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FR3151340A1 - Différenciation neurale à partir de cellules pluripotentes - Google Patents

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FR3151340A1
FR3151340A1 FR2307835A FR2307835A FR3151340A1 FR 3151340 A1 FR3151340 A1 FR 3151340A1 FR 2307835 A FR2307835 A FR 2307835A FR 2307835 A FR2307835 A FR 2307835A FR 3151340 A1 FR3151340 A1 FR 3151340A1
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FR
France
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cells
smad
concentration
pluripotent cells
smad inhibitor
Prior art date
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Pending
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FR2307835A
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English (en)
Inventor
Mathieu Pierre PRUDON Nicolas
Lucia CORDERO ESPINOZA
Maxime Feyeux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Treefrog Therapeutics SAS
Original Assignee
Treefrog Therapeutics SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Treefrog Therapeutics SAS filed Critical Treefrog Therapeutics SAS
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Priority to PCT/EP2024/070652 priority patent/WO2025021728A1/fr
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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie cellulaire et plus particulièrement celui de la culture cellulaire. L’invention se rapporte ainsi à une méthode de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales, adaptée et optimisée pour une culture cellulaire en trois dimensions. Les cellules neurales obtenues peuvent notamment être utilisées dans le cadre de thérapie cellulaire afin de traiter une maladie neurodégénérative, par exemple la maladie de Parkinson.

Description

Différenciation neurale à partir de cellules pluripotentes
L’invention concerne le domaine de la biologie cellulaire et plus particulièrement celui de la culture cellulaire. L’invention se rapporte ainsi à une méthode de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales, adaptée et optimisée pour la culture cellulaire en trois dimensions. La pluralité de cellules neurales obtenue, en particulier sous forme de micro-tissu, peuvent notamment être utilisées dans le cadre de thérapie cellulaire afin de traiter une maladie neurodégénérative, par exemple la maladie de Parkinson.
Etat de l’art
Les cellules souches embryonnaires pluripotentes (ES) ont des propriétés de prolifération et de différenciation qui font d’elles un outil prometteur pour la thérapie cellulaire, mais impliquent de nombreuses questions éthiques. En effet, ces cellules ES sont majoritairement obtenues à partir de tissus de fœtus avortés. Leur utilisation en clinique est donc difficilement supportable, c’est pourquoi, de nombreux gouvernements interdisent leur utilisation à des fins cliniques.
La découverte, en 2006, des cellules souches pluripotentes induites (iPS ou iPSCs) par le Pr. Yamanaka, a permis de donner une nouvelle impulsion dans le domaine, permettant de surmonter la plupart des problèmes éthiques liés à l’utilisation de ces cellules ES. Très rapidement des essais cliniques ont vu le jour, avec pour objectif de traiter des maladies incurables par la médecine traditionnelle, telles que les maladies neurodégénératives. La greffe de cellules neurales, préférentiellement sous forme de micro-tissu, obtenues à partir d’iPSCs permet d’envisager le développement de nouveaux traitement curatifs.
A titre d’exemple, selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), plus de 8,5 millions de personnes sont atteintes de la maladie de Parkinson dans le monde et les cas augmentent plus rapidement que pour tout autre trouble neurologique. Or, en raison du vieillissement de la population mondiale, le nombre de personnes atteintes de la maladie de Parkinson devrait doubler entre 2005 et 2030 et, par conséquent, le coût sociétal, en l’absence de traitement curatif, va continuer à croitre dans le monde.
En effet, à ce jour, il n’existe pas de traitement curatif pour traiter ces maladies, seul des traitements permettant au mieux de ralentir sa progression avec des résultats très nuancés, ont été développés. Pour la maladie de Parkinson, on peut citer la L-Dopa, ainsi que des agonistes dopaminergiques.
Les nouvelles découvertes et technologies déployées ces dernières années dans le domaine de la culture cellulaire semblent à ce jour la solution la plus prometteuse pour développer un traitement curatif à l’inverse des traitements classiques médicamenteux, induisant, en outre, de forts effets secondaires indésirables.
Dans ce contexte, les avancées réalisées dans le domaine de la culture cellulaire des cellules pluripotentes permettant la régénération de tissus, apportent un réel espoir pour réparer les tissus neuronaux lésés et ainsi maintenir voire rétablir une activité neuronale. Il est déjà connu des procédés de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales, en deux dimensions ou en trois dimensions. Or, ceux-ci présentent respectivement les inconvénients suivants à savoir une très forte mortalité cellulaire, ou un faible rendement de différenciation. A titre d’exemple, on peut citer le procédé de différenciation décrit dans la demande US 2017/0130199.
Bien que ces procédés soient adaptables en culture cellulaire en trois dimensions, ils nécessitent d’être parfaitement optimisés afin de surmonter les inconvénients susmentionnés, à savoir diminuer la mortalité cellulaire et améliorer le rendement ainsi que le taux de différenciation des cellules neurales, et aussi améliorer l’efficacité de la greffe. En effet, il est bien connu de l’art antérieur la fragilité des cellules neurales, notamment des cellules matures, par exemple les neurones dopaminergiques, nécessitant d’importantes précautions dans un contexte clinique. De plus, la simple transposition d’un procédé de différenciation en deux dimensions dans un système en trois dimensions, permet, certes, de surmonter la problématique liée à la forte mortalité cellulaire, néanmoins, au préjudice du rendement de différenciation. A l’inverse, les procédés connus en deux dimensions, permettent d’obtenir un bon rendement de différenciation, au préjudice de la mortalité cellulaire.
Par conséquent, il n’est pas connu de procédé de différenciation spécifique à la culture cellulaire en trois dimensions surmontant l’ensemble de ces inconvénients, à savoir diminuer la mortalité cellulaire, minimiser le plus possible le risque de mortalité lors de la greffe, et offrir de meilleurs rendements de différenciation que ceux actuellement connus en culture cellulaire en deux dimensions.
Il existe donc un besoin pour un nouveau procédé de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales particulièrement adapté et optimisé pour une culture cellulaire en trois dimensions, permettant de s’affranchir des inconvénients des procédés de différenciation en deux dimensions (2D) connus de l’art antérieur, à savoir un faible rendement de production, une forte mortalité cellulaire, et un faible taux de différenciation.
Aussi, pour répondre à ce besoin, l’invention propose un nouveau procédé de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales, mise en œuvre au moyen d’au moins un microcompartiment cellulaire en trois dimensions, dans lequel est mis en œuvre une étape d’exposition desdites cellules pluripotentes avec un mélange de plusieurs facteurs, connu pour être impliqué dans la différenciation des cellules pluripotentes en cellules neurales, à savoir au moins un inhibiteur SMAD, au moins un activateur SHH, un activateur FGF, et un activateur Wnt.
Bien que connu pris individuellement ou en combinaison dans des procédés de différenciation de l’art antérieur, la présente invention, permet par la cinétique d’exposition des cellules auxdits facteurs dans un microcompartiment cellulaire en trois dimensions, de résoudre les inconvénients susmentionnés.
En effet, les inventeurs ont observé que l’exposition spécifique des cellules pluripotentes associées à une augmentation constante des facteurs de type SMAD pendant une durée déterminée, préalablement à l’ajout et donc de l’exposition des cellules avec les autres facteurs de différenciation, permet d’améliorer le rendement, le taux de différenciation, en particulier la proportion de neurones dopaminergiques dans le mélange obtenu comprenant une pluralité de cellules neurales, réduire la mortalité cellulaire, et améliorer le succès de la greffe de cette pluralité de cellules neurales obtenues par le procédé selon l’invention.
Contrairement à l’enseignement de l’art antérieur qui vise à exposer les cellules pluripotentes avec l’ensemble des facteurs d’intérêt, notamment les facteurs SMAD, à une concentration donnée et à un temps donné, les inventeurs ont découvert que l’augmentation de la concentration dans le milieu de culture d’au moins un inhibiteur SMAD de façon continue ou discontinue pendant au moins 3 jours à partir de l’exposition initiale des cellules pluripotentes avec ledit inhibiteur SMAD, permet d’induire une diminution de la quantité des cellules souches neurales dans le mélange de cellules neurales obtenu par le procédé selon l’invention (diminution du marqueur PAX6+/SOX1+), et une augmentation de la quantité de cellules engagées dans la différenciation, tels que les progéniteurs dopaminergiques (FOXA2/OTX2) dans ledit mélange obtenu, permettant ainsi de surmonter les inconvénients susmentionnés.
Ainsi, l’invention concerne une méthodein vitrode différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales, mise en œuvre au moyen d’au moins un microcompartiment cellulaire en trois dimensions dans un milieu de culture adapté, ledit microcompartiment comprenant lesdites cellules pluripotentes, ladite méthode comprenant au moins une étape d’exposition desdites cellules pluripotentes à :
  • au moins deux inhibiteurs SMAD,
  • au moins un activateur SHH,
  • au moins un activateur FGF, et
  • au moins un activateur Wnt,
dans laquelle la concentration dans le milieu, d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée de façon continue ou discontinue pendant au moins 3 jours à partir de l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD, d’au moins 20%, préférentiellement au moins 40% par rapport à la concentration initiale dudit inhibiteur SMAD, pour obtenir une pluralité de cellules neurales, au moins 30%, préférentiellement au moins 40% des cellules exprimant au moins les marqueurs FOXA2/OTX2. Le mélange obtenu constitué d’une pluralité de cellules neurales, à la fin du procédé comprend ainsi une quantité de cellules positives aux marqueurs FOXA2 plus importante qu’avec les procédés de culture 3D de l’art antérieur, et une quantité de cellules positives aux marqueurs PAX6/SOX1 plus faible qu’avec les procédés de culture 3D de l’art antérieur.
Selon un objet préféré de l’invention, l’augmentation d’au moins un inhibiteur SMAD de façon continue ou discontinue est une augmentation de type exponentielle. Aussi, la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est préférentiellement augmentée de façon exponentielle.
Avantageusement, le procédé selon l’invention vise à exposer les cellules pluripotentes à au moins deux inhibiteurs SMAD, dans laquelle la concentration des deux inhibiteurs SMAD est augmentée par rapport à l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD.
Selon un autre objet préféré, la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée pendant au moins un moins 3 jours et pendant au plus 4 jours, préférentiellement au plus 5 jours, après l’exposition initiale des cellules pluripotentes avec ledit inhibiteur SMAD, plus préférentiellement deux inhibiteurs SMAD.
Selon un autre objet particulièrement avantageux, le procédé selon l’invention expose les cellules pluripotentes avec deux inhibiteurs SMAD, chaque inhibiteur SMAD étant apte à agir respectivement sur des voies de signalisations cellulaire distinctes. Ainsi, le premier inhibiteur SMAD (i) est apte à agir sur la voie BMP-2,4,7. En particulier, il prévient l’activation de la transcription par le complexe SMAD-1,5,8/SMAD-4, notamment en prévenant l’interaction des SMAD-1,5,8 avec le cofacteur SMAD4, notamment en prévenant la phosphorylation des SMAD-1,5,8. Le second inhibiteur SMAD (ii) est quant à lui, apte à agir sur la voie TGFbeta, Activin, Nodal. En particulier, il prévient l’activation de la transcription par le complexe SMAD-2,3/SMAD-4, notamment en prévenant l’interaction des SMAD-2,3 avec le cofacteur SMAD4, notamment en prévenant la phosphorylation des SMAD-2,3.
