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CN110603319A - 细胞微区室和制备方法 - Google Patents

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CN110603319A
CN110603319A CN201780071921.9A CN201780071921A CN110603319A CN 110603319 A CN110603319 A CN 110603319A CN 201780071921 A CN201780071921 A CN 201780071921A CN 110603319 A CN110603319 A CN 110603319A
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马克西姆·法耶尤科斯
凯文·亚历山德里
皮埃尔·纳索伊
劳伦特·可格纳特
格雷·雷希尔
艾万·贝扎尔德
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Institute Of Theory And Applied Optics
Universite de Bordeaux
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FRENCH NATIONAL CENTRE FOR SCIENTIFIC RESEARCH
Institute Of Theory And Applied Optics
Universite de Bordeaux
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Abstract

本发明涉及一种细胞微区室，其依次包含被组织在腔周围的：至少一层多能细胞，细胞外基质层，和水凝胶外层。本发明还涉及用于制备这样的细胞微区室的方法。

Description

细胞微区室和制备方法
本发明涉及一种允许维持人类细胞多能性的细胞微区室。本发明还涉及一种用于获得这样的三维(3D)细胞培养区室的制备方法。
多能细胞被认为是重要的人类细胞资源，并且它们的培养日益受到关注，特别是在医学和制药领域。因此，大量生产多能细胞将满足制药工业所表达的新需求，这减少了动物模型的使用，有利于比目前使用的许多细胞系更相关的细胞模型。由制药公司开发的高通量试验已经使用大量的人类多能细胞。类似地，人类的组织工程和细胞疗法依赖于工业量的人类多能细胞的可用性。
目前，人类多能细胞通常在二维(2D)环境中、例如在陪替氏培养皿上培养，与细胞正常演化的3D介质非常不同。这些2D培养细胞的操纵通常是精细的，并且特别需要纯化、酶促脱离等步骤。此外，这些细胞难以储存并且冷冻后的存活率非常低。然而，使用常规运载工具发送大量冷冻的并与液体培养相容的多能细胞培养物的能力代表了对研究实验室和制药工业的主要挑战。
响应于这种情况，已经开发了三维培养系统，其特别致力于增加人类多能干细胞培养系统的通量、效率和质量。
然而，现有的3D培养系统并不完全令人满意。经常观察到不受控制的融合现象，产生细胞聚集体，所述细胞聚集体的大小(直径>200μm)使得培养基的扩散不充分。因此，在这样的3D培养系统内，难以控制细胞分化和/或细胞死亡率很高。通常，源自于3D细胞培养的产物缺乏同质性和这种技术的成本使得该技术与2D培养相比没有竞争力，然而2D培养并不令人满意。
因此需要一种3D细胞培养系统，其能够提供具有受控表型的大量多能细胞，所述细胞可容易地用于基础研究和工业上。
发明内容
在开发用于3D细胞培养的细胞微区室的同时，本发明人开发了一种系统，其允许人类多能细胞的大量液体悬浮培养，同时维持所述细胞的表型。开发的微区室允许利用2D培养中常规使用的培养基在液体培养基中培养细胞，同时保护细胞并控制它们的表型以避免野生型分化并维持多能性。更确切地说，由本发明人开发的微区室或囊依次包含以基本上同心的方式组织的水凝胶壳、细胞外基质层、和一层或多层围绕中央腔的人类多能细胞。与现有培养系统不同，本发明的囊的水凝胶壳保护细胞免受与液体悬浮培养期间的碰撞或融合相关的机械应力。特别有利地，本发明的微区室的“包囊”中的组织化允许它们以高细胞存活率冷冻。此外，细胞可以在使用前直接在所述微区室内分化，或在多能性阶段用于3D和2D培养。本发明人还开发了用于制备这样的细胞微区室的方法，保证获得并维持所述包囊形式，其既适用于冷冻它们所含的细胞又适用于控制所述细胞的表型。
