CN108220343A - 一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物发酵技术领域，为解决目前骨粉酶解液钙转化率低，多肽转化率低，利用度低的问题，提供一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法。碱性蛋白酶酶解羊骨酶解液，驯化好的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)加入到制备好的羊骨酶解液中发酵，植物乳杆菌接种量为羊骨酶解液体积的4.0%‑4.5%，控制发酵温度为37‑37.5℃，pH值为5‑5.5，发酵12‑14h，得高钙转化率和抗氧化性能的发酵液。促进骨钙的转化和胶原短肽的生成并显著提高其体外抗氧化能力，短肽和钙离子反过来促进植物乳杆菌的繁殖，增强其益生功能，乳酸菌产生的维生素、胞外多糖等物质使羊骨酶解液更富营养。

Description

一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法。

背景技术

骨粉中的钙以羟磷灰石晶体和无定型磷酸氢钙两种形式存在，蛋白质主要以三螺旋结构的骨胶原形式存在，二者很难被机体吸收和利用。骨胶原在蛋白酶作用下降解为肽和少量氨基酸的同时，骨矿中的钙也以离子形式释放。Ca²⁺是可被机体直接吸收的有效钙，作为二价矿物营养，参与体内神经传导、骨骼生长等许多重要生理过程，是维持机体全面健康的必需常量元素。经不同水解工艺制备的骨胶原肽，肠道对其的吸收率远远高于蛋白质，且具有促进脂质代谢、降低血液胆固醇浓度、促进机体免疫力等生理功能，还可促进机体对钙的吸收，所以酶解不仅使骨粉的生物利用度大大提高，还赋予了其某些生理功能。

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)属肠道正常菌群，具有安全性和多种益生特点，能通过胃并在消化道上皮细胞定殖，改善肠道环境，有利于肠道对营养物质的消化吸收，缓解因高脂饮食引起的肥胖症状，是泡菜中的优势乳酸菌，也是基因工程中常用的表达宿主细胞。目前国内外有关骨粉乳酸菌发酵的研究极少，对骨粉酶解液发酵的研究则更少。

前期研究发现，碱性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶是水解骨粉的最适的工具酶，且碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合水解效果最佳。

发明内容

本发明为了解决目前骨粉酶解液钙转化率低，多肽转化率低，利用度低的问题，提供了一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法。

本发明由如下技术方案实现的：一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法，碱性蛋白酶酶解制备羊骨酶解液，活化驯化好的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)加入到制备好的羊骨酶解液中发酵，植物乳杆菌的接种量为羊骨酶解液体积的4.0%-4.5%，控制发酵温度为37-37.5℃，pH值为5-5.5，发酵12-14h，获得高钙转化率和抗氧化性能的发酵液。

优选发酵条件为：所述植物乳杆菌的接种量为羊骨酶解液体积的4.23%，控制发酵温度为37.32℃，pH值为5.25，发酵时间为13.59h。

具体包括如下步骤：

（1）制备羊骨酶解液：取新鲜羊骨粉，酶解时骨粉的质量百分数为12%，碱性蛋白酶的添加量为羊骨粉重量的4.25%，用NaOH调节pH至9，45℃水解400min后添加羊骨粉重量3.65%的风味蛋白酶，用柠檬酸调节pH至6，55℃水解240min，121℃维持20min杀菌灭酶处理；

（2）驯化植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：步骤(1)制备的羊骨酶解液中添加羊骨酶解液体积1%的麦芽糖，然后在MRS肉汤培养基中添加羊骨酶解液，羊骨酶解液的体积比例按MRS肉汤培养基体积的10%的比例递增，至羊骨酶解液完全置换掉MRS肉汤培养基；移种驯化时，将植物乳杆菌以体积比为5%的接种量接入羊骨酶解液占比逐渐递增的新培养基中，37℃培养48h，至培养基浑浊时，进行移种，至植物乳杆菌在羊骨酶解液中生长良好为止；

