FR3151044A1 - Transduction et/ou transfection dans un microcompartiment en trois dimensions - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte aux domaines de la transduction et transfection de cellules dans un modèle de culture cellulaire en trois dimensions et concerne, en particulier un microcompartiment cellulaire particulier permettant de réaliser une transduction et/ou une transfection au sein de la partie interne dudit microcompartiment.
Description
La présente invention se rapporte au domaine de la modification génétique et protéomique, de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle, de cellules dans un modèle de culture cellulaire en trois dimensions. L’invention a en particulier pour objet un microcompartiment cellulaire particulier permettant de réaliser une transduction et/ou une transfection au sein de la partie interne dudit microcompartiment.
Au cours de ces dernières années, les méthodes de culture cellulaire ont évolué tant en termes de complexité que de performances. Les méthodes traditionnelles de cultures cellulaires, qui consistent à cultiver des cellules sur des surfaces planes, en deux dimensions, sont remplacées par des techniques de culture tridimensionnelle (3D), offrant une meilleure reproduction de l’environnement cellulairein vivo.
La culture cellulaire en 3D offre une alternative plus proche de la réalité biologique en reproduisant les interactions cellules-matrice extracellulaire et cellule-cellule de manière plus précise, conduisant à des résultats plus fiables et pertinents pour les études de biologie cellulaires, la recherche médicale et la thérapie cellulaire.
Les cellules cultivées dans ces systèmes en 3D peuvent être de tout type. Il peut s’agir, aussi bien de cellules différenciées avec différents phénotypes, de cellules progénitrices que de cellules souches.
Toutefois, certaines contraintes associées à la culture cellulaire en 3D peuvent constituer un frein à son utilisation, notamment pour des applications spécifiques telles que la délivrance et l’expression de transgène. En effet, les techniques courantes de transduction ou de transfection fonctionnant bien en culture cellulaire en 2D peuvent ne pas être efficaces pour les cultures en 3D, où les cellules sont encapsulées dans des matrices extracellulaires plus denses, limitant ainsi l'accès des vecteurs de transduction ou des agents chimiques ou physiques de transfection aux cellules.
Par exemple, le document « Neumann AJ, Schroeder J, Alini M, Archer CW, Stoddart MJ. Enhanced adenovirus transduction of hMSCs using 3D hydrogel cell carriers. Mol Biotechnol. 2013;53(2):207-216. doi:10.1007/s12033-012-9522-y » présente une méthode de transduction de cellules dans une culture en 3D via l’encapsulation de cellules et de vecteurs viraux dans de l’alginate. Les capsules ainsi formées sont remplies d’alginate de même densité, limitant la transduction au sein de la capsule. L’encapsulation dans de l’alginate formant des capsules « pleines » limite voire bloque le déplacement des cellules et des vecteurs viraux et par conséquent diminue l’efficacité de la transduction.
Ainsi, les systèmes de culture cellulaire en 3D existant à ce jour n’exploitent pas leurs potentiels de performances, notamment pour la réalisation d’une modification génétique et/ou protéomique de cellules, plus particulièrement par transfection ou transduction.
Il existe donc un besoin important pour une nouvelle solution permettant de transfecter et/ou transduire des cellules cultivées en 3D afin que lesdites cellules puissent exprimer ou recevoir au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Pour répondre à ce besoin, l’invention propose un nouveau microcompartiment cellulaire comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l’hydrogel constituant la couche externe.
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l’hydrogel constituant la couche externe.
Préférentiellement, l’hydrogel de la partie interne est différent de l’hydrogel constituant la couche externe, en ce qu’il présente au moins une propriété chimique et/ou au moins une propriété physique différente.
Avantageusement, l’hydrogel de la couche externe maintient l’hydrogel de la partie interne de façon à former un microcompartiment cellulaire en trois dimensions. L’hydrogel et/ou la solution aqueuse de la partie interne sont quant à eux particulièrement adaptés au maintien de la viabilité des cellules eucaryote humaine, animale ou végétale tout en permettant la diffusion desdites cellules et des agents de transduction et/ou agent de transfection au sein de la partie interne.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l’invention est caractérisé par une conductance diffusive de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
La conductance diffusive correspond à la capacité d’un matériau, tel qu’une couche d’hydrogel, à permettre la diffusion d’un objet, tel qu’un agent de transduction et/ou agent de transfection en solutions. Ainsi, plus la conductance diffusive d’un matériau à un objet est élevée, plus l’objet pourra diffuser dans ledit matériau.
Selon un mode de réalisation, la couche externe du microcompartiment selon l’invention est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
Avantageusement, la taille des pores de la couche externe est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection permet d’empêcher la diffusion d’au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection à travers la couche externe. En d’autres termes, les pores de la couche externe permettent, par leurs dimensions adaptées, de maintenir au moins un agent de transfection et/ou agent de transduction au sein de la partie interne du microcompartiment. A contrario, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores permettant, par leurs dimensions adaptées, de laisser diffuser au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection au sein de la partie interne.
Dans le contexte de l’invention, la taille des pores peut être mesurée par des techniques bien connues de l’Homme du métier, à savoir :
- Par microscopie électronique à transmission ;
- Par microscopie optique super résolutive ;
- Par imagerie par diffraction des rayons X ;
- Par imagerie par diffraction de neutron ; et
- Par exclusion de molécules de tailles et de conformation connues.
- Par microscopie électronique à transmission ;
- Par microscopie optique super résolutive ;
- Par imagerie par diffraction des rayons X ;
- Par imagerie par diffraction de neutron ; et
- Par exclusion de molécules de tailles et de conformation connues.
Préférentiellement, la couche externe en hydrogel est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 20nm, notamment inférieure à 10nm, encore plus préférentiellement inférieure à 5nm.
Selon un objet préféré de l’invention, l’hydrogel de la partie interne est caractérisé par la présence de pores dont la plus petite dimension est supérieure à 10 nm, préférentiellement supérieure à 25nm, encore plus préférentiellement comprise entre 25 et 500 nm.
Lorsque la partie interne comprend au moins une solution aqueuse, celle-ci ne limite pas la diffusion de particules solubles telles que des agents de transfection et/ou transduction en fonction de leur taille au travers de ladite solution, en particulier les particules solubles dont la taille serait supérieure à 10 nm, préférentiellement à 25nm.
Selon un mode de réalisation, la partie interne du microcompartiment selon l’invention comprend au moins une solution et/ou au moins un hydrogel comprenant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à 10 nm, notamment supérieure à 25nm, préférentiellement supérieure à 100nm, encore plus préférentiellement supérieure à 500nm.
L’invention se rapporte ainsi à un microcompartiment comportant deux éléments structurels distincts permettant une transfection et/ou une transduction au sein du microcompartiment, à savoir :
- une couche ou enveloppe externe, formée par une couche d’hydrogel, empêchant les cellules et les agents de transduction et/ou transfection de la partie interne de la traverser. Préférentiellement ladite couche externe présente une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection strictement inférieure à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection, et/ou comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection, de sorte que l’agent de transduction ne puisse diffuser à travers cette couche externe ; et
- une partie interne, comprenant notamment au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de celui de la couche externe, destinée à favoriser la rencontre entre les cellules et les agents de transduction et/ou transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, étant entendu que ladite partie interne est délimitée par la couche externe en hydrogel. Préférentiellement, ladite partie interne présente une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection strictement supérieure à la conductance diffusive de la couche externe à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection, et/ou lorsque la partie interne comprend au moins au moins un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection, de sorte que l’agent de transduction puisse diffuser à travers cette partie interne.
- une couche ou enveloppe externe, formée par une couche d’hydrogel, empêchant les cellules et les agents de transduction et/ou transfection de la partie interne de la traverser. Préférentiellement ladite couche externe présente une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection strictement inférieure à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection, et/ou comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection, de sorte que l’agent de transduction ne puisse diffuser à travers cette couche externe ; et
- une partie interne, comprenant notamment au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de celui de la couche externe, destinée à favoriser la rencontre entre les cellules et les agents de transduction et/ou transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, étant entendu que ladite partie interne est délimitée par la couche externe en hydrogel. Préférentiellement, ladite partie interne présente une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection strictement supérieure à la conductance diffusive de la couche externe à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection, et/ou lorsque la partie interne comprend au moins au moins un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection, de sorte que l’agent de transduction puisse diffuser à travers cette partie interne.
La couche externe en hydrogel permet, d’une part de former l’enveloppe externe protectrice, et donc de constituer la capsule ou microcompartiment, d’autre part, la solution et/ou l’hydrogel de la partie interne moins rigide, plus lâche, permet la croissance cellulaire et favorise les mouvements des cellules et des agents de transfection et/ou transduction au sein de la partie interne, étant donné la conductance et/ou la taille des pores particulièrement adaptée de la solution et/ou de l’hydrogel.
A l’inverse, l’art antérieur connu, composé d’une unique couche d’hydrogel, est soit trop rigide, ne permettant pas le déplacement des cellules et des agents de transduction et/ou transfection et induisant une faible efficacité de transfection/transduction, soit au contraire, trop lâche et donc incompatible avec une culture en bioréacteur. En effet, les contraintes mécaniques d’une culture en bioréacteur, notamment du fait des forces de cisaillement importantes générées lors de la culture nécessite un microcompartiment cellulaire adapté.
La couche externe en hydrogel, différente de la partie interne comprenant une solution et/ou un hydrogel différent, permet de former l’enveloppe externe du microcompartiment ou de la capsule selon l’invention, qui permettant de protéger le contenu de la capsule de l’environnement extérieur, notamment lorsque les capsules sont cultivées dans un bioréacteur. Par ailleurs, la couche externe en hydrogel garantit le maintien des cellules et des agents de transduction/transfection à l’intérieure de celle-ci. La couche externe permet ainsi de pouvoir dissocier la concentration des agents de transduction/transfection à proximité des cellules également appelée « concentration locale », de la concentration globale d’agents de transduction/transfection dans le système de culture appelée également « concentration globale ».
Ainsi, la structure du microcompartiment optimise les rencontres cellules-agents de transfection et/ou transduction et permet ainsi de diminuer la quantité d’agent de transfection et/ou transduction nécessaire pour obtenir l’efficacité de transfection et/ou transduction désirée, notamment par rapport aux cultures en 2D ou aux cultures en 3D décrites dans l’art antérieur.
Selon un autre objet préféré de l’invention, le microcompartiment comprend au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction capable de diffuser dans la partie interne. Préférentiellement la majorité des agents de transfection et/ou de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment sont capables de diffuser. Selon un mode de réalisation tous les agents de transfection et/ou de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment sont capables de diffuser.
Avantageusement, les propriétés de la solution aqueuse et/ou de l’hydrogel dans la partie interne permettent le déplacement des cellules et des agents de transfection et/ou transduction favorisant ainsi leur rencontre et par conséquent favorise la transfection/transduction au sein de la partie interne du microcompartiment.
Aussi, le microcompartiment selon l’invention comprend quatre constituants majoritaires, à savoir :
- au moins une couche externe en hydrogel formant l’enveloppe dudit microcompartiment;
- au moins une solution et/ou un hydrogel, permettant la diffusion des agents de transduction et/ou transfection ainsi, optionnellement, que des cellules présentes dans la partie interne du microcompartiment ;
-au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécules d’intérêt ;
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale.
