，离心弃缓冲液，加入 50mL磁珠储存液，制备出抗体捕捉载体，终浓度为1mg/mL。
2、吖啶酯标记的链霉亲和素的制备：
a)打开恒温振荡器，温度设置为25.0℃；
b)取1mg链霉亲和素(鼠原，单克隆抗体)，加入4.5μL吖啶酯(1mg/mL)，然后加入50mM PB(pH 8.0)，终体积为1mL；震荡混匀，25℃摇床反应60min；
c)在上述反应管中加入封闭液乙醇胺10μL混合，终止多余的吖啶酯，置于25℃反应30min。
d)上述反应物加入透析袋中，然后置于2L烧杯中，加入1.5L 0.1mol/L PBS进行透析，每1h换液1次，共换液10次，制得的SA-AE(吖啶酯标记的链霉亲和素)。
3、抗体偶联比质控品制备：
在体外诊断领域，单克隆抗体或多克隆抗体的种属来源的主要是鼠、兔、羊和人源重组，标记抗体常用的生物素为生物素N—羟基琥珀酰亚胺酯生物素，具体实施步骤如下：
(1)生物素化抗体质控品L(2:1)制备：
a)打开恒温振荡器，温度设置为25.0℃；
b)取2mg肌红蛋白抗体(鼠源，单克隆抗体)，加入15μL生物素 (1mg/mL)，然后加入50mM CB(pH 9.5)，终体积为5mL；震荡混匀，25℃摇床反应30min；
c)然后在上述反应管中加入封闭液乙醇胺10μL混合，终止多余的生物素，置于25℃反应30min。
d)上述反应物加入透析袋中，然后置于2L烧杯中，加入1.5L 0.1mol/L PBS进行透析，每1h换液1次，共换液10次，制得的生物素化抗体，使用样本稀释液进行稀释，终浓度为0.1μg/mL，即为生物素化抗体质控品L(2:1)。
(2)生物素化抗体质控品H(20:1)制备：
取2mg肌红蛋白抗体(鼠源，单克隆抗体)，加入150μL生物素(1mg/mL)，然后加入50mM CB(pH 9.5)，终体积为5mL；震荡混匀，25℃摇床反应30min；其他步骤同生物素化抗体质控品L(2:1)制备。
实施例2
应用上述生物素与抗体偶联比检测试剂盒检测步骤如下：
1)将待检生物素化抗体，采用样本稀释液稀释到0.1μg/mL；
2)分别向80μL 0.1μg/mL样本(待检生物素化抗体)、0.1μg/mL生物素化抗体质控品L和0.1μg/mL生物素化抗体质控品H中，加10μL 1mg/mL抗体捕捉载体，温浴10min，清洗3遍，得待检生物素化抗体-载体复合物，生物素化抗体质控品L-载体复合物和生物素化抗体质控品H-载体复合物；
3)分别向待检生物素化抗体-载体复合物，生物素化抗体质控品L-载体复合物和生物素化抗体质控品H-载体复合物中加100μL 1μg/mL吖啶酯标记的链霉亲和素，温浴10min，清洗3遍，泵入激发液1(0.05mol/L HNO3+0.5％(质量分数)H2O2)和激发液2(0.2mol/L NaOH)，使复合物产生化学发光信号，通过光电倍增器PMT测量发光强度，得出待检生物素化抗体、抗体偶联比质控品L和抗体偶联比质控品H的发光值，分别为RLUD、RLUL和RLUH；
4)计算待检生物素化抗体生物素与抗体偶联摩尔比：按公式(1)计算得出：
式(1)中，NL为生物素化抗体质控品L，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUL为生物素化抗体质控品L的发光值；
NH为生物素化抗体质控品H，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUH为生物素化抗体质控品H的发光值；
ND为待检生物素化抗体，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUD为待检生物素化抗体的发光值。
本发明所述生物素与抗体偶联比检测试剂盒检测原理如图1所示：待测生物素化抗体、抗体捕捉载体、链霉亲和素信号标记物在温育条件下反应，抗体捕捉载体结合待检生物素抗体的Fc端或F(ab)端，然后与链霉亲和素信号标记物结合，形成反应复合物，温育结束后，用清洗液清洗沉淀复合物，并吸干废液，除去未反应的物质，再将反应杯送入测量室中，仪器分别泵入激发液1和激发液2，使复合物产生化学发光信号，通过光电倍增器PMT测量发光强度，如图2所示，生物素化抗体偶联比与发光值信号成正相关，由此，根据斜率推导出公式(1)，根据2个生物素化抗体质控品(生物素化抗体质控品L和H)的信号值算出抗体分子与生物素的偶联比。
按照实施例2的步骤，采用不同肌红蛋白抗体与生物素投料比制备以下6个样本进行测试，其中，肌红蛋白抗体与生物素投料比分别为1、3、5、10、20、 40，制得的6个样本分别为样本1、样本2、样本3、样本4、样本5和样本6，结果见表2：
表2 本发明试剂盒与Pierce Biotin Quantitation Kit(Thermo Scientific)试剂盒比对
表2结果表明，本发明试剂盒测值与实际值基本一致。
表3 本发明试剂盒与Pierce Biotin Quantitation Kit(Thermo Scientific)干扰比对