（3）发酵：驯化后的菌种接种到添加有羊骨酶解液体积1%的麦芽糖的羊骨酶解液中，硅胶塞封口，以300 r/min的转速在摇床上发酵培养即可。

本发明所采用的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）分离自市售Lyocarni SHI-59发酵剂，经检测，其蛋白酶活力能够接近18U/ml，采用植物乳杆菌发酵含有麦芽糖的羊骨酶解液，所获得的发酵液中Ca²⁺含量为19.8 mg/mL，多肽生成总量达到112.8mg/g，短肽得率为92.0%，活菌数为94.6×10⁸ CFU•mL^-1。

通过发酵过程中各指标间相关性分析，说明酶解和发酵过程中释放的Ca²⁺和短肽可促进植物乳杆菌的生长繁殖，促进其分泌产生酸性蛋白酶和肽酶，反过来进一步促进Ca²⁺的释放和短肽的生成。相关性结果还表明，多肽含量与短肽得率呈负相关，此结果与羊骨粉酶解结果一致。本发明中多肽生产量与乳酸菌活菌数呈负相关，而短肽得率与活菌数呈正相关，充分说明真正促进乳酸菌生长的是短肽，短肽可作为植物乳杆菌的生长因子。另外乳酸菌产生的诱导酶将多肽水解为短肽的同时所产生的游离氨基酸，也可作为乳酸菌的生长因子，促进其生长繁殖。酶解和发酵处理可提高骨钙的生物利用度，对酶解液进行发酵可使其大幅提高。发酵还可使酶解液对DPPH·、·OH、O^2-·三种自由基的清除能力显著提高。

与现有技术相比，本发明以植物乳杆菌发酵羊骨酶解液，进一步促进骨钙的转化和胶原短肽的生成并显著提高其体外抗氧化能力，短肽和Ca²⁺反过来可促进植物乳杆菌的繁殖，增强其益生功能，乳酸菌产生的维生素、胞外多糖等物质使羊骨酶解液更富营养。

在骨粉酶解液中植物乳杆菌以肽类、氨基酸等为氮源进行生长繁殖，利用产生的蛋白酶和肽酶，将多肽进一步水解为短肽和氨基酸，同时分泌胞外多糖、多种维生素、有机酸、抑菌物质等多种代谢产物。肽链越短，免疫原性就越低，越不容易引发超敏反应，经口摄入就越安全，且大多生理功能强的活性肽均为短肽，因此羊骨酶解液经过植物乳杆菌发酵，营养将更丰富和全面，功能性将更强，并且还具有了一定数量的益生菌，骨腥味也可得到部分掩蔽。

本发明以筛选出的产蛋白酶能力最强的植物乳杆菌对羊骨的上述复合酶解液进行发酵，以游离钙离子为指标，优化发酵工艺，并与羊骨酶解液比较，考察发酵对多肽总量、短肽得率、羟脯氨酸含量及体外抗氧化活性的影响，为禽畜骨的高值利用和新产品开发提供新思路和方法参考，将带来可观的社会效益和经济收益，并可促进养殖产业链的延伸。

附图说明

图1为植物乳杆菌发酵条件的单因素实验结果，图中左上图为接种比例不同对产酶活性的影响，右上图为发酵温度对产酶活性的影响,左下图为发酵pH值对产酶活性的影响，右下图为发酵时间对产酶活性的影响，中间底部图为不同碳源对产酶活性的影响；图2为乳酸菌各菌株产蛋白酶能力比较图；图3为植物乳杆菌发酵对羊骨酶解液各指标的影响结果图，注：A、B、C、D、E分别代表Ca²⁺含量、水解度、多肽生成量、短肽得率和羟脯氨酸含量。**表示差异极显著（P<0.01)，*表示差异显著（P<0.05)；图4为植物乳杆菌发酵对羊骨酶解液体外抗氧化活性的影响结果图。

具体实施方式

实验例1：高产蛋白酶活性菌株的筛选

1.乳酸菌菌株及试剂：瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和副干酪乳杆菌副干酪亚种（Lactobacillus paracasei subsp.paracasei）购于中科院微生物菌种保藏中心；清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）分离自Lyocarni BOM-13发酵剂；弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）分离自Lyocarni VBL-97发酵剂；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）分离自Lyocarni SHI-59发酵剂；乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）分离自Lyocarni VBM-60发酵剂。

