CN110891573A - Ret抑制剂和mtorc1抑制剂的组合及其用于治疗由异常ret活性介导的癌症的用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及RET抑制剂和mTORC1抑制剂的组合及其在治疗由异常RET活性介导的各种癌症中的用途。优选地，所述癌症选自甲状腺癌、非小细胞肺癌、副神经节瘤或肝内胆管癌。所述RET抑制剂优选BLU‑667，并且所述mTORC1抑制剂优选依维莫司或AZD8055。

Description

RET抑制剂和MTORC1抑制剂的组合及其用于治疗由异常RET活 性介导的癌症的用途

本申请要求2017年5月15日提交的美国临时申请号62/506,334、2018年4月3日提交的美国临时申请号62/652,284、2018年4月11日提交的美国临时申请号62/656,297以及2018年4月13日提交的美国临时申请号62/657,605的优先权，所述临时申请的内容通过引用以其全文并入本文。

本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。所述ASCII副本创建于2018年5月11日，名称为14320_0033-00304_SL.txt并且大小为32,144字节。

本公开涉及RET抑制剂和mTORC1抑制剂的组合及其在治疗各种癌症中的用途。

RET是一种受体酪氨酸激酶，其激活参与细胞增殖和存活的多个下游途径。越来越多的证据暗示，RET的异常激活是大量实体瘤中肿瘤生长和增殖的关键驱动因素(MulliganLM.,Nat.Rev.Cancer.14:173–186(2014))。致癌性RET激活经由以下方式发生：获得功能突变或RET基因重排，使得产生具有组成型活性RET信号传导的RET融合蛋白，从而促进非配体依赖性肿瘤生长。最初在遗传性和散发性甲状腺癌中并且随后在非小细胞肺癌(NSCLC)中描述了致癌性RET激活。迄今为止，RET融合物已参与若干种癌症，包括甲状腺乳头状癌和非小细胞肺癌。例如，对激酶融合物状况进行的基因组分析鉴定出乳腺癌和结肠癌患者样品中的RET融合物，这为在多个患者亚群中使用RET抑制剂提供了治疗依据。

另外，在1-2％的NSCLC中鉴定出致癌性RET重排(Lipson,D.等人,Nat.Med.18:382–384(2012)；Takeuchi,K.等人,Nat.Med.18:378–381(2012)；Stransky,N.等人,Nat.Commun.5:4846(2014))。此举产生促进肿瘤发生的组成型活性激酶。至于间变性淋巴瘤激酶(ALK)和c-ros致癌基因(ROS)1重排的NSCLC，RET重排的NSCLC通常具有腺癌组织学(但偶尔鳞状的)并且发生在年轻不吸烟患者中。由于针对RET的诊断测试不是标准护理，因此根据NCCN关于表皮生长因子受体(EGFR-)和ALK阴性腺癌的指南对RET重排的晚期NSCLC患者进行治疗。这通常包括使用铂类双联药物或更近期使用检查点抑制剂进行的化学疗法，但是，尤其是在RET重排的NSCLC中使用这些药剂的临床应答和总体存活率尚未充分了解。根据NCCN指南，对于难治性患者，除了化学疗法和检查点抑制剂以外的后续疗法最好是支持性护理或临床试验。

致癌性RET激活也与甲状腺癌相关。甲状腺癌主要由分化型甲状腺癌(DTC；约90％的病例)、甲状腺髓样癌(MTC，约5％的病例)和未分化型甲状腺癌(<5％的病例)组成。DTC散发于甲状腺滤泡细胞，并且由乳头状甲状腺癌(PTC)(占所有甲状腺癌病例的约80％)和滤泡状甲状腺癌组成。相比之下，MTC产生自滤泡旁C细胞，并且以遗传性和散发性形式出现。致癌性RET激活在MTC和PTC中均被暗示为驱动因素。

在一些癌症中鉴定出RET融合物为驱动因素推动了使用具有RET抑制活性的已批准的多激酶抑制剂(MKI)来治疗其肿瘤表达RET融合蛋白的患者。尽管在这些早期研究中观察到令人鼓舞的应答率(约12％-60％)(Horiike A等人,Lung Cancer 93:43-6(2016年3月)；Lin JJ等人,J Thorac Oncol.11(11):2027-32(2016年11月)；Gautshi O等人,J ClinOncol.34(增刊；文摘9014)(2016))，但应答的持续时间通常少于一年。由于因抑制RET以外的靶标导致的毒性，因此不能始终以足以抑制RET所需的水平给予MKI药物。此外，治疗癌症的最大挑战之一是肿瘤细胞对疗法产生抗性的能力。经由突变进行的激酶重新激活是常见的抗性机制。当抗性发生时，患者的治疗选择通常非常有限，并且在大多数情况下，癌症的进展未受抑制。

在成年人中大约有5％-20％的散发性乳头状肿瘤中已鉴定出涉及RET和二聚化结构域编码基因的复发性基因重排。激酶激活的RET突变在几乎所有遗传性MTC病例(87％-97％)(Machens A等人,N Engl J Med 349:1517-25(2003)；Mulligan LM等人,Nature 363(6428):458-60(1993年6月3日)；Mulligan LM等人,J Int Med.238(4):343–346(1995))和大约43％-65％的散发性MTC(Elisei R.等人,J Clin Endocrinol Metab.93:682–687(2008)；Moura MM等人,British Journal of Cancer 100:1777–1783(2009))中发生。这些RET突变发生在胞外结构域中(主要在C634位置处)，所述突变促进RET的非配体依赖性二聚化和激活，而激酶结构域突变(主要是M918T、A883F或V804L/M)促进RET自激活和随后的致癌信号传导(Romei C等人,Nat Rev Endocrinol.12(4):192–202(2016年4月))。

本文描述的(1S,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酰胺(化合物A)是转染期间重排(RET)激酶和致癌性RET突变体的强有力且选择性抑制剂。在细胞系统中，化合物A以低纳摩尔效价抑制RET致癌突变体的激酶活性。在若干种RET驱动的模型中证明了化合物A的体内剂量依赖性抗肿瘤功效。目前正在研究化合物A在治疗患有RET驱动的恶性肿瘤，诸如甲状腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和其他晚期实体瘤的患者中的用途。

某些mTORC1抑制剂已被批准用于治疗癌症，例如肾细胞癌(依维莫司(everlolimus))和套细胞淋巴瘤(替西罗莫司(temsirolimus))。这些抑制剂导致参与蛋白质合成的mTOR下游效应物S6核糖体蛋白激酶(S6K1)和真核起始因子4E结合蛋白(4E-BP1)的活性降低。对mTORC1的抑制已应用于雌激素依赖性和HER2+乳腺癌中。尽管作为单一疗法的mTORC1抑制剂在某些癌症中具有功效并且RET抑制剂在某些癌症中具有潜力，但仍然需要在癌症中甚至更有效的治疗方案。RET和mTOR是已知调控各种癌症相关过程(包括细胞生长、增殖、代谢和血管生成)的相同信号传导途径中的两个组分。

附图说明

图1，图片A-C绘示了化合物A和mTORC1抑制剂AZD8055的组合对FTC-133细胞系的影响。图片A绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的组合的细胞增殖抑制百分比，如通过CTG测定测量的。图片B绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的协同作用评分。图片C是绘示与加性结果(直线)相比，组合(·线)中化合物A和AZD8055的各种量的效应的等效线图。

图2，图片A-C绘示了化合物A和AZD8055的组合对LC2/ad(CCDC6-RET)细胞系的影响。图片A绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的组合的细胞增殖抑制百分比，如通过CTG测定测量的。图片B绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的协同作用评分。图片C是绘示与加性结果(直线)相比，组合(·线)中化合物A和AZD8055的各种量的效应的等效线图。

图3，图片A-C绘示了化合物A和AZD8055的组合对RET(C634W)细胞系的影响。图片A绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的组合的细胞增殖抑制百分比，如通过CTG测定测量的。图片B绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的协同作用评分。图片C是绘示与加性结果(直线)相比，组合(·线)中化合物A和AZD8055的各种量的效应的等效线图。

图4，图片A-C绘示了化合物A和AZD8055的组合对MZ-CRC-1(RET M918T)细胞系的影响。图片A绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的组合的细胞增殖抑制百分比，如通过CTG测定测量的。图片B绘示了组合中化合物A和AZD8055的各种量的协同作用评分。图片C是绘示与加性结果(直线)相比，组合(·线)中化合物A和AZD8055的各种量的效应的等效线图。

图5A、5B和5C是显示出化合物A对LC2/ad(图5A)、MZ-CRC-1(图5B)、和TT(图5C)细胞中的DUSP6和SPRY4表达的影响的一系列条形图。

图6是显示KIF5B-RET NSCLC PDX模型中MAPK靶基因DUSP6和SPRY4的表达持续降低的条形图。

图7是示出化合物A在由工程化KIF5B-RET V804L细胞系产生的卡博替尼(cabozantinib)抗性肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性的图。

图8A是示出在用化合物A治疗过程中肿瘤尺寸和降钙素和CEA(癌胚抗原)水平降低的图。将患者用60mg每日一次治疗并且然后每日一次接受最多达300mg的连续剂量递增。图8B是基线处(顶部)和化合物A治疗8周后(底部)的CT扫描，其证明了肿瘤生长的快速减少。图8C是示出在用化合物A以300mg每日一次治疗过程中肿瘤尺寸和降钙素和CEA水平降低的图。图8D是在基线处(顶部)和在化合物A治疗24周之后(底部)患者肿瘤的CT扫描。图8E是示出来自治疗期间的MTC患者的血浆中RET M918T水平的ctDNA分析的图。治疗前和治疗后肿瘤活检揭示，在用化合物A治疗28天之后DUSP6降低93％并且SPRY4 mRNA表达降低86％。

图9A是示出在用200mg每日一次化合物A治疗过程中肿瘤以及KIF5B-RET和TP53ctDNA减少的图；图9B是展示在基线处(顶部)和在化合物A治疗32周之后(底部)的肿瘤的CT扫描。

图10A是示出相对于时间(h)的平均血浆浓度(ng/mL)的图；图10B是示出DUSP6和SPRY4的平均基因表达水平相对于基线的变化百分比的条形图。

图11A是示出在第2周期第1天测量的患者中CEA的剂量依赖性减少的条形图。图11B是示出在第2周期第1天测量的患者中降钙素的剂量依赖性减少的条形图。

图12是示出最大肿瘤减少–相对于基线的直径变化总和百分比–来自化合物A的I期临床研究中的患者。

图13是在基线处(顶部)和在化合物A治疗8周之后(底部)的CT扫描。

图14是示出RET改变的NSCLC中的患者应答率的图表。

图15是在基线处(A-B)和化合物A治疗8周之后(底部)的CT扫描。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“患者”、“受试者”、“个体”和“宿主”是指罹患或疑似罹患与异常RET活性(即，与健康患者相比增加或下调的RET活性、与野生型RET相比改变或另外的底物特异性、或与野生型RET表达相比RET的表达增加)相关的疾病或病症，例如癌症的人或非人动物。

如本文所用，“治疗(treat/treating)”这种疾病或病症是指改善疾病或病症的至少一个症状。这些术语当与疾病诸如癌症结合使用时是指以下中的一者或多者：阻碍癌症的生长；按重量或体积计使癌症缩小；延长患者的预期生存时间；抑制肿瘤生长；减少肿瘤块；减少转移性病灶的尺寸或数量；抑制新的转移性病灶的发展；延长生存期；延长无进展生存期；延长进展时间；和/或提高生活质量。