因此，本发明的主题是一种细胞微区室，其依次包含被组织在腔周围的：
-至少一层人类多能细胞；
-细胞外基质层；
-水凝胶外层。
有利地，培养基填充所述层之间留下的空间。
本发明的另一个主题是一种用于制备本发明的细胞微区室的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中温育人类多能干细胞；
(b)将来自步骤(a)的多能干细胞与细胞外基质混合；
(c)将来自步骤(b)的混合物囊封在水凝胶层中；
(d)将步骤(c)中获得的囊在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养；
(e)清洗来自步骤(d)的囊以除去所述RHO/ROCK途径抑制剂；
(f)将来自步骤(e)的囊在不含RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养3至20天，优选5至10天，并任选回收所获得的细胞微区室。
本发明的另一个主题是一种用于制备本发明的细胞微区室的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将人类分化细胞与细胞外基质和细胞重编程试剂混合；
(b)将来自步骤(a)的混合物囊封在水凝胶层中；
(c)将来自步骤(b)的囊培养10至40天，并任选回收所获得的细胞微区室。
附图说明
图1：本发明的形成包囊的细胞微区室的照片(A)和示意图(B)(1：水凝胶层；2：细胞外基质层；3：多能细胞层；4：腔)。
具体实施方式
本发明的主题是包含人类多能细胞的3D细胞微区室，其中维持所述细胞的多能性。
细胞微区室
本发明的细胞微区室形成包囊，所述包囊的中空中心或腔优选是含水的。在本发明的上下文中，“包囊”是指含有基本上同心的层的封闭中空结构，在所述层被依次组织在同一点周围的意义上，所述外层包封所述基质层，所述基质层包封所述细胞层，所述细胞层围绕所述腔。通常，构成所述包囊的多能细胞是极化的。所述包囊内这些细胞的极性可以通过TJP-1或ZO-1蛋白来检测，这两种蛋白都位于与所述腔相邻的多能细胞层的内/顶侧。
在包囊形成时，由在所述细胞外基质层上增殖和发育的细胞产生所述腔。有利地，所述腔含有液体，更特别是培养基。
在本发明的上下文中，“水凝胶层”是指由被液体、优选水溶胀的聚合物链的基质形成的三维结构。有利地，所使用的水凝胶在它对细胞无毒的意义上是生物相容的。此外，所述水凝胶层必须允许氧和营养物的扩散以供养所述微区室中含有的细胞并使它们存活。例如，所述水凝胶外层含有藻酸盐。优选地，所述外层只含有藻酸盐。在本发明的上下文中，“藻酸盐”是指由β–D–甘露糖醛酸(M)和α–L–古洛糖醛酸(G)、其盐和衍生物形成的线性多糖。有利地，所述藻酸盐是由大于80％G和小于20％M组成、平均分子量为100至400KDa(例如，SLG100)并且总浓度在0.5质量％和5质量％之间的藻酸钠。根据本发明，所述水凝胶层不含细胞。在本发明的细胞微区室的一个实施方式中，所述外层包含藻酸盐。
反过来，所述细胞外基质层可以含有少量细胞。实际上，在包囊形成时，细胞在所述基质中建立它们的空间并增殖，填充所述微区室。因此，所述细胞外基质层和所述多能细胞层之间的边界可能不是非常清楚。因此，在与细胞层接触的表面处，所述细胞外基质可含有一些多能细胞。相反，与所述水凝胶层接触的所述细胞外基质层的表面是不含细胞的。
所述细胞外基质层对于所述微区室中多能细胞的存活和对于包囊的建立是必需的。
优选地，所述细胞外基质层在所述水凝胶层的内侧上形成凝胶，所述内侧意指朝向微区室的腔的一侧。所述细胞外基质层包含细胞培养、更特别是多能细胞的培养所必需的蛋白和细胞外化合物的混合物。优选地，所述细胞外基质包含结构蛋白，例如含有α1、α4或α5亚基、β1或β2亚基、和γ1或γ3亚基的层粘连蛋白，巢蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，胶原蛋白，以及生长因子例如TGF-β和/或EGF。在一个实施方式中，所述细胞外基质层由和/或组成或者含有和/或
