CN110628837B - 一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及牛骨处理技术领域，具体涉及一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，包括如下步骤：S1破碎；S2脱脂；S3渗透；S4速冻；S5解冻；S6微波处理；采用本发明的方法较好地保留了骨中的氨基酸、多糖等成分的完整性，使得蛋白质不易变性，同时，转化了钙离子形成柠檬酸钙，提高了钙的吸收利用率和溶出率，由于未使用强酸强碱进而避免了生产设备的腐蚀。
Description
技术领域
本发明涉及牛骨处理技术领域，具体涉及一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法。
背景技术
钙是人体不可或缺的重要营养素，目前市场上的钙制剂很多，但均存在一定的局限性。柠檬酸钙是一种无臭无味的白色粉末，它的吸收效率为普通碳酸钙的2.6倍，对肠胃刺激较小，可以在医药行业用作人和动物的补钙剂,诊治骨质疏松症；在食品工业，柠檬酸钙也是一种安全的食品添加剂、缓冲剂及酸度调节剂；柠檬酸钙还被认为是具有潜在市场价值的饲料添加剂而用于水产养殖中。此外，柠檬酸钙能保证饲料不吸潮，并有效改良饲料风味，提升动物进食量，缓解动物对激烈现象做出的反应，还能对动物体形和肉色进行改良，使肉的品质得到提高。
牛硬骨的组成稳定，硬骨中70％作用为以钙盐为主的矿物质，98％以上的钙盐为磷酸钙与碳酸钙，但骨骼钙的羟基磷灰石水溶性极差，并且骨骼通常与胶原纤维结构，使得钙提取率低，若直接食用骨粉则钙的吸收利用率又低，所以有效利用牛硬骨中钙至关重要。现有的酸解法、碱解法会造成蛋白质不可逆变形，进而不利于游离钙的转化。而如专利号CN201810507693.1虽然公开了牛骨中钙的提取方法，但仍停留在溶出率方面。
发明内容
本发明为解决上述技术问题，提供了一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过50-80目筛；
S2脱脂：将牛骨置于鼠李糖乳杆菌活化液中，在20-35℃、100-200转/min的条件下摇床发酵培养10-20h，过滤，得牛骨粉；；
S3渗透：将牛骨粉置于容器中，用含柠檬酸的水蒸汽喷淋120-240s；所述含柠檬酸的水蒸汽中柠檬酸质量分数为10-20％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为300-400mL/s；
S4速冻：将经渗透处理的牛骨粉在零下10℃至零下30℃的条件下进行冷冻1-3h；
S5解冻：将经速冻处理的牛骨粉置于2个大气压，121℃高温高压处理5min，再升至4个大气压处理10min；
S6微波处理：经发解冻后的牛骨粉转入微波仪器中，并向其中加入柠檬酸溶液调节pH为3-6，经微波处理、过滤后，取滤液加热浓缩，即得柠檬酸钙。
所述鼠李糖乳杆菌活化液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在30-35℃条件下活化1-4h后，得悬浮液；将悬浮液倒入含钾溶液静置处理10-20h，在45-55℃下热胁迫处理10-25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为(1.7-3.7)×107cfu/mL；所述悬浮液与含钾溶液的体积比为1：(0.2-0.4)。
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨6-8g，酵母提取物2-4g，葡萄糖22-27g，乙酸钠1-3g，柠檬酸二铵3-4g，吐温80 1-2mL，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g，MnSO4·4H2O 0.03-0.04g，K2HPO4 2-4g，琼脂粉12-16g，水1100-1300mL。
所述酵母提取物的制备方法为：
(1)将酵母乳与温度为75-84℃的热水按1：(2-5)的质量比混合搅拌20-25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至25-35℃，并将pH值调节到6.5-7.0，然后加入复合酶，进行水解反应8-12h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至75-85℃，灭活0.5-2h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物。
所述复合酶为胰蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺酶组成。
所述复合酶的加入量均以其占所述酵母乳中酵母总重量的千分数计算，所述胰蛋白酶的加入量为1-3‰，所述核酸酶的加入量为1-3‰，所述谷氨酰胺酶的加入量为10-15‰。