如本文所用，术语“预防”当关于疾病或病症诸如癌症使用时是指疾病或病症的症状的频率减少、或发作延迟。例如，预防癌症包括例如相对于未治疗对照群体使接受预防性治疗的患者群体中的可检测癌生长物的数目减少，和/或相对于未治疗对照群体使治疗群体中可检测癌生长物的出现延迟例如统计学和/或临床上显著的量。

如本文所用，术语“治疗效果”是指动物、特别是哺乳动物并且更特别是人类中由施用本公开的化合物或组合而引起的有益局部或全身性效应。短语“治疗有效量”意指本公开的化合物或组合的以合理的益处/风险比有效治疗由RET的过表达或异常RET生物活性引起的疾病或病症的量。这种化合物或组合的治疗有效量根据所治疗的受试者和疾病或病症、受试者的体重和年龄、疾病或病症的严重程度、施用方式等而变化，其可容易地由本领域的普通技术人员来确定。

如本文所用，“效应标记物”意指DUSP6 mRNA表达、SPRY4 mRNA表达、CEA、降钙素、KIF5B ctDNA或TP53 ctDNA。

如本文所用，“发展抗性”意指当首次向患者施用药物时，无论是通过肿瘤体积的减少、新病灶的数量减少还是医生用于判断疾病进展的一些其他手段所测量，患者的症状改善；但是，这些症状在某一时刻停止改善甚至恶化。此时，认为患者对药物发展了抗性。

如本文所用，术语“共同施用”意指使受试者暴露于两种或更多种治疗性方案(例如，两种或更多种化合物)。在一些实施方案中，两种或更多种化合物可以同时施用；在一些实施方案中，此类化合物可以顺序施用；在一些实施方案中，此类化合物以重叠给药方案施用。在一些实施方案中，组合疗法的“施用”可以涉及向接受其他化合物的受试者施用一种或多种化合物。为了清楚起见，尽管在一些实施方案中，可以将两种或更多种化合物以单一组合形式一起施用，但是组合疗法不要求将单独化合物以单一组合物形式一起(或甚至必须同时)施用。在一些实施方案中，待共同施用的化合物处于单独的剂型中，但是包装在一起(例如，在泡罩包装或其他药物药盒中)以有利于它们的共同施用。

如本文所用，术语“化合物A”意指(1S,4R)-N-((S)-1-(6-(4-氟-1H-吡唑-1-基)吡啶-3-基)乙基)-1-甲氧基-4-(4-甲基-6-((5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基)嘧啶-2-基)环己烷甲酰胺，即具有以下化学式的化合物：

在2017年3月，化合物A(也称为BLU-667)在美国进入I期临床试验中用于治疗患有甲状腺癌、非小细胞肺癌、和其他完全实体瘤的患者(NCT03037385)。通过引用并入本文的WO 2017/079140描述了化合物A(实例化合物130)的合成并且还公开了此分子抑制、调控和/或调节RET激酶的治疗活性(测定，在72-74页上的实施例10)。

在生物化学测定中，化合物A以亚纳摩尔效价(IC₅₀ 0.4nM(表1))抑制野生型(WT)RET的激酶活性。与多激酶抑制剂(MKI)卡博替尼、凡德他尼(vandetanib)和RXDX-105(分别地，IC₅₀ 11、4、3nM)相比，化合物A的效力相对于WT RET强8-至28-倍(表1)。此外，化合物A对常见的致癌性RET改变展示出强有力的活性(IC₅₀ 0.4nM)，所述RET改变包括RET M918T，一种见于甲状腺髓样癌中的激活突变以及乳头状癌和非小细胞肺癌中观察到的CCDC6-RET融合物(Romei C等人,Nat Rev Endocrinol 2016；12(4):192-202.；Wang R,Hu H,Pan Y,LiY,Ye T,Li C等人RET fusions define a unique molecular and clinicopathologicsubtype of non-small-cell lung cancer.J Clin Oncol 2012；30(35):4352-9)。

表1.化合物A和MKI针对激活RET突变体和融合变体的生物化学效价

缩写：IC₅₀，50％抑制浓度；MKI，多激酶抑制剂；RET，转染期间重排；VEGFR-2，血管内皮生长因子受体2；WT，野生型

如本文所用，术语“AZD8055”意指具有以下化学结构的化合物：

AZD8055是mTOR抑制剂。

如本文所用，术语“依维莫司(everolimus)”意指具有以下化学结构的化合物：

依维莫司是mTOR抑制剂。

如本文所用，“DOR”意指应答的持续时间。

如本文所用，“PD”意指进行性疾病。

如本文所用，“SD”意指稳定疾病。

如本文所用，“CR”意指完全应答。

如本文所用，“ORR”意指总体完全应答率。

如本文所用，“CBR”意指临床益处率。

如本文所用，“PFS”意指无进展存活期。

如本文所用，“融合物”是由其中两个基因与框内编码序列连接并产生嵌合蛋白染色体易位产生的蛋白质。在一些实施方案中，融合是其中一种蛋白质的激酶结构域融合至另一种基因的二聚化结构域的染色体易位。

如本文所用，“RET改变癌症”是具有驱动肿瘤发生的激活转染期间重排(RET)改变的癌症。激活RET改变的非限制性实例包括突变、融合和拷贝数变异。

如本文所用，“RET融合”是基因重排。RET重排产生融合蛋白，其将RET激酶结构域和另一种蛋白的二聚化结构域并置，从而形成驱动肿瘤发生的组成型激活二聚体。

如本文所用，“RET融合蛋白”是基因重排的结果。RET重排产生融合蛋白，其将RET激酶结构域和另一种蛋白的二聚化结构域并置，从而形成驱动肿瘤发生的组成型激活二聚体。

如本文所用，“RET激活突变”意指RET激酶中的突变，其促进驱动肿瘤发生的非配体依赖性组成型RET激酶激活。例如，RET突变可以在细胞外半胱氨酸残基(例如，C620R或C634R/W)中发生，其触发异常的受体二聚化，或者RET突变可以在细胞内激酶结构域中发生。

如本文所用，“RET抑制剂”是抑制RET激酶活性的化合物。RET激酶是野生型RET激酶和/或一种或多种RET改变的激酶(例如RET融合、RET突变或RET拷贝数变异)。

RET抑制剂的实例包括但不限于化合物A、LOXO-292、卡博替尼、凡德他尼、艾乐替尼(alectinib)、索拉非尼、乐伐替尼、帕纳替尼、多韦替尼(dovitinib)、舒尼替尼、氟瑞替尼(foretinib)、西屈替尼(sitravatinib)、DS-5010、TAS0286和RXDX-105。RET抑制剂的另外实例包括但不限于阿帕替尼、莫特塞尼、nintendanib、瑞格拉非尼(regorafenib)、瓦他拉尼(vatalanib)、AUY-922、DCC-2157、NVP-AST487、PZ-1、RPI-1、TG101209和SPP86。

在一些实施方案中，本公开提供了治疗由异常RET活性介导的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者共同施用RET抑制剂和mTORC1抑制剂，从而治疗癌症。

在一些实施方案中，异常RET活性由RET基因中导致癌症的突变引起。这些突变中的一些使表达的RET蛋白对用仅可抑制野生型RET的化合物的治疗有抗性。在一些实施方案中，受试者具有描述于表2中的RET中位置处的突变。

表2.RET突变

表2中的一些RET突变讨论于以下文献中：美国专利申请公布号2014/0272951；Krampitz等人,Cancer 120:1920-31(2014)；Latteyer等人,JClin.Endocrinol.Metab.101(3):1016-22(2016)；Silva等人Endocrine 49.2:366-72(2015)；Jovanovic等人,Prilozi 36(1):93-107(2015)；Qi等人,Oncotarget 6(32):33993-4003(2015)；Kim等人ACTA ENDOCRINOLOGICA-BUCHAREST 11.2,189-194,(2015)；Cecchirini等人Oncogene,14:2609-12(1997)；Karrasch等人,Eur.Thyroid J 5(1):73-77(2016)；Scollo等人,Endocr.J 63:87-91(2016)；和Wells等人,Thyroid 25:567-610(2015)。

R525W和A513D可以与S891A组合用于增强致癌活性。

在一些实施方案中，RET突变在RET蛋白的804门卫(gatekeeper)残基和/或门卫残基处或附近的残基处具有点突变。例如，在一些实施方案中，这些编码异常RET的抗性突变可以在804、806、810、865、870、891和918氨基酸残基中的一个或多个处。在一些实施方案中，此类抗性突变可以包括以下氨基酸突变中的一个或多个：V804L、V804M、V804E、Y806C、Y806S、Y806H、Y806N、G810R、G810S、L865V、L870F、S891A和M918T。例如，在一些实施方案中，异常RET活性由M918T突变引起。

另外，RET的半胱氨酸氨基酸609、611、618、620、630和/或634处的突变已在罹患甲状腺髓样癌的患者中鉴定到并且据信是致癌性的。在一些实施方案中，RET半胱氨酸变体(影响C609、C611、C618和C620)被称为“Janus突变”例如，在一些实施方案中，具有以下另外突变中的一个或多个的RET与异常RET活性相关：C618R、C618S、C634Y、C634W和C634R。在一些实施方案中，异常RET活性由C634W突变引起。

在一些实施方案中，异常RET活性由野生型RET蛋白的过表达引起。这可能是由于增加的RET基因拷贝数、控制RET mRNA或RET蛋白水平的调控细胞机制中的缺陷或导致RET表达增加的RET基因启动子区域中的突变。

在一些实施方案中，异常RET活性由致癌性RET融合物引起。此类融合物可以是具有野生型RET或上文讨论的任一种RET突变形式。在一些实施方案中，受试者具有RET与表3中列出的RET融合配偶体之间的融合物，例如包括包含RET或其片段与表3的蛋白质或其片段的融合蛋白。在一些实施方案中，融合配偶体是RET的N末端或C末端。在一些实施方案中，受试者细胞的亚组，例如受试者肿瘤细胞的亚组包含RET改变。在一些实施方案中，受试者细胞的亚组，例如受试者肿瘤细胞的亚组是RET改变的。在一些实施方案中，受试者具有表3中列出的癌症，例如，受试者具有RET突变和表3中列出的癌症两者。

表3.RET融合物

表3中的一些RET融合物讨论于以下文献中：Grubbs等人,J Clin EndocrinolMetab.,100:788-93(2015)；Halkova等人,Human Pathology 46:1962-69(2015)；美国专利号9,297,011；美国专利号9,216,172；Le Rolle等人,Oncotarget 6(30):28929-37(2015)；Antonescu等人,Am J Surg Pathol 39(7):957-67(2015)；美国专利申请公布号2015/0177246；美国专利申请公布号2015/0057335；日本专利申请公布号2015/109806A；中国专利申请公布号105255927A；Fang,等人,Journal of Thoracic Oncology 11.2(2016):S21-S22；欧洲专利申请公布号EP3037547A1；Lee等人,Oncotarget DOI:10.18632/oncotarget.9137,e-published ahead of printing,2016；Saito等人,Cancer Science107:713-20(2016)；Pirker等人,Transl Lung Cancer Res,4(6):797-800(2015)；以及Joung等人,Histopathology 69(1):45-53(2016)。

本领域普通技术人员可以确定受试者是否具有例如具有突变，例如融合、缺失、插入、易位、移码、重复、点突变和/或重排的RET改变的细胞、癌症、基因、或基因产物，例如使用选自以下的方法：基于杂交的方法、基于扩增的方法、微阵列分析、流式细胞术分析、DNA测序、下一代测序(NGS)、引物延伸、PCR、原位杂交、荧光原位杂交、斑点印迹和DNA印迹。