Avantageusement, la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 20% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 450%, 1 jour après l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD, plus préférentiellement la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 40% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 900%.
Selon un autre objet préféré de l’invention, la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 33% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 4950%, 2 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD, plus préférentiellement la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 67% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 9900%.
Plus préférentiellement, le procédé selon l’invention comprend l’exposition des cellules pluripotentes avec deux inhibiteurs SMAD, dans lequel le premier inhibiteur SMAD (i) est choisi parmi le facteur Noggin, LDN193189, Dorsomorphin, DMH1, A83-1, et leur combinaison ; et le deuxième inhibiteur SMAD (ii) est choisi parmi le facteur SB431542, SB505124, LY2157299, LY550410, et leur combinaison.
Selon un autre objet, le procédé selon l’invention expose également les cellules pluripotentes avec au moins un facteur SHH. Préférentiellement, l’au moins un activateur SHH est ajouté au moins 3 jours et au plus 5 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes. Aussi, à l’inverse des procédés connus de l’art antérieur, l’exposition des cellules avec l’au moins un activateur SHH n’est pas simultanée par rapport à la première exposition des cellules pluripotentes avec les inhibiteurs SMAD. Très préférentiellement, au moins deux activateurs SHH sont ajoutés au moins 3 jours et au plus 5 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes.
Selon un autre objet préféré de l’invention, l’activateur FGF est également ajouté au moins 3 jours et au plus 5 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes, avantageusement en même temps que l’activateur SHH, soit lors de l’exposition initiale avec au moins un activateur SHH.
Selon un autre objet préféré de l’invention, au moins un activateur Wnt est ajouté au moins 6 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes, plus préférentiellement au moins 3 jours après l’exposition initiale des cellules avec l’activateur SHH et/ou FGF.
Lorsqu’au moins un inhibiteur SMAD est ajouté afin d’exposer les cellules pluripotentes avec ledit inhibiteur SMAD, celles-ci sont préférentiellement sous forme isolées ou sous forme d’agrégats. Par ailleurs, la culture cellulaire est une culture cellulaire en trois dimensions et les cellules sont encapsulées dans des microcompartiments cellulaires en trois dimensions. Lesdits microcompartiments sont bien connus et notamment décrits dans la demande de brevet WO 2018/096277.
Dans le contexte de l’invention, lesdits microcompartiments en trois dimensions sont adaptés pour la culture de cellules pluripotentes, comprenant notamment lesdites cellules, une couche de matrice extracellulaire ou de substitut de matrice extracellulaire. A titre d’exemple ladite couche peut-être de type Matrigel® ou de type fibrine et le microcompartiment comprend une couche externe en hydrogel, par exemple en alginate.
Etant donné que l’exposition des cellules pluripotentes avec au moins un inhibiteur SMAD peut être mise en œuvre simultanément, ou postérieurement à l’encapsulation desdites cellules pluripotentes, lesdites cellules pluripotentes peuvent ainsi être sous forme de cellules isolées, sous forme d’agrégats, ou d’un mélange comprenant des formes isolées et des agrégats.
Selon un autre objet de la présente invention, les cellules pluripotentes peuvent être de tous types et aptes à être différenciées en cellules d’intérêt, en particulier des cellules neurales, très préférentiellement lesdites cellules pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Il est particulièrement bien documenté dans l’art antérieur, les différentes techniques de culture cellulaire permettant d’obtenir des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), notamment dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Selon un autre objet particulier de l’invention, la méthode selon l’invention, peut comprendre une étape supplémentaire d’exposition avec au moins les facteurs choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison, pour poursuivre la maturation des cellules neurales exprimant au moins FOXA2 permettant notamment l’apparition de neurones dopaminergiques exprimant notamment les marqueurs FOXA2 et TH+.
Avantageusement, le procédé selon l’invention permet une augmentation des cellules exprimant FOXA2 et TH+ et une diminution des cellules exprimant PAX6/SOX1, démontrant respectivement une augmentation du nombre des cellules matures neurales, à savoir au moins des cellules dopaminergiques (neurones et progéniteurs dopaminergiques), et une diminution des cellules souches neurales, ce qui se traduit par un meilleur engagement des cellules pluripotentes dans la différenciation en cellules neuronales. Enfin l’absence des marqueurs de pluripotence, notamment TRA-1-60+/OCT+ confirme l’absence de cellules souches pluripotentes au sein du produit final obtenu à la fin du procédé, c’est-à-dire la pluralité de cellules neurales sous forme de micro-tissu. Une telle absence réduisant les risques de toxicités ou de différenciation non contrôlés.
Préférentiellement, lesdits facteurs choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison, sont ajoutés pendant au moins 5 jours, plus préférentiellement, pendant au moins 13 jours.
Selon un autre objet préféré, lesdits facteurs choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison, sont ajoutés au moins 12 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes avec les facteurs SMAD.
Selon un autre objet de l’invention, ladite méthode de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales comprend une étape intermédiaire pendant au moins 1 jour durant laquelle le milieu ne comprend pas d’inhibiteurs de la voie TGF-Beta, lorsque le microcompartiment comprend au moins 50% de cellules neurales exprimant au moins les facteurs FOXA2+/OTX2+, pour éliminer les facteurs de différenciation du milieu.
Enfin, selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à la pluralité de cellules neurales obtenues par le procédé selon l’un des quelconques modes de réalisation précédent. Préférentiellement, le produit final obtenu par le procédé est un mélange de cellules neurales, comprenant notamment des neurones dopaminergiques, des progéniteurs dopaminergiques, des cellules gliales. Ainsi, l’invention se rapporte également à une population hétérogène de cellules neurales, particulièrement d’intérêt pour la greffe de cellules neurales. Cette population hétérogène composées d’une pluralité de type de cellules neurales, préférentiellement une population striatale et/ou corticale est très préférentiellement sous forme d’aggrégat, ou de micro-tissu.
Selon un autre aspect, l’invention se rapporte également à la pluralité de cellules neurales, préférentiellement sous forme d’un micro-tissu, pour son utilisation comme médicament, plus préférentiellement pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement de la maladie de Parkinson.
D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
Brève description des Figures
représente les étapes du procédé de différenciation selon un mode de réalisation particulier de l’invention.
représente la cinétique d’apparition des marqueurs au cours du procédé de neurodifférenciation selon l’invention dans un bioréacteur, mesurée par Cytométrie en flux. Les jours de différenciations sélectionnés correspondent au jour d’encapsulation des iPSC (D0) et à la fin des phases d’induction neural (D5), de ventralisation (post-rinçage) (D12), de maturation (D17) et de post-maturation (D24). Les données sont présentées sous forme d’histogramme et compilent les données de 16 bioréacteurs différents et indépendants (n = 16).
représente l’expression transcriptomique du gène de la tyrosine hydroxylase (TH) par rapport à l’expression du gène de ménage ACT-B (panel gauche), et l’expression transcriptomique du gène Engrailed (EN-1) par rapport à l’expression du gène de ménage ACT-B (panel droite), par RT-qPCR à différents timing de différenciation, à savoir à la fin de la phase d’induction neurale (D5), à la fin de la phase ventralisation (post-rinçage) (D12), à la fin de la phase de maturation (D17) et à la fin de la phase post-maturation (D24) du procédé de différenciation selon l’invention et d’un procédé hors invention ne comprenant pas l’étape d’ajout d’au moins un inhibiteur SMAD augmenté de façon continue ou discontinue pendant au moins 3 jours.
est une analyse comparative par cytométrie en flux (FACS) du mélange de cellules neurales obtenus à la fin d’un procédé de différenciation hors invention et par le procédé de différenciation selon l’invention (micro-tissu neuronal à D24). Les résultats sont présentés sous forme d’histogramme. L’augmentation de cellules positives au marqueur FOXA2 indique une augmentation du nombre de cellules dopaminergiques (neurones et progéniteurs dopaminergiques), à l’inverse la diminution des cellules positives PAX6+/SOX1+ indique une diminution du nombre de cellules souches neurales au sein du mélange de cellules obtenu.
représente les niveaux d’expressions d’ARNm des cellules obtenues par le procédé selon l’invention composant le produit final à D24, par RT-qPCR. Les valeurs sont exprimées en proportion par rapport à celles des iPSC (D0) en comparant la moyenne des valeurs Ct à celle de 5 gènes de ménage différents (ACTB, PSMB4, NONO, C1orf43 et YWHAZ). Les expériences ont été réalisées en duplicat et sont représentées sous forme de Boxplot de Tuckey (n=17).
décrit la capacité de la pluralité de cellules neurales, sous forme de micro-tissu, obtenue par le procédé de différenciation selon l’invention à rétablir une symétrie motrice dans un modèle de rat hémi parkinsonien, à l'aide du test de rotation induit par l'amphétamine (rotomètre). La transplantation du greffon est réalisée de façon unilatérale dans le striatum du rat, après lésion. La lésion a été réalisée au préalable par injection d’une neurotoxine (6-OHDA) dans le faisceau médian du cerveau antérieur (MFB). Cette lésion reproduit une destruction sévère des neurones dopaminergiques et induit un déficit moteur unilatéral, similaires aux symptômes moteurs de la maladie de Parkinson.
est une image d’une coupe d’un greffon post-mortem, 20 semaines après la transplantation des cellules neurales selon l’invention. Une coloration pour la TH, marqueur des neurones dopaminergique (B), une coloration pour le marqueur humain Stem121 (C), une coupe du greffon comprenant les deux marqueurs. Le rectangle indique la zone de grossissement montrée dans le panneau de droite (E). Barres d'échelle, 2,5 mm (B, C et D) et 50 um (E). Le panel D représente une réinnervation à partir du greffon.
 Description détaillée de l’invention
Définition
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l’invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules. Celle-ci est formée à partir d’une matrice de chaînes polymères, par exemple l’alginate, gonflée par un liquide et préférentiellement de l’eau. La structure est ainsi constituée d’une couche externe en hydrogel rigidifiée et d’une partie interne comprenant au moins une cellule, et une matrice extracellulaire ou substitut de matrice extracellulaire adaptée à la culture cellulaire et la croissance desdites cellules.