所述鼠李糖乳杆菌活化液的用量为牛骨粉质量3-7倍。
所述微波处理是先在600-800MHz条件下处理200-300s，再升高频率1800-2000MHz条件下处理200-300s，再降低频率为250-450MHz条件下处理100-160s。
所述升高频率的速率为1-2MHz/s。
所述降低频率的速率为2.5-3.5MHz/s。
所述柠檬酸溶液的质量分数为50-60％。
所述含钾溶液为KCl、硝酸钾、磷酸钾中任意一种；所述含钾溶液中钾的质量分数为5-9％。
有益效果：
采用本发明的方法较好地保留了骨中的氨基酸、多糖等成分的完整性，使得蛋白质不易变性，同时，转化了钙离子形成柠檬酸钙，提高了钙的吸收利用率和溶出率，由于未使用强酸强碱进而避免了生产设备的腐蚀。
本发明以牛骨为原料，通过含柠檬酸的水蒸气处理，不仅利用水溶解可溶钙，还利用热能和柠檬酸的作用使柠檬酸深层透入骨骼中，再利用速冻和解冻处理相结合，分解晶体组织，释放出可溶性物质和骨钙等有益元素，进而使得渗透的柠檬酸能够与钙相互结合。本发明利用多频率微波处理，破坏了骨胶原与羟基磷灰石的结合，加速柠檬酸的渗透与扩散，促进钙的溶出与转化。
另外，本申请利用鼠李糖乳杆菌的作用，还将大量不溶性钙转化成乳酸钙、氨基酸钙等游离形式的钙元素，并且利用含钾溶液对其进行活化，改善了活化效率，削弱了葡萄糖等成分对提钙的不良影响；利用酵母提取物活化鼠李糖乳杆菌，不仅增强了其活性，还可以提高骨粉中营养成分的解离与溶出，使得蛋白质分解成多肽，进而提高了钙的溶出率，还提高了蛋白质的生理活性，同时含钾溶液能够抑制美拉德反应。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过80目筛；
S2脱脂：将牛骨置于鼠李糖乳杆菌活化液中，在35℃、200转/min的条件下摇床发酵培养20h，过滤，得牛骨粉；；
S3渗透：将牛骨粉置于容器中，用含柠檬酸的水蒸汽喷淋240s；所述含柠檬酸的水蒸汽中柠檬酸质量分数为20％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为400mL/s；
S4速冻：将经渗透处理的牛骨粉在零下10℃条件下进行冷冻3h；
S5解冻：将经速冻处理的牛骨粉置于2个大气压，121℃高温高压处理5min，再升至4个大气压处理10min；
S6微波处理：经发解冻后的牛骨粉转入微波仪器中，并向其中加入柠檬酸溶液调节pH为6，经微波处理、过滤后，取滤液加热浓缩，即得柠檬酸钙；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在35℃条件下活化4h后，得悬浮液；将悬浮液倒入含钾溶液静置处理20h，在55℃下热胁迫处理25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为3.7×107cfu/mL；所述悬浮液与含钾溶液的体积比为1：0.4；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨8g，酵母提取物4g，葡萄糖27g，乙酸钠3g，柠檬酸二铵4g，吐温80 2mL，MgSO4·7H2O 0.3g，MnSO4·4H2O 0.04g，K2HPO4 4g，琼脂粉16g，水1300mL；
所述酵母提取物的制备方法为：
(1)将酵母乳与温度为84℃的热水按1：5的质量比混合搅拌25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至35℃，并将pH值调节到7.0，然后加入复合酶，进行水解反应12h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至85℃，灭活2h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述复合酶为胰蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺酶组成；
所述复合酶的加入量均以其占所述酵母乳中酵母总重量的千分数计算，所述胰蛋白酶的加入量为3‰，所述核酸酶的加入量为3‰，所述谷氨酰胺酶的加入量为15‰；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的用量为牛骨粉质量7倍；
所述微波处理是先在800MHz条件下处理300s，再升高频率2000MHz条件下处理300s，再降低频率为450MHz条件下处理160s；
所述升高频率的速率为2MHz/s；
所述降低频率的速率为3.5MHz/s；
所述柠檬酸溶液的质量分数为60％；
所述含钾溶液为KCl；所述含钾溶液中钾的质量分数为9％。
实施例2
一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过50目筛；
S2脱脂：将牛骨置于鼠李糖乳杆菌活化液中，在20℃、100转/min的条件下摇床发酵培养10h，过滤，得牛骨粉；；
