CN110787107B - 一种重楼果壳提取物的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重楼果壳提取物的制备方法，包括粉碎步骤、回流提取步骤、减压浓缩步骤、离心步骤和大孔树脂富集步骤，采用本发明的制备方法制备的重楼果壳提取物质量稳定、有效成分可以得到精确的控制，对DPPH有较好的清除作用，具有较好的抗氧化活性，可以用于护肤、美容等产品中。
Description
技术领域
本发明涉及一种重楼果壳提取物的制备方法及用途。
背景技术
重楼(RHIZOMA PARIDIS)是一味传统的中药材，其基源为百合科(Lilliaceac) 重楼属(Paris)植物的根茎。重楼的别名有草河车、华重楼、七叶莲、独角莲、金线莲、七叶一枝花等。重楼在全世界有24种，主要分布于亚欧大陆的热带和温带地区，我国有19种，主要分布于云南、广西、四川、贵州、陕西等省或自治区。
重楼的药用历史悠久，首次被收录在《神农本草经》，在李时珍所著的《本草纲目》中以蚤休之名收载为下品；在《唐本草》中录别名为重楼。2010年版药典将滇重楼Parispolyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.和七叶一枝花Parispolyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara作为中药重楼的基源植物进行收载。
现代药理学对其药理活性研究发现该药材具有止血、祛痰和抑菌、镇痛镇静、抗细胞毒等作用，在临床应用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎和外科炎症等，都有较为显著的效果。
以重楼根作为原料进行提取，在以往的研究中较为常见，例如赵保胜等人在《中药重楼研究进展》中对重楼的研究进行了综述。但是，重楼根茎需要5到7年才能入药，随着重楼提取物需求的增加，现在野生重楼资源已经枯竭，重楼根替代品的探寻越来越重要。
重楼果壳为百合科重楼属植物重楼的干燥蒴果外壳。重楼种植者在收集重楼种子时，会将成熟蒴果摘下，取出其中的种子，舍弃掉果壳，因此，重楼果壳是一种较易获得的单一重楼植物部位，然而，对重楼果壳化学成分的研究较少，现在尚未有重楼果壳提取物研究的报道。因此，开发出一种工艺简洁，有效成分明确，质量标准清晰的重楼果壳提取物意义重大。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种重楼果壳提取物的制备方法，对重楼果壳进行提取纯化后可以得到富含重楼总皂苷和总黄酮的提取物，可以变废为宝，促进重楼资源利用及保护，同时由于使用单一部位进行提取，批次间质量稳定。
本发明的另外一个目的是提供一种重楼果壳提取物的用途，采用本发明的制备方法所得的重楼果壳提取物对DPPH有较好的清除作用，具有较好的抗氧化活性，可以用在护肤、美容等产品中。
实现上述目的一种技术方案是：一种重楼果壳提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将重楼干燥果壳粉碎得到重楼果壳细粉，重楼果壳细粉的颗粒大小为至少95％的颗粒通过80目筛；
S2，回流提取步骤：采用醇/水混合液对重楼果壳细粉进行回流提取得到提取液，所述醇/水混合液中醇的质量含量为70％～80％，所述醇/水混合液的使用重量为所述重楼果壳细粉重量的5～10倍；回流提取的温度为75～90℃；
S3，减压浓缩步骤：将所述提取液在45℃～65℃的温度下进行减压浓缩，除去提取液中的醇得到浓缩液；
S4，离心步骤：将所述浓缩液以3000～16000转/分钟的转速进行离心，取出上清液；
S5，大孔树脂富集步骤：将所述上清液采用大孔树脂进行吸附后，采用洗脱剂进行洗脱得到洗脱液，将所述洗脱液浓缩干燥即得重楼果壳提取物。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述粉碎步骤中，重楼采用百合科重楼属植物云南重楼、华重楼或七叶一枝花；所述重楼干燥果壳为重楼蒴果去除种子后的干燥蒴果外壳。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述回流提取步骤中，采用醇/水混合液对重楼果壳细粉进行1～3次回流提取，每次回流提取时间为1～3h。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述回流提取步骤中，所述醇/水混合液中的醇采用乙醇。