为了检测融合物，可以从受试者收集原发性肿瘤样品。处理样品，使用本领域已知的技术分离核酸，然后使用本领域已知的方法对核酸进行测序。然后将序列映射到单个外显子，并且定量转录表达的量度(诸如RPKM或每百万映射读取的每千碱基读取)。原始序列和外显子阵列数据可从诸如TCGA、ICGC和NCBI基因表达综合(GEO)的来源获得。对于给定的样品，单个外显子坐标注释有基因标识符信息，并且标记属于激酶结构域的外显子。然后将外显子水平在所有肿瘤样品中进行z评分归一化。

接下来，鉴定出其中5’外显子以与3’外显子显著不同的水平表达的基因。使用滑动框架鉴定单独样品内的断点。具体地，在每次迭代，增量断点将基因分成5’和3’区域，并且使用t统计量测量两个区域之间的表达(如果有的话)差异。选择具有最大t统计量的断点作为可能的融合断点。如本文所用，“断点”是两个不同基因融合所处的边界。有时将它称为“融合点”。外显子表达差异在5’与3’之间最大的位置是推测的融合断点。可以以这种方式快速分析成千上万个肿瘤样品，生成融合候选物列表(按t统计量排序)。然后可以验证高级候选物并且通过检查原始RNA测序数据集，和鉴定支持融合物的嵌合对和/或拆分读取来鉴定融合配偶体。然后可以通过实验如下所述地确认候选融合物。

另选地，还可以使用描述于以下中的方法：Wang L等人,Genes ChromosomesCancer 51(2):127-39(2012).doi:10.1002/gcc.20937,2011年10月27日电子出版；和Suehara Y等人,Clin Cancer Res.18(24):6599-608(2012).doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-0838,2012年10月10日电子出版。

已提出在临床试验中包括对分子靶向疗法的药效动力学评估可以简单化药物开发过程(Tan DS等人,Cancer J 15(5):406-20(2009)；Sarker D和Workman P.Adv CancerRes 96:213-68(2007))。药效动力学生物标记物已成功用于激酶抑制剂，包括伊马替尼和吉非替尼的临床开发(Sarker D和Workman P.Adv Cancer Res 96:213-68(2007)；BaselgaJ等人,J Clin Oncol 23(23):5323-33(2005)；Druker BJ等人,N Engl J Med 344(14):1031-7(2001))。如本文所述，化合物A剂量依赖性地抑制RET和SHC激活，这反映了在RET驱动的临床前模型中对DUSP6和SPRY4转录的抑制，表明这些转录物可以充当RET抑制活性的生物标记物。在这项研究中确立了这些标记物的翻译能力，其中化合物A治疗诱导的MTC肿瘤缩小与对肿瘤组织内DUSP6和SPRY4表达的有效抑制相关。

RET具有两种主要蛋白和mRNA同种型，命名为RET51和RET9。在一些实施方案中，RET具有同种型RET51(SEQ ID NO:1)的序列。激酶结构域对应于SEQ ID NO:1的氨基酸724-1016。除非另外指明，否则本文所述的氨基酸位置是指SEQ ID NO:1中的RET51的编号。

在一些实施方案中，RET具有同种型RET9的序列(SEQ ID NO:2)，其中激酶结构域是724-1016。

在一些实施方案中，RET51由具有SEQ ID NO:3的序列的核酸编码。

在一些实施方案中，RET9由具有SEQ ID NO:4的序列的核酸编码。

在一些实施方案中利用的RET抑制剂可以是仅抑制野生型RET的RET选择性抑制剂、仅抑制RET的一种或多种突变形式的抑制剂、或仅抑制野生型RET和RET的一种或多种突变形式并且对其他激酶具有很小抑制活性的抑制剂。在一些实施方案中利用的RET抑制剂还可以是抑制野生型RET和其他激酶的抑制剂或抑制RET的野生型和一种或多种突变形式并且对其他激酶具有抑制活性的抑制剂。

可在一些实施方案中利用的RET抑制剂包括本领域中熟知的那些，例如凡德他尼、卡博替尼、舒尼替尼、索拉非尼、帕纳替尼、RXDX-105、阿帕替尼、乐伐替尼、化合物A和US2017/0121312或US 2013/0096136中公开的化合物、艾乐替尼、多韦替尼、瑞格拉非尼和nintedanib，以及PCT公布WO2017/079140、WO 2017/011776、WO 2016/127074、WO 2016/075224、WO 2016/038552、WO 2016/037578、WO 2015/079251、WO 2015/006875、2015/006875、WO 2014/141187、WO 2014/050781、WO 2009/100536中公开的化合物，和WO 20176/161269、WO 2018/017983和WO 2018/022761中任一者公开的化合物。

在一些实施方案中，RET选择性抑制剂为化合物A。化合物A是仅抑制野生型RET和RET的一种或多种突变形式并且对其他激酶具有很小抑制活性的RET选择性抑制剂

如本文所用，“mTORC1抑制剂”是抑制哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶蛋白复合物1(mTORC1)活性的化合物。

在一些实施方案中利用的mTORC1抑制剂可以选自任何已知的mTORC1抑制剂。此类抑制剂可以对mTORC2具有活性或不具有活性。可以在本公开的一些实施方案中利用的经批准的mTORC1抑制剂包括西罗莫司(sirolimus)(实体瘤)、替西罗莫司/CC1-779(晚期肾细胞癌)和依维莫司(晚期肾细胞癌)。可以在一些实施方案中利用的其他抑制剂包括达托利司(dactolisib)/BEZ235(乳腺癌，实体瘤)、奥帕利司(omipalisib)/GSK2126458(实体瘤)、XL765/SAR245409(胶质瘤)、AZD8055(胶质瘤)、INK128/MLN0128(子宫内膜瘤)、OSI027(实体瘤或淋巴瘤)和各种RapaLink(Rodrik-Outmezguine VS,Okaniwa M,Yao Z等人,Nature.2016；534(7606):272–6)(胶质母细胞瘤(gliomoblastoma))。在一些实施方案中，mTORC1抑制剂是雷帕霉素(rabamycin)或雷帕霉素的制剂诸如nab^TM-雷帕霉素或类似物，例如地磷莫司(ridaforolimus)。

在一些实施方案中，mTORC1抑制剂是变构抑制剂。

在一些实施方案中，mTORC1抑制剂是依维莫司或AZD8055。在一些实施方案中，mTORC1抑制剂是依维莫司。在一些实施方案中，mTORC1抑制剂是AZD8055。

在一些实施方案中，RET抑制剂是化合物A并且mTORC1抑制剂是依维莫司或AZD8055。在一些实施方案中，RET抑制剂是化合物A并且mTORC1抑制剂是依维莫司。在一些实施方案中，RET抑制剂是化合物A并且mTORC1抑制剂是AZD8055。

在一些实施方案中，mTORC1和RET抑制剂中的每一者每天施用一次。

在一些实施方案中，mTORC1抑制剂每天施用两次并且RET抑制剂每天施用一次。

在一些实施方案中，mTORC1抑制剂每天施用一次并且RET抑制剂每天施用两次。

在一些实施方案中，mTORC1和RET抑制剂中的每一者每天施用两次。

在一些实施方案中，待治疗的癌症是特征在于异常RET活性的任何癌症。已经许多癌症与异常RET表达有关联(Kato等人,Clin.Cancer Res.23(8):1988-97(2017))。如本文所用，“癌症”的非限制性实例包括肺癌、头颈癌、胃肠道癌、乳腺癌、皮肤癌、泌尿生殖道癌、妇科癌、血液学癌症、中枢神经系统(CNS)癌、周围神经系统癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、骨癌、肉瘤、斯皮茨瘤、腺鳞癌、嗜铬细胞瘤(PCC)、肝细胞癌、多发性内分泌瘤(MEN2A和MEN2B)和炎性肌成纤维细胞肿瘤。关于与异常RET表达有关联的癌症的其他实例，参见NatureReviews Cancer 14:173-86(2014)。

癌症的另外的非限制性实例包括血管外皮细胞瘤、分化型甲状腺癌、未分化型甲状腺癌、肺癌肉瘤、输尿管尿路上皮癌、子宫癌肉瘤、基底细胞癌、默克尔(Merkel)细胞癌、非典型肺癌、输卵管腺癌、卵巢上皮癌、唾液腺腺癌、脑膜瘤、十二指肠腺癌、子宫颈腺癌、肾上腺癌、胃食管连接癌、皮肤鳞状细胞癌、胰腺导管腺癌、前列腺腺癌、食管腺癌、子宫内膜腺癌、卵巢浆液性癌、原发灶不明癌、膀胱尿路上皮癌(移行细胞)癌、肺鳞状细胞癌、结肠直肠腺癌、头颈部鳞状细胞癌和胃腺癌。

在一些实施方案中，待治疗的癌症是表3中所述的癌症。

在一些实施方案中，与异常RET活性相关的病状是甲状腺癌(例如，乳头状甲状腺癌、甲状腺癌或MTC，例如家族性MTC)、肺癌(例如，肺腺癌，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、乳腺癌(例如，雌激素受体阳性肿瘤和内分泌抗性肿瘤，例如对诸如他莫昔芬的雌激素调节剂、诸如芳香酶抑制剂的阻断雌激素生物合成的药剂，以及诸如氟维司群(fulvestrant)的雌激素受体拮抗剂有抗性)、胰腺癌(例如，胰腺癌或胰腺导管癌)、造血系统癌症，例如白血病(例如，慢性骨髓单核细胞性白血病或急性髓性白血病)、结肠癌(colon cancer)(例如，结肠癌(colon carcinoma))、黑素瘤(例如，皮肤或增生性恶性黑素瘤)、前列腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)和头颈部肿瘤、神经母细胞瘤、神经节瘤(例如，口腔或肠的神经节瘤)、结肠癌(例如散发性结肠癌)、MEN2A(2A型多发性内分泌瘤)、或MEN2B(2B型多发性内分泌瘤)。

在一些实施方案中，待治疗的癌症选自乳头状甲状腺癌(PTC)、甲状腺髓样癌(MTC)、和非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，MEN2A与嗜铬细胞瘤和甲状旁腺增生相关。在患有MEN2A的受试者中发现了RET中的半胱氨酸取代并且其也经常发现于FMTC中。RET细胞外结构域外显子8突变(诸如G533C)或RET细胞内结构域(残基E768、L790、Y791、V804和S891)与FMTC或MEN2A相关。在患有MEN2B的受试者中发现了RET激酶结构域中的取代，Met918至Thr(M918T)或A883F。在散发性MTC中也发现了RET M918T和RET A883F。

在一些实施方案中，MEN2A的特征在于MTC，并且包括肾上腺肿瘤嗜铬细胞瘤。

在一些实施方案中，MEN2B与粘膜神经瘤、嗜铬细胞瘤、肠神经节瘤和马凡体征(marfanoid habitus)相关。

在一些实施方案中，肺癌选自小细胞肺癌(SCLC)、肺腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、细支气管肺癌和间皮瘤。

在一些实施方案中，头颈癌选自甲状腺癌和唾液腺癌。在一些实施方案中，甲状腺癌选自乳头状甲状腺癌(PTC)、转移性乳头状甲状腺癌、甲状腺髓样癌(MTC)、乳头状甲状腺癌的弥漫性硬化变异和甲状腺癌。在一些实施方案中，癌症为家族性甲状腺髓样癌。