S3渗透：将牛骨粉置于容器中，用含柠檬酸的水蒸汽喷淋120s；所述含柠檬酸的水蒸汽中柠檬酸质量分数为10％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为300mL/s；
S4速冻：将经渗透处理的牛骨粉在零下30℃条件下进行冷冻1-3h；
S5解冻：将经速冻处理的牛骨粉置于2个大气压，121℃高温高压处理5min，再升至4个大气压处理10min；
S6微波处理：经发解冻后的牛骨粉转入微波仪器中，并向其中加入柠檬酸溶液调节pH为3，经微波处理、过滤后，取滤液加热浓缩，即得柠檬酸钙；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在30℃条件下活化1h后，得悬浮液；将悬浮液倒入含钾溶液静置处理10h，在45℃下热胁迫处理10-25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为1.7×107cfu/mL；所述悬浮液与含钾溶液的体积比为1：0.2；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨6g，酵母提取物2g，葡萄糖22g，乙酸钠1g，柠檬酸二铵3g，吐温80 1mL，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4·4H2O 0.03g，K2HPO4 2g，琼脂粉12g，水1100mL；
所述酵母提取物的制备方法为：
(1)将酵母乳与温度为75℃的热水按1：2的质量比混合搅拌20-25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至25℃，并将pH值调节到6.5，然后加入复合酶，进行水解反应8h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至75℃，灭活0.5h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述复合酶为胰蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺酶组成；
所述复合酶的加入量均以其占所述酵母乳中酵母总重量的千分数计算，所述胰蛋白酶的加入量为1‰，所述核酸酶的加入量为1‰，所述谷氨酰胺酶的加入量为10‰；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的用量为牛骨粉质量3倍；
所述微波处理是先在600MHz条件下处理200s，再升高频率1800MHz条件下处理200s，再降低频率为250MHz条件下处理100s；
所述升高频率的速率为1MHz/s；
所述降低频率的速率为2.5MHz/s；
所述柠檬酸溶液的质量分数为50％；
所述含钾溶液为硝酸钾；所述含钾溶液中钾的质量分数为5％。
实施例3
一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过70目筛；
S2脱脂：将牛骨置于鼠李糖乳杆菌活化液中，在25℃、150转/min的条件下摇床发酵培养15h，过滤，得牛骨粉；；
S3渗透：将牛骨粉置于容器中，用含柠檬酸的水蒸汽喷淋180s；所述含柠檬酸的水蒸汽中柠檬酸质量分数为15％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为350mL/s；
S4速冻：将经渗透处理的牛骨粉在零下20℃的条件下进行冷冻2h；
S5解冻：将经速冻处理的牛骨粉置于2个大气压，121℃高温高压处理5min，再升至4个大气压处理10min；
S6微波处理：经发解冻后的牛骨粉转入微波仪器中，并向其中加入柠檬酸溶液调节pH为4，经微波处理、过滤后，取滤液加热浓缩，即得柠檬酸钙；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在33℃条件下活化3h后，得悬浮液；将悬浮液倒入含钾溶液静置处理15h，在50℃下热胁迫处理18min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为2.7×107cfu/mL；所述悬浮液与含钾溶液的体积比为1：0.3；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨7g，酵母提取物3g，葡萄糖25g，乙酸钠2g，柠檬酸二铵4g，吐温80 2mL，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.03g，K2HPO4 3g，琼脂粉14g，水1200mL；
所述酵母提取物的制备方法为：
(1)将酵母乳与温度为80℃的热水按1：3的质量比混合搅拌23min；