碱性蛋白酶（Activity≥200 000 U/g）和风味蛋白酶（Activity≥20 U/mg）为Solarbio产品；1,1-二苯基-2-苦基苯基 (DPPH)为Sigma公司产品；无水乙醇、福林酚等其他化学试剂均为国产分析纯。

2.主要仪器及设备：722可见光分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)、PHS-3C 型精密pH 计(上海雷磁分析仪器厂)、HF160W Heal Force 二氧化碳培养箱(香港力康生物医疗科技控股集团)、Lambda 850紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司）等。

3.实验方法：各菌株产蛋白酶培养条件的确定及产蛋白酶能力比较

A、各菌株产蛋白酶培养条件的确定：将乳酸菌各菌株在MRS培养基中活化并培养至对数生长期，以此作为菌种，考察培养温度（30、35、37、40、42、45℃）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、培养基起始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、不同碳源（1%葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉）、培养时间（12、18、24、30、36、42h）对各菌株产蛋白酶能力的影响，从而确定各菌株产蛋白酶的较适条件。

B、产蛋白酶能力的比较：将各菌株对数生长期菌悬液的OD₆₀₀值调节成等值，并以体积比3%的接种量接种于MRS培养基，在各自最适产蛋白酶条件下培养，收集培养液，8400r/min，4℃，离心15min后收集上清液（粗酶液）测定蛋白酶活力并进行比较。

蛋白酶活力测定：取50ul浓度为1%（w/v） 牛血清蛋白（BSA），待测样品 450ul，与浓度为0.1mol/L，pH7.0的 1.5ml乙酸钠缓冲液混合，37℃孵育5min，以0.5mL 10%的三氯乙酸终止反应，280nm处测定吸光值。37℃每分钟水解牛血清蛋白产生1μmoL色氨酸所需酶量即为一个酶活单位。酶活（U/mL）=（K×w）/（v×T），公式中K为样品稀释倍数；W为生成的色氨酸量（umoL）；v为反应液体积（mL）；T为反应时间（min）。

4.实验结果：图1为植物乳杆菌单因素实验结果，由图1可知，随着发酵条件的不断优化，植物乳杆菌（L.plantarum）所产蛋白酶的活性越来越高，从而确定其较适的产酶条件，见表1。用确定植物乳杆菌产酶较适条件的方法确定其他乳酸菌的较适产酶条件。接种量相同，在确定的其他较适培养条件下培养，经测定各菌株蛋白酶活力存在显著差异，如图2所示，植物乳杆菌蛋白酶活力最高，戊糖片球菌和瑞士乳杆菌次之。

表1：产蛋白酶菌株的较适培养条件

实验例2：植物乳杆菌发酵条件的响应面优化分析

以新鲜羊骨为原料制备羊骨粉，酶解时骨粉的质量百分数为12%，碱性蛋白酶的添加量为4.25%，调节pH至9，45℃水解400min后添加3.65%的风味蛋白酶，调节pH至6，55℃水解240min后杀菌灭酶处理。

将羊骨酶解液中添加1%麦芽糖，逐步增加MRS肉汤培养基中羊骨酶解液的比例（10%、20%、30%~100%），对植物乳杆菌进行移种驯化处理。将驯化后的菌种以一定体积接种到添加1%麦芽糖的羊骨酶解液中，按响应面试验设计进行实验，硅胶塞封口，在摇床上进行培养。

运用Diesign-Expert.V 8.0.61软件的Box-Behnken Design中心组合设计，设计4因素3水平响应面试验，设计方案见表2，表中X₁为培养温度（℃），-1、0、1三水平分别为30℃、37℃和45℃；X₂为pH_，三水平分别为4、5、6；X₃为培养时间（h）,三水平分别为（10h、12h、15h）； X4为接种量，三水平分别为（3%、4%、5%）。以发酵液中的Ca²⁺含量为响应值，在Diesign-Expert. V8.0.61 软件中使用编码单位对试验数据进行多元回归拟合，建立模型，并对模型进行显著性检验。