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述减压浓缩步骤中，所述浓缩液的浓缩程度为每毫升浓缩液的重量等于0.5克～1.5克重楼果壳细粉的重量。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述离心步骤中，将所述浓缩液以 3000～16000转/分钟的转速进行离心，取出上清液后的离心沉淀用水进行复溶，将复溶的溶液再次以3000～16000转/分钟的转速进行离心，并将上清液取出，将浓缩液离心后的上清液与复溶的溶液离心后的上清液合并后，进行大孔树脂富集步骤。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述大孔树脂富集步骤中，所述大孔树脂采用AB-8型大孔树脂，所述大孔树脂的重量与重楼果壳细粉的重量比为1:1～ 1:2；所述洗脱剂采用乙醇和水混合成乙醇质量含量为20％乙醇洗脱剂、40％乙醇洗脱剂和80％乙醇洗脱剂。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，所述大孔树脂富集步骤具体包括以下步骤：
S51，将所述上清液采用大孔树脂进行上样吸附，上样速度为0.5柱体积/小时，上清液吸附完毕后，静置2～12小时；
S52，采用水洗脱5～10个柱体积；
S53，采用20％乙醇洗脱剂洗脱4～8个柱体积；
S54，采用40％乙醇洗脱剂洗脱4～8个柱体积，并收集洗脱液；
S55，采用80％乙醇洗脱剂洗脱4～8个柱体积，并收集洗脱液；
S56，将步骤S54和步骤S55所得的洗脱液进行合并，并浓缩干燥即得重楼果壳提取物。
上述的一种重楼果壳提取物的制备方法，采用如利要求1所述的一种重楼果壳提取物的制备方法制得的重楼果壳提取物中，总黄酮含量大于15％；重楼总皂苷含量大于30％；槲皮素-3-龙胆二糖苷含量大于3％；对DPPH清除作用IC50小于 0.5mg/mL。
本发明还提供了一种重楼果壳提取物的用途，所述重楼果壳提取物采用如权利要求1所述的一种重楼果壳提取物的制备方法制得，所述重楼果壳提取物作为抗氧化活性成分加入到护肤品配方中。
采用本发明的重楼果壳提取物的制备方法的技术方案，积极进步效果在于：
(1)本发明的制备方法首次单独以重楼果壳为原料，变废为宝，对其提取后进行富集纯化，得到其中富含总皂苷和总黄酮的有效部位；
(2)本发明的制备方法能有效的得到重楼果壳中的总皂苷和总黄酮，且可以有效的去除其中的大极性杂质和灰尘等；
(3)本发明的制备方法所得不同批次重楼果壳提取物中的总皂苷、总黄酮以及活性标记物槲皮素-3-龙胆二糖甙含量稳定，可以保证其质量的可靠性，可以用于商业化；
(4)本发明的制备方法所得重楼果壳提取物，具有较强的抗氧化活性，可以作为活性物用于护肤品及医药辅助用品中。
附图说明
图1为本发明的重楼果壳提取物的制备方法的流程图；
图2为采用本发明的制备方法制得的重楼果壳提取物的HPLC图；
图3为槲皮素-3-龙胆二糖苷标准品的HPLC图；
图4为采用本发明的制备方法制得的重楼果壳提取物的DPPH自由基清除作用试验结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
请参阅图1实施，下列实施例中的溶剂配制均为质量比，所用试剂和原料均市售可得。重楼采用百合科重楼属植物云南重楼、华重楼或七叶一枝花；重楼干燥果壳为重楼蒴果去除种子后的干燥蒴果外壳。洗脱剂采用乙醇和水混合成乙醇质量含量为20％乙醇洗脱剂、40％乙醇洗脱剂和80％乙醇洗脱剂。
实施例1：
一种重楼果壳提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将200g重楼干燥果壳粉碎得到80目的重楼果壳细粉；
S2，回流提取步骤：将重楼果壳细粉装入提取罐中，采用70％的乙醇/水混合液进行3次回流提取得到提取液，乙醇/水混合液的用量为1Kg，回流提取的温度为75～ 90℃，每次回流提取的时间为2小时，将3次回流提取得到的提取液合并；
S3，减压浓缩步骤：将提取液在60℃的温度下进行减压浓缩，除去提取液中的醇得到100g浓缩液；
S4，离心步骤：将浓缩液以3000转/分钟的转速进行离心，取出上清液，取出上清液后的离心沉淀用100g水(水的添加量为浓缩液的重量)进行复溶，将复溶的溶液再次以3000转/分钟的转速进行离心，并将上清液取出，将浓缩液离心后的上清液与复溶的溶液离心后的上清液合并；