Par « cellules humaines » au sens de l’invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n’est pas précisé, les cellules, les cellules pluripotentes, les cellules progénitrices et les cellules différenciées, y compris les cellules neurales sont obtenues ou issues de cellules humaines ou de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par cellules « pluripotentes » au sens de l’invention on entend des cellules qui ont la capacité de former tous les tissus présents dans l’organisme d’origine entier, sans pour autant pouvoir former un organisme entier en tant que tel, étant donné qu’elles ont déjà subi une première étape de différenciation, elles peuvent uniquement générer les cellules des feuillets embryonnaires, endodermique, mésodermique, et ectodermique mais ne peuvent plus générer les cellules du trophectoderme. Les cellules pluripotentes humaines peuvent être appelées hPSC ou ES dans le contexte de la présente invention. Il peut s’agir en particulier de cellules souches pluripotentes induites (iPSC ou hiPSC pour les cellules souches pluripotentes induites humaines). La pluripotence de ces cellules peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4, NANOG et SOX2 et des marqueurs de surface comme SSEA4/5, Tra-1-60 et Tra-1-81. Eventuellement, selon un mode de réalisation très spécifique, les cellules pluripotentes obtenues à partir des cellules souches embryonnaires sont obtenues sans destruction de l’embryon dont elles sont issues, par exemple à l’aide de la technique décrite dans Chang et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2)) : 113-117). Eventuellement, lesdites cellules souches embryonnaires d’êtres humains peuvent être exclues.
Par « cellule souche pluripotente induite » ou « iPSC » ou « hiPSC » au sens de l’invention on entend une cellule souche pluripotente induite à la pluripotence par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, comme la coloration à la phosphatase alcaline et l’expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA4/5. Des exemples de procédés permettant l’obtention de cellules souches pluripotentes induites sont décrits dans les articles Yu et al. (Science 2007, 318 (5858) : 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 207, 131(5) : 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1) : 101-106).
Par cellules « neurales » au sens de l’invention, on entend toutes les cellules du système nerveux. Il peut s’agir de cellules matures, par exemple des neurones dopaminergiques, GABAergiques etc., des cellules de soutien dites gliales (astrocytes, oligodendrocytes…) ; soit de cellules progénitrices (progéniteurs dopaminergiques, GABAergiques etc.); soit de cellules souches à l’origine du tissu neural (cellules souches neurales). Il peut également s’agir d’un mélange de cellules de type neurale, en particulier une population hétérogène de cellules neurales comprenant plusieurs types cellulaire, par exemples des neurones dopaminergiques, des progéniteurs, des cellules souches neurales, éventuellement des cellules gliales.
Par cellules « progénitrices » au sens de l’invention on entend des cellules qui sont en cours de différenciation, c’est-à-dire déjà engagées dans une voie de différenciation, mais pas encore différenciées. Dans le contexte de l’invention, les cellules progénitrices sont, par exemple, des cellules gliales radiales, ou cellules progénitrices gliales radiales (CPGR), mais également des progéniteurs dopaminergiques exprimant au moins le facteur FOXA2.
Par cellules « différenciées » au sens de l’invention on entend des cellules qui présentent un phénotype particulier, par opposition à des cellules pluripotentes qui ne sont pas différenciées ou des cellules progénitrices qui sont en cours de différenciation. Dans ce contexte les cellules différenciées sont des cellules matures, par exemple les cellules neuronales, c’est-à-dire des neurones, par exemple les neurones dopaminergiques, exprimant au moins les facteurs FOXA2 et TH.
Par « micro-tissu », au sens de l’invention on entend au moins une unité de tissu neurale comprenant une pluralité de cellules neurales obtenue par le procédé de différenciation selon l’invention, la pluralité de cellules neurales comprenant par exemple des neurones dopaminergiques, des progéniteurs, notamment des progéniteurs dopaminergiques, des cellules gliales, lesdites cellules sont organisées en réseau à trois dimensions dans une matrice extracellulaire. Ledit micro-tissu peut être encapsulé dans un microcompartiment cellulaire en trois dimension ou décapsulé et apte à être implanté dans le système nerveux d'un mammifère, préférentiellement d’un humain.
Par « augmentation exponentielle » ou « augmentée de façon exponentielle » au sens de l'invention, on entend la croissance exponentielle d’une quantité, à savoir dans le contexte de l’invention, d’une concentration d’un facteur de différenciation, par exemple un inhibiteur SMAD. On entend ainsi, la définition mathématique connue de l’Homme du métier caractérisée en ce que la croissance suit au cours du temps une loi exponentielle.
Par « augmentation logarithmique » ou « augmentée de façon logarithmique » au sens de l'invention, on entend la croissance logarithmique d’une quantité, à savoir dans le contexte de l’invention, d’une concentration d’un facteur de différenciation, par exemple un inhibiteur SMAD. On entend ainsi, la définition mathématique connue de l’Homme du métier caractérisée en ce que la croissance suit au cours du temps une loi logarithmique.
Par « inhibiteur SMAD » au sens de l’invention on entend une famille de molécules intervenant dans la transduction du signal du facteur de croissance transformant-bêta (Transforming Growth Factor-bêta,TGF-bêta) et de ses analogues. Il existe au moins 8 types de protéines SMAD chez les mammifères, numérotées de SMAD 1 à SMAD 8. Lorsque le TGF-bêta se fixe à son récepteur de la surface cellulaire, celui-ci phosphoryle SMAD 2 et SMAD 3 qui peuvent former un complexe avec SMAD 4 et migrent alors dans le noyau. Le complexe SMAD ainsi formé se fixe sur la séquence promoteur des gènes cibles pour activer leur transcription et médier ainsi l'effet biologique du TGF-bêta. Inversement, les protéines SMAD 6 et SMAD 7 inhibent la transduction du signal du TGF-bêta. Lorsque le BMP-2 se fixe à son récepteur de la surface cellulaire, celui-ci phosphoryle SMAD 1, SMAD 5 et SMAD 8, qui peuvent former un complexe avec SMAD 4 et migrent alors dans le noyau. Le complexe SMAD ainsi formé se fixe sur la séquence promoteur des gènes cibles pour activer leur transcription et médier ainsi l'effet biologique du BMP-2. Inversement, les protéines SMAD 6 et SMAD 7 inhibent la transduction du signal du BMP-2. A titre d’exemple, l’inhibiteur SMAD peut être choisi parmi Noggin, LDN193189, Dorsomorphin, DMH1, et A83-1, SB431542, SB505124, LY2157299, LY550410, et leur combinaison.
Par « activateur SHH » au sens de l’invention on entend une molécule capable d’activer la voie de signalisation Sonic Hedgehog. La protéine Sonic hedgehog est, chez les mammifères, l’une des trois protéines impliquées dans la voie de signalisation nommée Hedgehog ; la protéine SHH est le ligand de la voie de signalisation Hedgehog qui joue un rôle clé dans la régulation de l’organogénèse des vertébrés, tels que la croissance des doigts sur les membres et l’organisation du cerveau. La voie de signalisation Sonic Hedgehog (SHH) est depuis longtemps connue pour jouer un rôle majeur au cours du développement embryonnaire, chez les vertébrés. Préférentiellement, l’activateur SHH est choisi parmi SHH, SHH C25II, SAG (Smoothened Agonist), et Purmorphamine.
Par « activateur FGF » au sens de l’invention on entend une molécule capable d’activer le signal du récepteur FGF. Le récepteur FGF appartient à la famille de récepteurs transmembranaires dont la partie intracellulaire possède une activité de tyrosine protéine kinase. Lorsque le récepteur à tyrosine kinase fixe son ligand extracellulaire, il devient capable de phosphoryler des protéines intracellulaires ou d'autres récepteurs transmembranaires sur certains acides aminés tyrosine, permettant ainsi la transduction du signal de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. Les principaux récepteurs à tyrosine kinase sont les récepteurs de facteurs de croissance polypeptidiques (EGF, FGF, PDGF, VEGF, etc.). Préférentiellement, l’activateur FGF est le rhFGF-8b.
Par « activateur Wnt » ou « activateur de la voie de signalisation Wnt » au sens de l’invention on entend une molécule capable d’activer la voie de signalisation Wnt, qui joue divers rôles dans le développement animal, le maintien des cellules souches. Préférentiellement, l’activateur Wnt est choisi parmi CHIR 99021, XAV939 et BIO.
Par « prévention » au sens de l’invention, on entend la réduction à un degré moindre du risque ou de la probabilité d’occurrence d’un phénomène donné, par exemple, dans le contexte de la présente invention, la maladie de Parkinson.
Par « traitement » au sens de l'invention, on entend une diminution de la progression de la maladie, une stabilisation, une inversion ou régression, voire une interruption ou inhibition de la progression d’une maladie, par exemple la maladie de Parkinson.
Procédé de différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales
La présente invention a donc pour objet une méthodein vitrode différenciation de cellules pluripotentes en cellules neurales, mise en œuvre au moyen d’au moins un microcompartiment cellulaire en trois dimensions dans un milieu de culture adapté, ledit microcompartiment comprenant lesdites cellules pluripotentes, ladite méthode comprenant au moins une étape d’exposition desdites cellules pluripotentes à :
  • au moins deux inhibiteurs SMAD,
  • au moins un activateur SHH,
  • au moins un activateur FGF, et
  • au moins un activateur Wnt,
dans laquelle la concentration dans le milieu de culture, d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée de façon continue ou discontinue pendant au moins 3 jours à partir de l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD, d’au moins 20%, préférentiellement au moins 40%, par rapport à la concentration initiale dudit inhibiteur SMAD, pour obtenir une pluralité de cellules neurales, au moins 30%, préférentiellement au moins 40% des cellules neurales exprimant au moins les facteurs suivants FOXA2/OTX2.
Dans le contexte de l’invention, les cellules pluripotentes sont encapsulées dans des microcompartiments ou capsules en trois dimensions permettant une culture cellulaire en trois dimensions, permettant de s’approcher autant que possible des conditions physiologiquesin vivo. Les avantages de la culture cellulaire en trois dimensions sont dorénavant bien décrits et bien connus de l’Homme du métier.
La méthode peut comprendre une étape préalable de culture cellulaire des cellules pluripotentes, suivi de l’encapsulation desdites cellules pluripotentes dans des microcompartiments cellulaires en trois dimensions. Les microcompartiments cellulaires en trois dimensions sont notamment décrits dans la demande de brevet WO 2018/096277. Brièvement, l’encapsulation peut comprendre avantageusement les étapes suivantes :
  1. encapsuler le mélange comprenant les cellules pluripotentes, un milieu de culture et une matrice extracellulaire ou substitut de matrice extracellulaire, dans une couche externe d’hydrogel, l’encapsulation comprenant les sous-étapes suivantes :
    1. mettre en contact ledit mélange et une solution d’hydrogel destinée à former ladite couche externe pour former au moins une goutte, et
    2. collecter la goutte obtenue dans un bain de calcium apte à rigidifier ladite solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment.
  2. cultiver les capsules obtenues à l’étape précédente dans un milieu de culture, préférentiellement dans un bioréacteur, préférentiellement pendant au moins 1 jour, préférentiellement de 3 à 50 jours, et
  3. récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus, comprenant les cellules pluripotentes d’intérêt.