表2：植物乳杆菌发酵羊骨酶解液的4因素3水平及Box-Behnken 设计方案

统计分析：对响应面试验29组试验结果中的各指标（多肽生成量、短肽得率、Ca²⁺含量、活菌数）采用IBM SPSS statistics v21.0软件进行相关性分析。应用Prism、Statistix8.1 软件对水解指标和抗氧化指标数据进行方差分析，P<0.01差异极显著，P<0.05差异显著。

水解指标测定：

多肽生成总量的测定：多肽是指分子量小于10KD以及不被10%三氯乙酸（TCA）沉淀的肽类物，其数值为羊骨酶解发酵液中TCA可溶性总氮（N_TAC）与氨基酸态氮（N_AA）的mg数之差与6.25的乘积。N_TAC测定时将发酵液与浓度为10%的TCA等体积混合，5000r/ min离心15min，取上清液按照福林-酚法测定，N_AA用中性甲醛滴定法测定。

短肽得率的测定：短肽不被15%的TCA沉淀，酶解液或发酵液样品的处理同上，最后上清液采用福林-酚法测定，其数值（%）为在15%TCA中可溶性氮含量与样品中的总氮（凯氏定氮法测定）含量的比值乘以100%。

水解度和钙离子含量分别用甲醛滴定法和EDTA络合法测定^[15]。羟脯胺酸（Hyp）含量根据文献《GB/T 9695.23-2008/ISO 3496:1994. Determination of hydroxyprolinecontent of meat and meat products[S].Beijing, Standards Press of China,2008.》中的方法测定。

体外抗氧化活性的测定：将发酵上清液与 DPPH溶液（0.1moL•L^-1）等体积混合，室温避光反应30min，517nm测定吸光值A₁，空白组以等体积95%乙醇代替，记为A₂；对照组以等体积去离子水代替，记作A₀。DPPH清除率=[1-（A₁-A₂）/A₀]×100%。发酵液对羟自由基（•OH）和超氧阴离子（O₂ ^-•）的清除能力的测定同文献《许女, 张天震, 陈旭峰, 等. 鸡腿菇子实体多糖的分离纯化、理化性质及抗氧化活性. 生物工程学报, 2017, 33(5): 808-816.》和《傅鑫森,李秀华,王凯,霍乃蕊. 高短肽得率羊骨酶解物的制备及其体外抗氧化活性. 山西农业科学,2017,45(07):1157-1161.》。

乳酸菌活菌计数：测发酵液的OD600值，估计其中的菌体数量，选择适宜稀释度涂MRS平板，进行活菌计数。

实验结果：响应面试验设计及结果如表3所示，利用 Design-Expert 软件，以Ca²⁺含量为指标，对表3中的数据进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型：Y（Ca²⁺）=2179+108.50X1-1.33X₂+3.75X₃-6.58X₄-238.88X₁ ²-222.13X₂ ²-79.76X₃ ²-106.26X₄ ²-68.5X₁X₂+2.5X₁X₃-42.5X₁X₄+50.25X₂X₃+75.75X₂X₄+36X₃X₄。

表3：植物乳杆菌发酵羊骨酶解液的响应面试验结果

方差分析结果见表4，结果表明，所建立的模型达到显著水平（P<0.05），且失拟项不显著（P>0.05），说明可用此模型来分析和预测植物乳杆菌发酵羊骨酶解液中的钙离子释放情况。并且可知工艺参数中温度的线性效应、交互项X₁X₄和X₂X₃对Ca²⁺浓度的影响显著（P<0.05）。R ² =0.9539，表明方程可充分拟合实验数据。CV=1.16，较低，说明实验操作可信，精确度高。