S5，大孔树脂富集步骤，具体包括以下步骤：
S51，取AB-8型大孔树脂220g装柱，用清水洗脱至无醇味后，将上清液采用该大孔树脂进行上样吸附，上样速度为0.5柱体积/小时，上清液吸附完毕后，静置 2小时；
S52，采用水洗脱5个柱体积；
S53，采用20％乙醇洗脱剂洗脱5个柱体积；
S54，采用40％乙醇洗脱剂洗脱5个柱体积，并收集洗脱液；
S55，采用80％乙醇洗脱剂洗脱5个柱体积，并收集洗脱液；
S56，将步骤S54和步骤S55所得的洗脱液进行合并，并浓缩干燥即得重楼果壳提取物11.2g，收率为5.6％。
实施例2：
一种重楼果壳提取物的制备方法，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将20Kg重楼干燥果壳粉碎得到80目的重楼果壳细粉；
S2，回流提取步骤：将重楼果壳细粉装入提取罐中，采用200Kg 80％的乙醇/ 水混合液进行3次回流提取得到提取液，回流提取的温度为75～90℃，每次回流提取的时间为2小时，将3次回流提取得到的提取液合并；
S3，减压浓缩步骤：将提取液在60℃的温度下进行减压浓缩，除去提取液中的醇得到20Kg浓缩液；
S4，离心步骤：将浓缩液以16000转/分钟的转速进行离心，取出上清液，取出上清液后的离心沉淀用20Kg水(水的添加量为浓缩液的重量)进行复溶，将复溶的溶液再次以16000转/分钟的转速进行离心，并将上清液取出，将浓缩液离心后的上清液与复溶的溶液离心后的上清液合并；
S5，大孔树脂富集步骤，具体包括以下步骤：
S51，取AB-8型大孔树脂24Kg装柱，用清水洗脱至无醇味后，将上清液采用该大孔树脂进行上样吸附，上样速度为0.5柱体积/小时，上清液吸附完毕后，静置 6小时；
S52，采用水洗脱4个柱体积；
S53，采用20％乙醇洗脱剂洗脱5个柱体积；
S54，采用40％乙醇洗脱剂洗脱5个柱体积，并收集洗脱液；
S55，采用80％乙醇洗脱剂洗脱5个柱体积，并收集洗脱液；
S56，将步骤S54和步骤S55所得的洗脱液进行合并，并浓缩干燥即得重楼果壳提取物1.54Kg，收率为7.7％。
重楼果壳提取物中总黄酮含量测定：
以芦丁为对照品，用硝酸铝比色法测定实施例1和实施例2中的重楼果壳提取物中的总黄酮含量。取芦丁标准品，配制成浓度为0.260mg/mL、0.173mg/mL、 0.115mg/mL、0.077mg/mL、0.051mg/mL的标准品溶液；取实施例1中的重楼果壳提取物配制成0.692mg/mL的待测样溶液。分别取标准品和待测样，按照硝酸铝比色法进行总黄酮显色反应，测定其吸光度，用吸光度和黄酮浓度绘制芦丁标准品的标准曲线：
Y＝3.1128X+0.0044，R2＝0.9994
其中Y为黄酮浓度，X为吸光度；
经计算，实施例1中的重楼果壳提取物中总黄酮含量为16.67％。
参照上述步骤，测得实施例2中的重楼果壳提取物中总黄酮含量为15.77％。
重楼果壳提取物中的重楼总皂苷含量测定：
以重楼皂苷Ⅰ为对照品，采用高氯酸法测定实施例1和实施例2中的重楼果壳提取物中的重楼总皂苷。
取重楼皂苷Ⅰ标准品配制成0.31mg/mL的标准品溶液，分别取10μL、20μL、 30μL、40μL、50μL、60μL标准品溶液置于试管中，吹干；取实施例1中的重楼果壳提取物配制成0.96mg/mL待测样溶液，取20μL待测样溶液置于试管中，吹干。分别取200μL高氯酸加入标准品和待测样中，反应30分钟后，在405nm波长下测定吸光度，用吸光度和标准品浓度绘制标准曲线：
Y＝0.9976X-0.0082，R2＝0.9963，
其中Y为吸光度，X为总皂苷浓度，R2为数据相关性系数；
经计算，实施例1中的重楼果壳提取物中重楼总皂苷含量为31.44％；
参照上述步骤，测得实施例2中的重楼果壳提取物中重楼总皂苷含量为34.52％。
重楼果壳提取物中的槲皮素-3-龙胆二糖苷含量测定：
请参阅图2和图3，以槲皮素-3-龙胆二糖苷为对照品，对实施例1和实施例2 中的重楼果壳提取物中的槲皮素-3-龙胆二糖苷含量进行测定。
取槲皮素-3-龙胆二糖苷配制成浓度为0.26400mg/mL，0.13200mg/mL，0.06600mg/mL，0.03300mg/mL，0.01650mg/mL，0.00825mg/mL的标准品溶液；取实施例1中的重楼果壳提取物配制成2.88mg/mL的待测样溶液，利用LC-MS方法对标准品和待测样分别进行分析，用MS和保留时间确定槲皮素-3-龙胆二糖苷，用积分面积和槲皮素-3-龙胆二糖苷浓度绘制标准曲线：