根据本发明，所述细胞微区室含有一层或多层人类多能干细胞。多能干细胞或多能细胞是能够形成整个原始生物体中存在的所有组织但不能形成整个生物体本身的细胞。
在一个特定实施方式中，所囊封的细胞是多能干细胞，例如诱导性多能干(IPS)细胞、在成年哺乳动物的皮肤和骨髓中发现的多系分化应激耐受(MUSE)细胞、或胚胎干(ES)细胞。
在本发明的上下文中，“诱导性多能干细胞”(IPS细胞)被定义为通过分化的体细胞的遗传重编程获得并具有与胚胎干细胞部分相似的形态以及自我更新和多能性潜力的多能干细胞。这些细胞尤其对多能性标志物例如碱性磷酸酶染色以及NANOG、SOX2、OCT4和SSEA3/4蛋白的表达来说呈阳性。获得诱导性多能干细胞的方法是本领域技术人员公知的，并尤其被描述在Yu等人(Science，2007，318(5858)：1917–1920)、Takahashi等人(Cell，2007，131(5)：861–872)和Nakagawa等人(Nat Biotechnol，2008，26(1)：101–106)的文章中。
在胚胎干细胞的情况下，所述多能干细胞是源自于胚囊内部细胞团并且能够导致形成生物体的所有组织的细胞。胚胎干细胞的多能性可以通过标志物例如转录因子OCT4和NANOG以及表面标志物例如SSEA3/4、Tra–1–60和Tra–1–81的存在来评定。胚胎干细胞可以在不破坏它们来源的胚胎的情况下获得，例如通过使用Chung等人(Cell Stem Cell，2008，2(2)：113–117)描述的技术来获得。在一个特定实施方式中，并且出于法律或伦理原因，干细胞被定义为排除人类胚胎干细胞。
在一个实施方式中，用于本发明的微区室的人类多能干细胞是从体细胞诱导成多能性的。
有利地，所述细胞层含有至少95体积％、优选至少96％、97％、98％、99％的细胞和由所述细胞产生的基质。细胞基本上是多能细胞。“基本上”意指所述细胞层中含有的至少90％的细胞是多能细胞，优选至少95％、96％、97％、98％、99％、100％是多能细胞。
有利地，所述包囊的腔含有培养基。特别地，可以使用允许悬浮培养多能细胞的任何培养基，特别是2D培养中常规使用的任何培养基。
优选地，所述细胞微区室是封闭的。所述水凝胶外层为所述细胞微区室提供了大小和形状。所述微区室可具有与细胞囊封相容的任何形状。
有利地，所述细胞微区室的尺寸是受控的。在一个实施方式中，本发明的细胞微区室具有球形形状。优选地，这样的微区室的直径在10μm和1mm之间，更优选在50μm和500μm之间，甚至更优选小于500μm，优选小于400μm。
在另一个实施方式中，本发明的细胞微区室具有细长的形状。特别地，所述微区室可具有卵形或管状形状。有利地，这样的卵形或管状微区室的最小尺寸在10μm和1mm之间，更优选在50μm和500μm之间，甚至更优选小于500μm，优选小于400μm。“最小尺寸”是指所述水凝胶层外表面上的点与所述微区室中心之间的最短距离的两倍。
在一个特定实施方式中，所述水凝胶外层的厚度占所述微区室的半径的5至40％。所述细胞外基质层的厚度占所述微区室的半径的5至80％，并有利地附着于所述水凝胶壳的内侧。所述多能细胞层的厚度占所述微区室的半径的约10％。所述多能细胞层至少在一点处与所述细胞外基质层接触，在所述基质层和所述包囊之间可以存在填充有培养基的空间。于是，腔占所述微区室的半径的5至30％。在本发明的上下文中，层的“厚度”是所述层相对于所述微区室的中心径向延伸的尺寸。
在一个特定实例中，所述细胞微区室具有半径为100μm的球形形状。所述水凝胶层的厚度为5μm至40μm。所述细胞外基质层的厚度为5μm至约80μm。大致地，所述多能细胞层的厚度为10至30μm，腔的半径为5至30μm。