在一些实施方案中，胃肠道癌选自食管癌、食管胃癌、胃肠道间质瘤(例如，伊马替尼抗性胃肠道间质瘤)、小肠癌、弥漫性胃癌和壶腹癌。

在一些实施方案中，乳腺癌为转移性乳腺癌。在一些实施方案中，皮肤癌为黑素瘤或非黑素瘤。

在一些实施方案中泌尿生殖道癌选自结肠癌、转移性结肠癌、膀胱癌、肾细胞癌(RCC)、前列腺癌、肝胆管癌、肝内胆管癌、肾上腺皮质癌、胰腺癌和胰腺导管腺癌。

在一些实施方案中，妇科癌症选自子宫肉瘤、生殖细胞肿瘤、宫颈癌、直肠癌、睾丸癌和卵巢癌。

在一些实施方案中，血液学癌症选自白血病、原发性骨髓纤维化伴继发性急性髓性白血病、骨髓增生异常(MDS)、非霍奇金淋巴瘤、慢性髓样白血病、费城染色体阳性的急性成淋巴细胞白血病和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。

在一些实施方案中，外周神经系统癌是副神经节瘤。在一些实施方案中，子宫内膜癌为子宫内膜腺癌。在一些实施方案中，肉瘤为软组织肉瘤。在一些实施方案中，中枢神经系统(CNS)癌选自与肺癌和胶质瘤相关的脑癌。在一些实施方案中，癌症为胶质瘤。在一些实施方案中，癌症选自多形性胶质母细胞瘤、间变性星形细胞瘤、间变性少突胶质瘤、恶性胶质瘤和脑干胶质瘤。在一些实施方案中，癌症选自混合胶质瘤、恶性胶质瘤和多形性胶质母细胞瘤。

在一些实施方案中，癌症选自乳腺癌、晚期实体瘤和Cowden综合征。

在一些实施方案中，癌症为子宫内膜瘤。

在一些实施方案中，癌症为实体瘤或淋巴瘤

在一些实施方案中，癌症为实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤选自肉瘤、胰腺(腺癌)、结肠直肠癌、肝细胞癌、神经内分泌癌和非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、胃癌、非小细胞肺癌和肝细胞癌。

在一些实施方案中，癌症为套细胞淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症为软组织或骨肉瘤。

已知在发生转移的病例的约40％中，肺癌扩散到脑中。对于肺癌，这被认为是疾病的第4阶段，并且脑转移情况下的平均生存时间通常少于一年。具有脑转移的肺癌具有相对较差的预后，例如化学疗法药物。由于许多原因，脑转移难以治疗。通常，当患者首次表现出症状时，他们已经具有多个病灶。脑转移往往具有很强的侵袭性。大脑有许多防御措施来减少外部物质的渗透。具体地，血脑屏障可防止许多药物进入大脑。脑转移的治疗选择可能会损害周围的正常组织，并对生活质量产生重大影响。

在一些实施方案中，癌症为与肺癌相关的脑转移。

在一些实施方案中，癌症为“RET改变癌症”，如本文所用，其意指具有激活RET改变的癌症。在一些实施方案中，RET改变癌症具有RET突变或RET基因重排。在一些实施方案中，RET改变癌症是RET改变的实体瘤。

用于确定患者中异常RET活性的方法是本领域中已知的并且可以利用任何此类方法来进行这种确定，所述方法包括：检测RET基因融合物、从这种基因融合物转录的mRNA或由这种mRNA编码的融合蛋白；检测突变的RET基因、从这种基因转录的mRNA或由这种mRNA编码的蛋白质；与正常对照相比，体外测量与癌症相关的RET激酶活性；检测野生型RET mRNA或蛋白质水平等。

本公开的一些示例实施方案包括以下：

1.一种在有需要的受试者中治疗由异常RET活性介导的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者共同施用RET抑制剂和mTORC1抑制剂。

2.如实施方案1所述的方法，其中所述异常RET活性归因于RET的致癌突变体或致癌性RET融合物。

3.如实施方案1或2所述的方法，其中所述异常RET活性归因于：

选自C634W、V804L、V804M、V804E、Y806C、Y806S、Y806H、Y806N、G810R、G810S、L865V、L870F、S891A和M918T的RET突变；或

选自KIF5B-RET和CCDC6-RET的RET融合物。

4.如实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述异常RET活性归因于：

选自C634W和M918T的RET突变；或

CCDC6-RET融合物。

5.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自甲状腺癌、非小细胞肺癌和其他实体瘤癌症。

6.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自甲状腺髓样癌和肺腺癌。

7.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳头状甲状腺癌(PTC)、甲状腺髓样癌(MTC)、嗜铬细胞瘤(PCC)、胰腺导管腺癌、多发性内分泌瘤(MEN2A和MEN2B)、转移性乳腺癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、结肠直肠癌、卵巢癌、炎性肌成纤维细胞肿瘤和唾液腺的癌症。

8.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自食管癌、皮肤癌(非黑素瘤)、子宫内膜癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、血液学癌症、白血病、软组织肉瘤、肾细胞癌(RCC)、非霍奇金淋巴瘤、肝胆管癌、肾上腺皮质癌、骨髓增生异常(MDS)、子宫肉瘤、生殖细胞肿瘤、宫颈癌、中枢神经系统癌、骨癌、壶腹癌、胃肠道间质瘤、小肠癌、间皮瘤、直肠癌、副神经节瘤和肝内胆管癌。

9.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自腺癌、斯皮茨瘤、肺腺癌、腺鳞癌、结肠癌、转移性结肠癌、转移性乳头状甲状腺癌、弥漫性硬化变异型乳头状甲状腺癌、原发性骨髓纤维化伴继发性急性髓性白血病、弥漫性胃癌、甲状腺癌和细支气管肺细胞癌。

10.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肝胆管癌、壶腹癌、小肠癌、肝内胆管癌、转移性结肠癌、与肺癌相关的脑癌、与肺癌相关的脑转移和腹膜后(retropentoneal)副神经节瘤。

11.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自甲状腺髓样癌(MTC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。

12.如实施方案11所述的方法，其中所述癌症选自散发性MTC、转移性RET改变的NSCLC、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)难治性KIF5B-RET NSCLC和KIF5B-RET NSCLC。

13.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自与肺癌相关的脑癌。

14.如实施方案13所述的方法，其中所述脑癌为脑转移。

15.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为RET改变的甲状腺髓样癌(MTC)。

16.如实施方案15所述的方法，其中所述癌症为家族性MTC。

17.如实施方案15所述的方法，其中所述癌症为散发性MTC。

18.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为具有M918T突变的MTC。

19.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为具有C634R突变的MTC。

20.如实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症为具有V804M突变的MTC。

21.如实施方案1或2所述的方法，其中所述癌症为副神经节瘤。

22.如实施方案21所述的方法，其中所述癌症为腹膜后副神经节瘤。

23.如实施方案21或22所述的方法，其中所述副神经节瘤具有R77H突变。

24.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为RET改变的NSCLC。

25.如实施方案24所述的方法，其中所述癌症为具有KIF5B-RET融合物的NSCLC。

26.如实施方案24所述的方法，其中所述癌症为具有CCDC6-RET融合物的NSCLC。

27.如实施方案24所述的方法，其中所述癌症为具有KIAA1468-RET融合物的NSCLC。

28.如实施方案24所述的方法，其中所述癌症为具有鉴定为FISH阳性的RET融合物的NSCLC。

29.如实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为RET改变的PTC。

30.如实施方案29所述的方法，其中所述癌症为具有CCDC6-RET融合物的PTC。

31.如实施方案29所述的方法，其中所述癌症为具有NCOA4-RET融合物的PTC。

32.如实施方案1或2所述的方法，其中所述癌症为RET改变的肝内胆管癌。

33.如实施方案32所述的方法，其中所述癌症为具有NCOA4-RET融合物的肝内胆管癌。

34.如实施方案1至33中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过用多激酶RET抑制剂的先前治疗。

35.如实施方案1至33中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过用多激酶RET抑制剂的一种或多种先前治疗。

36.如实施方案35所述的方法，其中所述多激酶RET抑制剂选自乐伐替尼、凡德他尼、卡博替尼和RXDX-105。

37.如实施方案1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前化学疗法。

38.如实施方案1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过先前化学疗法。

39.如实施方案38所述的方法，其中所述先前化学疗法选自卡铂、培美曲塞、亚柏杉、顺铂、贝伐单抗及其组合。

40.如实施方案1至39中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前免疫疗法。

41.如实施方案1至39中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过先前免疫疗法。

42.如实施方案41所述的方法，其中所述先前免疫疗法选自伊匹单抗、派姆单抗、尼沃鲁单抗、MPDL3280A、MEDI4736及其组合。

43.如实施方案1至42中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

44.如实施方案1至43中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

45.如实施方案1至43中任一项所述的方法，其中mTORC1抑制剂为AZD8055。

46.如实施方案1至45中任一项所述的方法，其中所述RET抑制剂具有结构：

(化合物A)。

47.如实施方案1至46中任一项所述的方法，其中：

所述受试者为人；

所述RET抑制剂为化合物A并且施用量在约5mg/天与约1000mg/天之间；并且

mTORC1抑制剂的施用量在约1mg/天至约1000mg/天之间。

48.如实施方案47所述的方法，其中化合物A的施用量为60mg至400mg，每日一次。

49.如实施方案47或48所述的方法，其中化合物A的施用量为100mg至400mg，每日一次。

50.如实施方案47至49中任一项所述的方法，其中化合物A的施用量为300mg至400mg，每日一次。

51.如实施方案47至50中任一项所述的方法，其中化合物A的施用量为300mg，每日一次。

52.如实施方案47至50中任一项所述的方法，其中化合物A的施用量为400mg，每日一次。

53.如实施方案47至52中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

54.如实施方案47至53中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

55.如实施方案47至53中任一项所述的方法，其中mTORC1抑制剂为AZD8055。

56.一种组合，所述组合包含：

RET抑制剂；以及

mTORC1抑制剂，

其中所述RET抑制剂和所述mTORC1抑制剂被配制为：

单一剂型；或

组合在药盒中的单独的剂型。

57.如实施方案56所述的组合，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

58.如实施方案56或57所述的组合，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

59.如实施方案56或57所述的组合，其中所述mTORC1抑制剂为AZD8055。

60.如实施方案56至59中任一项所述的组合，其中所述RET抑制剂具有结构：

61.如实施方案56至60中任一项所述的组合，其中：

所述RET抑制剂和所述mTORC1抑制剂被配制为组合在药盒中的单独的剂型中；并且

所述药盒进一步包括用于共同施用所述RET抑制剂和所述mTORC1抑制剂来治疗由异常RET活性介导的癌症的说明书。

62.一种在有需要的受试者中治疗由异常RET活性介导的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者共同施用RET抑制剂和mTORC1抑制剂，其中所述RET抑制剂的施用与所述受试者中的至少一个效应标记物的持续下调相关。

63.如实施方案62所述的方法，其中所述RET抑制剂为化合物A。

64.如实施方案62或63所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

65.如实施方案62至64中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

66.如实施方案62至64中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为AZD8055。

67.如实施方案62至66中任一项所述的方法，其中所述效应标记物选自DUSP6mRNA表达、SPRY4 mRNA表达、癌胚抗原水平和降钙素水平。

68.如实施方案62至66中任一项所述的方法，其中所述效应标记物为KIF5B ctDNA水平或TP53 ctDNA水平。

69.如实施方案62至68中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的量产生至少一种效应标记物的大于95％下调。