- au moins une couche externe en hydrogel formant l’enveloppe dudit microcompartiment;
- au moins une solution et/ou un hydrogel, permettant la diffusion des agents de transduction et/ou transfection ainsi, optionnellement, que des cellules présentes dans la partie interne du microcompartiment ;
-au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécules d’intérêt ;
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale.
Les cellules présentes dans la partie interne, peuvent être de tous types cellulaires. Plus préférentiellement, les cellules sont choisies parmi les cellules eucaryotes humaines, animales et végétales, encore plus préférentiellement les cellules souches pluripotentes, les progéniteurs les cellules en cours de différenciation et les cellules différenciées. Préférentiellement les cellules ne sont pas des cellules issues d’un embryon humain ou nécessitant la destruction d’un embryon humain.
Les cellules présentes dans la partie interne peuvent être isolées et/ou sous forme d’au moins une couche et/ou ou sous forme d’au moins un agrégat en trois dimensions et/ou sous forme d’au moins un micro-tissu cellulaire en trois dimensions, éventuellement avec au moins une lumière.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment comprend au moins une couche de cellules et au moins une lumière. Lorsque le microcompartiment comprend au moins une lumière, au moins une couche de cellules, le ou les agent(s) de transduction et/ou agent(s) de transfection, la couche de solution aqueuse ou l’hydrogel de la partie interne et la couche externe sont préférentiellement, successivement organisées autour de ladite lumière.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à un ensemble de microcompartiments, dans lequel ledit ensemble comprend au moins un microcompartiment selon l’un des quelconques modes de réalisation précédents.
Le microcompartiment selon l’invention ou l’ensemble de microcompartiments selon l’invention, est également particulièrement adapté pour être utilisé en culture cellulaire, en particulier en culture cellulaire en trois dimensions, permettant la production de cellules d’intérêt en grande quantité, notamment des cellules, micro-tissu ou organoïde comprenant et/ou exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle, susceptible d’être utilisé, par exemple dans le cadre de thérapie cellulaire.
Avantageusement, la conformation du microcompartiment selon l’invention permet de réaliser une transduction et/ou transfectionin capsuloet par conséquent produire des cellules comprenant et/ou exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Aussi, l’invention se rapporte également à un microcompartiment selon l’invention ou un ensemble de microcompartiment selon l’invention, pour son utilisation comme médicament.
Selon une variante, l’invention se rapporte également à une utilisation du microcompartiment selon l’invention ou d’un ensemble de microcompartiments selon l’invention pour insérer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle dans une cellule eucaryote.
Selon une autre variante, l’invention porte également sur l’utilisation du microcompartiment selon l’invention pour fabriquer des micros tissus comprenant et/ou exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle. Etant entendu que dans ce mode de réalisation particulier, les micros tissus ne sont préférentiellement pas destinés à être implantés chez un être humain ou un animal. A titre d’exemple, ils peuvent être utilisés comme modèle ex-vivo.
L’invention a également pour objet un procédé de transduction et un procédé de transfection mis en œuvre dans au moins un microcompartiment selon l’invention.
D’autre part, le microcompartiment selon l’invention peut être produit de différentes manières, toutefois selon un aspect particulier, l’invention se rapporte à un procédé de préparation du microcompartiment cellulaire selon l’invention, comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel différent de celui de l’étape (b) ;
(d) cultiver les microcompartiments obtenues à l’étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
(e) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt,
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(d) cultiver les microcompartiments obtenues à l’étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
(e) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Selon un objet particulier de l’invention, l’étape (c) comprend les sous-étapes suivantes :
- mettre en contact la solution de l’étape (a) et la solution de l’étape (b) avec une couche d’hydrogel pour former au moins une goutte, et
- collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
- mettre en contact la solution de l’étape (a) et la solution de l’étape (b) avec une couche d’hydrogel pour former au moins une goutte, et
- collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
De façon particulièrement préférée, l’étape (c) est réalisée par co-injection simultanée de la solution de l’étape (a), la solution de l’étape (b) et une couche externe d’hydrogel, ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes.
Avantageusement, le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est compris entre 50 et 800 µm, préférentiellement entre 80 et 240 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 0,1 et 2000 mL/h, préférentiellement entre 10 et 2000 mL/h, plus préférentiellement entre 10 et 150 mL/h, encore plus préférentiellement entre 11 et 100mL/h.
Selon une variante du procédé selon l’invention, l’étape (c) est réalisée par co-injection de la solution de l’étape (a) et la solution de l’étape (b) dans une couche externe d’hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l’étape (a); ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant un tube.
Lorsque ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec la solution de calcium, le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est préférentiellement compris entre 50 et 1000 µm, plus préférentiellement entre 80 et 300 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 1 et 100 mL/h.
D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
Définitions
Par « cellules différenciées » au sens de l’invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules souches pluripotentes qui ne sont pas différenciées ou des cellules progénitrices qui sont en cours de différenciation.
Par « cellules humaines » au sens de l’invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n’est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l’invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Par « cellule mutante » au sens de l’invention, on entend une cellule porteuse d’au moins une mutation.
Par « cellule progénitrice » au sens de l’invention, on entend une cellule souche déjà engagée dans la différenciation cellulaire mais pas encore différenciée.
Par « cellule souche embryonnaire » au sens de l’invention on entend une cellule souche pluripotente de cellule dérivée de la masse cellulaire interne du blastocyste. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA4/5, Tra-1-60 et Tra-1-81. Les cellules souches embryonnaires utilisées dans le cadre de l’invention sont obtenues sans destruction de l’embryon dont elles sont issues, par exemple à l’aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement les cellules souches embryonnaires d’êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente » ou « cellule pluripotente » au sens de l’invention, on entend une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC dans le contexte de la présente invention. Il peut s’agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines), de cellules souches embryonnaires ou de cellules MUSE (pour « Multilineage-differentiating Stress Enduring »).
Par « cellule souche pluripotente induite » au sens de l’invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l’expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA4/5. Des exemples de procédés permettant l’obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par « conductance diffusive » au sens de l’invention, on entend la capacité d’un matériau à permettre la diffusion d’un objet en solutions. Où la conductance diffusive de l’objet est :
[Math1]
µobjet
Où D est le coefficient de diffusion effectif des objets dans le matériau
L est la longueur du matériau à travers laquelle les objets diffusent
∫∫dS est correspond à l’intégration sur toute la surface du matériau à travers laquelle les objets diffusent.
[Math1]
µobjet
Où D est le coefficient de diffusion effectif des objets dans le matériau
L est la longueur du matériau à travers laquelle les objets diffusent
∫∫dS est correspond à l’intégration sur toute la surface du matériau à travers laquelle les objets diffusent.
Dans le contexte de l’invention, la conductance diffusive de l’hydrogel de la partie externe peut se mesurer à l’aide de deux compartiments séparés par l’hydrogel de la couche externe dont on veut mesurer la conductance diffusive. Pour mesurer sa conductance diffusive, il suffit de placer dans le premier compartiment la solution contenant l’agent de transfection ou l’agent de transduction en question et dans l’autre compartiment, la solution sans l’agent. Il suffit alors de mesurer avec une méthode adaptée, telle que le comptage, la fluorescence ou le dosage, l’évolution de la quantité d’agent dans le compartiment en fonction du temps pour en déduire la conductance diffusive. A titre d’exemple, les deux compartiments peuvent par exemple être deux réservoirs séparés par une membrane constituée de l’hydrogel de la couche externe dont on veut mesurer la conductance diffusive.
Alternativement, la conductance diffusive de l’hydrogel de la couche externe à un agent peut être mesurée localement en utilisant la technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), pour des agents d’intérêts fluorescents. Cette technique consiste à irradier une zone d’un matériau avec un laser, permettant de photoblanchir les agents fluorescent dans la zone d’irradiation, et d’observer le retour à un niveau de fluorescence normal. Le temps de retour au niveau normal est directement lié au coefficient de diffusion ce qui permet ensuite de calculer une conductance diffusive.
Dans le contexte de l’invention, la conductance diffusive de l’hydrogel de la partie interne à un agent de transfection ou transduction est définie de la manière suivante :
[Math2]
µint min= Dint*π(R)²/r
Où D est le coefficient de diffusion, R est le rayon de la plus grande sphère inscrite dans la partie intérieure et r est le diamètre de la plus petite sphère circonscrite à la partie intérieure.
[Math2]
µint min= Dint*π(R)²/r
Où D est le coefficient de diffusion, R est le rayon de la plus grande sphère inscrite dans la partie intérieure et r est le diamètre de la plus petite sphère circonscrite à la partie intérieure.
Par « couche de cellules » ou « assise de cellules » au sens de l'invention, on entend plusieurs cellules formant une couche ou une assise pouvant être structurée autour d’une lumière, il peut s’agir par exemple d’un tissu ou d’un micro-tissu cellulaire ou d’une culture groupée en trois dimensions. L’épaisseur de la couche de cellules pouvant être variable. Cette couche est organisée en trois dimensions dans le microcompartiment.
Par « diamètre de Feret » au sens de l’invention, on entend la distance, notamment « d » ou « D », comprise entre deux tangentes, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l’ensemble de la projection soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « goutte » au sens de l’invention, on entend également une structure tridimensionnel formée à partir d’au moins une solution liquide comprenant les constituants d’un hydrogel non rigidifié (précurseurs de polymérisation, chaines de polymères non ou partiellement réticulées), d’éléments précurseurs d’hydrogel. Aussi, la goutte constitue un état transitoire entre la co-injection des différents constituants et le microcompartiment selon l’invention.
Par « hydrogel d’origine végétale ou synthétique » on entend un hydrogel qui n’est pas d’origine animale et/ou issues de lignées cellulaires cancéreuses tel que le Matrigel®. Il peut s’agir par exemple et de façon non limitative d’alginate.
Par « la plus petite dimension » de X au sens de l’invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret de X.
Par « la plus grande dimension » de X au sens de l’invention, on entend la valeur du plus grand diamètre de Feret de X.
Par « lumière » ou « lumen » au sens de l’invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement, son contenu n’est pas en équilibre diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l’extérieur du microcompartiment.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l’invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules.
Par « MOI ou multiplicity of infection » au sens de l’invention, on entend le rapport entre le nombre de particules fonctionnelles de chaque agent de transduction et le nombre de cellules au sein du microcompartiment.
Par « pore » au sens de l’invention, on entend un sous-volume au sein du volume général d’hydrogel au sein duquel, monomères et/ou polymère de l’hydrogel ne présentent pas liaisons chimiques covalentes ou ioniques en continuité avec le réseau tridimensionnel du volume général de l’hydrogel.
Par « tissu » ou « tissu biologique » au sens de l’invention, on entend le sens commun de tissu en biologie c’est-à-dire le niveau d'organisation intermédiaire entre la cellule et l’organe. Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine (le plus souvent issus d’un lignage cellulaire commun, bien qu’elles puissent trouver leur origine par association de lignages cellulaires distincts), regroupées en amas, réseau ou faisceau (fibre). Un tissu forme un ensemble fonctionnel, c'est-à-dire que ses cellules concourent à une même fonction. Les tissus biologiques se régénèrent régulièrement et sont assemblés entre eux pour former des organes.
Microcompartiment selon l’invention
La présente invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l’hydrogel constituant la couche externe.