一般而言，所述水凝胶外层的存在对细胞层施加了最大尺寸并通过界限限制了细胞的不受控制的增殖，而不受控制的增殖可能导致细胞的缺氧性死亡和/或最深层中的细胞不受控制的分化，所述最深层意指最接近于包囊的腔的层。在陪替氏培养皿上的2D中，集落是圆盘，圆盘中心处的细胞趋向于死亡(由分裂产生的每个新细胞由于缺乏空间而被逐出集落)或者在围绕它们的细胞的约束下分化，在边缘上的细胞趋向于分化并且只有在正确距离处的条带具有最佳表型。在此介绍的微区室的拓扑结构，即由所述囊形成的球体的内表面，使得可以产生“没有边缘”的干细胞的“集落”(多能细胞层)，其中对于小分子的扩散和在机械应力方面这二者而言，所有细胞都被最佳地和相等地定位。有利地，所述微区室中的细胞密度在1个细胞/微区室至数千个细胞/微区室之间，优选在50个细胞/100μm半径微区室至1000个细胞/100μm半径微区室之间。
用于制备细胞微区室的方法
本发明还涉及用于制备细胞微区室的方法，所述方法使得可以获得本发明的细胞微区室。更具体地，本发明提出了产生含有多能干细胞的细胞微区室，其直接由多能干细胞或由将在微区室形成期间在所述水凝胶囊内被重编程为多能细胞的分化细胞组织成包囊。
用于产生在水凝胶囊内含有细胞外基质和多能干细胞的细胞微区室的任何方法可用于实施本发明的制备方法。特别地，可以通过调整Alessandri等人，2016(“用于产生培养和分化人类神经干细胞(hNSC)的功能化水凝胶微囊的3D打印微流体装置(A 3D printedmicrofluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsulesfor culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells(hNSC))”，Lab on aChip，2016，第16卷，第9号，1593–1604页)中描述的微流体方法和装置，按照下述步骤来制备微区室。
在第一实施方式中，本发明的制备方法包括以下步骤：
(a)在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中温育人类多能干细胞；
(b)将来自步骤(a)的多能干细胞与细胞外基质混合；
(c)将来自步骤(b)的混合物囊封在水凝胶层中；
(d)将步骤(c)中获得的囊在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养；
(e)清洗来自步骤(d)的囊以除去所述RHO/ROCK途径抑制剂；
(f)将来自步骤(e)的囊培养3至20天，优选5至10天，直至获得包囊，并任选回收所获得的细胞微区室。
在含有一种或多种RHO/ROCK(“Rho相关蛋白激酶”)途径抑制剂例如thiazovivin(C15H13N5OS)和/或Y-27632(C14H21N3O)的培养基中的温育步骤(a)和培养步骤(d)，促进了多能干细胞的存活和当在所述细胞外基质周围形成所述水凝胶外层时细胞附着到所述细胞外基质上。然而，希望这些步骤在时间上受到限制，使得RHO/ROCK途径抑制剂不阻止包囊的形成。
因此，优选地，步骤(a)的温育进行几分钟至几小时，优选2分钟至2小时，更优选10分钟至1小时的时间。
类似地，优选地，培养步骤(d)进行2至48小时的时间，优选6至24小时的时间，更优选12至18小时的时间。
步骤(e)是确保除去所有痕量的RHO/ROCK途径抑制剂所必需的。步骤(e)例如通过在不含RHO/ROCK途径抑制剂的连续培养基中清洗、优选几次清洗来进行。
有利地，步骤(f)进行足够的时间以获得其中多能细胞层和腔的累计厚度等于微区室半径的10至95％的细胞微区室，也就是说，进行足够的时间以允许从两个细胞传代到约一千个细胞。可以使用适合于多能干细胞培养的任何培养基，特别是盐水磷酸盐缓冲液，例如Roswell Park Memorial Institute培养基。
在一个实施方式中，本发明的方法包括中间步骤(a')：优选借助于无酶试剂，在步骤(b)之前解离来自步骤(a)的多能干细胞。有利地，在所述囊封步骤之前抑制或清洗所述试剂，特别是通过在特定的多能细胞培养基中连续清洗。例如，使用的试剂是含有EDTA或EGTA的等渗缓冲液，例如当然，也可以使用胰蛋白酶或含酶试剂，但与使用无酶试剂相比，则该步骤结束时多能细胞的存活率可能较低。在所有情况下，所述清洗步骤是除去任何痕量的用于细胞解离的试剂所必需的。