70.如实施方案62至68中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的量产生至少一种效应标记物的大于94％、大于93％、大于92％、大于91％、大于90％、大于89％、大于88％、大于87％、大于86％大于85％、大于80％、大于75％、大于70％、大于65％、大于60％、大于55％或大于50％下调。

71.如实施方案62至68中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的量产生至少一种效应标记物的大于89％、大于88％、大于87％、大于86％、大于85％、大于80％、大于75％或大于70％下调。

72.如实施方案62至71中任一项所述的方法，其中至少两种效应标记物下调。

在一些实施方案中，将RET抑制剂和mTORC1抑制剂中的每一者配制为药物组合物。可以将两种抑制剂配制为单独的组合物或组合成单一组合物。如果配制为单独的组合物，则可以将那些组合物配制用于相同的递送途径或用于不同的递送途径。在一些实施方案中，将RET抑制剂和mTORC1抑制剂中的每一者配制用于相同的递送途径，其中该抑制剂将用于单一疗法。在一些实施方案中，将RET抑制剂配制用于口服递送。在一些实施方案中，将mTORC1抑制剂配制用于口服递送。在一些实施方案中，将RET抑制剂和mTORC1抑制剂两者配制用于口服递送。

本公开的药物组合物包含本公开的一种或多种化合物和一种或多种生理上或药学上可接受的载体。本文采用短语“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内、适用于与人类和动物组织接触而没有过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指涉及携带或运输任何主题组合物或其组分量药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊化材料。各载体在可与主题组合物及其成分相容并且不损伤患者的意义上必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；(9)油，诸如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药物制剂中采用的其他无毒相容性物质。

本公开的组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻、颊、阴道或经由植入型贮库的方式施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射、或输注技术。在一些实施方案中，本公开的组合物以口服、腹膜内或静脉内方式施用。本公开的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域中已知的技术利用合适的分散或湿润剂以及悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在非毒性的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌的非挥发性油作为溶剂或悬浮介质。

为此目的，可采用任何温和的非挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。脂肪酸诸如油酸及其甘油酯衍生物同天然的药学上可接受的油诸如橄榄油或蓖麻油(尤其是它们的聚氧乙烯化形式)一样适用于制备可注射剂。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳液和悬浮液)的类似分散剂。其他常用的表面活性剂诸如吐温类、司盘类以及通常用于制造药学上可接受的固体、液体、或其他剂型的其他乳化剂或生物利用率增强剂也可以用于配制目的。

本公开的药学上可接受的组合物可以按任何口服可接受的剂型来口服施用，所述剂型包括但不局限于，胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在供口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当要求口服使用水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。

另选地，本公开的药学上可接受的组合物可以以用于直肠施用的栓剂形式施用。可以通过将药剂与适合的非刺激性赋形剂混合来制备这些栓剂，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中融化以释放药物。此类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。

本公开的药学上可接受的组合物还可以局部施用，尤其是当治疗靶标包括通过局部用药可以容易地到达的区域或器官，包括眼、耳、皮肤、或下肠道的疾病。可以容易地制备对于这些区域或器官中的每一个合适的局部制剂。用于下肠道的局部用药可以在直肠栓剂制剂(见上)或在合适的灌肠剂制剂中实现。也可使用表面经皮贴片。

对于局部用药，药学上可接受的组合物可以于含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏中来配制。用于本公开的化合物的局部施用的载体包括但不限于矿物油、液体石蜡、白石蜡、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。另选地，可将药学上可接受的组合物于含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的适合的洗剂或霜剂来配制。适合的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

本公开的药学上可接受的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入施用。此类组合物是根据药学制剂领域中熟知的技术来制备并且可被制成盐水溶液，其采用苄醇或其他合适的防腐剂、吸收促进剂(用以提高生物利用率)、氟碳类、和/或其他常规的助溶剂或分散剂。

可以与载体材料组合以产生呈单一剂型的组合物的化合物的量将根据所治疗的宿主、特定施用模式而改变。

在一些实施方案中，RET抑制剂和mTORC1抑制剂中的每一者的剂量等于各自在单一疗法中使用时的剂量。

如本文所证明的，RET抑制剂和mTORC1抑制剂的组合在治疗特征在于异常RET活性的癌症中显示出意料不到的协同作用。因为该协同作用，对于RET抑制剂和/或mTORC1抑制剂可以使用比单一疗法中使用的剂量少的剂量。因此，在一些实施方案中，在本公开方法中使用的RET抑制剂的剂量是这种RET抑制剂以单一疗法使用时的剂量的小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％或小于70％。另外，在一些实施方案中，在本公开方法中使用的mTORC1抑制剂的剂量是这种mTORC1抑制剂以单一疗法使用时的剂量的小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％或小于70％。在一些实施方案中，在本公开方法中使用的RET抑制剂和mTORC1抑制剂的剂量是此类抑制剂中的每一者以单一疗法使用时的剂量的小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％或小于70％。

还应理解的是，对于任何特定患者的特定剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括采用的特定化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合、以及治疗医师的判断和所治疗的特定疾病的严重程度。组合物中的本公开化合物的量还将取决于组合物中的特定化合物。

在一些实施方案中，用于本文所述的方法中的组合的每种化合物的剂量在约5mg至约1000mg之间。在一些实施方案中，当RET抑制剂为化合物A时，用于本公开的方法中的剂量在约5mg至约1000mg之间。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为60mg至400mg。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为100mg至400mg。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为300mg至400mg。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为300mg。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为400mg。

在一些实施方案中，化合物A每日施用一次。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为60mg至400mg，每日一次。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为100mg至400mg，每日一次。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为300mg至400mg，每日一次。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为300mg，每日一次。

在一些实施方案中，化合物A的施用量为400mg，每日一次。

在一些实施方案中，本公开特征在于药盒(例如，药物包)，所述药盒包括RET抑制剂和mTORC1抑制剂，其中RET抑制剂和mTORC1抑制剂各自被配制为单独的剂型。所述药盒可用于治疗特征在于异常RET活性的癌症，例如本文所述的癌症。所提供的药盒可以在单独的容器(例如，小瓶、安瓿、瓶、注射器和/或分配器包装，或其他合适的容器)中包含mTORC1抑制剂和RET抑制剂中的每一者。在一些实施方案中，所提供的试剂盒可以任选地进一步包括另外的容器，其包含用于稀释或悬浮RET抑制剂和mTORC1抑制剂中的一者或两者的药物赋形剂。在一些实施方案中，在施用之前将在单独的容器中的mTORC1抑制剂和RET抑制剂组合(任选地具有包含用于稀释或悬浮的药物赋形剂的第三容器)合并以形成一个单位剂型。

所述药盒可以进一步包括用于施用两种抑制剂(例如，如何将两种抑制剂合并为单一剂型、试剂盒可用的癌症类型、mTORC1和RET抑制剂中的每一者作为单独的剂型的施用频率以及与两种抑制剂共同施用相关的其他信息的书面说明书。

实施例

以下实施例旨在说明并非旨在以任何方式进行限制。

实施例1.体外细胞增殖测定

以下所述研究中使用的细胞系购自ATCC(TT细胞，RET C634W甲状腺髓样癌细胞系)、Riken(LC2/ad细胞，CCDC6-RET肺腺癌细胞系)或Sigma(FTC-133，滤泡状甲状腺癌)，或获自科罗拉多大学(MZ-CRC-1，RET M918T，甲状腺髓样癌细胞)。

使用Multidrop(Thermo Fisher)将细胞一式两份涂铺在96孔不透明的底部透光板(Falcon)中，并且在第二天用如下所述的化合物组合处理。在每个板上包括针对DMSO和激酶抑制剂星形孢菌素的一式三份孔，以确定对细胞增殖的相对抑制。将细胞系孵育3天(FTC-133)或5天(TT、MZ-CRC-1、LC2/ad)，并且使用CellTiter-Glo(CTG)测定(Promega)测量相对增殖。为了计算细胞增殖的抑制百分比，使用以下公式：

1-([(平均组合孔信号)-(平均星形孢菌素信号)]/[(平均DMSO信号)–

(平均星形孢菌素信号)])

实施例2.组合研究

使用CHALICE^TM软件(Horizon CombinatoRx Inc.,Cambridge,MA)，经由根据观察值与来自Loewe加性模型的预测值之间的差异计算出的协同作用评分在每种化合物的一系列浓度上评估相对于Loewe加性模型的化合物之间的潜在协同相互作用。对于这些实验，将化合物A的最少5点稀释系列(剂量范围1000nM-0.39nM)与剂量范围为1000nM-1.4nM的AZD-8055的7点稀释系列组合以创建跨越48-64个不同组合的药物组合矩阵。如上所述计算细胞增殖值的抑制百分比，并将其输入到CHALICE软件中以产生协同作用评分和等效线图，以可视化用组合测试的化合物获得的任何过量抑制或效价转变。当两种化合物的组合效应大于基于化合物组合的Loewe加性模型的所预测效应时，发生了协同生长抑制。评估协同生长抑制的这种方法在Lehar等人(Nat.Biotechnology,2009)和CHALICE软件技术指南中进行了详细解释。

在图1-4，图片A中，对于每种细胞系示出了在单一化合物存在下和在一系列组合浓度上，用CTG测定测量的抑制值的矩阵。图1-4，图片B中的Loewe过量抑制矩阵和图1-4，图片C中的等效线图表明观察到的过量抑制超过由Loewe加性模型预测的抑制。在等效线图中，连接横坐标值和纵坐标值的直线表示针对两种化合物的组合的严格加性的生长抑制。处于直线以下的曲线表示协同生长抑制。

如可以在图2-4中观察到的，在RET驱动的细胞系(包括甲状腺髓样癌细胞系TT(图3)和MZ-CRC-1(图4)以及肺腺癌细胞系LC2/ad(图2))中观察到化合物A和AZD8055的组合的协同相互作用。在不具有致癌性RET突变并且对RET抑制不敏感的细胞系，即FTC-133细胞系中未观察到协同相互作用(图1)。

对于化合物A和AZD8055的组合的总体协同作用评分的汇总示出在下表4中。对于大于1的协同作用评分发生了协同相互作用。

表4.化合物A和AZD8055在各种细胞系中的协同作用评分的汇总

另外，以下实施例进一步支持化合物A在治疗RET改变癌症中的用途。

实施例3.DUSP6和SPRY4表达分析

用指出的化合物处理细胞7小时，然后用含1％β-巯基乙醇的缓冲液RLT(QIAGEN,Hilden,Germany)裂解。根据制造商的说明书，使用Rneasy Plus微型试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)分离总RNA。根据制造商的说明书，使用SuperScript VILO主混合物(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)合成第一链cDNA。在ViiA 7实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)上运行实时qPCR。对于qRT-PCR，将参考基因葡糖醛酸酶β(GUSB)的表达用于归一化靶基因DUSP6、SPRY4和糖原合酶激酶3β(GSK3B)的表达。对每个样品分析重复的qRT-PCR反应，并且QuantStudio实时PCR软件(Life Technologies,Carlsbad,CA)将DUSP6、SPRY4或GSK3B的平均表达归一化至每个样品中参考基因GUSB的平均表达。图5A-5C示出了在用化合物A或卡博替尼处理(图5A)L2C/ad、(图5B)MZ-CRC-1细胞或(图5C)TT MTC细胞后7小时，RET途径靶标DUSP6和SPRY4以及AKT途径靶标GSK3B的相对转录物表达。图6示出了来自KIF5B-RET NSCLC PDX的DUSP6、SPRY4和GSK3B的相对转录物表达。在施用最后剂量之后的指定时间(小时)收集肿瘤。数据为平均值+SD。^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，2侧学生t检验。SD，标准偏差。