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l’hydrogel constituant la couche externe.
Le microcompartiment selon l’invention est un microcompartiment en trois dimensions, délimité par la couche externe en hydrogel et à l’intérieur de ladite couche externe, une partie interne comprend une ou plusieurs cellules, un ou plusieurs agents de transduction et/ou transfection, et une ou plusieurs solutions aqueuses et/ou un ou plusieurs hydrogels.
Avantageusement, la couche externe délimite une partie interne et permet de contenir les éléments présents au sein de la partie interne, notamment les cellules et les agents de transfection et/ou transduction.
Préférentiellement, l’hydrogel de la partie interne est différent de l’hydrogel constituant la couche externe, en ce qu’il présente au moins une caractéristique différente, en particulier au moins une propriété chimique et/ou au moins une propriété physique différente.
Avantageusement, l’hydrogel de la partie interne, différent de celui de la couche externe, permet aux agents de transfection et/ou transduction de diffuser dans la partie interne et par conséquent améliore l’efficacité de transduction/transfection, notamment par rapport à des capsules ou microcompartiment constitué par un seul hydrogel.
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la couche externe présente une densité et/ou une viscosité strictement supérieure à la densité et/ou la viscosité de la solution et/ou de l’hydrogel présent au sein de la partie interne.
Selon un autre mode de réalisation, l’hydrogel de la couche externe présente un poids moléculaire différent de l’hydrogel présent au sein de la partie interne. Préférentiellement, dans ce mode de réalisation, le microcompartiment cellulaire selon l’invention comprend dans sa partie interne au moins une cellule, au moins un agent de transfection et/ou transduction, au moins une solution et/ou au moins un hydrogel de poids moléculaire inférieur à l’hydrogel de la couche externe. Ainsi, dans ce mode de réalisation, le poids moléculaire de l’hydrogel de la couche externe est supérieur au poids moléculaire de l’hydrogel de la partie interne.
Avantageusement, l’hydrogel et/ou la solution de la partie interne permet aux cellules et aux agents de transfection et/ou transduction de diffuser au sein de la partie interne. Par ailleurs, la couche externe présente une résistance à la diffusion plus importante que la solution et/ou l’hydrogel de la partie interne ce qui permet d’améliorer la transfection et/ou transduction au sein du microcompartiment. Par ailleurs, la couche d’hydrogel externe permet également de protéger les cellules du milieu extérieur, de limiter la prolifération incontrôlée des cellules, et leur différenciation en cas de différenciation.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l’invention est caractérisé par une conductance diffusive de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention présente une conductance diffusive maximale de l’hydrogel de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure à 0,1/h, préférentiellement inférieure à 0,05/h, encore plus préférentiellement inférieure à 0,01/h.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention présente une conductance diffusive maximale de l’hydrogel de la partie interne à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection supérieure à 0,1/h, préférentiellement supérieure à 1/h, encore plus préférentiellement supérieure à 10/h, notamment supérieure à 50/h.
Selon un autre mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention présente un ratio de la conductance diffusive de l’hydrogel de la partie interne sur la conductance diffusive de l’hydrogel de la couche externe par rapport à un agent de transfection et/ou transduction supérieur à 5, préférentiellement supérieur à 10, encore plus préférentiellement supérieur à 100, notamment supérieur à 1000.
Dans le contexte de l’invention, la conductance diffusive est préférentiellement mesurée à 25°C et à un pH de 7.
Selon un mode de réalisation de l’invention, le microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprend une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, dans lequel la porosité de la couche externe est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d'intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, dans lequel la porosité de la couche externe est caractérisée par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
Dans le contexte de l’invention, la taille des pores peut être mesurée par des techniques bien connues de l’Homme du métier, à savoir :
- Par microscopie électronique à transmission ;
- Par microscopie optique super résolutive ;
- Par imagerie par diffraction des rayons X ;
- Par imagerie par diffraction de neutron ;
- Par exclusion de molécules de tailles et de conformation connues.
- Par microscopie électronique à transmission ;
- Par microscopie optique super résolutive ;
- Par imagerie par diffraction des rayons X ;
- Par imagerie par diffraction de neutron ;
- Par exclusion de molécules de tailles et de conformation connues.
Préférentiellement la taille des pores de l’hydrogel de la couche externe et de l’hydrogel de la partie interne est mesurée par diffusion de neutron ou rayons X aux petits angles (SANS/SAXS) et par test de diffusion de polymères de masse moléculaire connue.
Préférentiellement l’hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d d’au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection présent dans la partie interne. Encore plus préférentiellement, l’hydrogel constituant la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d de la majorité des agents de transduction et/ou des agents de transfection présents dans la partie interne. Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d de tous les agents de transduction et/ou de tous les agents de transfection présents dans la partie interne.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l’hydrogel constituant la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d de l’agent de transduction ou de l’agent de transfection présentant la plus petite dimension d au sein de la partie interne.
Préférentiellement, l’hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 20nm, notamment inférieure à 10nm, encore plus préférentiellement inférieure à 5nm. Avantageusement, la taille des pores particulière de la couche externe en hydrogel permet de maintenir les cellules et les agents de transduction et/ou agents de transfection dans la partie interne.
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence d’au moins un chemin de diffusion continu entre la face externe et la face interne de la couche externe d’hydrogel pour lequel la plus petite dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 10 nm. En d’autres termes, l’hydrogel de la couche externe est caractérisé par l’absence de chemin de diffusion continu entre la face externe et la face interne de la couche externe d’hydrogel pour lequel la plus petite dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 10 nm.
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la partie interne comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d d’au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection présent dans la partie interne. Préférentiellement l’hydrogel constituant la partie interne comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d de la majorité des agents de transduction et/ou des agents de transfection présents dans la partie interne. Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la partie interne comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d de tous les agents de transduction et/ou de tous les agents de transfection présents dans la partie interne.
De façon préférée, l’hydrogel de la partie interne du microcompartiment comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d de l’agent de transduction et/ou l’agent de transfection présentant la plus petite dimension d au sein de la partie interne.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, la plus petite dimension des pores de l’hydrogel de la partie interne est supérieure à 10nm, préférentiellement supérieure à 25nm, encore plus préférentiellement comprise entre 25 et 500nm.
De façon préférée, le microcompartiment selon l’invention est caractérisé en ce qu’il comprend au moins un chemin de diffusion continu au sein de l’hydrogel de la partie interne entre une cellule et un agent de transfection et/ou transduction pour lequel la plus petite dimension est supérieure à 10nm, préférentiellement comprise entre 25 et 500nm.
Selon un mode de réalisation préféré, le microcompartiment selon l’invention comprend au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, dans lequel l’hydrogel de la partie interne est caractérisé par la présence de pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus grande dimension D dudit agent de transduction et/ou agent de transfection présents dans la partie interne, et en ce que l’hydrogel de la couche externe est caractérisé par la présence de pores dont la plus grande dimension est inférieure à celle de la dimension D de sorte que l’agent de transduction ne puisse diffuser à travers cette couche externe.
De façon préférée, l’hydrogel de la partie interne du microcompartiment comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus grande dimension D de l’agent de transduction et/ou l’agent de transfection présentant la plus grande dimension D au sein de la partie interne.
Selon un mode de réalisation particulier, le microcompartiment selon l’invention comprend une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins un hydrogel, dans lequel le module de Young de l’hydrogel de la partie interne est strictement inférieur au module de Young de l’hydrogel de la couche externe. Grâce à ce module de Young de l’hydrogel de la partie interne, la couche externe sera plus rigide, que l’hydrogel de la partie interne dont l’hydrogel est plus lâche, plus desserré, notamment dû à la présence de chaîne plus courte, facilitant la croissance des cellules et le déplacement des agents de transduction et/ou transfection.
Selon un objet de l’invention, les avantages cités précédemment peuvent être améliorés lorsque le module de Young de l’hydrogel de la partie interne est compris entre 0,01 et 200kPa, plus préférentiellement entre 0,1 et 60kPa, encore plus préférentiellement compris entre 0,1 et 5kPa. Préférentiellement, le module de Young de l’hydrogel de la couche externe est supérieur à 10kPa, plus préférentiellement supérieur à 60kPa, encore plus préférentiellement supérieur à 100kPa.
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la partie interne est enchevêtré avec l’hydrogel de la couche externe, notamment sur la face interne de la couche externe. Aussi, la délimitation entre les deux hydrogels malgré un module de Young différent peut ne pas être parfaitement nette. Par conséquent, au moins une partie de l’hydrogel de la couche ou du maillage de la partie interne peut être enchevêtrée avec la face interne de la couche externe.
L’hydrogel de la partie interne avec un faible module de Young présente alors des propriétés viscoélastiques et viscoplastiques particulièrement avantageuses pour obtenir un substitut de matrice extracellulaire, dans laquelle les cellules vont pouvoir se loger, croitre, se déplacer et être transfectées et/ou transduites de manière satisfaisante.
Avantageusement, un hydrogel, par exemple un hydrogel d’alginate, avec un faible module de Young, présente des propriétés de relaxation plus rapide, également connu sur le terme "fast-relaxing", ce qui permet aux cellules de se déplacer, de changer de forme, de s'étendre, de proliférer et de remodeler de façon mécanique la matrice à base de l’hydrogel et également de permettre la diffusion des agents de transfection et/ou transduction rendant le microcompartiment selon l’invention particulièrement adapté à une transfection et/ou transductionin capsulo.
Préférentiellement, le ou les hydrogel(s) utilisé(s) dans les microcompartiments selon l’invention sont biocompatibles, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas toxiques pour les cellules. Ils doivent permettre la diffusion d’oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie.
L’hydrogel de la couche externe et/ou de la partie interne peut comprendre ou être constitué d’alginate.
L’hydrogel d’alginate est rhéofluidifiant, c’est-à-dire que sa viscosité diminue quand la vitesse de cisaillement augmente, ceci est particulièrement avantageux lors du passage dans un injecteur micro fluidique pour former les microcompartiments selon l’invention.
Selon un mode de réalisation préféré, la couche externe d’hydrogel comprend au moins de l’alginate. Elle peut être constituée exclusivement d’alginate.
L’alginate constituant la couche externe peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d’α-L-guluronate et 20% de β-D-mannuronate, ayant un module de Young supérieur à 10kPa, préférentiellement supérieur à 60 kPa, plus préférentiellement supérieur à 100 kPa.
Selon un mode de réalisation, l’alginate de la couche externe présente un poids moléculaire moyen de 100 à 400 kDa, plus préférentiellement compris entre 150 et 250kDa. Lorsque l’hydrogel de la couche externe est de l’alginate, la concentration de la solution d’alginate utilisée pour former ladite couche externe du microcompartiment, est préférentiellement comprise entre 0,5 et 5% en masse, plus préférentiellement la concentration est égale à 2% (plus ou moins 0,5%) en masse.
Lorsque la concentration de la solution d’alginate destinée à former la couche externe du microcompartiment est égale à 2%, la viscosité de l’alginate formant la couche externe est préférentiellement comprise entre 100 et 200mPa/s.
Préférentiellement, la couche externe en hydrogel est dépourvue de cellules.
L’hydrogel de la partie interne peut se présenter sous forme de couche ou de maillage. Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la partie interne est juxtaposé au moins partiellement à la face interne de la couche externe.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention comprend dans sa partie interne :
- une couche de solution aqueuse ; et/ou une couche et/ou maillage en hydrogel, ou
- une solution aqueuse ; et/ou une couche et/ou maillage en hydrogel, ou
- une couche de solution aqueuse ; et/ou un hydrogel.