在一个实施方式中，步骤(a′)、(b)、(c)、(d)或(e)中的至少一个，优选所有步骤(a′)、(b)、(c)、(d)和(e)在0至8℃的温度下进行。维持基本上等于4℃的温度允许细胞的生物学过程变得休眠，包括来自外部环境的信号的转导。这使得可以限制因细胞脱离可能引起的细胞死亡现象。
在另一个实施方式中，本发明的细胞微区室的制备方法包括以下步骤：
(a)将分化的人类细胞与细胞外基质和不渗透所述水凝胶层的细胞重编程试剂混合；
(b)将来自步骤(a)的混合物囊封在水凝胶层中；
(c)将来自步骤(b)的囊培养10至40天，并任选回收所获得的细胞微区室。
在另一个实施方式中，本发明的细胞微区室的制备方法包括以下步骤：
(a)将分化的人类细胞与细胞外基质混合；
(b)将来自步骤(a)的混合物囊封在水凝胶层中；
(c)将来自步骤(b)的囊与渗透水凝胶层的细胞重编程试剂一起温育，并将所述囊培养10至40天，并任选地回收所获得的细胞微区室。
例如，使用的分化细胞是成纤维细胞。
技术人员知道如何通过借助于特定因子(在本发明中称为“重编程试剂”)重新激活与胚胎期相关的基因的表达而将分化细胞重编程为干细胞。实例包括以下文献中描述的方法：Takahashi等人，2006(“通过限定的因子从小鼠胚胎和成体成纤维细胞培养物诱导多能干细胞(Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adultfibroblast cultures by defined factors)”Cell，2006，第126卷，663–676页)，Ban等人，2009(“使用基于仙台病毒——一种不整合到宿主基因组中的RNA病毒——的载体有效诱导无转基因的人类多能干细胞(Efficient induction of transgene–free humanpluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus，an RNA virus thatdoes not integrate into the host genome)”Proc Jpn Acad Ser B Phys BiolSci.2009；85(8)：348–62)，以及题为“重编程的多能细胞的产生(Production ofreprogrammed pluripotent cells)”的国际申请WO2010/105311。
所述重编程试剂有利地与分化细胞共同囊封，以便集中该产品并促进与所有细胞的接触。在重编程试剂渗透所述水凝胶层的情况下，可以在囊封步骤后将所述试剂添加到培养基中。
所述重编程试剂使得可以对细胞施加一系列表型变化直至多能性阶段。有利地，使用特定培养基进行重编程步骤(a)，以促进这些表型变化。例如，在包含10％人或牛血清的第一培养基中、在补充有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体抑制剂(例如产品SB-431542(C22H16N4O3))、一种或多种RHO/ROCK(“Rho相关蛋白激酶”)途径抑制剂例如thiazovivin和/或Y-27632、成纤维细胞生长因子如FGF-2、抗坏血酸和抗生素例如曲古抑菌素A(C17H22N2O3)的Eagle's最小必需培养基(DMEM)中培养细胞。然后所述培养基被促进多能细胞增殖的培养基例如1替代。
有利地，来自步骤(b)的每个囊含有1至500个、优选50至200个分化细胞。
在一个实施方式中，步骤(a)、(b)、(c)或(d)中的至少一个，优选所有步骤(a)、(b)、(c)和(d)在0至4℃的温度下进行。维持4℃或更低的温度允许细胞的生物学过程变得休眠，包括来自外部环境的信号的转导。这使得可以限制因细胞脱离可能引起的细胞死亡现象。
可以对在步骤(d)期间获得的微区室进行分选，以便分离具有期望的包囊形式的细胞微区室。这样的分选步骤可以连续进行，以便将已经具有期望的包囊形式的细胞微区室与仍在形成的微区室分开。这样的分选步骤可以通过简单的形态学分析来完成，而不会干扰重编程仍在进行中和/或包囊组织化尚未完成的其它微区室。
一般而言，通过本发明的方法获得的细胞微区室然后可以在使用前冷冻。实际上，所述包囊形式促进所述微区室内的细胞存活，并且在解冻后，存活率大于80％。有利地，使用液氮进行冷冻以使所述微区室快速玻璃化并限制在细胞的脂质膜内形成晶体的风险。所述细胞微区室可以被悬浮在促进细胞存活的冷冻缓冲液中。例如，可以使用常规用于冷冻胚胎的冷冻缓冲液。