表4：植物乳杆菌发酵条件回归方程的方差分析结果

通过Design-Expert 软件，求出发酵的最佳工艺参数为：温度37.32℃ 、pH5.25、时间13.59 h、接种量4.23 %，预测的发酵液中游离Ca²⁺含量为21.7 mg/mL。验证实验调整温度为37℃ 、起始pH5.5、发酵14h、4%接种量，实际Ca²⁺含量为19.8 mg/mL，比较接近预测值，说明采用响应面法优化得到的工艺参数比较可靠，具有一定的实用价值。经测定，优化工艺下发酵液中的多肽生成总量为112.8 mg/g、短肽得率为92.0%、活菌数为94.6×10⁸ CFU•mL^-1。

发酵过程中各指标间相关性分析结果：

羊骨酶解液植物乳杆菌发酵过程中各指标相关性分析结果见表5，由表5可知，发酵液中的活菌数与Ca²⁺含量和短肽得率呈极显著正相关（P<0.01),说明酶解和发酵过程中释放的Ca²⁺和短肽可促进植物乳杆菌的生长繁殖，促进其分泌产生酸性蛋白酶和肽酶反过来进一步促进Ca²⁺的释放和短肽的生成。相关性结果还表明，多肽含量与短肽得率呈负相关，此结果与文献《甄守艳.羊骨胶原肽的酶法制备及肽钙螯合研究[D].山西农业大学,2015.》中的羊骨粉酶解结果一致。本发明中多肽生产量与乳酸菌活菌数呈负相关，而短肽得率与活菌数呈正相关，充分说明真正促进乳酸菌生长的是短肽，短肽可作为植物乳杆菌的生长因子。另外乳酸菌产生的诱导酶将多肽水解为短肽的同时所产生的游离氨基酸，也可作为乳酸菌的生长因子，促进其生长繁殖。

表5：羊骨酶解液植物乳杆菌发酵过程中各指标相关性分析（n=29）

	多肽生成量	短肽得率	钙离子含量	活菌数
					多肽生成量	1	-0.013	0.07	-0.048
短肽得率		1	0.297	0.655**
					钙离子含量			1	0.495**
活菌数				1

注：**表示在0.01水平显著相关

发酵前后各指标对比：植物乳杆菌发酵对羊骨酶解液各指标的影响结果见图3，由图可知发酵使羊骨酶解液的水解度和Ca²⁺浓度显著增加（P<0.01，P<0.05)。需要指出的是骨胶原在水解过程中可形成一些能与矿物离子或金属螯合的肽，面扫描分析结果表明这些肽与溶出的Ca²⁺确实形成了螯合钙，所以在酶解过程中实际释放的Ca²⁺要大于实测值。和在乳中的存在形式一样，钙在骨粉酶解液或发酵液中也以螯合钙和游离钙两种形式存在，所以酶解和发酵处理可提高骨钙的生物利用度，对酶解液进行发酵则可使其大幅提高。

羟脯氨酸是骨胶原蛋白的特征性氨基酸，其含量在发酵液上清液中极显著增加（P<0.01)，说明植物乳杆菌所产生的蛋白酶和肽酶的作用位点和方式（内切或外切）不同于碱性蛋白酶和风味蛋白酶，也进一步解释了发酵使水解度和短肽得率增加的原因。短肽得率极显著增加（P<0.01)，短肽由多肽降解而来，而发酵液中的多肽总量却没有显著变化（P >0.05)，说明酶解还不彻底，发酵可使更多的羊骨胶原转化为肽，从而有利于骨粉的高效转化和充分利用。

发酵前后体外抗氧化活性比较：自由基非常活跃，几乎可与所有细胞成分反应，并对细胞的功能特性和形态学产生扰动，其中氧自由基是人类许多疾病和衰老过程的重要病理介质。对酶解液和酶解+发酵液的体外抗氧化活性进行测定，结果见图4，结果表明，酶解+发酵液对三种氧自由基的清除能力显著高于酶解液，特别是对·OH的清除能力极显著提高。这种抗氧化能力的显著提高可能是由乳酸菌的代谢产物、抗氧化肽和具有抗氧化作用的游离氨基酸导致。另乳酸菌分泌的胞外多糖能够增加发酵液的粘度，改善羊骨酶解-发酵液的风味和口感，植物乳杆菌及其产生的其他代谢产物也可有效抑制有害微生物的生长繁殖，从而有望延长发酵液及相关制品的保藏时间等。