- une couche de solution aqueuse ; et/ou une couche et/ou maillage en hydrogel, ou
- une solution aqueuse ; et/ou une couche et/ou maillage en hydrogel, ou
- une couche de solution aqueuse ; et/ou un hydrogel.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l’invention comprend dans sa partie interne :
- au moins une couche de solution aqueuse ; et/ou
- au moins une couche et/ou un maillage en hydrogel.
- au moins une couche de solution aqueuse ; et/ou
- au moins une couche et/ou un maillage en hydrogel.
Préférentiellement, le ou les hydrogels utilisés dans la partie interne des microcompartiments selon l’invention sont biocompatibles, c’est-à-dire qu’ils ne sont pas toxiques pour les cellules. Ils doivent permettre la diffusion d’oxygène et de nutriment pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment et permettre leur survie. Ces hydrogels peuvent être choisis parmi tous les hydrogels biocompatibles présentant les caractéristiques de l’invention. Il peut s’agir par exemple d’alginate, de fibrine, de laminine, de fibronectine, d’entactine, d'acide hyaluronique et/ou de collagène. Il peut s’agir également d’une matrice extracellulaire ou d’un substitut de matrice extracellulaire tel que le Matrigel®.
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la partie interne comprend de l’alginate ou est un alginate mais différent de l’alginate de la couche externe si la couche externe est en alginate. Cette différence peut être caractérisée notamment par une différence de conductance diffusive, de viscosité, de densité, de poids moléculaire, de module d’Young et/ou de tailles de pores. Selon une variante, la partie interne comprend une couche et/ou un maillage d’hydrogel comprenant au moins de l’alginate. La couche et/ou maillage peut être constitué exclusivement ou partiellement d’alginate. L’alginate présent dans la partie interne peut être en particulier un alginate de sodium, composé à 80% d’α-L-guluronate et 20% de β-D-mannuronate. L’aginate de la partie interne peut être un alginate comprenant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d d’au moins un agent de transfection et/ou transduction, et/ou un module de Young compris entre 0,01kPa et 200kPa, préférentiellement entre 0,1kPa et 60 kPa, plus préférentiellement entre 0,1kPa et 5 kPa.
Préférentiellement, l’alginate présent dans la partie interne présente un poids moléculaire moyen d’au plus 75kDa. Lorsque l’hydrogel de la partie interne est de l’alginate, la concentration de la solution d’alginate destinée à former la partie interne du microcompartiment, est préférentiellement comprise entre 0,25 et 2%, plus préférentiellement entre 0,25 et 1%, encore plus préférentiellement 0,5% (pourcentage en masse). Lorsque la concentration de la solution d’alginate destinée à former la partie interne du microcompartiment est de 0,5%, la viscosité de l’alginate est préférentiellement de 3mPa/s.
Avantageusement, bien que les cellules mammaliennes soient incapables d'interagir avec l'alginate, notamment, car celui-ci permet une adsorption minimale des protéines, l’alginate est bien caractérisé, facile à stériliser et à stocker, il peut éventuellement être modifié chimiquement, et offre des propriétés mécaniques intéressantes. Aussi, l’alginate permet d’obtenir une bonne croissance, peu de mort cellulaire, une bonne amplification et une bonne proportion de cellules transfectées et/ou transduites.
Selon un mode de réalisation, l’hydrogel de la partie interne comprend de la fibrine ou est de la fibrine, la fibrine est préférentiellement obtenue à partir de la polymérisation du fibrinogène par un agent de polymérisation du fibrinogène, tel que la thrombine. Cet agent de polymérisation peut être ajouté pendant l’encapsulation et/ou après l’encapsulation. Aussi, la polymérisation de la solution de fibrinogène par la solution de thrombine a lieu au cours de l’encapsulation et/ou après celle-ci. Lorsqu’elle a lieu après l’encapsulation, la polymérisation a lieu au sein de la goutte ou de la capsule nouvellement formée, c’est-à-dire après la rigidification de la couche externe.
L’hydrogel de la partie interne, peut comprendre d’autres constituants comme par exemple au moins une séquence peptidique, plus préférentiellement une séquence peptidique d’intérêt apte à interagir avec les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention. A titre d’exemple la séquence peptidique peut être un peptide, ou une protéine. La séquence peptidique peut-être par exemple un motif YIGSR et/ou un motif RGD. Le motif YIGSR est un peptide issu de la chaîne β1 de la laminine de séquence Tyrosine-Isoleucine-Glycine-Serine-Arginine facilitant l’adhésion cellulaire à la matrice. Le motif RGD est un peptide de séquence Arginine-Glycine-Asparagine facilitant également l’adhésion cellulaire à la matrice.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la partie interne comprend au moins deux hydrogels différents, chacune étant différent de l’hydrogel de la couche externe. Ces au moins deux hydrogels présents dans la partie interne sont préférentiellement choisis parmi l’alginate, la fibrine, la laminine, la fibronectine, l'entactine, l'acide hyaluronique, et le collagène.
Lorsque la partie interne comprend au moins deux hydrogels, le deuxième hydrogel peut se présenter sous forme de particules.
Avantageusement, cette forme du deuxième hydrogel n’empêche pas la diffusion des agents de transfection et/ou transduction au sein de la partie interne tout en apportant un effet bénéfique sur les cellules, préférentiellement en améliorant la survie cellulaire.
Lorsque la partie interne comprend au moins une solution aqueuse, celle-ci ne limite pas la diffusion de particules solubles, notamment des agents de transfection et/ou des agents de transduction en fonction de leur taille au travers de ladite solution, en particulier les particules solubles dont la taille serait supérieure à 10 nm, préférentiellement à 25nm.
Selon un autre mode de réalisation, lorsque la partie interne comprend au moins une solution aqueuse, celle-ci présente une viscosité comprise entre 0,1 et 10mPa/s.
Préférentiellement, lorsque la partie interne comprend une solution aqueuse et un hydrogel, la partie interne présente une viscosité comprise entre 0,1 et 50mPa/s.
Préférentiellement, la viscosité de la partie interne est comprise entre 0,1 et 50mPa/s.
Avantageusement, la viscosité particulière de la solution aqueuse et/ou de l’hydrogel facilite la rencontre des agents de transfection et ou agents de transduction et des cellules aux seins de la partie interne du microcompartiment et par conséquent d’augmenter la proportion de cellules transduites/transfectées par rapport aux cultures en 2D ou aux cultures en 3D décrites dans l’art antérieur.
Dans le contexte de l’invention, la viscosité de la solution aqueuse et/ou de l’hydrogel peut être mesurée à l’aide d’un viscosimètre à 20°C.
Avantageusement, l’hydrogel et/ou la solution aqueuse de la partie interne permettent de favoriser la rencontre avec les cellules et par conséquent améliorer l’efficacité de transduction/transfection.
De façon préférée, lorsque la partie interne comprend une solution aqueuse, celle-ci est préférentiellement un milieu de culture adapté aux cellules du microcompartiment. Typiquement, le milieu de culture est choisi parmi les milieux de culture usuellement compatibles avec la culture des cellules présentent au sein du microcompartiment, par exemple parmi les milieux de culture utilisés en culture à deux dimensions ou en culture en sphéroïde.
Préférentiellement l’hydrogel de la couche externe et/ou dans la partie interne est choisi parmi la fibrine, le collagène, la fibronectine, l'entactine, l'acide hyaluronique, l’alginate, la laminine, un substitut de matrice extra cellulaire et leurs mélanges.
En plus de l’hydrogel et/ou de la solution aqueuse, la partie interne du microcompartiment comprend au moins un agent de transduction et/ou un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt.
Préférentiellement, le microcompartiment selon l’invention comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection dans la solution aqueuse et/ou dans l’hydrogel de la partie interne.
Lorsque le microcompartiment selon l’invention comprend au moins un agent de transduction, ledit agent peut être choisi parmi une particule virale, une pseudo-particule virale ou leur combinaison.
Préférentiellement, l’agent de transduction est choisi parmi un adénovirus, un virus adéno-associé, un retrovirus, un lentivirus, un Sendaï virus, un baculovirus et leurs combinaisons.
Préférentiellement, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transduction, la MOI (« multiplicity of infection ») dudit microcompartiment est compris entre 0,01 et 100, notamment entre 0,1 et 50, encore plus préférentiellement entre 0,1 et 10.
Selon une variante, lorsque le microcompartiment comprend au moins un agent de transduction, la MOI dudit microcompartiment est inférieure à 10.
Lorsque le microcompartiment selon l’invention comprend au moins un agent de transfection, ledit agent peut être choisi parmi une vésicule extracellulaire d’origine endosomale tel qu’un exosome, un dérivé de la membrane plasmique, un liposome, une nanoparticule, un complexe peptidique, du phosphate de calcium et leurs combinaisons.
Selon un mode de réalisation particulier, le microcompartiment comprend au moins un agent de transfection, ledit agent est un dérivé de la membrane plasmique comprenant des protéines d’origines virales
Avantageusement, le microcompartiment selon l’invention est adapté à tous types d’agents de transduction et de transfection susceptibles de modifier le génome, le transcriptome ou le protéome d’une cellule eucaryote, préférentiellement capable de comprendre et/ou d’exprimer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle. Par ailleurs, le microcompartiment selon l’invention nécessite une concentration en agent de transduction et/ou transfection plus faible que les solutions proposées par l’art antérieur tout en obtenant une efficacité de transfection/transduction similaire.
Selon un mode de réalisation, la plus petite dimension d d’au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction présent dans la partie interne du microcompartiment est supérieure à 10nm, préférentiellement comprise entre 15 et 25nm. Selon une variante, la majorité des agents de transfection et/ou des agents de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment, préférentiellement tous, présentent une plus petite dimension d inférieure à 25nm, préférentiellement comprise entre 15 et 25nm
Selon un autre mode de réalisation, la plus grande dimension D d’au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction présent dans la partie interne du microcompartiment est supérieure à 25nm, préférentiellement supérieure à 100nm, notamment supérieure à 500nm, encore plus préférentiellement supérieure à 1µm. Selon une variante, la majorité des agents de transfection et/ou des agents de transduction présents dans la partie interne du microcompartiment, préférentiellement tous, présentent une plus grande dimension D supérieure à 50nm, notamment supérieure à 100nm, encore plus préférentiellement comprise entre 300 et 500nm.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention comprend au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection dans la solution aqueuse et/ou l’hydrogel de la partie interne.
Avantageusement, ledit agent de transduction et/ou agent de transfection peut diffuser dans la solution aqueuse et/ou dans l’hydrogel de la partie interne de façon à augmenter ses chances de rencontrer une cellule et d’y insérer au moins une molécule d’intérêt.
De façon préférée, le microcompartiment selon l’invention comprend au moins un agent de transfection et/ou au moins un agent de transduction comprenant au moins une molécule d’intérêt choisie parmi un acide nucléique, un acide ribonucléique, une protéine, un peptide et leurs combinaisons.
Avantageusement, l’agent de transfection et/ou transduction permet de modifier le comportement des cellules présentes dans la partie interne en y insérant au moins une molécule d’intérêt.