然后可以根据需要将如此冷冻的细胞微区室解冻。
应用
本发明所涉及的细胞微区室可用于许多应用。实际上，通过简单水解和/或溶解所述水凝胶外层，可以容易地回收所述细胞微区室含有的细胞。此外，可以在所述水凝胶囊内或在所述水凝胶囊水解/溶解后根据需要使多能细胞分化，以获得大量的目标细胞系。有利地，所述细胞在所述微区室内，即在所述水凝胶外层水解之前，分化成一种或多种目标细胞类型。
所述细胞微区室，更准确地说是它们含有的细胞，可以以3D细胞网络的形式和更常规的2D培养物的形式用于研究和开发目的。它们也可以用于治疗目的，例如细胞疗法、组织工程等。
实施例
实施例1：用于从被诱导成多能性的人类细胞获得细胞微区室的方案
所用溶液：
溶液1，补充有2μM Thiazovivin的DMEMF12培养基
溶液2，没有镁且没有钙并补充有1μM 2μM的Thiazovivin的PBS
溶液3，非酶促细胞脱离缓冲液：补充有2μM Thiazovivin的RelesRTM。
溶液4，多能干细胞培养基：MTeSR1TM hES/hIPS细胞培养基STEMCELLTM)。
溶液4+，补充有2μM Thiazovivin的溶液4。
溶液5，MatrigelTM。
溶液6，含有2μM Thiazovivin的300mM山梨糖醇。
细胞溶液：
25cm2陪替式培养皿中90％汇合的人类IPS细胞(得自原代真皮成纤维细胞；正常人类成人PCS–201–012TM和CytoTuneTM–iPS2.0仙台重编程试剂盒(商品编号A16517)，使用实施例2中显示的技术)然后用于匹配所推荐的体积。所有以下步骤均在4℃下进行，直到水凝胶壳在钙浴中交联为止。
步骤1：用溶液1清洗所述细胞。等待10分钟至1小时。
步骤2：用4mL溶液2清洗2次。
步骤3：轻柔吸出所述溶液。
步骤4：将所述细胞与4mL溶液3温育5-10分钟。
步骤5：使用宽头移液管以减小剪切应力，用2mL溶液4+将细胞脱离。
步骤6：将细胞悬浮液以360g离心5分钟。
步骤7：吸出上清液。
步骤8：用0.5mL溶液4+重悬。
步骤9：再次以360g离心并吸出上清液。
步骤10：将细胞沉淀团重悬于70μL溶液5和100μL溶液6中(沉淀团的体积应为30μL)。细胞溶液准备就绪。
囊封：
如Alessandri等人，2016(“用于产生培养和分化人类神经干细胞(hNSC)的功能化水凝胶微囊的3D打印微流体装置(A 3D printed microfluidic device for productionof functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation ofhuman Neuronal Stem Cells(hNSC))”，Lab on a Chip，2016，第16卷，第9号，1593–1604页)中所述来制备囊封装置。
总之，将所述装置的不同部件进行灭菌(通过高压灭菌器)；将三种必需的溶液装载在三个注射泵上，i)藻酸盐溶液(SLG100，2质量％，在蒸馏水中)，ii)中间溶液(300mM山梨糖醇)，iii)细胞溶液(在前面的步骤中制备)；使用微流体注射器将所述三种溶液进行同心共注射，所述微流体注射器形成射流，所述射流分解成外层为所述藻酸盐溶液并且核心为所述细胞溶液的液滴；将这些液滴收集在钙浴(100mM)中，所述钙浴使藻酸盐溶液变硬以形成壳。
为了改善所述细胞微区室的单分散性，对所述藻酸盐充+2kV DC电流。在与射流离开所述微流体注射器的轴线垂直的平面中，在距离尖端500μm处放置直径为2cm的质量环，以产生电场。
应该注意，在这些囊封条件下，层自发地形成。
囊封后的处理：
步骤1：用40μm细胞筛收集所述囊，然后在用溶液1清洗后，将它们储存在含有20mL溶液4+的75cm2烧瓶中。
步骤2：将所述烧瓶在37℃和5％CO2的培养箱中保留12小时。
步骤3：将培养基更换成溶液4以允许形成包囊。
步骤4：在24至72小时后，在所述囊中形成几十个细胞的包囊。细胞微区室在5至10天后成熟。
实施例2：从人类成纤维细胞获得细胞微区室的方案。