实施例4.KIF5B-RET Ba/F3细胞的产生和ENU诱变测定

将编码人KIF5B-RET变体1的氨基酸序列的DNA置于慢病毒载体中处于强力霉素诱导型启动子下，以最大化具有羧基末端FLAG表位的表达，从而促进抗FLAG抗体对融合物的免疫检测。慢病毒介导的基因转导用于在Ba/F3细胞中表达KIF5B-RET，KIF5B-RET依赖性细胞通过IL-3撤离来选择，并且通过免疫印迹分析确认表达KIF5B-RET融合蛋白。为了产生携带V804取代的Ba/F3细胞，将WT KIF5B-RET Ba/F3细胞用ENU诱变过夜，并且在存在6种浓度的MKI(帕纳替尼、瑞格拉非尼、卡博替尼或凡德他尼)的情况下铺在96孔板中，持续2周的时间段。对于每种化合物选择的浓度在2×–64×增殖IC₅₀的范围内：125nM至4μmol/L卡博替尼，20至640nM帕纳替尼，和250nM至8μmol/L凡德他尼。从抗性克隆中分离出基因组DNA，并且使用Sanger测序来鉴定那些具有取代的基因。图7示出了在KIF5B-RET V804L Ba/F3同种异体移植物中，化合物A与卡博替尼相比的抗肿瘤活性。

实施例5.I期研究

启动了一项1期，首次在人体内的研究(NCT03037385)，以定义化合物A在RET改变的晚期NSCLC、MTC和其他实体瘤中的最大耐受剂量、安全性概况、药代动力学和初步抗肿瘤活性。在进入研究之前，从所有患者中获得了关于化合物A治疗和采集血液和肿瘤样品用于探索性生物标志物分析以表征安全性和功效的潜在预测性生物标记物的书面知情同意书。成年患者(≥18岁)必须患有晚期不可切除的实体瘤，其东部肿瘤协作组表现状态为0至2，并具有适当的骨髓、肝、肾和心脏功能。使用贝叶斯(Bayesian)最佳间隔设计，以4周为周期每日一次口服施用化合物A。在≥120mg的剂量水平下，还需要有记录证明的RET改变才能进入研究。将不良事件根据不良事件通用术语标准(CTCAE)进行分级。通过RECIST 1.1版评价了计算机断层摄影术的射线照相应答(European Journal of Cancer 45:228-247(2009))。使用PlasmaSELECT^TM-R64 NGS面板(Personal Genome Diagnostics,Baltimore,MD)评估血浆中ctDNA的水平。通过ELISA(Medpace,Cincinnati,OH)测量MTC患者中的血清降钙素水平。通过qRT-PCR(Molecular MD,Portland,OR)分析肿瘤DUSP6/SPRY4水平。

病例研究

患者1是一名患有具有多个RET突变(L629P、D631_R635DELINSG和V637R)的散发性MTC的27岁患者。患者在开始化合物A治疗之前未接受过酪氨酸激酶抑制剂并伴有高度侵袭性疾病，所述疾病需要紧急气管切开术和广泛性手术，包括全甲状腺切除术、中央区颈淋巴结清扫术、双侧1-4级颈淋巴结清扫术、全胸腺切除术和正中胸骨切开术。术后病程并发乳糜胸。多学科医生共识反对对颈部放射治疗，并且再分期扫描显示出左气管旁疾病伴有气管和食管侵袭以及肺和肝的转移性疾病。考虑到VEGFR相关毒性的相关风险，认为两种用于MTC的FDA批准的多激酶药物(凡德他尼和卡博替尼)不适于该患者，所述相关毒性可以包括伤口愈合不良，并且增加瘘管形成和出血的风险(CAPRELSA(凡德他尼)[包装插页].Cambridge,MA:Sanofi Genzyme；2016；COMETRIQ(卡博替尼)[包装插页].South SanFrancisco,CA:Exelixix,Inc.；2018)。因此，将患者招募至化合物A临床试验，并以第二剂量水平(60mg，QD)开始治疗。引人注目地，在化合物A疗法28天后，血清肿瘤标记物降钙素降低>90％(图8A)。8周后，靶病灶减少了19％。在将化合物A的剂量连续递增至200mg QD之后，根据实体瘤应答评价标准(RECIST)1.1版，患者实现了部分反应，肿瘤减少>30％(图8B)。该患者随后升至300mg QD化合物A，并在10个月时实现经确认的部分应答(最大减少47％)。总体而言，在此期间，癌胚抗原(CEA)水平降低57％。使用化合物A治疗改善的健康状况允许去除患者的气管造口管，并且在治疗前几千克的体重减轻后恢复到基线体重。化合物A在连续治疗的11个月中一直耐受性良好，其中唯一药物相关不良事件是白细胞短暂下降1级，其无需中断药物或改变剂量就可消退。截至2018年4月13日，患者仍在接受治疗。

患者A为56岁、患有散发性RET M918T突变型MTC，在接受凡德他尼中进行了应答并然后进展，开始使用化合物A，300mg QD治疗。在化合物A治疗的最初几周内出现了临床活性的早期信号：28天后，血清降钙素降低>90％，并且CEA降低75％(图8C)。RET M918T循环肿瘤DNA(ctDNA)在28天后降低47％，并且在56天后未检测出。在治疗前和治疗后28天收集的成对肿瘤活检物展示出DUSP6降低93％，并且SPRY4 mRNA表达降低86％，这证实了肿瘤内的RET途径抑制(图8E)。重要的是，这些活性指示是在8周后通过根据RECIST 1.1的放射照相应答(-35％)来确认的(图8D)。患者对化合物A治疗耐受良好，没有中断剂量；药物相关不良事件为1级恶心和高磷血症。患者在8个月时继续接受治疗，截至2018年4月13日，具有经确认的部分应答(最大减少47％)。

患者3是患有转移性RET改变的NSCLC的37岁患者，其在接受顺铂、培美曲塞和贝伐单抗中进展，经由FISH分析具有对RET融合物为阳性的肿瘤组织测试。患者开始用200mg QD化合物A治疗，并且基线时的ctDNA分析显示典型的KIF5B-RET融合物和同时发生的TP53突变。在治疗8周后的第一次放射照相评估时注意到肿瘤减少(-25％)，并且所述肿瘤减少与KIF5B-RET和TP53 ctDNA水平的同时下降相关联(图9A)。患者在16周后的第二次放射照相评估时实现了部分应答(图9B)，并持续治疗至10个月，截至2018年4月13日，具有经确认的部分应答。如关于上述的MTC患者所观察到的，化合物A的耐受性一直良好，其中所有药物相关不良事件均为1级并且包括便秘(已消退)、皮肤干燥、皮疹和白细胞减少症。

患者4是69岁的NSCLC患者，其先前进行过肺切除术肾切除术和胸膜腔引流术。患者开始用400mg QD化合物A治疗。注意到针对KIF5B-RET NSCLC脑转移的肿瘤减少(图13)。具体地，在患者中观察到颅内抗肿瘤活性的证据。在基线时，患者的大脑中有大约6mm转移性病灶，其在治疗8周后显现出消退。在8周评估时，确定患者患有稳定疾病。

患者5是一名患有局部晚期KIF5B-RET NSCLC的74岁曾吸烟者。患者的CT扫描示于图15A-D中。患者同时接受化学放射以及顺铂和培美曲塞，然后用卡铂和nab-紫杉醇治疗，并最终进展。肿瘤组织的下一代测序连同FISH一起揭示出KIF5B-RET融合物，并且将患者招募至测试凡德他尼和依维莫司的组合治疗方案的临床试验(NCT01582191)。患者实现了部分应答，但在11个周期后进行的分期扫描显示出进展性疾病，其与呼吸困难增加和表现状态恶化的临床症状相关。然后将患者招募至化合物A的1期试验。用化合物A(300mg QD)治疗16周后，患者具有部分应答，其中肿瘤体积减少34％(图15C和15D)并且呼吸困难和表现状态得到改善。在治疗期间，化合物A的耐受性一直良好，并且截至2018年4月13日，患者未经历药物相关不良事件。

测量ctDNA水平

可以使用PlasmaSELECT^TM-R64 NGS面板(Personal Genome Diagnostics,Baltimore,MD)评估血浆中的一种示例效应标记物ctDNA(例如KIF5B或TP53 ctDNA)的水平。PlasmaSELECT^TM 64针对癌症中的遗传改变分析循环肿瘤DNA。具体地，血浆SELECT^TM 64评价了64个充分表征的癌症基因的靶向组。从血浆中提取无细胞DNA，并且使用适合低丰度样品DNA的专有方法制备。然后使用专有的捕获过程和高覆盖率的下一代测序技术处理样品。

稳态血浆浓度RET IC₉₀和脑IC₉₀(预测的)

在预定的时间点从每天一次口服给予30至600mg化合物A的患者中采集血液样品。使用经验证的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法分析血浆样品中的化合物A。使用Phoenix

(6.4版，Certara L.P.)或Graphpad Prism(7.02版)对血浆化合物A的浓度-时间数据作图。图10A示出了稳态下化合物A的血浆浓度-时间曲线。RET IC₉₀和脑IC₉₀(预测的)是基于根据动物的PK和PD数据的预测和推断的。

本文提及的所有出版物和专利申请都特此通过引用以其全文并入，如同每个单独的出版物或专利明确且单独地被指明通过引用并入一样。

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本公开的具体实施方案的许多等效物。此类等效物旨在为以下权利要求所涵盖。