本发明从分离自发酵菌剂的7株乳酸菌中筛选出了产蛋白酶能力最强的植物乳杆菌。对其进行驯化，以释放的Ca²⁺浓度为指标，通过响应面法确定了其发酵羊骨酶解液的工艺。发酵过程中，活菌数与Ca²⁺含量和短肽得率呈极显著正相关。发酵可使原酶解液中的多肽进一步水解为短肽，并释放更多的游离Ca²⁺ 和羟脯氨酸含量，发酵还可使酶解液对DPPH·、·OH、O^2-·三种自由基的清除能力显著提高。综上所述，以植物乳杆菌发酵羊骨酶解液可进一步促进骨钙的转化和胶原短肽的生成并显著提高其体外抗氧化能力，短肽和Ca²⁺反过来可促进植物乳杆菌的繁殖，增强其益生功能，乳酸菌产生的维生素、胞外多糖等物质使羊骨酶解液更富营养。

在骨粉酶解液中植物乳杆菌以肽类、氨基酸等为氮源进行生长繁殖，利用产生的蛋白酶和肽酶，将多肽进一步水解为短肽和氨基酸，同时分泌胞外多糖、多种维生素、有机酸、抑菌物质等多种代谢产物。肽链越短，免疫原性就越低，越不容易引发超敏反应，经口摄入就越安全，且大多生理功能强的活性肽均为短肽，所以羊骨酶解液经过植物乳杆菌发酵，营养将更丰富和全面，功能性将更强，并且还具有了一定数量的益生菌，骨腥味也可得到部分掩蔽。

本发明以筛选出的产蛋白酶能力最强的植物乳杆菌对羊骨的上述复合酶解液进行发酵，以游离钙离子为指标，优化发酵工艺，并与羊骨酶解液比较，考察发酵对多肽总量、短肽得率、羟脯氨酸含量及体外抗氧化活性的影响，为禽畜骨的高值利用和新产品开发提供新思路和方法参考，将带来可观的社会效益和经济收益，并可促进养殖产业链的延伸。

Claims (3)

1.一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法，其特征在于：碱性蛋白酶酶解制备羊骨酶解液，活化驯化好的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)加入到制备好的羊骨酶解液中发酵，植物乳杆菌的接种量为羊骨酶解液体积的4.0%-4.5%，控制发酵温度为37-37.5℃，pH值为5-5.5，发酵12-14h，获得高钙转化率和抗氧化性能的发酵液。

2.根据权利要求1所述的一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法，其特征在于：所述植物乳杆菌的接种量为羊骨酶解液体积的4.23%，控制发酵温度为37.32℃，pH值为5.25，发酵时间为13.59h。

3.根据权利要求1或2所述的一种提高羊骨粉酶解液中钙转化率和抗氧化性能的发酵方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

（1）制备羊骨酶解液：取新鲜羊骨粉，酶解时骨粉的质量百分数为12%，碱性蛋白酶的添加量为羊骨粉重量的4.25%，用NaOH调节pH至9，45℃水解400min后添加羊骨粉重量3.65%的风味蛋白酶，用柠檬酸调节pH至6，55℃水解240min，121℃维持20min杀菌灭酶处理；

（2）驯化植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：步骤(1)制备的羊骨酶解液中添加羊骨酶解液体积1%的麦芽糖，然后在MRS肉汤培养基中添加羊骨酶解液，羊骨酶解液的体积比例按MRS肉汤培养基体积的10%的比例递增，至羊骨酶解液完全置换掉MRS肉汤培养基；移种驯化时，将植物乳杆菌以体积比为5%的接种量接入羊骨酶解液占比逐渐递增的新培养基中，37℃培养48h，至培养基浑浊时，进行移种，至植物乳杆菌在羊骨酶解液中生长良好为止；

（3）发酵：发酵：驯化后的菌种接种到添加有羊骨酶解液体积1%的麦芽糖的羊骨酶解液中，硅胶塞封口，以300 r/min的转速在摇床上发酵培养即可。