En plus de l’hydrogel et/ou de la solution aqueuse et d’au moins un agent de transfection et/ou d’au moins un agent de transduction, la partie interne du microcompartiment comprend au moins une cellule.
Dans le contexte de l’invention, les cellules présentes dans le microcompartiment peuvent être tout type de cellules, en particulier les cellules sont des cellules eucaryotes. Plus préférentiellement, les cellules sont des cellules humaines ou végétales ou animales.
De façon préférée, les cellules présentes dans la partie interne sont choisies parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation, des cellules différenciées et leurs mélanges.
Dans un mode de réalisation particulier, le microcompartiment comprend des cellules souches pluripotentes. Une cellule souche pluripotente, ou cellule pluripotente, s’entend d’une cellule qui a la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel. Les cellules souches pluripotentes peuvent être en particulier des cellules souches pluripotentes induites (iPS), des cellules MUSE (« Multilineage-differentiating Stress Enduring ») que l’on trouve dans la peau et la moelle osseuse des mammifères adultes, ou des cellules souches embryonnaires (ES). Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention ne comprend pas de cellules souche embryonnaires (ES).
Selon une variante particulièrement adaptée de l’invention, le microcompartiment selon l’invention comprend des cellules souches pluripotentes induites humaines ou animales.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le microcompartiment selon l’invention comprend des cellules multipotentes humaines ou animales et/ou des cellules progénitrices humaines ou animales issues de ces cellules multipotentes et/ou des cellules en cours de différenciation. Les cellules multipotentes et/ou progénitrices ont préférentiellement été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes, en particulier de cellules souches pluripotentes humaines, ou éventuellement à partir de cellules humaines non pluripotentes dont le profil transcriptionnel a été modifié artificiellement pour rejoindre celui de cellules multipotentes et/ou de progéniteurs particuliers, typiquement par expression forcée de facteurs de transcriptions spécifiques du phénotype cellulaire cible. Préférentiellement, les cellules multipotentes et/ou progénitrices ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes après mise en contact avec une solution capable d’initier la différenciation desdites cellules souches.
Selon une autre variante, le microcompartiment selon l’invention comprend des cellules différenciées humaines ou animales. Les cellules différenciées ont préférentiellement été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes ou de cellules progénitrices, en particulier de cellules souches pluripotentes humaines ou de cellules progénitrices humaines, ou éventuellement à partir de cellules humaines non pluripotentes dont le profil transcriptionnel a été modifié artificiellement pour rejoindre celui de cellules différenciées particulières, typiquement par expression forcée de facteurs de transcriptions spécifiques du phénotype cellulaire cible. Préférentiellement, les cellules différenciées ont été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes ou multipotentes ou progénitrices après mise en contact avec une solution capable d’initier la différenciation desdites cellules souches. Selon une variante, le contenu cellulaire du microcompartiment comprend des identités cellulaires homogènes ou mixtes.
Les cellules différenciées peuvent en particulier se présenter sous forme d’au moins une couche de cellules ou sous forme d’un tissu, d’un agrégat cellulaire ou d’un micro-tissu en trois dimensions ou sous forme de plusieurs tissus ou micro-tissus dans le microcompartiment. Il peut s’agir d’un tissu ou micro-tissu compacté ou non, avec ou sans lumière.
Le microcompartiment selon l’invention peut donc comprendre plusieurs types de cellules. Ainsi, selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention présente dans sa partie interne au moins deux types cellulaires différents. En particulier, le microcompartiment selon l’invention peut comprendre par exemple des cellules souches induites à la pluripotence et/ou des cellules multipotentes et/ou des cellules progénitrices et/ou en cours de différenciation et/ou des cellules différenciées.
Lorsque le microcompartiment selon l’invention comprend au moins une couche de cellules ou assise de cellules, la solution aqueuse et/ou l’hydrogel sont préférentiellement agencés entre la couche externe en hydrogel et ladite couche ou assise de cellules. Etant entendu que le microcompartiment peut également comprendre dans sa partie interne des cellules en suspension dans la solution aqueuse ou l’hydrogel de la partie interne.
Lorsque le microcompartiment selon l’invention comprend au moins un agrégat et/ou un tissu et/ou un microtissu cellulaire, la solution aqueuse et/ou l’hydrogel sont préférentiellement agencés entre la couche externe en hydrogel et ledit agrégat et/ou tissu et/ou microtissu de cellules. Etant entendu que le microcompartiment peut également comprendre dans sa partie interne des cellules en suspension dans la solution aqueuse ou l’hydrogel de la partie interne.
Selon un autre objet préféré de l’invention, l’agrégat et/ou la couche de cellules et/ou l’assise de cellules et/ou le tissu et/ou le microtissu comprend au moins une lumière ou un lumen. Ladite lumière peut contenir un liquide, notamment du milieu de culture et/ou un liquide sécrété par les cellules.
Avantageusement la présence de cette partie creuse permet aux cellules de disposer d’un petit volume diffusif dont elles peuvent contrôler la composition, favorisant une communication cellulaire.
Selon un mode de réalisation, la couche de cellules et la couche et/ou le maillage en hydrogel et/ou la couche de solution aqueuse de la partie interne sont organisées autour d’au moins une lumière, plus préférentiellement elles sont organisées successivement autour d’au moins une lumière.
Selon un mode de réalisation, la couche de cellules et la couche et/ou le maillage en hydrogel et/ou la couche de solution aqueuse de la partie interne sont organisées successivement autour d’une lumière. On parle d’une conformation en forme de cyste.
Selon un mode de réalisation dans lequel le microcompartiment ne comprend qu’un seul cyste, la couche de cellules, la couche et/ou le maillage en hydrogel et/ou la couche de solution aqueuse de la partie interne, et la couche externe sont organisées successivement autour d’une lumière.
Cette conformation sous forme de cyste(s) permet de réduire les pressions subies par les cellules. Cette configuration permet également de diminuer la mortalité cellulaire et d’augmenter le facteur d’amplification de la culture. Par conséquence cela permet de réduire le nombre de passages et dissociation nécessaire ; de réduire le temps en culture nécessaire pour atteindre le nombre de cellules final nécessaire.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment peut comprendre un ou plusieurs cystes, et/ou un ou plusieurs tissus et/ou micro tissus et/ou agrégats de cellules avec ou sans lumière(s).
Avantageusement, le microcompartiment selon l’invention est adapté à la transduction et/ou transfection de tout type de cellule eucaryote.
Un tel microcompartiment est ainsi particulièrement adapté pour réaliser une modification génétique et/ou transcriptomique et/ou protéique de cellules d’intérêts, préférentiellement afin que lesdites cellules puissent comprendre et/ou exprimer au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Selon un objet particulier de l’invention, le microcompartiment selon l’invention est obtenu après plusieurs cycles de division cellulaire. En effet, les cellules comprises dans le microcompartiment selon l’invention peuvent être des cellules obtenues par amplification, à partir d’au moins une cellule.
En particulier, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention peuvent être obtenues après au moins deux cycles de division cellulaire après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel d’au moins une cellule.
De façon préférée, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28 ou 30 cycles de division cellulaire après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel d’au moins 1 cellule, préférentiellement entre 1 et 5, entre 1 et 10, entre 1 et 15, entre 1 et 20, entre 1 et 30, entre 1 et 40, entre 1 et 50, entre 1 et 60, entre 1 et 100 cellules. Par exemple, les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues après au moins six cycles de division cellulaire après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel d’au moins 1 cellule, préférentiellement entre 1 et 50 cellules.
Préférentiellement le microcompartiment est obtenu après au moins 2 passages après l’encapsulation, plus préférentiellement au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 passages. Chaque passage peut durer par exemple au moins 1 jour, ou entre 2 et 50 jours, notamment entre 3 et 10 jours.
Préférentiellement la totalité des cellules encapsulées initialement dans le microcompartiment avant le premier cycle de division cellulaire représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Ainsi, selon l’un mode de réalisation, les cellules présentes dans le microcompartiment selon l’invention ont été obtenues après au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 28, 30 cycles de division cellulaire, après l’encapsulation dans une couche externe d’hydrogel de cellule(s) représentant un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées, plus préférentiellement inférieur à 40%, 30%, 20%, 10% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées.
Préférentiellement, dans le microcompartiment selon l’invention, les cellules représentent plus de 50% en volume par rapport au volume du microcompartiment, encore plus préférentiellement plus de 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% en volume par rapport au volume du microcompartiment.
Le microcompartiment selon l’invention comprend plusieurs cellules, préférentiellement au moins 20 cellules, encore plus préférentiellement au moins 100, au moins 500, au moins 1000, au moins 10000.
Le microcompartiment selon l’invention peut être obtenu par encapsulation réalisée au moyen d’une co-injection réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange des différentes solutions utiles, ledit jet se fractionnant en gouttes. Les gouttes sont alors collectées dans un bain, notamment un bain de calcium, apte à rigidifier la solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
Selon une variante permettant la formation d’un tube, la co-injection est également réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant le tube dans la solution de calcium.
Le microcompartiment cellulaire selon l’invention est préférentiellement, clos ou partiellement clos, c’est à dire que la couche externe est close ou partiellement close. Plus préférentiellement le microcompartiment est clos.
Le microcompartiment selon l’invention peut se présenter sous toute forme en trois dimensions, c’est-à-dire qu’il peut avoir la forme de tout objet de l’espace. Le microcompartiment peut avoir n’importe quelle forme compatible avec l’encapsulation de cellules. Préférentiellement le microcompartiment selon l’invention se présente sous une forme sphérique ou allongée. Il peut avoir la forme d’un ovoïde, d’une larme, d’un cylindre, d’un sphéroïde ou d’une sphère. Il peut en particulier se présenter sous la forme d’un sphéroïde creux, d’un ovoïde creux, d’un cylindre creux ou d’une sphère creuse.
C’est la couche externe du microcompartiment, c’est-à-dire la couche d’hydrogel, qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment selon l’invention. Préférentiellement la plus petite dimension du microcompartiment selon l’invention est comprise entre 10 µm et 1 mm, préférentiellement entre 100 µm et 700 µm. Elle peut être comprise entre 200 µm et 600 µm, notamment entre 300µm et 500 µm.
Sa plus grande dimension est préférentiellement supérieure à 10µm, plus préférentiellement comprise entre 10µm et 1m, encore plus préférentiellement entre 10µm et 50cm.
Le microcompartiment selon l’invention peut être éventuellement congelé pour être stocké. Il devra ensuite être décongelé avant son utilisation.
L’invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble. Aussi, l’invention vise aussi un ensemble ou une série de microcompartiments cellulaires tels que décrits précédemment comprenant au moins un microcompartiment cellulaire selon l’invention.
L’invention vise aussi un ensemble ou une série de microcompartiments d’au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, dans lequel au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’invention, préférentiellement la majorité des microcompartiments de l’ensemble sont des microcompartiments selon l’invention. Selon un mode de réalisation particulier la totalité des microcompartiments de l’ensemble sont des microcompartiments selon l’invention.
L’ensemble de microcompartiments selon l’invention comprend préférentiellement entre 2 et 1016microcompartiments, préférentiellement entre 1000 et 109microcompartiments selon l’invention.
De façon préférée la série de microcompartiments selon l’invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l’invention a pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu’un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu’un bioréacteur.