序列表

<110> 缆图药品公司

<120> RET抑制剂和MTORC1抑制剂的组合及其用于治疗由异常RET活性介导的癌症的用途

<130> 14320.0033-00304

<140>

<141>

<150> 62/657,605

<151> 2018-04-13

<150> 62/656,297

<151> 2018-04-11

<150> 62/652,284

<151> 2018-04-03

<150> 62/506,334

<151> 2017-05-15

<160> 4

<170> PatentIn 第3.5 版

<210> 1

<211> 1114

<212> PRT

<213> 现代人

<400> 1

Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser

20 25 30

Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr

35 40 45

Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro

50 55 60

Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu

65 70 75 80

His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr

85 90 95

Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg

100 105 110

Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser

115 120 125

Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg

130 135 140

Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu

145 150 155 160

Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile

165 170 175

Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro

180 185 190

Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu

195 200 205

Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser

210 215 220

Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val

225 230 235 240

Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val

245 250 255

Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe

260 265 270

Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys

275 280 285

Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val

290 295 300

Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro

305 310 315 320

Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn

325 330 335

Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His

340 345 350

Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg

355 360 365

Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro

370 375 380

Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val

385 390 395 400

Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala

405 410 415

Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala

420 425 430

Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn

435 440 445

Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile

450 455 460

Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu

465 470 475 480

Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala

485 490 495

Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu

500 505 510

Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys

515 520 525

Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg

530 535 540

Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro

545 550 555 560

Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln

565 570 575

Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly

580 585 590

Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr

595 600 605

Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp

610 615 620

Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala

625 630 635 640

Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys

645 650 655

Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala

660 665 670

Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser

675 680 685

Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val

690 695 700

Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro

705 710 715 720

Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly

725 730 735

Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr

740 745 750

Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu

755 760 765

Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His

770 775 780

Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu

785 790 795 800

Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu

805 810 815

Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser

820 825 830

Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met

835 840 845

Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr

850 855 860

Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile

865 870 875 880

Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser

885 890 895

Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg

900 905 910

Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr

915 920 925

Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile

930 935 940

Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu

945 950 955 960

Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys

965 970 975

Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro

980 985 990

Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met

995 1000 1005

Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro

1010 1015 1020

Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr

1025 1030 1035

Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro

1040 1045 1050

Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Met Ser Asp Pro Asn

1055 1060 1065

Trp Pro Gly Glu Ser Pro Val Pro Leu Thr Arg Ala Asp Gly Thr

1070 1075 1080

Asn Thr Gly Phe Pro Arg Tyr Pro Asn Asp Ser Val Tyr Ala Asn

1085 1090 1095

Trp Met Leu Ser Pro Ser Ala Ala Lys Leu Met Asp Thr Phe Asp

1100 1105 1110

Ser

<210> 2

<211> 1072

<212> PRT

<213> 现代人

<400> 2

Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser

20 25 30

Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr

35 40 45

Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro

50 55 60

Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu

65 70 75 80

His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr

85 90 95

Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg

100 105 110

Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser

115 120 125

Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg

130 135 140

Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu

145 150 155 160

Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile

165 170 175

Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro

180 185 190

Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu

195 200 205

Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser

210 215 220

Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val

225 230 235 240

Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val

245 250 255

Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe

260 265 270

Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys

275 280 285

Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val

290 295 300

Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro

305 310 315 320

Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn

325 330 335

Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His

340 345 350

Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg

355 360 365

Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro

370 375 380

Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val

385 390 395 400

Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala

405 410 415

Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala

420 425 430

Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn

435 440 445

Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile

450 455 460

Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu

465 470 475 480

Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala

485 490 495

Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu

500 505 510

Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys

515 520 525

Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg

530 535 540

Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro

545 550 555 560

Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln

565 570 575

Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly

580 585 590

Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr

595 600 605

Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp

610 615 620

Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala

625 630 635 640

Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys

645 650 655

Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala

660 665 670

Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser

675 680 685

Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val

690 695 700

Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro

705 710 715 720

Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly

725 730 735

Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr

740 745 750

Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu

755 760 765

Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His

770 775 780

Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu

785 790 795 800

Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu

805 810 815

Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser

820 825 830

Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met

835 840 845

Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr

850 855 860

Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile

865 870 875 880

Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser

885 890 895

Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg

900 905 910

Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr

915 920 925

Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile

930 935 940

Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu

945 950 955 960

Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys

965 970 975

Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro

980 985 990

Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met

995 1000 1005

Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro

1010 1015 1020

Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr

1025 1030 1035

Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro

1040 1045 1050

Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Arg Ile Ser His Ala

1055 1060 1065

Phe Thr Arg Phe

1070

<210> 3

<211> 5629

<212> DNA

<213> 现代人

<400> 3

agtcccgcga ccgaagcagg gcgcgcagca gcgctgagtg ccccggaacg tgcgtcgcgc 60

ccccagtgtc cgtcgcgtcc gccgcgcccc gggcggggat ggggcggcca gactgagcgc 120

cgcacccgcc atccagaccc gccggcccta gccgcagtcc ctccagccgt ggccccagcg 180

cgcacgggcg atggcgaagg cgacgtccgg tgccgcgggg ctgcgtctgc tgttgctgct 240

gctgctgccg ctgctaggca aagtggcatt gggcctctac ttctcgaggg atgcttactg 300

ggagaagctg tatgtggacc aggcggccgg cacgcccttg ctgtacgtcc atgccctgcg 360

ggacgcccct gaggaggtgc ccagcttccg cctgggccag catctctacg gcacgtaccg 420

cacacggctg catgagaaca actggatctg catccaggag gacaccggcc tcctctacct 480

taaccggagc ctggaccata gctcctggga gaagctcagt gtccgcaacc gcggctttcc 540

cctgctcacc gtctacctca aggtcttcct gtcacccaca tcccttcgtg agggcgagtg 600

ccagtggcca ggctgtgccc gcgtatactt ctccttcttc aacacctcct ttccagcctg 660

cagctccctc aagccccggg agctctgctt cccagagaca aggccctcct tccgcattcg 720

ggagaaccga cccccaggca ccttccacca gttccgcctg ctgcctgtgc agttcttgtg 780

ccccaacatc agcgtggcct acaggctcct ggagggtgag ggtctgccct tccgctgcgc 840

cccggacagc ctggaggtga gcacgcgctg ggccctggac cgcgagcagc gggagaagta 900

cgagctggtg gccgtgtgca ccgtgcacgc cggcgcgcgc gaggaggtgg tgatggtgcc 960

cttcccggtg accgtgtacg acgaggacga ctcggcgccc accttccccg cgggcgtcga 1020

caccgccagc gccgtggtgg agttcaagcg gaaggaggac accgtggtgg ccacgctgcg 1080

tgtcttcgat gcagacgtgg tacctgcatc aggggagctg gtgaggcggt acacaagcac 1140

gctgctcccc ggggacacct gggcccagca gaccttccgg gtggaacact ggcccaacga 1200

gacctcggtc caggccaacg gcagcttcgt gcgggcgacc gtacatgact ataggctggt 1260

tctcaaccgg aacctctcca tctcggagaa ccgcaccatg cagctggcgg tgctggtcaa 1320

tgactcagac ttccagggcc caggagcggg cgtcctcttg ctccacttca acgtgtcggt 1380

gctgccggtc agcctgcacc tgcccagtac ctactccctc tccgtgagca ggagggctcg 1440

ccgatttgcc cagatcggga aagtctgtgt ggaaaactgc caggcattca gtggcatcaa 1500

cgtccagtac aagctgcatt cctctggtgc caactgcagc acgctagggg tggtcacctc 1560

agccgaggac acctcgggga tcctgtttgt gaatgacacc aaggccctgc ggcggcccaa 1620

gtgtgccgaa cttcactaca tggtggtggc caccgaccag cagacctcta ggcaggccca 1680

ggcccagctg cttgtaacag tggaggggtc atatgtggcc gaggaggcgg gctgccccct 1740

gtcctgtgca gtcagcaaga gacggctgga gtgtgaggag tgtggcggcc tgggctcccc 1800

aacaggcagg tgtgagtgga ggcaaggaga tggcaaaggg atcaccagga acttctccac 1860

ctgctctccc agcaccaaga cctgccccga cggccactgc gatgttgtgg agacccaaga 1920

catcaacatt tgccctcagg actgcctccg gggcagcatt gttgggggac acgagcctgg 1980

ggagccccgg gggattaaag ctggctatgg cacctgcaac tgcttccctg aggaggagaa 2040

gtgcttctgc gagcccgaag acatccagga tccactgtgc gacgagctgt gccgcacggt 2100

gatcgcagcc gctgtcctct tctccttcat cgtctcggtg ctgctgtctg ccttctgcat 2160

ccactgctac cacaagtttg cccacaagcc acccatctcc tcagctgaga tgaccttccg 2220

gaggcccgcc caggccttcc cggtcagcta ctcctcttcc ggtgcccgcc ggccctcgct 2280

ggactccatg gagaaccagg tctccgtgga tgccttcaag atcctggagg atccaaagtg 2340

ggaattccct cggaagaact tggttcttgg aaaaactcta ggagaaggcg aatttggaaa 2400

agtggtcaag gcaacggcct tccatctgaa aggcagagca gggtacacca cggtggccgt 2460

gaagatgctg aaagagaacg cctccccgag tgagcttcga gacctgctgt cagagttcaa 2520

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tggcccgctc ctcctcatcg tggagtacgc caaatacggc tccctgcggg gcttcctccg 2640

cgagagccgc aaagtggggc ctggctacct gggcagtgga ggcagccgca actccagctc 2700

cctggaccac ccggatgagc gggccctcac catgggcgac ctcatctcat ttgcctggca 2760

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cagaaacatc ctggtagctg aggggcggaa gatgaagatt tcggatttcg gcttgtcccg 2880

agatgtttat gaagaggatt cctacgtgaa gaggagccag ggtcggattc cagttaaatg 2940

gatggcaatt gaatcccttt ttgatcatat ctacaccacg caaagtgatg tatggtcttt 3000

tggtgtcctg ctgtgggaga tcgtgaccct agggggaaac ccctatcctg ggattcctcc 3060

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ccttgcggcg tccactccat ctgactccct gatttatgac gacggcctct cagaggagga 3300

gacaccgctg gtggactgta ataatgcccc cctccctcga gccctccctt ccacatggat 3360

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cacgagagct gatggcacta acactgggtt tccaagatat ccaaatgata gtgtatatgc 3480

taactggatg ctttcaccct cagcggcaaa attaatggac acgtttgata gttaacattt 3540

ctttgtgaaa ggtaatggac tcacaagggg aagaaacatg ctgagaatgg aaagtctacc 3600

ggccctttct ttgtgaacgt cacattggcc gagccgtgtt cagttcccag gtggcagact 3660

cgtttttggt agtttgtttt aacttccaag gtggttttac ttctgatagc cggtgatttt 3720

ccctcctagc agacatgcca caccgggtaa gagctctgag tcttagtggt taagcattcc 3780

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ttctgtgttc acatgtgtgg gtccaacact tactacctgg tgtatgaaat tggacctgaa 3900

ctgttggatt tttctagttg ccgccaaaca aggcaaaaaa atttaaacat gaagcacaca 3960

cacaaaaaag gcagtaggaa aaatgctggc cctgatgacc tgtccttatt cagaatgaga 4020

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tgcaaccttt ccttaggaag acatttggtt ttcatcatga ttaagatgat tcctagattt 4200

agcacaatgg agagattcca tgccatcttt actatgtgga tggtggtatc agggaagagg 4260

gctcacaaga cacatttgtc ccccgggccc accacatcat cctcacgtgt tcggtactga 4320

gcagccacta cccctgatga gaacagtatg aagaaagggg gctgttggag tcccagaatt 4380

gctgacagca gaggctttgc tgctgtgaat cccacctgcc accagcctgc agcacacccc 4440

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tactcacttt aatttgaatc ttatcaactt actcataaag ggacaggcta gctagctgtg 4560

ttagaagtag caatgacaat gaccaaggac tgctacacct ctgattacaa ttctgatgtg 4620

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tgtgtttgta atttaatgct gctacaagat gtttctgttt cttagattct gaccatgact 4740

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agtcttgtgg gggcagcttt tgggaagtct cagcagctct tctggctgtg ttgtcagcac 4860

tgtaacttcg cagaaaagag tcggattacc aaaacactgc ctgctcttca gacttaaagc 4920

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tggctctaat ttgggctgtt tttcagatac actgtgataa gttcttttac aaatatctat 5160

agacatggta aacttttggt tttcagatat gcttaatgat agtcttacta aatgcagaaa 5220

taagaataaa ctttctcaaa ttattaaaaa tgcctacaca gtaagtgtga attgctgcaa 5280

caggtttgtt ctcaggaggg taagaactcc aggtctaaac agctgaccca gtgatgggga 5340

atttatcctt gaccaattta tccttgacca ataacctaat tgtctattcc tgagttataa 5400

aagtccccat ccttattagc tctactggaa ttttcataca cgtaaatgca gaagttacta 5460

agtattaagt attactgagt attaagtagt aatctgtcag ttattaaaat ttgtaaaatc 5520

tatttatgaa aggtcattaa accagatcat gttccttttt ttgtaatcaa ggtgactaag 5580

aaaatcagtt gtgtaaataa aatcatgtat cataaaaaaa aaaaaaaaa 5629

<210> 4

<211> 4174

<212> DNA

<213> 现代人

<400> 4

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ccccagtgtc cgtcgcgtcc gccgcgcccc gggcggggat ggggcggcca gactgagcgc 120