Préférentiellement, l’étape d’encapsulation est réalisée par une co-injection simultanée de la solution d’hydrogel destinée à former la couche externe, du mélange comprenant notamment les cellules pluripotentes et éventuellement la matrice extracellulaire ou substitut de matrice extracellulaire, et optionnellement d’une solution intermédiaire. Ladite co-injection est réalisée de manière concentrique via un injecteur microfluidique ou millifluidique formant un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange desdites solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes. Les gouttes sont ensuite récupérées dans le bain de calcium, par gravité, permettant de rigidifier la solution d’hydrogel pour forme la couche externe et, par conséquent, le microcompartiment cellulaire comprenant les cellules pluripotentes d’intérêt. Lesdites cellules pluripotentes peuvent être sous forme isolées ou sous forme d’agrégats ou amas cellulaires. Aussi, les cellules pluripotentes encapsulées sont en suspension, dans la capsule, sous forme de cellules uniques ou isolées et/ou d’amas ou d’agrégats de cellules. De façon préférée, les cellules isolées représentent moins de 50% en nombre de la totalité des cellules encapsulées, plus préférentiellement les cellules isolées sont des cellules iPSCs.
Dès lors que les cellules d’intérêts sont encapsulées, avantageusement sous forme isolées et/ou d’agrégats, lesdites cellules vont être exposées à plusieurs agents de différenciation, tels que au moins deux inhibiteurs SMAD, au moins un activateur SHH, au moins un activateur FGF, et au moins un activateur Wnt. Lesdits agents de différenciation sont ajoutés directement dans le milieu de culture comprenant lesdits microcompartiments, préférentiellement dans un bioréacteur. Lesdits agents de différenciation diffusant à travers la couche externe des microcompartiments cellulaires, celle-ci étant permissive à leur diffusion. Aussi, lesdits agents de différenciation diffusent à l’intérieur de chaque microcompartiment cellulaire, au sein du milieu du culture présent dans lesdits microcompartiment cellulaire.
Dans ce contexte, les inventeurs ont développé un procédé permettant d’améliorer le rendement en culture cellulaire en trois dimensions, d’améliorer le taux de différenciation, améliorant ainsi, la réussite de la greffe du mélange de cellules neurales obtenu par ledit procédé selon l’invention, et diminuer la mortalité cellulaire par rapport à l’enseignement de l’art antérieur.
Pour y parvenir, les inventeurs ont observé que, l’exposition des cellules pluripotentes encapsulées avec au moins un inhibiteur SMAD ajouté progressivement, c’est-à-dire que sa concentration est augmentée progressivement avant l’ajout des autres facteurs de différenciation, à savoir les activateurs SHH, l’activateur FGF et l’activateur Wnt, ce qui permet de surmonter les inconvénients de l’art antérieur.
Ainsi, l’invention se rapporte à l’ajout d’au moins un inhibiteur SMAD, préférentiellement deux inhibiteurs SMAD, progressivement avant le début de la différenciation neurale, initié par l’ajout des autres facteurs, à savoir les activateurs SHH, l’activateur FGF et l’activateur Wnt.
A l’inverse, l’art antérieur nous enseigne, qu’après l’étape de culture des cellules pluripotentes ayant pour objectif leur amplification, lesdites cellules pluripotentes obtenus, sont exposées avec l’ensemble des facteurs de différenciations à forte concentration, en particulier la combinaison des facteurs suivant, les inhibiteurs SMAD, les activateurs SHH et l’activateur FGF. L’exposition des cellules pluripotentes permet, certes, une différenciation en cellules neurales mais au prix d’une forte mortalité cellulaire. En effet, une exposition soudaine de cellules n’exprimant pas encore les récepteurs de la voie induite par le facteur de différenciation, à une forte concentration, induit un stress cellulaire important ce qui induit un fort taux de mortalité cellulaire. En outre, le rendement de production n’est pas satisfaisant avec un faible taux de différenciation. A l’inverse, une augmentation progressive de ces facteurs favorise la compliance et la résilience des cellules au processus de différenciation, c’est-à-dire la capacité des cellules à répondre à un signal, diminuant ainsi la mortalité cellulaire.
Ainsi, la présente invention vise à exposer lesdites cellules pluripotentes, exprimant notamment OCT/NANOG, SSEA5/SSEA4, TRA-1-60/OCT, encapsulées, avec au moins un inhibiteur SMAD à T0. Ledit inhibiteur SMAD est ajouté à une plus faible concentration que la concentration connue dans l’art antérieur, afin de ne pas engendrer un stress cellulaire et une mortalité cellulaire importante. Avantageusement, la concentration dudit inhibiteur SMAD est augmentée de façon continue ou discontinue pendant au moins 3 jours à partir de l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD, plus préférentiellement d’au moins 40% par rapport à la concentration initiale dudit inhibiteur SMAD.
Par « augmentation continue » au sens de l’invention, on entend une augmentation de la concentration du facteur de différenciation d’intérêt de façon linéaire au cours du temps, préférentiellement dans une période donnée, par exemple pendant 3 jours.
A l’inverse, par « augmentation discontinue » au sens de l’invention, on entend une augmentation de la concentration du facteur de différenciation d’intérêt par palier jusqu’à obtenir la concentration finale d’intérêt, pendant une période donnée, par exemple 3 jours.
L’augmentation de la concentration de l’inhibiteur SMAD peut se présenter sous plusieurs formes. Ainsi, l’augmentation peut suivre une loi exponentielle ou une échelle logarithmique. Très préférentiellement, l’augmentation de la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est exponentielle. Aussi, la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est, préférentiellement, augmentée de façon exponentielle, permettant de diminuer la mortalité cellulaire des cellules d’intérêts encapsulées et d’améliorer le taux de différenciation.
Préférentiellement, la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée pendant au plus 4 jours, plus préférentiellement au plus 5 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD.
Selon un autre objet de l’invention, les cellules pluripotentes sont exposées avec au moins deux inhibiteurs SMAD, au moins un premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée de façon continue ou discontinue, préférentiellement de façon exponentielle, et les cellules pluripotentes sont exposées avec un second inhibiteur SMAD (ii), la concentration dudit inhibiteur SMAD (ii) peut-être constante au cours du temps ou augmentée de façon continue ou discontinue. Ainsi, la concentration d’au moins deux inhibiteurs SMAD est préférentiellement augmentée, par rapport à la concentration d’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD.
Lorsque la concentration du second inhibiteur SMAD (ii) est augmentée de façon continue ou discontinue, l’augmentation de la concentration peut être exponentielle ou logarithmique. Préférentiellement, l’augmentation de la concentration du second inhibiteur SMAD (ii) est logarithmique, ceci a pour effet de maintenir les cellules pluripotentes et éviter que les cellules pluripotentes s’engagent dans une voie non souhaitée, par exemple la voie permettant d’engager les cellules pluripotentes vers le mésendoderme. Selon un objet particulièrement préféré, l’augmentation de la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) est exponentielle et l’augmentation de la concentration du second inhibiteur SMAD (ii) est logarithmique.
Préférentiellement, la concentration des deux inhibiteurs SMAD est augmentée pendant au plus 4 jours, plus préférentiellement au plus 5 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD.
Aussi, la présente invention vise une méthode de différenciation comprenant une étape d’exposition des cellules pluripotentes encapsulées avec au moins un, préférentiellement au moins deux inhibiteurs SMAD, dans laquelle la concentration de chaque inhibiteur SMAD est augmentée pendant une période donnée, avantageusement comprise entre 3 et 5 jours. Durant cette période, la concentration d’un premier inhibiteur SMAD (i) est avantageusement augmentée de façon exponentielle, alors que la concentration d’un second inhibiteur SMAD (ii) peut être stable ou augmentée, préférentiellement augmentée selon une échelle logarithmique.
Selon un autre objet particulièrement d’intérêt, 1 jour après l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD, la concentration d’un premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 40% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 900%, par rapport à la concentration initiale desdits inhibiteurs SMAD, c’est-à-dire à 0 jour, soit l’exposition initiale des inhibiteurs SMAD avec les cellules pluripotentes d’intérêt encapsulées.
Préférentiellement, 2 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 67% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 9 900%, par rapport à la concentration initiale.
Selon un objet préféré de l’invention, l’inhibiteur SMAD peut être choisi parmi un inhibiteur SMAD (i) apte à agir sur la voie BMP-2,4,7 et un inhibiteur SMAD (ii) apte à agir sur la voie TGFbeta, Activin, Nodal.
L’inhibiteur SMAD (i) apte à agir sur la voie BMP-2,4,7 permet avantageusement de prévenir l’activation de la transcription par le complexe SMAD-1,5,8/SMAD-4, notamment en prévenant l’interaction des SMAD-1,5,8 avec le cofacteur SMAD4, notamment en prévenant la phosphorylation des SMAD-1,5,8.
L’inhibiteur SMAD (ii) apte à agir sur la voie TGFbeta, Activin, Nodal permet avantageusement de prévenir l’activation de la transcription par le complexe SMAD-2,3/SMAD-4, notamment en prévenant l’interaction des SMAD-2,3 avec le cofacteur SMAD4, notamment en prévenant la phosphorylation des SMAD-2,3.
Préférentiellement, l’inhibiteur SMAD peut être choisi parmi Noggin, LDN193189, Dorsomorphin, DMH1, et A83-1, SB431542, SB505124, LY2157299, LY550410, et leur combinaison.
De façon particulièrement préféré, le premier inhibiteur SMAD (i) est choisi parmi les facteurs Noggin, LDN193189, Dorsomorphin, DMH1, A83-1, et leur combinaison. De façon particulièrement préféré, le deuxième inhibiteur SMAD (ii) est choisi parmi les facteurs SB431542, SB505124, LY2157299, LY550410, et leur combinaison.
Par « Noggin » au sens de l’invention, on entend une glycoprotéine homodimérique sécrétée qui se lie aux membres de la superfamille des protéines de signalisation du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), tels que la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4), et les inactive. La protéine Noggin est généralement une protéine de 65 kDa exprimée dans les cellules humaines sous la forme d'un dimère glycosylé et lié par un disulfure. (Groppe, et al., (2002). Nature 420, 636-642 ; Xu, et al. (2005) Nat Methods 2, 185-190 ; Wang, et al. (2005) Biochem Biophys Res Commun 330, 934-942).
Par « LDN193189 » ou « LDN-193189 » au sens de l’invention, on entend un composé chimique analogue de la protéine Noggin, inhibiteur de la voie morphogénétique osseuse (BMP), qui inhibe ALK1, ALK2, ALK3 et ALK6. Il s'agit d'un dérivé de la dorsomorphine qui est généralement utilisée à des concentrations environ 100 fois inférieures (Sanvitale et al. ; Vogt et al.). Ce composé favorise notamment la différenciation des cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches pluripotentes humaines (Chambers et al. ; Kriks et al.), favorise la différenciation des cellules de la crête neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines (Kreitzer et al.)., favorise la différenciation de l'endoderme de l'intestin antérieur à partir de l'endoderme définitif dérivé de cellules souches pluripotentes humaines et de souris (Kearns et al.), favorise la différenciation des cellules épithéliales sensorielles de l'oreille interne à partir de cellules souches embryonnaires de souris (Koehler et al.). Le composé est notamment accessible via son numéro CAS n°1062368-24-4.