(2)将步骤(1)所得物降温至30℃，并将pH值调节到6.8，然后加入复合酶，进行水解反应10h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至80℃，灭活1h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述复合酶为胰蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺酶组成；
所述复合酶的加入量均以其占所述酵母乳中酵母总重量的千分数计算，所述胰蛋白酶的加入量为2‰，所述核酸酶的加入量为2‰，所述谷氨酰胺酶的加入量为12‰；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的用量为牛骨粉质量5倍；
所述微波处理是先在700MHz条件下处理250s，再升高频率1900MHz条件下处理250s，再降低频率为3450MHz条件下处理130s；
所述升高频率的速率为1.5MHz/s；
所述降低频率的速率为3MHz/s；
所述柠檬酸溶液的质量分数为55％；
所述含钾溶液为磷酸钾；所述含钾溶液中钾的质量分数为7％。
实施例4
一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过80目筛；
S2脱脂：将牛骨置于鼠李糖乳杆菌活化液中，在35℃、100转/min的条件下摇床发酵培养10h，过滤，得牛骨粉；；
S3渗透：将牛骨粉置于容器中，用含柠檬酸的水蒸汽喷淋120s；所述含柠檬酸的水蒸汽中柠檬酸质量分数为20％；所述每100g牛骨粉的喷淋速率为400mL/s；
S4速冻：将经渗透处理的牛骨粉在零下25℃的条件下进行冷冻1.5h；
S5解冻：将经速冻处理的牛骨粉置于2个大气压，121℃高温高压处理5min，再升至4个大气压处理10min；
S6微波处理：经发解冻后的牛骨粉转入微波仪器中，并向其中加入柠檬酸溶液调节pH为4，经微波处理、过滤后，取滤液加热浓缩，即得柠檬酸钙；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在32℃条件下活化2h后，得悬浮液；将悬浮液倒入含钾溶液静置处理20h，在45℃下热胁迫处理10-25min；所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为3.5×107cfu/mL；所述悬浮液与含钾溶液的体积比为1：0.3；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨7g，酵母提取物3g，葡萄糖25g，乙酸钠2g，柠檬酸二铵4g，吐温80 2mL，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.03g，K2HPO4 3g，琼脂粉14g，水1200mL；
所述酵母提取物的制备方法为：
(1)将酵母乳与温度为79℃的热水按1：4的质量比混合搅拌25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至28℃，并将pH值调节到6.7，然后加入复合酶，进行水解反应10h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至85℃，灭活1h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述复合酶为胰蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺酶组成；
所述复合酶的加入量均以其占所述酵母乳中酵母总重量的千分数计算，所述胰蛋白酶的加入量为1‰，所述核酸酶的加入量为3‰，所述谷氨酰胺酶的加入量为11‰；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的用量为牛骨粉质量5倍；
所述微波处理是先在700MHz条件下处理250s，再升高频率1800MHz条件下处理300s，再降低频率为250MHz条件下处理160s；
所述升高频率的速率为2MHz/s；
所述降低频率的速率为2.5MHz/s；
所述柠檬酸溶液的质量分数为60％；
所述含钾溶液为KCl；所述含钾溶液中钾的质量分数为6％。
对比例1
与实施例3的区别在于：脱脂处理采用乙醇回流提取技术进行脱脂。
对比例2
与实施例3的区别在于：未经渗透处理。
对比例3
与实施例3的区别在于：未经解冻处理。
对比例4
与实施例3的区别在于：鼠李糖乳杆菌活化液的制备过程中未包括含钾溶液静置处理。
试验例1
钙溶出率测定
采用法EDTA滴定法(GB/T 5009.92—2003食品中钙的测定)测定钙含量X。
式中：T为EDTA滴定度(mg/ml)；V为滴定样品时所用EDTA的体积(ml)；V0为滴定空白时所用EDTA的体积(ml)；f为稀释倍数；m为样品的质量(g)
式中：X1为离子化骨矿物质干粉中的钙含量(mg/100g)；m1为离子化骨矿物质干粉的质量(g)；X0为牛骨中的钙含量(mg/100g)；m0为牛骨的质量(g)。
表1不同处理方法中钙溶出率