La présence d’une couche externe d’hydrogel et de la solution aqueuse et/ou l’hydrogel de la partie interne, permettent une distribution uniforme des cellules entre les microcompartiments. Par ailleurs la couche externe d’hydrogel permet d’éviter les fusions de microcompartiments qui sont une source majeure de variabilité défavorable pour l’homogénéité phénotypique des cellules.
Selon un mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention est susceptible d’être obtenu par un procédé comprenant la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, ledit hydrogel présentant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l’étape (a) ;
(d) cultiver les microcompartiments obtenues à l’étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
(e) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, ledit hydrogel présentant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l’étape (a) ;
(d) cultiver les microcompartiments obtenues à l’étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
(e) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
Ainsi, le microcompartiment selon l’un des quelconques modes de réalisation précédemment décrits ou l’ensemble de microcompartiment selon l’un des quelconques modes de réalisation précédemment décrits, est également particulièrement adapté pour être utilisé en culture cellulaire, en particulier en culture cellulaire en trois dimensions. Ceux-ci permettant la production de cellules d’intérêt en grande quantité, notamment des cellules, micro-tissu ou organoïde exprimant au moins une séquence peptidique, une séquence ARN codante ou non codante, ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle, susceptible d’être utilisé, par exemple dans le cadre de thérapie cellulaire. Aussi, l’invention se rapporte également à un microcompartiment selon l’invention ou un ensemble de microcompartiment selon l’invention, pour son utilisation comme médicament.
Ainsi, le microcompartiment est particulièrement adapté à une utilisation en clinique.
Selon un autre objet, l’invention se rapporte à l’utilisation du microcompartiment selon l’un des quelconques précédents objets, pour insérer au moins une séquence peptidique, une séquence ARN codante ou non codante, ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle dans au moins une cellule eucaryote.
L’invention se rapporte également à l’utilisation du microcompartiment selon l’invention pour la mise en œuvre de procédé(s) de transfection et/ou de transduction.
Selon un autre objet, l’invention se rapporte à l’utilisation du microcompartiment selon l’un des quelconques précédents objets, pour la production, préférentiellement à grande échelle, de cellules, micro tissus ou tissus exprimant au moins un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
Procédé de préparation
Le microcompartiment peut être obtenu par différents moyens connus de l’Homme du métier pour préparer des microcompartiments ou capsules.
L’invention a également pour objet un procédé particulier de préparation de microcompartiments.
Selon un mode de réalisation, l’invention a pour objet un procédé de préparation d’un microcompartiment comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, ladite solution et/ou ledit hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel, ledit hydrogel étant différent de l’éventuel hydrogel de l’étape (b).
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, ladite solution et/ou ledit hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel, ledit hydrogel étant différent de l’éventuel hydrogel de l’étape (b).
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation selon l’invention comprend également une étape (d) consistant à cultiver les microcompartiment obtenus à l’étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours.
Selon un autre mode de réalisation, l’étape (c) consiste à encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel, ledit hydrogel présentant une conductance diffusive à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’invention comprend la mise en œuvre des étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, ledit hydrogel présentant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection.
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l’étape (a).
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, ledit hydrogel présentant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection.
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogels des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel présentant des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection de l’étape (a).
Selon un mode de réalisation, la solution de l’étape (a) est réalisée dans au moins une solution aqueuse, préférentiellement un milieu de culture adapté. Ledit milieu de culture comprend préférentiellement au moins un facteur cytoprotecteur, plus préférentiellement au moins un inhibiteur de l’apoptose.
L’inhibiteur de l’apoptose peut par exemple être un ou plusieurs inhibiteur(s) des voies RHO/ROCK (« Rho-associated protein kinase »), ou tout autre inhibiteur de l’apoptose connu de l’homme du métier. L’inhibiteur de l’apoptose doit permettre de promouvoir la survie des cellules au moment de la formation de la couche externe d’hydrogel.
Le procédé selon l’invention peut comprendre une étape de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique, préalablement ou simultanément mise en œuvre à l’étape d’incubation des cellules, elle-même effectuée préalablement à l’étape a) de mélange. Cette étape est particulièrement importante dans le cas de cellules adhérentes.
Les cellules encapsulées sont en suspension sous forme de cellules uniques et/ou d’amas de cellules. De façon préférée, les cellules uniques représentent moins de 50% en nombre de la totalité des cellules encapsulées, plus préférentiellement les cellules uniques sont des cellules hPSC. En effet il est préférable d’encapsuler des amas de cellules car cela diminue l’apoptose.
De façon préférée, la densité cellulaire de la solution de l’étape (a) est comprise entre 0,1 et 40 millions de cellules par mL, préférentiellement entre 0,8 et 20 millions.
La solution de l’étape (a) comprend préférentiellement au moins une cellule choisie parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation, des cellules différenciées et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré, la solution de l’étape (a) comprend au moins 2 types cellulaires différents.
De façon préférée, l’agent de transduction est choisi parmi un adénovirus, un virus adéno-associé, un retrovirus, un lentivirus, un Sendaï virus, un baculovirus et leurs combinaisons.
Selon un autre mode de réalisation, la solution de l’étape (b) comprend au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, ledit agent peut être choisi parmi une vésicule extracellulaire d’origine endosomale tel que qu’un exosome, un dérivé de la membrane plasmique, un liposome, une nanoparticule, un complexe peptidique, du phosphate de calcium et leurs combinaisons.
Préférentiellement, l’étape (c) d’encapsulation comprend les sous étapes suivantes :
- mettre en contact la solution de l’étape (a), la solution de l’étape (b) et une solution d’hydrogel destinée à former la couche externe pour former au moins une goutte, et
- collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
- mettre en contact la solution de l’étape (a), la solution de l’étape (b) et une solution d’hydrogel destinée à former la couche externe pour former au moins une goutte, et
- collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
Une fois la couche externe en hydrogel rigidifiée par le bain de calcium, le microcompartiment est formé. Celui-ci peut alors être rincé. Avantageusement, si le module de Young de l’hydrogel dans la partie interne est inférieur à celui de l’hydrogel de la couche externe, cela permet d’éviter/de limiter la rigidification de l’hydrogel dans la partie interne par le bain de calcium. En particulier, étant donné, le module de Young de l’hydrogel dans la partie interne strictement inférieur à celui de l’hydrogel de la couche externe, le processus de rigidification par le bain de calcium ne permet pas de rigidifier l’hydrogel dans la partie interne pendant la durée d’utilisation des capsules et donc de faciliter la multiplication cellulaire.
Préférentiellement, l’étape (c) est réalisée par une co-injection simultanée de la solution d’hydrogel destinée à former la couche externe, de la solution de l’étape (a) et de la solution de l’étape (b); ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes.
Selon un objet de l’invention, le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est compris entre 50 et 800 µm, préférentiellement entre 80 et 240 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 0,1 et 2000 mL/h, préférentiellement entre 10 et 2000 mL/h, plus préférentiellement entre 11 et 100 mL/h.
Selon un variante, l’étape (c) est réalisée par une co-injection simultanée de la solution d’hydrogel destinée à former la couche externe, de la solution de l’étape (a) et de la solution de l’étape (b); ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant un tube.
Lorsque la pointe de l’injecteur est en contact avec la solution de calcium, le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est préférentiellement compris entre 50 et 1000 µm, plus préférentiellement entre 80 et 300 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 1 et 100 mL/h.
Selon une autre variante de l’invention, la partie interne comprenant au moins un hydrogel comprenant des pores dont la plus petite dimension est supérieure à la plus petite dimension d dudit agent de transduction et/ou agent de transfection comprend également au moins un deuxième hydrogel distinct du premier hydrogel constituant la couche ou le maillage de la partie interne.
Lorsque au moins un hydrogel de la partie interne est la fibrine, elle est préférentiellement obtenue à partir de la polymérisation du fibrinogène par un agent de polymérisation du fibrinogène, avantageusement ledit agent est la thrombine, ledit agent peut être ajouté pendant l’encapsulation et/ou après l’encapsulation.
Aussi, selon une variante la solution de thrombine est co-injectée avec les autres solutions, celle-ci est préférentiellement mélangée avec la solution intermédiaire isotonique et la solution de fibrinogène est mélangée avec la solution de l’étape (b).
Préférentiellement, la concentration du fibrinogène est comprise entre 10 et 25 mg/mL, préférentiellement 14-20 mg/mL, plus préférentiellement 20 mg/mL.
Selon un autre objet de l’invention, la concentration de la thrombine est préférentiellement comprise entre 0.001U/mL et 2U/ml, plus préférentiellement entre 0.01U/mL et 1U/ml, entre 0.01U/mL et 0,05U/ml, encore plus préférentiellement 0,04U/ml. Par « U » on entend une unité d’activité enzymatique (soit la concentration pour une enzyme) qui représente la quantité d’enzyme nécessaire pour traiter une micromole de substrat en 1 minute. Etant entendu que la concentration indiquée est celle dans le mélange. En effet, avantageusement la thrombine est mélangée avec les autres constituants selon un ratio 1 :1. Aussi, au sein de la capsule, lorsque que la concentration de la thrombine, avant le mélange, est de 0.01U/ml, la concentration dans la capsule est de l’ordre de 0.01U/ml.
Les étapes postérieures à l’encapsulation peuvent être mises en œuvre en l’absence d’agitation ou sous agitation. Préférentiellement, les étapes postérieures à l’encapsulation sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Cette agitation est importante car elle maintient l’homogénéité de l’environnement de culture et évite la formation de tout gradient diffusif. Par exemple, elle permet un contrôle homogène de niveau d’oxygénation cellulaire ; évitant ainsi les phénomènes de nécrose lié à l’hypoxie, ou de stress oxydatif lié à l’hyperoxie. Par conséquent, elle évite une augmentation de la mortalité cellulaire et/ou du stress oxydatif.
Préférentiellement, après l’étape de culture des capsules obtenues, le procédé comprend une étape qui consiste à rincer les capsules issues de l’étape (d), avantageusement de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur, tel que l’inhibiteur de l’apoptose.
Lorsque, le procédé selon l’invention, comprend une étape de rinçage des capsules obtenues, la solution constituant le bain de calcium est éliminée et remplacée par un milieu adapté pour la culture des microcompartiments selon l’invention, préférentiellement une solution isotonique, plus préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose. L’étape de rinçage des capsules obtenues est réalisée après l’étape (d).
Dans une variante préférée, le procédé selon l’invention comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (d), préférentiellement après l’étape de rinçage si une telle étape est présente après l’étape (d). Par « au moins une ré-encapsulation des cellules », on entend au moins deux cycles d’encapsulations. Préférentiellement chaque cycle d’encapsulation correspond à un passage. Dans cette variante du procédé (au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (d) le nombre de divisions cellulaires de l’ensemble du procédé (pour l’ensemble des passages) est d’au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire.
Dans un procédé selon l’invention il peut y avoir plusieurs ré-encapsulation, préférentiellement entre 1 et 100, notamment entre 1 et 10 ré-encapsulation.
Chaque ré-encapsulation peut comprendre :
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d’amas de cellules ; l’élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c’est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l’élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d’ions divalents, une enzyme comme l’alginate lyase si l’hydrogel comprend de l’alginate et/ou la microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d’hydrogel.
- une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de cellules ou une suspension d’amas de cellules ; l’élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c’est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l’élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d’ions divalents, une enzyme comme l’alginate lyase si l’hydrogel comprend de l’alginate et/ou la microdissection laser, et
- une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des cellules ou amas de cellules dans une capsule d’hydrogel.