Par « Dorsomorphine » au sens de l’invention, on entend un inhibiteur de l'AMPK, de formule C24H25N5O, sous le nom de 6-[4-[2-(1-Piperidinyl)ethoxy]phényl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride. La dorsomorphine inhibe la voie BMP en ciblant les récepteurs de type I ALK2, ALK3 et ALK6. Il s’agit d’un composé analogue à la protéine Noggin et au composé LDN193189. Il est accessible via le numéro CAS 866405-64-3.
Par « DMH1 » au sens de l’invention, on entend une petite molécule inhibitrice de la voie BMP hautement sélective favorisant la neurogenèse des hiPSCs, accessible via le numéro CAS 1206711-16-1.
Par « A83-1 » au sens de l’invention, on entend un inhibiteur sélectif du récepteur ALK du TGF-β de type I, de formule 3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide. En particulier, il inhibe la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) induite par le TGF-β via l'inhibition de la phosphorylation de Smad2. Des études antérieures ont montré que le A83-01 favorisait considérablement la reprogrammation cellulaire somatique.
Par « SB431542 » ou « SB-431542 » au sens de l’invention, on entend un inhibiteur des récepteurs kinases de type récepteur de l'activine, ALK5, ALK4 et ALK7. Il est notamment utilisé en association avec le LDN193189, le CHIR99021 et le DAPT pour transformer les astrocytes en neurones. Il est accessible via le numéro CAS 301836-41-9.
Par « SB505124 » ou « SB-505124 » au sens de l’invention, on entend un également un inhibiteur sélectif des récepteurs ALK4, ALK5 et ALK7 du facteur de croissance transformant bêta de type I. Il inhibe de manière sélective et dépendante de la concentration l'activation dépendante des ALK4, ALK5 et ALK 7 des transducteurs de signaux cytoplasmiques en aval, Smad2 et Smad3, et des composants de la voie de la protéine kinase activée par le TGF-bêta, mais n'altère pas la signalisation Smad induite par les ALK1, ALK2, ALK3 ou ALK6. Le SB-505124 est trois à cinq fois plus puissant que l’inhibiteur apparenté de l'ALK5 décrit précédemment, le SB-431542.
Par « LY2157299 » ou « galunisertib » au sens de l’invention, on entend une petite molécule inhibitrice de la voie de signalisation du facteur TGF-bêta, en particulier du récepteur I du TGF-β qui régule spécifiquement la phosphorylation de SMAD2, abrogeant ainsi l'activation de la voie canonique.
Par « LY550410 » au sens de l’invention, on entend là encore, une petite molécule inhibitrice de la voie de signalisation du facteur TGF-bêta, en particulier du récepteur I du TGF-β.
Ainsi, très préférentiellement, la concentration du premier inhibiteur SMAD (i) choisi parmi les facteurs Noggin, LDN193189, Dorsomorphin, DMH1, A83-1, et leur combinaison, est augmentée de façon exponentielle pendant une durée comprise entre 3 et 5 jours après l’exposition initiale dudit inhibiteur SMAD avec les cellules pluripotentes encapsulées, c’est-à-dire à T0.
Selon un autre objet très préféré, la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) choisi parmi les facteurs SB431542, SB505124, LY2157299, LY550410, et leur combinaison, est augmentée de façon logarithmique pendant une durée comprise entre 3 et 5 jours après l’exposition initiale dudit inhibiteur SMAD avec les cellules pluripotentes encapsulées.
Selon un autre objet préféré de l’invention, le premier inhibiteur SMAD (i) est le facteur Noggin, la concentration de celui-ci lors de l’exposition initiale avec les cellules pluripotentes encapsulées est comprise entre 50 et 70 ng/mL. La concentration de Noggin est alors augmentée avantageusement de façon exponentielle pendant au moins 3 jours après l’exposition initiale avec les cellules pluripotentes encapsulées à une concentration comprise entre 50 et 70 ng/mL. Préférentiellement, la concentration maximum ajoutée du facteur Noggin est de 100ng/mL.
Selon un autre objet préféré de l’invention, le second inhibiteur SMAD (ii) est le facteur SB431542, la concentration de celui-ci lors de l’exposition initiale avec les cellules pluripotentes encapsulées est comprise entre 0,1 et 0,3 µM. La concentration de SB431542 est alors augmentée avantageusement de façon exponentielle ou logarithmique pendant au moins 3 jours après l’exposition initiale avec les cellules pluripotentes encapsulées à une concentration comprise entre 50 et 70 ng/mL jusqu’à parvenir à une concentration maximum ajoutée du facteur SB431542 de 20 µM.
Ainsi, à l’inverse des procédés connus en 2D ou 3D, l’exposition des cellules pluripotentes encapsulées avec au moins un inhibiteur SMAD en culture 3D, préférentiellement deux inhibiteurs, et l’augmentation progressive de la concentration desdits inhibiteurs préalablement à l’ajout des autres facteurs de différenciation, notamment l’activateur SHH et l’activateur FGF, permet de surmonter les inconvénients de l’art antérieur, à savoir réduire la mortalité cellulaire et concomitamment améliorer le rendement de différenciation. Par « préalablement à l’ajout des autres facteurs de différenciation » au sens de l’invention, on entend l’exposition d’au moins un inhibiteur SMAD au moins 3 jours avant l’ajout des autres facteurs de différenciation, notamment l’activateur SHH et l’activateur FGF.
Cette exposition différée dans le temps des différents facteurs de différenciation avec les cellules pluripotentes, combinée avec une augmentation pendant au moins 3 jours et au plus 5 jours, de la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD, préférentiellement au moins deux inhibiteurs SMAD, permet d’améliorer le rendement, obtenu à la fois par la diminution de la mortalité cellulaire ainsi que d’un meilleur taux de différenciation des cellules d’intérêt, facilitant en outre, la synchronisation des différentes populations cellulaires obtenues dans la capsule. En effet, les cellules pluripotentes sont constamment en train de cycler. Or, la phase du cycle impacte la réponse cellulaire à un signal donné. Par conséquent, l’exposition d’une concentration croissante sur un temps caractéristique de cycle cellulaire (24h) optimise la probabilité que les cellules reçoivent un signal optimisé au moment du pic de leur compétence.
Au moins 3 jours et au plus 5 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes avec au moins un inhibiteur SMAD, le procédé de différenciation comprend une étape d’exposition des cellules pluripotentes engagées dans le processus de différenciation, avec au moins un activateur SHH, et au moins un activateur FGF. Préférentiellement, le procédé comprend l’exposition à au moins deux activateur SHH. Enfin, l’exposition des cellules pluripotentes avec les inhibiteurs SMAD est maintenue pendant toute la durée d’exposition avec au moins un activateur SHH et au moins un activateur FGF.
Ainsi, au moins 3 jours et au plus 5 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes avec au moins deux inhibiteurs SMAD, les cellules pluripotentes sont exposées avec les inhibiteurs SMAD à la concentration maximum à laquelle les cellules à J3-J5 sont soumises.
Lorsque les inhibiteurs SMAD sont respectivement Noggin et SB431542, la concentration à laquelle sont exposées les cellules après une durée comprise entre 3 et 5 jours de différenciation, est respectivement de 100ng/mL et 20 µM pendant une durée comprise entre 9 et 12 jours.
L’activateur SHH permet de notamment activer la voie de signalisation Sonic Hedgehog. Le signal canonique de la protéine Shh passe par un récepteur à multi composants qui comprend Patched (PTCH1, PTCH2) et Smoothened (SMO). La liaison de la protéine Shh à PTCH inactive la répression basale de SMO par PTCH. La protéine Shh, SHH-C25II, SAG (Smoothened Agonist) et la Purmorphamine peuvent être utilisés pour activer cette voie. Cette voie est impliquée dans la structuration du système nerveux central en développement. La protéine SHH régule le devenir des cellules souches neurales par morphogénèse des tissus.
FGF-8b est un membre de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes. FGF-8b est largement exprimé durant l’embryogénèse, et régule les transitions épithelio-mésenchymateuses. FGF-8b joue un rôle d’organisation et de déclenchement de la gastrulation, et est aussi impliqué dans la structuration du mésencéphale/rhombencéphale.
A la différence des inhibiteurs SMAD, la concentration dudit activateur SHH et activateur FGF est stable au cours du temps. Préférentiellement, la durée d’exposition dudit activateur SHH et dudit activateur FGF est ainsi comprise entre 9 et 12 jours, à partir de l’exposition de l’activateur SHH et de l’activateur FGF avec les cellules déjà engagées dans la différenciation exprimant notamment une plus faible quantité des marqueurs OCT/NANOG et TRA-1-60/OCT que les cellules pluripotentes.
Ainsi, au moins un activateur SHH est avantageusement ajouté au moins 3 jours et au plus 5 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes encapsulées. Préférentiellement, au moins deux activateurs SHH sont ajoutés.
Selon un objet de l’invention, au moins un activateur FGF est avantageusement ajouté entre 3 et 5 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes encapsulées, très préférentiellement de façon concomitante ou simultanée avec l’exposition des cellules avec au moins un activateur SHH, plus préférentiellement deux activateurs SHH. Ainsi, l’activateur FGF est préférentiellement ajouté entre 3 et 5 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes.
Selon un objet particulièrement préféré de l’invention, au moins un activateur SHH est le facteur SHH C25II, à une concentration consigne de 100ng/mL.
Selon un autre objet particulièrement préféré de l’invention, au moins un activateur SHH est le facteur Purmorphamine, à une concentration consigne de 2µM.
Selon un objet préféré de l’invention, l’activateur FGF est le facteur rhFGF-8b, à une concentration de 100ng/mL.
Le procédé selon l’invention, comprend également une étape d’exposition des cellules en cours de différenciation avec un activateur Wnt. Celui-ci est préférentiellement ajouté afin d’exposer les cellules en cours de différenciation, à savoir les cellules exprimant au moins les facteurs PAX6/SOX1, c’est-à-dire les cellules gliales radiales, ou cellules progénitrices gliales radiales (CPGR), qui sont des cellules progénitrices de forme bipolaire responsables de la production de tous les neurones du cortex cérébral et produisent également certaines lignées de cellules gliales, notamment les astrocytes et les oligodendrocytes.
Préférentiellement, l’activateur Wnt est le facteur CHIR 99021, à une concentration consigne de 3µM.
Selon un autre objet, la concentration d’au moins un des facteurs choisis parmi l’activateur SHH, l’activateur FGF, et l’activateur Wnt, est comprise entre 30 et 300% de la concentration consigne, préférentiellement entre 50 et 200% de la concentration consigne, plus préférentiellement entre 90 et 110% de la concentration consigne.
Selon un objet préféré de l’invention, l’activateur Wnt est ajouté au moins 6 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes. Selon une variante, l’activateur Wnt est ajouté au moins 3 jours après l’exposition avec au moins un activateur SHH et un activateur FGF et les cellules pluripotentes engagées dans la différenciation exprimant au moins les facteurs PAX6/SOX1. Selon une autre variante, au moins un activateur Wnt est ajouté lorsque les cellules sont des cellules progénitrices gliales radiales.