| 项目 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 钙溶出率(％) | 73.5 | 71.8 | 76.9 | 75.2 |
| 项目 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 |
| 钙溶出率(％) | 41.6 | 60.8 | 39.4 | 54.7 |
试验例2
柠檬酸钙的纯度和转化率的测定
采用减量法精确称量柠檬酸钙粉末质量m1，定容于100mL容量瓶，每次取20mL溶液于250mL锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，再用1mol/LNaOH溶液调pH至11-12，随后滴加钙指示剂摇匀。用EDTA标准液小心滴定样品溶液，至酒红色完全褪去，溶液呈纯蓝色，且30s不褪色为滴定终点，记录消耗EDTA标准液的体积V。同时以蒸馏水为空白对照，记录消耗EDTA标准液的毫升数记为V0；
柠檬酸钙纯度(％)＝100％×(V-V0)×CEDTA×V总×M/(m1×V滴)
其中：V，样品滴定时消耗EDTA-Na2体积，L；V0，空白对照消耗EDTA-Na2体积，L；CEDTA，EDTA-Na2溶液的浓度，mol/L；V总为柠檬酸钙溶液的总体积，L；V滴为参加滴定的柠檬酸钙溶液体积，L；M为柠檬酸钙的摩尔质量，g/mol；m1为柠檬酸钙粉末的质量，g。柠檬酸钙的转化率按照下式计算：
柠檬酸钙转化率(％)＝100％×m0×柠檬酸钙纯度/m
其中，m0为柠檬酸钙粗粉的质量，g；m为骨粉的质量，g；
表2不同处理方法中柠檬酸钙转化率
Claims (4)
1.一种牛骨源柠檬酸钙的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1破碎：将新鲜牛骨洗净后破碎至过50-80目筛；
S2脱脂：将牛骨置于鼠李糖乳杆菌活化液中，在20-35℃、100-200转/min的条件下摇床发酵培养10-20h，过滤，得牛骨粉；
S3渗透：将牛骨粉置于容器中，用含柠檬酸的水蒸汽喷淋120-240s；所述含柠檬酸的水蒸汽中柠檬酸质量分数为10-20％；每100g牛骨粉的喷淋速率为300-400mL/s；
S4速冻：将经渗透处理的牛骨粉在零下10℃至零下30℃的条件下进行冷冻1-3h；
S5解冻：将经速冻处理的牛骨粉置于2个大气压，121℃高温高压处理5min，再升至4个大气压处理10min；
S6微波处理：经发解冻后的牛骨粉转入微波仪器中，并向其中加入柠檬酸溶液调节pH为3-6，经微波处理、过滤后，取滤液加热浓缩，即得柠檬酸钙；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌冻干菌粉采用MRS液体培养基在30-35℃条件下活化1-4h后，得悬浮液；将悬浮液倒入含钾溶液静置处理10-20h，在45-55℃下热胁迫处理10-25min；
所述鼠李糖乳杆菌活化液总活菌数为(1.7-3.7)×107cfu/mL；所述悬浮液与含钾溶液的体积比为1：(0.2-0.4)；
所述MRS液体培养基配方为：蛋白胨6-8g，酵母提取物2-4g，葡萄糖22-27g，乙酸钠1-3g，柠檬酸二铵3-4g，吐温801-2mL，MgSO4·7H2O0.1-0.3g，MnSO4·4H2O0.03-0.04g，K2HPO42-4g，琼脂粉12-16g，水1100-1300mL；
所述酵母提取物的制备方法为：
(1)将酵母乳与温度为75-84℃的热水按1：(2-5)的质量比混合搅拌20-25min；
(2)将步骤(1)所得物降温至25-35℃，并将pH值调节到6.5-7.0，然后加入复合酶，进行水解反应8-12h；
(3)将步骤(2)得到的水解液加热至75-85℃，灭活0.5-2h，然后分离，分离后的液体经浓缩或喷雾干燥后即得所述酵母提取物；
所述复合酶为胰蛋白酶、核酸酶、谷氨酰胺酶组成；所述复合酶的加入量均以其占所述酵母乳中酵母总重量的千分数计算，所述胰蛋白酶的加入量为1-3‰，所述核酸酶的加入量为1-3‰，所述谷氨酰胺酶的加入量为10-15‰；
所述鼠李糖乳杆菌活化液的用量为牛骨粉质量3-7倍；
所述微波处理是先在600-800MHz条件下处理200-300s，再升高频率1800-2000MHz条件下处理200-300s，再降低频率为250-450MHz条件下处理100-160s；
所述含钾溶液为KCl、硝酸钾、磷酸钾中任意一种；所述含钾溶液中钾的质量分数为5-9％。
2.如权利要求1所述牛骨源柠檬酸钙的提取方法，其特征在于，所述升高频率的速率为1-2MHz/s。
3.如权利要求1所述牛骨源柠檬酸钙的提取方法，其特征在于，所述降低频率的速率为2.5-3.5MHz/s。
4.如权利要求1所述牛骨源柠檬酸钙的提取方法，其特征在于，所述柠檬酸溶液的质量分数为50-60％。
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