La ré-encapsulation est un moyen adapté pour une augmentation de l’amplification cellulaire obtenue depuis l’étape pluripotente, et diminuer les risques de mutation.
Selon un mode de réalisation particulier la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes :
- éliminer la couche externe en hydrogel,
- remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
- encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ;
- préférentiellement, cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l’apoptose, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- préférentiellement, rincer les microcompartiments, avantageusement, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et
- optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
- éliminer la couche externe en hydrogel,
- remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose,
- encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ;
- préférentiellement, cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l’apoptose, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ;
- préférentiellement, rincer les microcompartiments, avantageusement, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ;
- cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et
- optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
L’invention a également pour objet un procédé de transduction mis en œuvre dans au moins un microcompartiment cellulaire définis dans l’un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit.
Enfin, l’invention a également pour objet un procédé de transfection mis en œuvre dans au moins un microcompartiment cellulaire définis dans l’un des quelconques modes de réalisation préalablement décrit.
L’invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs de compositions selon l’invention et par des résultats.
Exemple 1 : Transduction de lymphocytes T CD3+ primaires humains
Le schéma expérimental de l’exemple 1 est décrit à la .
Les lymphocytes T CD3+ humains primaires sont décongelés, comptés et ensemencés à raison de 1 million de cellules par ml dans le milieu TexMACS (Miltenyi Biotec).
Après l'ensemencement, les cellules sont activées en ajoutant "T Cell TransAct human " au milieu de culture cellulaire (dilution au 1/100e) et de l'IL-2 (concentration finale de 300 U/mL).
Les cellules sont cultivées dans un flacon de culture cellulaire T75 (maintenu en position verticale) à 37°C, 5% CO2.
48 heures après l'activation, les cellules sont collectées et concentrées à 10 millions de cellules par ml dans du milieu TexMACS supplémenté en IL-2 (300 U/mL).
En parallèle, les vecteurs viraux sont dilués dans un volume de milieu TexMACS (supplémenté en IL-2 à 300 U/mL) jusqu'à la MOI finale souhaitée (voir le tableau 1 ci-dessous) et ajoutés aux cellules pour obtenir une densité finale de 5 millions de cellules par mL.
| Titre | Nul | Bas | Moyen | Haut | |
| Lentivirus (LV) | 1,00E+09 TU/ml | 0 | 0,1 | 1 | 10 |
| Sendaï virus (SeV) | 1,10E+08 CIU/ml | 0 | 0,3 | 1 | 5 |
La population cellulaire obtenue (contenant des particules virales) est divisée en 2 échantillons, l'un pour la culture cellulaire 2D dans une plaque de 12 puits (volume final de milieu de 1mL à 0,5 million de cellules par mL) et l'autre pour l'encapsulation cellulaire 3D.
Pour l'encapsulation, 400 µl de l'échantillon de cellules et de vecteurs viraux (à raison de 5 millions de cellules par ml) sont injectés dans le système d'encapsulation programmé avec les paramètres suivants : débit de la seringue d'alginate (100 ml/h) ; débit des cellules et des solutions intermédiaires (50 ml/h) ; champ électrique (2000 V).
Les cellules passent à travers le dispositif d'encapsulation et les capsules sont collectées dans un bain de calcium (25 mM HEPES, 100 mM CaCl2, Tween80) situé en dessous de la buse de sortie de la puce d'encapsulation (configuration grandes capsules). Les capsules sont ensuite collectées et rincées avec du milieu DMEM/F12 additionné de CaCl2 (3mM final) sur un filtre de 100 µm. Les capsules rincées sont remises en suspension dans 4 volumes (en utilisant le volume des capsules comme référence) de milieu TexMACS additionné de CaCl2 (3mM final).
Une fois que les capsules se sont déposées (~30 minutes à 1 heure), elles sont collectées sur un filtre de 100 µm et remises en suspension dans 13 ml de milieu TexMACS supplémenté en IL-2 (300 U/mL), transférées dans un flacon T75 et incubées à 37°C, 5% CO2.
Les capsules ainsi formées comprennent une couche externe en hydrogel présentant un alginate à 2% à un poids moléculaire de 150-250 KDa XXXXXXX. La partie interne comprend quand à elle une solution aqueuse composée de milieu de culture TexMACS.
2 jours (pour les vecteurs SeV) ou 5 jours (pour les vecteurs LV) après la transduction/encapsulation, les cellules sont décapsulées à l'aide de 10 volumes de ReLeSR, culottées et remises en suspension dans le milieu TexMACS pour être comptées et traitées ultérieurement pour la cytométrie en flux.
Les cellules à analyser par cytométrie en flux sont incubées avec le LIVE/DEAD™ Fixable Near IR (780) (Thermo Fisher Scientific, catalogue # L34994) pendant 30 minutes à température ambiante (RT) en suivant les instructions du fabricant. Les cellules sont ensuite incubées avec différents anticorps fluorescents (voir tableau 2), fixées dans du PBS/4% PFA et analysées par cytométrie en flux (LSR Fortessa 5L). Les résultats de cytométrie en flux obtenus pour l'expression de la GFP sont présentés à la et 2B pour le vecteur Lentiviral et à la et 2E pour le vecteur viral sendaï. A titre complémentaire, des résultats portant sur la viabilité cellulaire comparant les systèmes en 2D et 3D sont présentés à la pour le vecteur Lentiviral et 3B pour le vecteur viral Sendaï.
| Cible | Référence | Dilution |
| Mouse Anti-Human CD4 BUV737 | 612748 | 1/200 |
| Mouse Anti-Human CD25 PE | 341009 | 20/100 |
| Mouse Anti-Human CD8 APC | 340584 | 1/100 |
| Mouse Anti-Human CD3 BUV395 | 563548 | 1/100 |
L’efficacité de transduction (% de cellules GFP+) des lymphocytes T par les lentivirus est meilleure pour les conditions de l’encapsulation cellulaire en 3D que pour les conditions 2D, notamment pour les plus faibles MOI testées (0.1 et 1), et ce sans affecter la viabilité des cellules ( et 3B). Par ailleurs, en plus de transduire plus de cellules, dans la condition de l’encapsulation cellulaire en 3D permet une meilleure expression du transgène dans les cellules transduites comme démontré par les intensités de fluorescence plus élevées ( et 2E). Cette meilleure expression du transgène est associée à un plus grand nombre de transgènes insérés dans le génome des lymphocyte T en condition 3D qu’en 2D à MOI équivalente ( )
De manière similaire, l’efficacité de transduction (% de cellules GFP+) des lymphocytes T par les vecteurs viraux Sendaï est meilleure pour les conditions de l’encapsulation cellulaire en 3D que pour les conditions 2D pour toute les MOI testées (0.3, 1 et 5) ( et 2D), et ce sans affecter la viabilité des cellules. Par ailleurs, en plus de transduire plus de cellules, l’encapsulation cellulaire en 3D permet une meilleure expression du transgène dans les cellules transduites comme démontré par les intensités de fluorescence plus élevées.
Exemple 2 : Transduction de cellules souches pluripotentes induites humaines (hIPS)
Pour les hiPSCs, les conditions de culture cellulaire pour les configurations 2D et 3D (avant l'encapsulation des cellules) sont différentes de l’exemple 1.
Le schéma expérimental de l’exemple 2 est décrit à la .
La veille de l'encapsulation, les cellules pour les expériences de transduction 2D sont ensemencées à 25 000 cellules/cm² dans une plaque à 12 puits dans le mTeSR1 complété par l'inhibiteur de Rock (10 µM final).
Pour les expériences de transduction 3D, le jour de l'encapsulation, des cellules préalablement cultivées en 2D sont lavées deux fois dans du PBS et détachées de la plaque à l'aide d'Accutase pendant 3 minutes à 37°C. Une fois en suspension, les cellules sont collectées dans 2 volumes de mTeSR1, concentrées à 10 millions de cellules/mL dans du milieu mTeSR1 supplémenté en inhibiteur de Rock (10 µM final) et incubées avec des vecteurs viraux à différentes MOI (décrites dans le tableau 3) pour une densité finale de 5 millions de cellules/mL. 400 µl de la suspension de cellules et de particules virales sont ensuite injectés dans le système d'encapsulation programmé avec les paramètres suivants : Débit de la seringue d'alginate (100 mL/h) ; Débit des cellules et des solutions intermédiaires (50 mL/h) ; Champ électrique (2000V). Les cellules passent à travers le dispositif d'encapsulation et les capsules sont collectées dans un bain de calcium (25 mM HEPES, 100 mM CaCl2, Tween80) situé en dessous de la buse de sortie de la puce d'encapsulation (configuration grandes capsules).
Les capsules sont ensuite collectées et rincées avec du milieu DMEM/F12 additionné de CaCl2 (3mM final) sur un filtre de 100 µm. Les capsules rincées sont remises en suspension dans 4 volumes (en utilisant le volume des capsules comme référence) de milieu DMEM/F12 additionné de CaCl2 (3mM final). Une fois que les capsules se déposent (~30 minutes à 1 heure), elles sont collectées sur un filtre de 100 µm et remises en suspension dans 13 mL de milieu mTeSR1 supplémenté en inhibiteur de Rock (10 µM final), transférées dans un flacon T75 et incubées à 37°C, 5% CO2.
Les capsules ainsi formées comprennent une couche externe en hydrogel présentant un alginate à 2% à un poids moléculaire de 150-250 kDa. La partie interne comprend quant à elle une solution aqueuse composée de milieu de culture mTeSR1.
Le même jour, le milieu des cellules cultivées pour la transduction cellulaire 2D (ensemencées la veille dans une plaque de 12 puits) est remplacé par du milieu mTeSR1 supplémenté en inhibiteur de Rock (10 µM final) et transduites avec des vecteurs viraux aux mêmes MOI que celles utilisées dans la configuration 3D (voir tableau 3).
| Titre | Nul | Bas | Moyen | Haut | |
| Lentivirus (LV) | 1,00E+09 TU/ml | 0 | 1 | 3 | 10 |
| Sendaï virus (SeV) | 1,10E+08 CIU/ml | 0 | 0,3 | 1 | 3 |
| Adeno associated virus (AAV) | 5,00E+12 GC/cell | 0 | 1E2 | 1E3 | 1E4 |
Le jour suivant la transduction, le milieu des cellules cultivées en 2D est remplacé par du mTeSR1 sans inhibiteur de Rock et le milieu des cellules cultivées en 3D est remplacé par du mTeSR1 supplémenté en inhibiteur de Rock (10 µM). Deux jours après la transduction, le milieu est à nouveau remplacé par du mTeSR1 sans inhibiteur de Rock, aussi bien pour les cellules cultivées en 2D qu'en 3D.