Après une durée comprise entre 12 et 17 jours d’exposition des cellules pluripotentes encapsulées avec au moins deux inhibiteurs SMAD, au moins un activateur SHH, au moins un activateur FGF, et au moins un activateur Wnt, une population hétérogène de cellules neurales est obtenue. Cette population comprend une pluralité de cellules de type neurale, dont au moins 30%, préférentiellement 40% expriment le marqueur FOXA2/OTX2.
Préférentiellement, la méthode peut comprendre une étape intermédiaire permettant d’éliminer les facteurs de différenciation du mélange. Avantageusement l’étape intermédiaire dure entre 12 et 48h, très avantageusement 24h.
Selon un autre objet de l’invention, le procédé de différenciation peut comprendre une étape supplémentaire de maturation, lors de laquelle les cellules obtenues sont exposées avec au moins les facteurs de différenciation choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison.
La présente invention a donc également pour autre objet, une méthode in vitro de différenciation de cellules pluripotentes comprenant en outre l’exposition des cellules neurales obtenues après une durée comprise entre 12 et 17 jours d’exposition des cellules pluripotentes encapsulées avec au moins deux inhibiteurs SMAD, avec au moins les facteurs choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison.
Aussi, après une durée comprise entre 12 et 17 jours d’exposition des cellules pluripotentes encapsulées avec au moins un inhibiteur SMAD, les cellules neurales obtenues sont exposées avec les facteurs de différenciation (dit facteurs de différenciation de maturation ou facteurs de maturation) choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison. Lesdits facteurs de maturation sont ajoutés pendant au moins 5 jours à une concentration stable au cours des au moins 5 jours d’exposition.
Selon un autre objet, lesdits facteurs de maturation sont ajoutés pendant au plus 30 jours, préférentiellement au plus 11 jours, encore plus préférentiellement au plus 5 jours, à une concentration stable.
Avantageusement, le facteur rhBDNF est ajouté pendant au moins 12 jours à une concentration. Selon un objet particulièrement préféré, rhBDNF est ajouté à une concentration consigne de 10 ng/mL
Selon un objet particulièrement préféré, L-Ascorbic acid est ajouté à une concentration consigne de 200 µM.
Selon un objet particulièrement préféré, rhGDNF est ajouté à une concentration consigne de 10 ng/mL
Selon un objet particulièrement préféré, rhTGF-Beta3 est ajouté à une concentration consigne de 1 ng/mL.
Selon un objet particulièrement préféré, rhFGF-20 est ajouté à une concentration consigne de 5 ng/mL
Selon un objet particulièrement préféré, dbcAMP est ajouté à une concentration consigne de 0,5 mM
Selon un objet particulièrement préféré, DAPT est ajouté à une concentration consigne de 10 µM
Selon un objet particulièrement préféré, Compound E est ajouté à une concentration consigne de 1 µM.
Selon un objet particulièrement préféré, Trichostatin A est ajouté à une concentration consigne de 10 nM.
Selon un autre objet, la concentration d’au moins un des facteurs choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E et Trichostatin A, est comprise entre 30 et 300% de la concentration consigne, préférentiellement entre 50 et 200% de la concentration consigne, plus préférentiellement entre 90 et 110% de la concentration consigne.
Préférentiellement, à la fin de l’exposition des cellules neurales avec les facteurs de maturation choisis parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison, la méthode comprend une étape supplémentaire de rinçage. Cette étape vise à éviter l’activation et l’inhibition concomitante de la voie TGF-Beta.
En effet, selon un autre objet, la méthode comprend préférentiellement une étape supplémentaire de rinçage pendant au moins 1 jour lorsque le microcompartiment comprend au moins 50% de cellules neurales exprimant au moins les marqueurs FOXA2/OTX2.
Micro-tissu obtenu par le procédé selon l’invention
A la fin du procédé de différenciation selon l’un des quelconques modes de réalisation précédemment décrits, une pluralité de cellules neurales est obtenue, cette pluralité de cellules neurales est organisée en trois dimensions et forme ainsi un micro-tissu ou unité de tissu neurale. Ainsi, selon un autre aspect, l’invention concerne également un micro-tissu constitué d’une pluralité de cellules neurales organisées en trois dimensions et de la matrice extracellulaire, lesdites cellules neurales sont susceptibles d’être obtenue par le procédé de différenciation de la présente invention. Cette pluralité de cellules neurales comprend avantageusement au moins des neurones dopaminergiques, des cellules progénitrices, notamment des progéniteurs dopaminergiques, et des cellules gliales.
Cette pluralité de cellules neurales exprime plusieurs marqueurs, spécifiques aux types cellulaires compris dans la pluralité de cellules neurales obtenue par le procédé de différenciation. Préférentiellement, la pluralité de cellules neurales constituant ainsi le micro-tissu présente une plus grande quantité de cellules positives au marqueur FOXA2 et une plus faible quantité de cellules positives aux marqueurs PAX6/SOX1, indiquant une augmentation du nombre de cellules dopaminergiques et une diminution des cellules souches neurales au sein du micro-tissu, ce qui traduit un meilleur engagement de la différenciation vers la voie dopaminergique et donc un meilleur taux de différenciation. En outre, une plus grande expression du marqueur EN1, population ayant été démontrée comme jouant un rôle clef dans l’efficacité de la greffe (Kirkeby et al., 2017), traduit l’obtention d’un micro-tissu avec une fonctionnalité améliorée. De plus, une plus grande expression du marqueur TH, marqueur des neurones dopaminergiques, traduit un meilleur engagement de la différenciation vers la voie dopaminergique et donc un meilleur taux de différenciation.
Micro-tissu comme médicament
Selon un dernier aspect, l’invention se rapporte au micro-tissu obtenu pour son utilisation comme médicament, préférentiellement pour la prévention et/ou le traitement de maladie neurodégénérative, encore plus préférentiellement pour la prévention et/ou le traitement de la maladie de Parkinson.
L’invention est à présent illustrée par des exemples non limitatifs du procédé selon l’invention et par des résultats.
Exemples
Exemple 1 – Protocole de différenciation selon l’invention
Production des microtissus neuronaux
Culture 2D des hiPSC
Toutes les lignées hiPSC ont été maintenues sur Vitronectin et cultivées dans le milieu mTeSR1 . Les cultures ont été nourries quotidiennement, passagées avec un réactif sans enzyme, ReLeSR pendant 6 min à 37 °C tous les 3-4 jours (autour de 80% de confluence), et replacées sous forme de petits amas (entre 100 et 200 μm) à une densité d'environ 20 000 - 40 000 cellules/cm². Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.
Encapsulation 3D des hiPSC
Avant l'encapsulation, les colonies de cellules souches 2D ont été détachées. Les HiPSC ont été remises en suspension dans le milieu mTeSR1 complété par 10 µM de Y-27632. Les cellules ont ensuite été mélangées dans un rapport 1/1 vol avec du fibrinogène humain et du Y-27632 pour atteindre des concentrations finales de fibrinogène et de Y-27632 de 14 mg/mL et 10 µM respectivement. La concentration finale de cellules dans la solution cellule/matrice était donc comprise entre 7,1 × 10^6 et 7,4 × 10^6 cellules viables/mL, appelée densité d'encapsulation. Des tubes sont connectés aux trois entrées d'un dispositif microfluidique à flux co-laminaire imprimé en verre 3D. Une pointe microcapillaire imprimée en verre 3D est collée à la sortie de la buse pour un meilleur contrôle de l'écoulement. La suspension cellulaire/matricielle est chargée dans le canal intérieur du dispositif à trois voies. Une solution d'alginate de sodium SDS est injectée dans le canal extérieur. Pour éviter la gélification de l'alginate à l'intérieur du dispositif microfluidique en raison de la libération de calcium par les cellules en suspension, une solution sans calcium (Sorbitol) est utilisée dans le canal intermédiaire de la puce de coextrusion et sert de barrière contre la diffusion du calcium. Cette solution est également complétée par de la thrombine à une concentration finale de 0,02 U/mL pour permettre la réticulation de la fibrine à l'intérieur des capsules. Les débits typiques pour les 3 solutions étaient de l'ordre de 80 mL/h pour les trois canaux : la solution d'alginate, la solution de sorbitol et la suspension cellule + matrice. À ces vitesses, la solution composite forme un jet liquide qui se fragmente en gouttelettes. Lorsque les gouttelettes entrent en contact avec le bain de calcium 100 mM, la couche externe d'alginate se gélifie facilement. Par conséquent, la solution cellulaire/matricielle interne reste piégée dans un micro-compartiment fermé, sphérique et perméable. Dans les 5 minutes suivant l'encapsulation, les capsules sont rincées avec du DMEM/F-12, HEPES 15mM complété par 2,9 mM CaCl2, afin de réduire la concentration basale de calcium. Enfin, ils sont transférés dans le milieu mTeSR1 complété par 10 μM Y-27632 comme milieu de culture initial en suspension pour la neurodifférenciation.
Neurodifférenciation 3D des hiPSC dans des flacons T statiques ou des bioréacteurs
Une neurodifférenciation plus poussée peut être réalisée dans plusieurs systèmes de culture, y compris la culture en suspension statique à l'aide de flacons en T ou de plaques à puits et les cultures en suspension agitées à l'aide de bioréacteurs de 30 ml ou de bioréacteurs de 500 ml.
En conditions statiques, les cultures en suspension de hiPSC encapsulées ont été réalisées à l'aide de flacons en T (de 5 à 30 mL) maintenus dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2, avec des changements de milieu quotidiens.
Dans des conditions d'agitation, des cultures en suspension agitée ont été réalisées dans différents bioréacteurs. Nous avons utilisé des STBR de paillasse, y compris des bioréacteurs de 30 ml ou de 500 ml. La vitesse d'agitation a été fixée à 150 rpm de J0 à J7, à 200 rpm de J7 à J18 et à 250 rpm de J18 à J24 ou 55 rpm de J0 à J24 dans les STBR de 500 mL et 30 mL respectivement. Dans les deux cas, les bioréacteurs ont été inoculés avec 25 % (V/V) de capsules pour un volume moyen. Dans le bioréacteur de 500 mL, le volume de culture a été maintenu à 300 mL pendant toute la durée de la culture. Au jour 1, le milieu a été entièrement renouvelé avec du milieu frais supplémenté en inhibiteur de ROCK. Au jour 2, aucun changement de milieu n'a été effectué. Au jour 3, le milieu a été entièrement renouvelé avec du milieu frais sans inhibiteur de ROCK. A partir de ce jour, le changement de milieu a été effectué en perfusion. Aux jours 12, 13 et 18, le milieu a été entièrement renouvelé avec du milieu frais. Le volume final de la capsule par rapport au milieu était compris entre 22% et 25% et le pH était maintenu à 7,2 ± 0,2. Le niveau d'oxygène dissous (DO) a été calibré à 100% avant et après l'autoclave dans le bioréacteur vide et dans les conditions de départ (rempli de milieu) respectivement. Pendant l'essai, le niveau d'oxygène a été surveillé et contrôlé. L'oxygène a été contrôlé à 50 % et le niveau d'oxygène a été régulé.