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cgcacgggcg atggcgaagg cgacgtccgg tgccgcgggg ctgcgtctgc tgttgctgct 240

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ggacgcccct gaggaggtgc ccagcttccg cctgggccag catctctacg gcacgtaccg 420

cacacggctg catgagaaca actggatctg catccaggag gacaccggcc tcctctacct 480

taaccggagc ctggaccata gctcctggga gaagctcagt gtccgcaacc gcggctttcc 540

cctgctcacc gtctacctca aggtcttcct gtcacccaca tcccttcgtg agggcgagtg 600

ccagtggcca ggctgtgccc gcgtatactt ctccttcttc aacacctcct ttccagcctg 660

cagctccctc aagccccggg agctctgctt cccagagaca aggccctcct tccgcattcg 720

ggagaaccga cccccaggca ccttccacca gttccgcctg ctgcctgtgc agttcttgtg 780

ccccaacatc agcgtggcct acaggctcct ggagggtgag ggtctgccct tccgctgcgc 840

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catcaacatt tgccctcagg actgcctccg gggcagcatt gttgggggac acgagcctgg 1980

ggagccccgg gggattaaag ctggctatgg cacctgcaac tgcttccctg aggaggagaa 2040

gtgcttctgc gagcccgaag acatccagga tccactgtgc gacgagctgt gccgcacggt 2100

gatcgcagcc gctgtcctct tctccttcat cgtctcggtg ctgctgtctg ccttctgcat 2160

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ggactccatg gagaaccagg tctccgtgga tgccttcaag atcctggagg atccaaagtg 2340

ggaattccct cggaagaact tggttcttgg aaaaactcta ggagaaggcg aatttggaaa 2400

agtggtcaag gcaacggcct tccatctgaa aggcagagca gggtacacca cggtggccgt 2460

gaagatgctg aaagagaacg cctccccgag tgagcttcga gacctgctgt cagagttcaa 2520

cgtcctgaag caggtcaacc acccacatgt catcaaattg tatggggcct gcagccagga 2580

tggcccgctc ctcctcatcg tggagtacgc caaatacggc tccctgcggg gcttcctccg 2640

cgagagccgc aaagtggggc ctggctacct gggcagtgga ggcagccgca actccagctc 2700

cctggaccac ccggatgagc gggccctcac catgggcgac ctcatctcat ttgcctggca 2760

gatctcacag gggatgcagt atctggccga gatgaagctc gttcatcggg acttggcagc 2820

cagaaacatc ctggtagctg aggggcggaa gatgaagatt tcggatttcg gcttgtcccg 2880

agatgtttat gaagaggatt cctacgtgaa gaggagccag ggtcggattc cagttaaatg 2940

gatggcaatt gaatcccttt ttgatcatat ctacaccacg caaagtgatg tatggtcttt 3000

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tgaaaacaaa ctctatggta gaatttccca tgcatttact agattctagc accgctgtcc 3420

cctctgcact atccttcctc tctgtgatgc tttttaaaaa tgtttctggt ctgaacaaaa 3480

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taggcattat tgcaactatg tttttctaaa aggaagtgaa aataagtgta attaccacat 3600

tgcccagcaa cttaggatgg tagaggaaaa aacagatcag ggcggaactc tcaggggaga 3660

ccaagaacag gttgaataag gcgcttctgg ggtgggaatc aagtcatagt acttctactt 3720

taactaagtg gataaatata caaatctggg gaggtattca gttgagaaag gagccaccag 3780

caccactcag cctgcactgg gagcacagcc aggttccccc agacccctcc tgggcaggca 3840

ggtgcctctc agaggccacc cggcactggc gagcagccac tggccaagcc tcagccccag 3900

tcccagccac atgtcctcca tcaggggtag cgaggttgca ggagctggct ggccctggga 3960

ggacgcaccc ccactgctgt tttcacatcc tttcccttac ccaccttcag gacggttgtc 4020

acttatgaag tcagtgctaa agctggagca gttgcttttt gaaagaacat ggtctgtggt 4080

gctgtggtct tacaatggac agtaaatatg gttcttgcca aaactccttc ttttgtcttt 4140

gattaaatac tagaaattta aaaaaaaaaa aaaa 4174

22

Claims (72)

1.一种在有需要的受试者中治疗由异常RET活性介导的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者共同施用RET抑制剂和mTORC1抑制剂。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述异常RET活性归因于RET的致癌突变体或致癌性RET融合物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述异常RET活性归因于：

选自C634W、V804L、V804M、V804E、Y806C、Y806S、Y806H、Y806N、G810R、G810S、L865V、L870F、S891A和M918T的RET突变；或

选自KIF5B-RET和CCDC6-RET的RET融合物。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述异常RET活性归因于：

选自C634W和M918T的RET突变；或

CCDC6-RET融合物。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自甲状腺癌、非小细胞肺癌和其他实体瘤癌症。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自甲状腺髓样癌和肺腺癌。

7.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳头状甲状腺癌(PTC)、甲状腺髓样癌(MTC)、嗜铬细胞瘤(PCC)、胰腺导管腺癌、多发性内分泌瘤(MEN2A和MEN2B)、转移性乳腺癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、结肠直肠癌、卵巢癌、炎性肌成纤维细胞肿瘤和唾液腺的癌症。

8.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自食管癌、皮肤癌(非黑素瘤)、子宫内膜癌、头颈癌、膀胱癌、前列腺癌、血液学癌症、白血病、软组织肉瘤、肾细胞癌(RCC)、非霍奇金淋巴瘤、肝胆管癌、肾上腺皮质癌、骨髓增生异常(MDS)、子宫肉瘤、生殖细胞肿瘤、宫颈癌、中枢神经系统癌、骨癌、壶腹癌、胃肠道间质瘤、小肠癌、间皮瘤、直肠癌、副神经节瘤和肝内胆管癌。

9.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自腺癌、斯皮茨瘤、肺腺癌、腺鳞癌、结肠癌、转移性结肠癌、转移性乳头状甲状腺癌、弥漫性硬化变异型乳头状甲状腺癌、原发性骨髓纤维化伴继发性急性髓性白血病、弥漫性胃癌、甲状腺癌和细支气管肺细胞癌。

10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肝胆管癌、壶腹癌、小肠癌、肝内胆管癌、转移性结肠癌、与肺癌相关的脑癌、与肺癌相关的脑转移和腹膜后副神经节瘤。

11.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自甲状腺髓样癌(MTC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症选自散发性MTC、转移性RET改变的NSCLC、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)难治性KIF5B-RET NSCLC和KIF5B-RET NSCLC。

13.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症选自与肺癌相关的脑癌。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述脑癌为脑转移。

15.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为RET改变的甲状腺髓样癌(MTC)。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症为家族性MTC。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述癌症为散发性MTC。

18.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为具有M918T突变的MTC。

19.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为具有C634R突变的MTC。

20.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述癌症为具有V804M突变的MTC。

21.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为副神经节瘤。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述癌症为腹膜后副神经节瘤。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述副神经节瘤具有R77H突变。

24.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为RET改变的NSCLC。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为具有KIF5B-RET融合物的NSCLC。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为具有CCDC6-RET融合物的NSCLC。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为具有KIAA1468-RET融合物的NSCLC。

28.如权利要求24所述的方法，其中所述癌症为具有鉴定为FISH阳性的RET融合物的NSCLC。

29.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述癌症为RET改变的PTC。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述癌症为具有CCDC6-RET融合物的PTC。

31.如权利要求29所述的方法，其中所述癌症为具有NCOA4-RET融合物的PTC。

32.如权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症为RET改变的肝内胆管癌。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌症为具有NCOA4-RET融合物的肝内胆管癌。

34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过用多激酶RET抑制剂的先前治疗。

35.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过用多激酶RET抑制剂的一种或多种先前治疗。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述多激酶RET抑制剂选自乐伐替尼、凡德他尼、卡博替尼和RXDX-105。

37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前化学疗法。

38.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过先前化学疗法。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述先前化学疗法选自卡铂、亚柏杉、培美曲塞、顺铂、贝伐单抗及其组合。

40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前免疫疗法。

41.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述受试者接受过先前免疫疗法。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述先前免疫疗法选自伊匹单抗、派姆单抗、尼沃鲁单抗、MPDL3280A、MEDI4736及其组合。

43.如权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

45.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中mTORC1抑制剂为AZD8055。

46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述RET抑制剂具有结构：

47.如权利要求1至46中任一项所述的方法，其中：

所述受试者为人；

所述RET抑制剂为化合物A并且施用量在约5mg/天与约1000mg/天之间；并且

mTORC1抑制剂的施用量在约1mg/天至约1000mg/天之间。

48.如权利要求47所述的方法，其中化合物A的施用量为60mg至400mg，每日一次。

49.如权利要求47或48所述的方法，其中化合物A的施用量为100mg至400mg，每日一次。

50.如权利要求47至49中任一项所述的方法，其中化合物A的施用量为300mg至400mg，每日一次。

51.如权利要求47至50中任一项所述的方法，其中化合物A的施用量为300mg，每日一次。

52.如权利要求47至50中任一项所述的方法，其中化合物A的施用量为400mg，每日一次。

53.如权利要求47至52中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

54.如权利要求47至53中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

55.如权利要求47至53中任一项所述的方法，其中mTORC1抑制剂为AZD8055。

56.一种组合，其包含：

RET抑制剂；和

mTORC1抑制剂，

其中所述RET抑制剂和所述mTORC1抑制剂被配制为：

单一剂型；或

组合在药盒中的单独剂型。

57.如权利要求56所述的组合，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

58.如权利要求56或57所述的组合，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

59.如权利要求56或57所述的组合，其中所述mTORC1抑制剂为AZD8055。

60.如权利要求56至59中任一项所述的组合，其中所述RET抑制剂具有结构：

61.如权利要求56至60中任一项所述的组合，其中：

所述RET抑制剂和所述mTORC1抑制剂被配制为组合在药盒中的单独剂型中；并且

所述药盒进一步包括用于共同施用所述RET抑制剂和所述mTORC1抑制剂来治疗由异常RET活性介导的癌症的说明书。

62.一种在有需要的受试者中治疗由异常RET活性介导的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者共同施用RET抑制剂和mTORC1抑制剂，其中所述RET抑制剂的施用与所述受试者中的至少一个效应标记物的持续下调相关。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述RET抑制剂为化合物A。

64.如权利要求62或63所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司或AZD8055。

65.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为依维莫司。

66.如权利要求62至64中任一项所述的方法，其中所述mTORC1抑制剂为AZD8055。

67.如权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述效应标记物选自DUSP6 mRNA表达、SPRY4 mRNA表达、癌胚抗原水平和降钙素水平。

68.如权利要求62至66中任一项所述的方法，其中所述效应标记物为KIF5B ctDNA水平或TP53 ctDNA水平。

69.如权利要求62至68中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的量产生至少一种效应标记物的大于95％下调。

70.如权利要求62至68中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的量产生至少一种效应标记物的大于94％、大于93％、大于92％、大于91％、大于90％、大于89％、大于88％、大于87％、大于86％大于85％、大于80％、大于75％、大于70％、大于65％、大于60％、大于55％或大于50％下调。

71.如权利要求62至68中任一项所述的方法，其中施用至所述受试者的量产生至少一种效应标记物的大于89％、大于88％、大于87％、大于86％、大于85％、大于80％、大于75％或大于70％下调。

72.如权利要求62至71中任一项所述的方法，其中至少两种效应标记物下调。

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