Trois jours après la transduction, les cellules cultivées en 3D sont décapsulées en retirant le milieu de croissance et en ajoutant 10 volumes de ReLeSR (pour chaque volume de capsules). Après décapsulation, les cellules sont dissociées à l'aide de TrypLE 0,5X, remises en suspension dans le milieu mTeSR1 et soumises à la cytométrie en flux. Les cellules à analyser par cytométrie de flux sont incubées avec la chaux fixable pendant 30 minutes à température ambiante (RT) en suivant les instructions du fabricant. Les cellules sont ensuite incubées avec différents anticorps fluorescents (voir tableau 4), fixées dans du PBS/4% PFA et analysées par cytométrie en flux. Les résultats de cytométrie en flux obtenus pour l'expression de la GFP sont présentés à la .
| Cible | Dilution |
| Oct3/4 antibody, anti-human/mouse PE | 1/50 |
| Nanog antibody, anti-human APC | 1/50 |
L’efficacité de transduction (% de cellules GFP+) des iPSC est meilleure pour les conditions d’encapsulation en 3D que pour les conditions 2D, et ce, qu’elle que soit la MOI utilisées pour les vecteurs lentiviraux, les AAV ou les vecteurs viraux Sendaï.
Exemple 3 :
Transduction de cellule encapsulée selon l’invention avec plusieurs agents de transduction.
Les conditions expérimentales de cet exemple sont identiques à celle de l’exemple 1.
Toutefois, la transduction est réalisée avec 3 lentivecteurs au lieu d’un seul dans l’exemple 1. Les MOI indiquées correspondent à la MOI total utilisée pour la combinaison des 3 lentivecteurs. Les résultats sont présentés à la . Ces résultats montrent qu’il est possible de co-transduire des cellules à l’aide de plusieurs vecteurs dans un microcompartiment en 3D.
Exemple 4 : Etude comparative de l’efficacité de transduction au sein de microcompartiment comprenant un seul hydrogel vs un microcompartiment selon l’invention
Pour réaliser cette étude comparative, cet exemple comprend 3 conditions spécifique :
*Condition 1 : un microcompartiment selon l’invention comprenant une couche externe en hydrogel composée d’alginate 2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa) et une partie interne comprenant une solution aqueuse (milieu mTeSR1).
*Condition 2 : un microcompartiment selon l’invention comprenant une couche externe en hydrogel composée d’alginate 2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa) et une partie interne comprenant un hydrogel d’alginate 0,5% de faible poids moléculaire (< 75kDa). Par conséquent, l’hydrogel de la couche externe et l’hydrogel de la partie interne sont différents.
*Condition 3 : un microcompartiment « plein », hors invention, comprenant un hydrogel d’alginate 1,2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa).
*Condition 2 : un microcompartiment selon l’invention comprenant une couche externe en hydrogel composée d’alginate 2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa) et une partie interne comprenant un hydrogel d’alginate 0,5% de faible poids moléculaire (< 75kDa). Par conséquent, l’hydrogel de la couche externe et l’hydrogel de la partie interne sont différents.
*Condition 3 : un microcompartiment « plein », hors invention, comprenant un hydrogel d’alginate 1,2% de haut poids moléculaire (150-250 kDa).
Pour obtenir la condition 3, le protocole décrit par Neumann et al., 2013 (DOI 10.1007/s12033-012-9522-y) a été reproduit.
Résultats :
Trois jours après la transduction, on peut observer à la que la transduction est plus efficace dans la condition 1 (82,5% de cellules GFP+ avec une intensité de fluorescence de 32338) que dans la condition 3 (37.1% de cellules GFP+ avec une intensité de fluorescence de 11317). La condition 2 un taux de transduction intermédiaire (73.3% de cellules GFP+ avec une intensité de fluorescence de 20909). En plus d’améliorer l’efficacité de transduction, la condition 2 démontre une meilleure viabilité ainsi qu’une meilleure amplification des cellules comparée à la condition 3 ( ).
La transduction au sein des microcompartiment générés dans les conditions 1 et 2 est donc plus efficace et moins toxique pour les cellules que la transduction réalisée dans la condition 3 ( et ). Par ailleurs, le fait que la condition 2 soit plus performante que la condition 3 ( ) démontre que l’on peut décorréler les propriétés physiques nécessaires à la formation des microcompartiment de celui favorisant une transduction et une culture cellulaire optimale, notamment en bioréacteur. En effet, il serait impossible de générer/maintenir l’intégrité physique de capsules pleines d’alginate à 0.5%.
Claims (40)
- Microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant :
- au moins une cellule eucaryote humaine, animale ou végétale, ledit microcompartiment ne comprenant pas de cellules souches embryonnaires d’êtres humains ;
- au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt, et
- au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel différent de l’hydrogel constituant la couche externe. - Microcompartiment cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que l’hydrogel de la partie interne est différent de l’hydrogel constituant la couche externe, en ce qu’il présente au moins une propriété chimique et/ou au moins une propriété physique différente.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, dans lequel la conductance diffusive de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection est inférieure strictement à la conductance diffusive de la partie interne à ce même agent de transduction et/ou agent de transfection.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, dans lequel la conductance diffusive maximale de l’hydrogel de la couche externe à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection est inférieure à 0,1/h, préférentiellement inférieure à 0,05/h, encore plus préférentiellement inférieure à 0,01/h.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, dans lequel la conductance diffusive maximale de l’hydrogel de la partie interne à au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection supérieure à 0,1/h, est préférentiellement supérieure à 1/h, encore plus préférentiellement supérieure à 10/h, notamment supérieure à 50/h.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, dans lequel le ratio de la conductance diffusive de l’hydrogel de la partie interne sur la conductance diffusive de l’hydrogel de la couche externe par rapport à un agent de transfection et/ou transduction supérieur à 5, préférentiellement supérieur à 10, encore plus préférentiellement supérieur à 100, notamment supérieur à 1000.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, dans lequel la couche externe comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à la plus petite dimension d dudit au moins un agent de transduction et/ou agent de transfection et, lorsque la partie interne comprend un hydrogel, celui-ci comprend des pores dont la plus petite dimension est supérieure à cette dimension d.
- Microcompartiment cellulaire selon la revendication 7, caractérisé en ce que la plus petite dimension des pores de l’hydrogel de la partie interne est supérieure à 10nm, préférentiellement comprise entre 25 et 500nm.
- Microcompartiment cellulaire selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la couche externe comprend des pores dont la plus grande dimension est inférieure à 25nm, préférentiellement inférieure à 10nm.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’hydrogel de la couche externe présente une densité et/ou une viscosité strictement supérieure à la densité et/ou la viscosité de la solution et/ou l’hydrogel présent au sein de la partie interne.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’hydrogel de la couche externe présente un poids moléculaire différent de l’hydrogel présent au sein de la partie interne.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe présente une résistance à la diffusion plus importante que la solution et/ou l’hydrogel de la partie interne.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la viscosité de la partie interne est comprise entre 0,1 et 50 mPa/s.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce la partie interne comprend :
- au moins une couche de solution aqueuse ; et/ou
- au moins une couche et/ou un maillage en hydrogel. - Microcompartiment cellulaire selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection se trouve dans la solution aqueuse et/ou dans l’hydrogel de la partie interne.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’au moins un agent de transduction est choisi parmi une particule virale, une pseudo particule virale et leur combinaison.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’au moins un agent de transfection est choisi parmi une vésicule extracellulaire d’origine endosomale, un dérivé de la membrane plasmique, un liposome, une nanoparticule, un complexe peptidique, du phosphate de calcium et leurs combinaisons.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprend au moins une molécule d'intérêt choisie parmi un acide nucléique, un acide ribonucléique, une protéine, un peptide et leurs combinaisons.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne comprend au moins deux types cellulaires différents.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules eucaryotes présentes dans la partie interne sont choisies parmi des cellules pluripotentes, des progéniteurs, des cellules en cours de différenciation, des cellules différenciées et leurs mélanges.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne comprend au moins une solution aqueuse et/ou un hydrogel dont le module de Young est strictement inférieur au module de Young de l’hydrogel de la couche externe.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le module de Young de la solution aqueuse ou de l’hydrogel dans la partie interne est compris entre 0,01 et 200kPa, préférentiellement de 0,1 et 60 kPa.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le module de Young de l’hydrogel dans la partie interne est compris entre 0,1 et 5kPa.
- Microcompartiment cellulaire selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le module de Young de l’hydrogel de la couche externe est supérieur à 10kPa, préférentiellement supérieur à 60kPa.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’hydrogel de la couche externe et/ou dans la partie interne est choisi parmi la fibrine, le collagène, la fibronectine, l'entactine, l'acide hyaluronique, l’alginate, la laminine, un substitut de matrice extra cellulaire et leurs mélanges.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la solution aqueuse de la partie interne est un milieu de culture adapté à la culture des cellules présentes dans la partie interne.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microcompartiment est clos.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microcompartiment a la forme d’un ovoïde, d’un cylindre, d’un sphéroïde, d’une sphère ou d’une larme.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne du microcompartiment comprend au moins une couche de cellules et/ou un au moins un agrégat de cellules et/ou au moins un micro-tissu cellulaire en trois dimensions, ledit agrégat et/ou micro-tissu comprenant éventuellement au moins une lumière.
- Ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’une des revendications précédentes.
- Microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 1 à 29 ou ensemble de microcompartiments cellulaires selon la revendication 30 pour son utilisation en tant que médicament.
- Utilisation d’un microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 1 à 29 ou ensemble de microcompartiments cellulaires selon la revendication 30 pour produire à grande échelle des cellules et/ou des micro-tissus et/ou des organoïdes exprimant au moins une séquence peptidique et/ou une séquence ARN codante ou non codante et/ou un transgène de manière transitoire, constitutive ou conditionnelle.
- Procédé de préparation d’un microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 1 à 29, comprenant les étapes suivantes :
(a) préparer une solution contenant des cellules,
(b) préparer au moins une solution aqueuse et/ou au moins un hydrogel, ladite solution et/ou ledit hydrogel comprenant au moins un agent de transduction et/ou au moins un agent de transfection comprenant au moins une molécule d’intérêt,
(c) encapsuler les solutions et/ou hydrogel(s) des étapes (a) et (b) par flux colinéaire dans une couche externe d’hydrogel, ledit hydrogel étant différent de l’éventuel hydrogel de l’étape b). - Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il comprend également une étape (d) qui consiste à cultiver les microcompartiments obtenues à l’étape (c) dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours.
- Procédé selon l’une des revendications 33 ou 34, caractérisé en ce que la densité cellulaire de la solution de l’étape (a) est comprise entre 0,1 et 40 millions de cellules par mL, préférentiellement entre 0,8 et 20 millions.
- Procédé selon l’une des revendications 33 à 35, caractérisé en ce que la solution de l’étape (a) comprend au moins 2 types cellulaires différents.
- Procédé selon l’une des revendications 33 à 36, caractérisé en ce que l’étape (c) est réalisée par co-injection simultanée d’une solution d’hydrogel destinée à former la couche externe, de la solution de l’étape (a) et de la solution de l’étape (b) ; ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes.
- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est compris entre 50 et 800 µm, préférentiellement entre 80 et 240 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 10 et 2000 mL/h, préférentiellement entre 11 et 100 mL/h.
- Procédé selon l’une des revendications 33 à 36, caractérisé en ce que l’étape (c) est réalisée par co-injection simultanée de la solution d’hydrogel destinée à former la couche externe, la solution de l’étape (a) et la solution de l’étape (b), ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique, ledit injecteur comprenant une pointe, ladite pointe étant en contact avec une solution de calcium, formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet formant un tube.
- Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est compris entre 50 et 1000 µm, préférentiellement entre 80 et 300 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 1 et 100 mL/h.
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Citations (2)
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2024
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2025012400A1 (fr) | 2025-01-16 |
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