Dans les conditions statiques et agitées, les molécules ont été ajoutées comme suit. À partir du jour 0, le milieu mTeSR1 a été complété par 10 μM Y-27632 pour l'inhibition de ROCK pendant les 72 premières heures de culture. Le milieu mTeSR1 a été conservé jusqu'au jour 3. La protéine recombinante humaine Noggin GMP a été initialement ajoutée au jour 0 (jour d'encapsulation) à une concentration de 60 ng/mL et progressivement augmentée au jour 1 et au jour 2 à 84 ng/mL et 100 ng/mL respectivement. De même, le SB431542 GMP a été initialement ajouté à une concentration de 0,2 µM au jour 0, et a été progressivement augmenté à 2 µM et 20 µM au jour 1 et au jour 2 respectivement. Au jour 3, le milieu a été changé pour Neurobasal™ CTS™ et DMEM/F-12, supplément GlutaMAX™ dans un rapport 1:1, complété par le supplément N-2 CTS™ et le supplément B-27™ GMP. Du jour 3 au jour 11, 100 ng/mL de protéine recombinante humaine Noggin GMP, 20 µM de SB431542 GMP, 100 ng/mL de protéine recombinante humaine Sonic Hedgehog/Shh (C24II) N-Term GMP, 100 ng/mL de protéine recombinante humaine FGF-8b HumanKine® et 2 µM StemMACS Purmorphamine ont été ajoutés. CHIR99021 GMP a été ajouté du jour 6 au jour 12. Ensuite, 200 µM d'acide ascorbique, 10 ng/mL de protéine GDNF GMP humaine recombinante, 1 ng/mL de protéine TGF-beta 3 humaine recombinante HumanKine®, 5 ng/mL de protéine FGF-20 humaine recombinante, 0,5 mM Dibutyryl cAMP, 10 µM DAPT RMU, 1 µM Compound E et 10 nM Trichostatin A ont été ajoutés de J13 à J17. Enfin, 20 ng/mL de protéine BDNF humaine recombinante HumanKine ont été ajoutés de J13 à J24. Ce protocole de différenciation est notamment décrit en .
Exemple 2 – Cinétique d’apparition des différents types cellulaires au cours du procédé de différenciation selon l’invention.
Protocole
Le protocole de préparation des micro-tissus est identique à celui de l’exemple 1.
Analyse par cytométrie en flux
Les microtissus neuraux ont été récoltés à plusieurs moments de la neurodifférenciation. La capsule d'alginate a été supprimée en incubant l'échantillon 5 min dans RelesR à température ambiante avec une concentration finale de 20 % de capsules (V/V). Après lavage au RelesR, les microtissus neuraux ont été dissociés à l'aide d’un kit de dissociation des neurosphères pendant 40 min à 37 °C avec agitation (150 rpm) et remise en suspension manuelle à l'aide d'une micropipette toutes les 10 min. Ensuite, les cellules ont été fixées et perméabilisées en utilisant un concentré de Fixation/Perméabilisation et un diluant de Fixation/Perméabilisation dans un rapport 1:4, à une densité cellulaire maximale de 5.10^6 par mL. Les cellules sont ensuite remises en suspension dans un tampon de coloration pour cytométrie en flux à une densité cellulaire de 833 333 par ml. Les cellules ont été centrifugées à 500 g pendant 5 minutes à température ambiante et le surnageant a été éliminé. Les échantillons ont ensuite été incubés 30 min dans l'obscurité à température ambiante, avec des anticorps spécifiques dilués à 1:50 dans le tampon de perméabilisation 1X (Invitrogen). Les échantillons ont finalement été lavés deux fois en effectuant des centrifugations à 500 g pendant 5 minutes à température ambiante et en remettant les cellules en suspension avec le tampon de coloration. Les échantillons ont été analysés à l'aide de l'analyseur MACSQUANT® Analyser 10 (Miltenyi Biotec). Des contrôles d'isotype ont été réalisés pour déterminer la limite de positivité au-delà de laquelle un échantillon sera considéré comme positif et valider la spécificité des anticorps. Des contrôles de compensation pour chaque fluorochrome ont été utilisés pour éliminer le chevauchement spectral. Les données ont été post-traitées avec le logiciel d'analyse FlowJo. Des cellules non colorées ont été utilisées comme contrôle négatif pour différencier la coloration des anticorps spécifiques de la tige ou des neurones et le signal de fond non spécifique. Un signal significatif des populations NANOG+/OCT4+, SSEA5+/SSEA4+ et TRA-1-60+/OCT+ est donc utilisé pour identifier et calculer le pourcentage de cellules pluripotentes. Le signal des populations PAX6+/SOX1+ ou FOXA2+/OTX2+ est utilisé pour identifier et calculer le pourcentage de cellules souches neurales et de progéniteurs dopaminergiques dans l'échantillon.
Extraction de l'ARN et analyses RT-PCR
Les échantillons ont été homogénéisés dans le Tri-réactif (Euromedex) et l'ARN a été isolé en utilisant un protocole standard chloroforme/isopropanol. L'ARN a été traité et analysé en suivant une adaptation des méthodes publiées. L'ADNc a été synthétisé à partir de 2 μg d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse Maxima (Fisher Scientific). La qPCR a été réalisée à l'aide d'un système LightCycler® 480 Real-Time PCR (Roche). Les réactions qPCR ont été effectuées en double pour chaque échantillon, en utilisant des amorces spécifiques de la transcription, de l'ADNc (4 ng) et le LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) dans un volume final de 10 μl. Pour la détermination du gène de référence, la méthode RefFinder a été utilisée. Si aucun gène de référence spécifique n'est mentionné, l'analyse de l'expression relative a été normalisée par rapport à cinq gènes de référence. Les gènes suivants ont été utilisés : Proteasome subunit beta 4 (Psmb4), non-POU domain containing octamer binding (Nono), chromosome 1 open reading frame 43 (C1orf43), Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxygenase Activation Protein Zeta (Ywhaz) et Actin beta (Actb). Les données PCR ont été exportées et analysées dans un outil informatique développé au NeuroCentre Magendie. Le niveau d'expression relatif a été évalué en calculant 2-∆Ct = 2-(Ct(gène d'intérêt) - Ct(moyenne des 5 gènes de référence)).
Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism 8. Pour les analyses comportementales (in vivo), les comparaisons ont été faites avec le groupe véhicule en utilisant l'ANOVA à deux voies et le test de comparaison multiple de Tuckey jusqu'à 20 semaines (**** p < 0,0001). De 24 à 32 semaines, l'ANOVA à deux voies et le test de comparaison multiple de Sidak ont été utilisés (* p < 0,05).
Résultats
Les résultats sont présentés en . Dans cet exemple, les jours de différenciation sélectionnés correspondent au jour d’encapsulation des iPSC (D0) et à la fin des phases d’induction neural (D5), de ventralisation (post-rinçage) (D12), de maturation (D17) et de post-maturation (D24). A D0, la quasi-totalité des cellules encapsulées exprime les marqueurs OCT/NANOG, SSEA5/SSEA4, TRA-1-60/OCT qui sont caractéristiques des cellules pluripotentes de type iPSCs. A D5, on observe une forte diminution des marqueurs OCT/NANOG et TRA-1-60/OCT et une augmentation des marqueurs FOXA2/OTX2 montrant ainsi un début de différenciation des cellules. A D12, la quasi-totalité des cellules exprime FOXA2/OTX2, marqueur caractéristique des progéniteurs dopaminergiques.
Exemple 3 – Comparaison du procédé selon l’invention et d’un procédé hors-invention.
Protocole
Le protocole est identique à celui décrit dans l’exemple 1 et 2.
Résultats
Les résultats présentés en , montrent l’expression transcriptomique du gène Tyrosine Hydroxylase (TH) par RT-qPCR à différents timing de différenciation. Les résultats correspondent à l’expression relative du gène TH par rapport à l’expression du gène de ménage ACT-B. Le gène TH est un marqueur des neurones dopaminergiques. démontrant ainsi une plus grande quantité de cellules exprimant ce marqueur et donc une plus grande proportion de neurones dopaminergiques dans le micro-tissu, obtenu avec le procédé selon l’invention.
Les résultats présentés en , montrent l’expression transcriptomique du gène Engrailed (EN-1) par RT-qPCR à différents timings de différenciation. Les résultats correspondent à l’expression relative du gène EN-1 par rapport à l’expression du gène de ménage ACT-B. Le gène EN-1 est un marqueur des progéniteurs dopaminergiques. démontrant ainsi une meilleure expression de ce marqueur et donc une plus grande proportion de progéniteurs dopaminergiques dans le micro-tissu, obtenu avec le procédé selon l’invention. En outre, ce type cellulaire est particulièrement recherché et d’intérêt car il a été démontré que l’expression du gène EN-1 est un marqueur prédictif du succès de la greffe dans le cadre de l’utilisation de progéniteurs dopaminergiques (Kirkeby et al., 2017). L’utilisation du procédé selon l’invention augmente l’expression du gène EN-1 au sein du micro-tissu, par rapport à un micro-tissu obtenu avec un procédé hors invention.
Les résultats présentés en décrivent les résultats d’analyse par cytométrie en flux (FACS) des micro-tissus après dissociation obtenus à l’aide du procédé selon l’invention comparé aux micro-tissus obtenus avec un procédé standard hors invention.
L’augmentation du nombre de cellules dopaminergiques (FOXA2+), associée à la diminution du nombre de cellules souches neurales (PAX6+/SOX1+) traduit un meilleur engagement de la différenciation vers la voie dopaminergique. L’absence des marqueurs de pluripotence (TRA-1-60+/OCT+) confirme l’absence de cellules souches pluripotentes au sein du micro-tissu obtenus avec le procédé selon l’invention. Ces résultats démontrent un meilleur engagement dans la différenciation et donc une amélioration du rendement de différenciation à l’aide du procédé selon l’invention.
Exemple 4 – Caractérisation d u micro-tissu constitué d’une pluralité de cellules neurales selon l’invention .
Protocole
Le protocole est identique à celui décrit dans l’exemple 1 et 2.
Résultats
La pluralité de cellules constituant le micro-tissu ont été caractérisée par qPCR, indiquant la présence de nombreuses cellules matures ou en cours de différenciation. Les résultats sont présentés en . On peut notamment observer la présence de cellules de types, neurones (MAP2, TUBB3), neurones dopaminergiques (TH, GIRK2), progéniteurs dopaminergique (LMX1A, OTX2, FOXA2, EN1, CORIN), astrocytes (GFAP), neurones GABAergiques (GAD1) et oligodendrocytes (OLIG2).
Ainsi, le micro-tissu comprend une pluralité de cellules de types neurale, comprenant un plus grand nombre de cellules matures ou en fin de différenciation confirmant un meilleur engagement de la différenciation des cellules neurales obtenues avec le procédé selon l’invention.
Exemple 5 – Injection de micro-tissu selon l’invention pour le traitement de la maladie de Parkinson.