所用溶液：
溶液1，DMEMF12培养基
溶液2，没有镁且不添加钙的PBS
溶液3，胰蛋白酶EDTA细胞脱离缓冲液
溶液4，成纤维细胞培养基：含有10％人血清的DMEM培养基
溶液4+，补充有2μM Thiazovivin的溶液4。
溶液5，MatrigelTM。
溶液6，含有2μM Thiazovivin的300mM山梨糖醇。
细胞溶液：
将25cm2陪替式培养皿中低汇合密度的人类成纤维细胞(原代真皮成纤维细胞；正常人类成人然后用于匹配所推荐的体积(1至2百万个细胞)。所有以下步骤均在4℃下进行，直到所述壳在钙浴中交联为止。
步骤1：用溶液2清洗所述细胞。
步骤2：轻柔吸出所述溶液。
步骤3：将所述细胞与4mL溶液3温育5-10分钟。
步骤4：使用宽头移液管以减小剪切应力，用2mL溶液4+将细胞脱离。
步骤6：将细胞悬浮液以360g离心5分钟。
步骤7：吸出上清液。
步骤8：用0.5mL溶液4+重悬。
步骤9：再次以360g离心并吸出上清液。
步骤10：将细胞沉淀团重悬于90μL溶液5和100μL溶液6中(沉淀团体积应为10μL)。
步骤11：添加为6孔板提供的“2.0仙台重编程试剂盒”(含有重编程病毒)的内容物的1/10。细胞溶液准备就绪。
囊封：
按照实施例1的方案进行囊封。
囊封后的处理：
步骤1：用40μm细胞筛收集所述囊，然后在用溶液1清洗后，将它们储存在含有20mL溶液4+的75cm2烧瓶中。
步骤2：将所述烧瓶在37℃和5％CO2的培养箱中保留24小时。
第3步：每天更换培养基。每个囊在囊形成时含有1至10个成纤维细胞。所述重编程病毒的转化效率为约0.2％。因此，大多数囊含有非常少的重编程细胞，如果有的话。在15至40天后包囊开始形成。所述成纤维细胞具有细长的形状并且没有形成包囊。因此，形成的所有包囊都由IPS细胞形成。

Claims (11)

1.细胞微区室，其依次包含被组织在腔周围的：
-至少一层人类多能细胞；
-细胞外基质层；
-水凝胶外层。
2.根据权利要求1所述的细胞微区室，其中所述微区室是封闭的。
3.根据权利要求1或2所述的细胞微区室，其中所述外层包含藻酸盐。
4.根据前述权利要求之一所述的细胞微区室，其中所述微区室具有球形或细长的形状。
5.根据前述权利要求之一所述的细胞微区室，其中所述微区室的直径或最小尺寸在10μm和1mm之间，优选在50μm和500μm之间，更优选小于500μm，甚至更优选小于400μm。
6.根据前述权利要求之一所述的细胞微区室，其中所述细胞密度在1个细胞/微区室和数千个细胞/微区室之间、优选为50个细胞/微区室至1000个细胞/微区室。
7.用于制备根据权利要求1至6之一所述的细胞微区室的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中温育人类多能干细胞；
(b)将来自步骤(a)的多能干细胞与细胞外基质混合；
(c)将来自步骤(b)的混合物囊封在水凝胶层中；
(d)将步骤(c)中获得的囊在含有RHO/ROCK途径抑制剂的培养基中培养；
(e)清洗来自步骤(d)的囊以除去所述RHO/ROCK途径抑制剂；
(f)将来自步骤(e)的囊培养3天至20天，优选5天至10天，并任选回收所获得的细胞微区室。
8.根据权利要求7所述的用于制备微区室的方法，所述方法包括以下中间步骤
(a′)优选借助于无酶试剂，在步骤(b)之前解离来自步骤(a)的多能干细胞。
9.用于制备根据权利要求1至6之一所述的细胞微区室的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将人类分化细胞与细胞外基质和细胞重编程试剂混合；
(b)将来自步骤(a)的混合物囊封在水凝胶层中；
(c)将来自步骤(b)的囊培养10天至40天，并任选回收所获得的细胞微区室。
10.根据权利要求9所述的用于制备细胞微区室的方法，其中来自步骤(b)的每个囊含有1个至500个分化细胞。
11.根据权利要求7至10之一所述的用于制备细胞微区室的方法，所述方法包括以下后续步骤：将在权利要求7的步骤(f)或权利要求9的步骤(c)中获得的细胞微区室冷冻。
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