一般来说，用于标记的生物素需要使用DMF或DMSO进行溶解，配制成1-10mg/mL生物素溶液使用。生物素标记抗体时，需要加入生物素溶液(含有DMF或DMSO)；而标记后的抗体需要透析或离心过柱纯化，除去游离未反应的生物素。采用离心过柱纯化，一般难以除去DMF或DMSO，或造成在待检的生物素化抗体中DMF或DMSO的残留。表3通过在在待检生物素化抗体(无DMF或DMSO)中添加不同浓度的DMF或DMSO(体积百分比)，进行对比本发明试剂盒和Pierce试剂盒的干扰测试，表3结果表明：本发明试剂盒信号值不受DMF和DMSO干扰的影响；Pierce试剂盒DMF或 DMSO浓度小于5％，不受影响，浓度大于10％，干扰较强，造成测值不准。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，包括抗体捕捉载体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H和化学发光标记的链霉亲和素,抗体捕捉载体为ProteinA/G磁珠或Protein A与Protein G混合物磁珠，生物素化抗体质控品L和H的生物素和抗体偶联摩尔比分别为1:1-5:1和15:1-30:1。
2.根据权利要求1所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述Protein A/G磁珠制备中，磁性微球与Protein A/G复合物质量比为1:0.05-0.1。
3.根据权利要求1所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述Protein A与Protein G混合物磁珠制备中，磁性微球与Protein A和Protein G混合物的质量比为1:0.05-0.1，其中，Protein A和Protein G混合物中Protein A和Protein G质量比为1:2-2:1。
4.根据权利要求2或3所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为羧基磁性微球或甲苯磺酰基磁性微球。
5.根据权利要求1所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述抗体捕捉载体的浓度为0.5-2.5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记的链霉亲和素中，发光物质选自N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶中的一种或其他任一种可以和化学发光激发液作用产生化学发光的物质。
7.根据权利要求6所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记的链霉亲和素制备中，发光物质选自吖啶酯，链霉亲和素与吖啶酯的摩尔比为1:1-1:20。
8.根据权利要求1所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记的链霉亲和素浓度为0.1～1μg/mL。
9.根据权利要求1所述的一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒，其特征在于，生物素化抗体质控品L的浓度为0.05-0.5μg/mL，生物素化抗体质控品H的浓度为0.05-0.5μg/mL。
10.权利要求1所述的生物素与抗体偶联比检测试剂盒的应用，其特征在于，按照以下步骤使用：
1)将待检生物素化抗体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H分别与抗体捕捉载体、化学发光标记的链霉亲和素在温浴条件反应，清洗后，加入化学发光激发液，经检测得出待检生物素化抗体、生物素化抗体质控品L，生物素化抗体质控品H的发光值，分别为RLUD、RLUL和RLUH；
2)计算待检生物素化抗体生物素与抗体偶联摩尔比：按公式(1)计算得出：
式(1)中，NL为生物素化抗体质控品L，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUL为生物素化抗体质控品L的发光值；
NH为生物素化抗体质控品H，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUH为生物素化抗体质控品H的发光值；
ND为待检生物素化抗体，生物素与抗体偶联摩尔比；RLUD为待检生物素化抗体的发光值。
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|---|---|---|---|---|
| CN117491650A (zh) * | 2023-11-01 | 2024-02-02 | 首都医科大学宣武医院 | 一种外周血Hb-Aβ复合物定量检测试剂盒、检测方法及应用 |
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