Protocole
Induction du modèle de rat hémi-parkinsonien
Les rats nus Rowett (Rnu+) ont d'abord été anesthésiés à l'aide d'une chambre d'induction à 4 % d'isoflurane (paramètres de la chambre d'induction : i4 Oxy1 Air1). Les rats ont ensuite été placés sur un masque d'anesthésie, utilisant environ 2,5% d'isoflurane (paramètres de la chambre d'induction : i2.5 Oxy0.4 Air0.4). La concentration pouvait être légèrement ajustée en vérifiant régulièrement la température des pattes et la température corporelle manuellement. L'analgésie a été réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine et de Lidocaïne à des concentrations respectives de 0,05 mg/kg et 5 mg/kg. Les rats ont reçu une injection intrapéritonéale supplémentaire de Chlorhydrate de désipramine à une concentration de 25 mg/kg au moins 20 minutes avant l'injection de bromhydrate de 6-hydroxydopamine (6-OHDA/HBr). 2,5 µl de 6-OHDA/HBr fraîchement préparé à une concentration de 0,5 % (w/v) ont été perfusés dans le faisceau cérébral antérieur médian (MFB) à l'aide d'un cadre stéréotaxique avec les coordonnées (Bregma comme référence) : AP : -3,8 ; ML (droite) : 1,6 ; DV : de -8 à -7. Après 3 semaines de stabilisation de la lésion, le comportement a été évalué à l'aide du test de rotation induite par l'amphétamine.
Test de rotation induite par l'amphétamine ( rotomètre )
Le comportement de rotation induit par l'amphétamine a été évalué avant (3 semaines après l'injection de 6-OHDA) et toutes les 4 semaines après la transplantation. La rotation a été enregistrée 10 min après l'injection intrapéritonéale d'amphétamine (2,5 mg/kg mg kg-1) pendant 40 min. Les résultats sont présentés en rotation/min. Seuls les rats qui ont montré plus de 3 rotations par minute après stabilisation de la lésion ont été inclus dans l'analyse comportementale.
Injection de micro-tissus neuronaux dans le modèle de rat hémi-parkinsonien
Les rats nus Rowett (Rnu+) ont d'abord été anesthésiés à l'aide d'une chambre d'induction à 4 % d'isoflurane (paramètres de la chambre d'induction : i4 Oxy1 Air1). Les rats ont ensuite été placés sur un masque d'anesthésie, utilisant environ 2,5% d'isoflurane (paramètres de la chambre d'induction : i2.5 Oxy0.4 Air0.4). La concentration pouvait être légèrement ajustée en vérifiant régulièrement la température des pattes et la température corporelle manuellement. L'analgésie a été réalisée par injection sous-cutanée de Buprénorphine et de Lidocaïne à des concentrations respectives de 0,05 mg/kg et 5 mg/kg. Les rats ont ensuite reçu une injection de microtissus neuraux dans le striatum droit à l'aide d'un Hamilton de 25µL (Hamilton, réf. 1702 CX SYR) avec des aiguilles sur mesure (canule en verre) et un milieu d'administration sur mesure composé de Carboxymethylcellulose et de Dextran 70kDA (CMC-DA70). L'injection a été réalisée en deux trajectoires en utilisant un cadre stéréotaxique. A la fin de la chirurgie, du Metacam a été injecté par voie sous-cutanée à une concentration de 1 mg/kg pour la gestion de la douleur postopératoire.
Etude post-mortem
Analyse histologique post-mortem
Les animaux ont d'abord été anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine et de xylazine. Les animaux ont ensuite été perfusés par voie intra-cardiaque avec 150 ml de NaCl 0,9 %, puis 200 ml de formol 10 % tamponné au phosphate. Après extraction, les cerveaux ont été post-fixés dans du formol 10% tamponné au phosphate pendant 24h à 4°C et finalement stockés dans du PBS à 4°C. Des coupes de 40 µm ont été prélevées à l'aide d'un vibratome et conservées dans du PBS à 0,01% d'azide. Les coupes ont été lavées 3 fois avec du PBS. Les coupes ont été perméabilisées par incubation pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS à 0,1% de Triton et 2% de BSA, puis lavées 3 fois avec du PBS. Les coupes ont été colorées pour la tyrosine hydroxylase (TH ; 1:1000) et l'antigène humain (Stem121 1:1000) en incubant les anticorps primaires dans du PBS 0,05% Triton 0,5% BSA pendant une nuit à 4 °C. Les coupes ont été lavées 3 fois avec du PBS. Les coupes ont ensuite été incubées avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents (Alexa 488, 568) (1:1000) dans du PBS Triton 0,05% BSA pendant 2 heures à température ambiante. Après avoir été rincées 3 fois avec du PBS, les sections ont été montées sur des lames avec du DAPI Fluoromount-G, pour la contre-coloration des noyaux. Les lames ont été imagées à l'aide du nanozoomer.
Résultats
L’étude vise à montrer la restauration de l’asymétrie motrice dans une étude d'efficacité non clinique avec des micro-tissus neuronaux selon l’invention. Les résultats sont présentés en et 7.
Les inventeurs ont observé les rotations induites par la d-amphétamine mesurées en préopératoire, à 4, 8, 12, 16, 20 semaines (n = 43) et 24, 28, 32 semaines (n = 2) après la greffe. Les rotations ont été mesurées dans un rotomètre, 10 minutes après l'injection de d-amphétamine (2,5 mg/kg i.p.) pendant 40 minutes. La greffe de micro-tissus neuraux a permis une récupération fonctionnelle complète des déficits moteurs à partir de 16 semaines pour tous les Cryo 10K (p < 0,0001), Cryo 21K (p < 0,0001), Fresh 3K (p < 0,01) et Fresh 10K (p < 0,0001). Un retard a été observé pour le groupe Cryo 6K, avec une récupération fonctionnelle complète à 20 semaines (p < 0,0001). Une récupération motrice fonctionnelle à long terme a été observée, le nombre de rotations induites par l'amphétamine se stabilisant entre 16 et 32 semaines (n = 2). Cryo 6K, Cryo 10K et Cryo 21K correspondent respectivement à un produit cryoconservé avec un total estimé de 6 000, 11 000 et 21 000 neurones dopaminergiques (cellules TH+) initialement greffées. Fresh 6K et Fresh 10K correspondent respectivement à un produit frais avec un total estimé de 3 000 et 10 000 neurones dopaminergiques initialement greffées. Les comparaisons ont été faites avec le groupe véhicule en utilisant l'ANOVA à deux voies et le test de comparaison multiple de Tuckey jusqu'à 20 semaines (**** p < 0,0001). De 24 à 32 semaines, l'ANOVA à deux voies et le test de comparaison multiple de Sidak ont été utilisés. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM.
Les résultats en sont des images de microscopie à fluorescence de la coupe d'un greffon 20 semaines après la transplantation d’un micro-tissu selon l’invention, immunocolorée pour le marqueur TH (B) et le marqueur humain Stem121 (C). Une fusion des deux marquages est également représenté confirmant la présence de neurones dopaminergiques issus du micro-tissu (D). Le rectangle indique la zone de grossissement montrée dans le panneau de droite (E) indiquant une réinnervation du tissu hôte à partir du greffon tel que révélé par le marquage des projections axonales issues de la greffe.

Claims (17)

  1. Méthodein vitrode différenciation de cellules pluripotentes, à l’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, en cellules neurales, mise en œuvre au moyen d’au moins un microcompartiment cellulaire en trois dimensions dans un milieu de culture adapté, ledit microcompartiment comprenant lesdites cellules pluripotentes, ladite méthode comprenant au moins une étape d’exposition desdites cellules pluripotentes à :
    • au moins deux inhibiteurs SMAD,
    • au moins un activateur SHH,
    • au moins un activateur FGF, et
    • au moins un activateur Wnt,
    dans laquelle la concentration dans le milieu, d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée de façon continue ou discontinue pendant au moins 3 jours à partir de l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD, d’au moins 20% par rapport à la concentration initiale dudit inhibiteur SMAD, pour obtenir des cellules neurales exprimant au moins FOXA2.
  2. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée de façon exponentielle.
  3. Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle la concentration d’au moins un inhibiteur SMAD est augmentée jusqu’à 4 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes audit inhibiteur SMAD.
  4. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle 1 jour après l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD, la concentration d’un premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 40% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 900%.
  5. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle 2 jours après l’exposition initiale des cellules pluripotentes auxdits inhibiteurs SMAD la concentration d’un premier inhibiteur SMAD (i) est augmentée d’au moins 67% et la concentration du deuxième inhibiteur SMAD (ii) est augmentée d’au moins 9 900%.
  6. Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle le premier inhibiteur SMAD (i) est apte à agir sur la voie BMP-2,4,7 et le deuxième inhibiteur SMAD (ii) est apte à agir sur la voie TGFbeta, Activin, Nodal.
  7. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle le premier inhibiteur SMAD (i) est choisi parmi le facteur Noggin, LDN193189, Dorsomorphin, DMH1, A-83-01, et leur combinaison ; et le deuxième inhibiteur SMAD (ii) est choisi parmi le facteur SB431542, SB505124, LY2157299, LY550410, et leur combinaison.
  8. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle la concentration du facteur Noggin lors de l’exposition initiale est comprise entre 50 et 70 ng/mL.
  9. Méthode selon l’une des revendications 7 ou 8, dans laquelle la concentration du facteur SB431542 lors de l’exposition initiale est comprise entre 0.1 et 0.3 µM.
  10. Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle
    1. l’au moins un activateur SHH est ajouté au moins 3 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes, et/ou
    2. l’activateur FGF est ajouté au moins 3 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes, et/ou
    3. l’au moins un activateur Wnt est ajouté au moins 6 jours après l’exposition initiale d’au moins un inhibiteur SMAD et des cellules pluripotentes.
  11. Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle les cellules pluripotentes sont sous forme isolées ou sous forme d’agrégats.
  12. Méthode selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle les cellules pluripotentes sont des cellules souches pluripotentes induites (iPSC).
  13. Méthode selon l’une des revendications précédentes, comprenant en outre, l’exposition des cellules neurales obtenues avec au moins un facteur choisi parmi rhBDNF, L-Ascorbic acid, rhGDNF, rhTGF-Beta3, rhFGF-20, dbcAMP, DAPT, Compound E, Trichostatin A, et leur combinaison, pour obtenir des cellules neurales exprimant au moins les marqueurs FOXA2.
  14. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle la méthode comprend une étape supplémentaire intermédiaire pendant au moins 1 jour durant laquelle le milieu ne comprend pas d’inhibiteurs de la voie TGF-Beta, lorsque le microcompartiment comprend au moins 50% de cellules neurales exprimant au moins les marqueurs FOXA2/OTX2.
  15. Micro-tissu comprenant une pluralité de cellules neurales susceptible d’être obtenues par la méthode selon l’une des revendications 1 à 14
  16. Micro-tissu selon la revendication précédente, caractérisées en ce que le micro-tissu est composé d’une population hétérogène de cellules neurales comprenant au moins des neurones dopaminergiques, des progéniteurs dopaminergiques ou des cellules gliales.
  17. Micro-tissu selon l’une des revendications 15 ou 16, pour son utilisation comme médicament.
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