Y＝0.0003X+0.0002,R2＝0.9997
其中Y为浓度，X为积分面积，R2为数据相关性系数。
经计算，实施例1中的重楼果壳提取物中槲皮素-3-龙胆二糖苷含量为3.277％；
参照上述步骤，测得实施例2中的重楼果壳提取物中槲皮素-3-龙胆二糖苷含量为3.537％。
重楼果壳提取物的DPPH自由基清除作用试验：
请参阅图4，以维生素C为对照，对实施例1和实施例2中的重楼果壳提取物的DPPH自由基清除作用进行测定。
取维生素C标准品，配制成浓度为0.414mg/mL、0.207mg/mL、0.103mg/mL、0.052mg/mL、0.026mg/mL、0.013mg/mL的标准品溶液，各取1mL待用；取实施例1和实施例2中的重楼果壳提取物分别配制成浓度为2.88mg/mL的待测样溶液，取1mL待用；取DPPH，配制成0.51mg/mL的DPPH溶液后，向待测样和对照样中各加入1mL DPPH溶液，反应30分钟后，在405nm波长下测定吸光度，以吸光度和样品浓度绘制曲线。
结果显示，在该条件下，维生素C对DPPH自由基清除作用IC50为0.024mg/mL，实施例1中的重楼果壳提取物对DPPH自由基清除作用IC50为0.307mg/mL。
参照上述步骤，测得实施例2中的重楼果壳提取物对DPPH自由基清除作用 IC50为0.209mg/mL。
采用本发明的制备方法制得的重楼果壳提取物，富含重楼皂苷和黄酮类物质，具有较强的抗氧化活性，可以作为活性物加入到护肤、美容等产品中。
综上所述，本发明的重楼果壳提取物的制备方法及用途，对重楼果壳进行提取纯化后可以得到富含重楼总皂苷和总黄酮的提取物，可以变废为宝，促进重楼资源利用及保护，同时由于使用单一部位进行提取，批次间质量稳定；该重楼果壳提取物对DPPH有较好的清除作用，具有较好的抗氧化活性，可以用在护肤、美容等产品中。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。
Claims (2)
1.一种重楼果壳提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，粉碎步骤：将重楼干燥果壳粉碎得到重楼果壳细粉，重楼果壳细粉的颗粒大小为至少95%的颗粒通过80目筛；重楼采用百合科重楼属植物云南重楼、华重楼或七叶一枝花；所述重楼干燥果壳为重楼蒴果去除种子后的干燥蒴果外壳；
S2，回流提取步骤：采用醇/水混合液对重楼果壳细粉进行1～3次回流提取得到提取液，所述醇/水混合液中醇的质量含量为70%～80%，所述醇/水混合液的使用重量为所述重楼果壳细粉重量的5～10倍；回流提取的温度为75～90℃；每次回流提取时间为1～3h；所述醇/水混合液中的醇采用乙醇；
S3，减压浓缩步骤：将所述提取液在45℃~65℃的温度下进行减压浓缩，除去提取液中的醇得到浓缩液；所述浓缩液的浓缩程度为每毫升浓缩液的重量等于0.5克～1.5克重楼果壳细粉的重量；
S4，离心步骤：将所述浓缩液以3000～16000转/分钟的转速进行离心，取出上清液后的离心沉淀用水进行复溶，将复溶的溶液再次以3000～16000转/分钟的转速进行离心，并将上清液取出，将浓缩液离心后的上清液与复溶的溶液离心后的上清液合并后，进行大孔树脂富集步骤；
S5，大孔树脂富集步骤：具体包括以下步骤：
S51，将所述上清液采用大孔树脂进行上样吸附，上样速度为0.5柱体积/小时，上清液吸附完毕后，静置2～12小时；所述大孔树脂采用AB-8型大孔树脂，所述大孔树脂的重量与重楼果壳细粉的重量比为1:1～1:2；
S52，采用水洗脱5～10个柱体积；
S53，采用20%乙醇洗脱剂洗脱4～8个柱体积；
S54，采用40%乙醇洗脱剂洗脱4～8个柱体积，并收集洗脱液；
S55，采用80%乙醇洗脱剂洗脱4～8个柱体积，并收集洗脱液；
S56，将步骤S54和步骤S55所得的洗脱液进行合并，并浓缩干燥即得重楼果壳提取物；
所述重楼果壳提取物中，总黄酮含量大于15%；重楼总皂苷含量大于30%；槲皮素-3-龙胆二糖苷含量大于3%；对DPPH清除作用IC50小于0.5mg/mL。
2.一种重楼果壳提取物的用途，其特征在于，所述重楼果壳提取物采用如权利要求1所述的一种重楼果壳提取物的制备方法制得，所述重楼果壳提取物作为抗氧化活性成分在制备护肤品产品中的用途。
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