CN119452079A

CN119452079A - 增强腹侧中脑神经祖细胞的神经元分化

Info

Publication number: CN119452079A
Application number: CN202380050961.0A
Authority: CN
Inventors: D·杰杰维奇; J·尼克利斯; J·R·克里斯蒂安森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2022-07-01
Filing date: 2023-06-30
Publication date: 2025-02-14
Also published as: WO2024003349A1

Abstract

本发明涉及引导腹侧中脑NSC向神经元分化的方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触，其中所述腹侧中脑NSC共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。

Description

增强腹侧中脑神经祖细胞的神经元分化

技术领域

本发明总体上涉及干细胞领域，如人类胚胎干细胞领域。提供了获得干细胞衍生的神经细胞的方法。具体而言，提供了获得用于治疗帕金森病的干细胞衍生的腹侧中脑神经细胞的方法。

背景技术

使用人类多能干细胞(hPSC)治疗各种病状的前景似乎非常光明。治疗包括对诸如帕金森病和卒中等神经系统状况的细胞替代疗法。然而，为了使此类治疗变得可行，需要开发体外方法来人工产生干细胞衍生的产品，以便将其递送到中枢神经系统(CNS)。hPSC向限定的细胞类型的分化是一个难以控制的过程；在许多情况下，通过体外方案产生的后代是异质的。通常，当向神经细胞分化时，产生的细胞类型的混合物包括神经元(并且其中包括多种神经元亚型，如谷氨酸能神经元和多巴胺能神经元)、神经胶质细胞、神经干细胞(NSC)以及其他非神经元细胞(例如，脑膜基质细胞)。这类异质培养物对于疾病建模研究或许多细胞替代疗法来说不是最佳的。

针对帕金森病的细胞替代疗法是一个典型的例子。在帕金森病中，A9腹侧中脑多巴胺能神经元(vmDA)丢失，并且可以说是必须移植才能恢复所丢失的功能的唯一细胞类型。然而，目前所有学术科学出版物和所有正在进行的人体临床试验都是移植多能祖细胞群体，这导致体内除了vmDA之外还有混合的细胞群体。这种混合群体包括诸如增殖NSC、血管柔脑膜细胞(VLMC)、非vmDA神经元和星形胶质细胞等细胞类型。非多巴胺能神经元无法恢复帕金森病的功能，而一些神经元(即，5-羟色胺能神经元)在患者中产生负面的功能获得行为，如在移植人类胎儿细胞的临床试验中所见，更普遍的是，这些非vmDA带来未知的安全性和有效性风险。因此，需要提供确保患者用腹侧中脑神经元或其祖细胞进行治疗的方法。

因此，本发明的目的是克服上述挑战，特别是提供可以引导细胞分化为腹侧中脑神经元的方法。

发明内容

如上概述的目的通过本发明的方面来实现。另外，本发明还可以解决其他问题，这从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出。

在第一方面，本发明提供了一种方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。具体而言，该方法用于引导腹侧中脑NSC向神经元的分化，这意味着腹侧中脑神经细胞的发育命运受到朝向某个结果即神经元的影响。然而，在本文公开的方法过程中，向神经元的分化不一定完成，并且细胞可能不一定发育成最终的命运。优选地，处于祖细胞阶段的细胞在体外被朝向分化为神经元引导，并且适合于施用于患者，其中在体内从祖细胞阶段的进一步发育产生神经元命运。本发明人发现，通过联合抑制MEK信号通路和NOTCH信号通路可以改善从细胞群体如人类PSC分化和制备腹侧中脑神经元。特别是，本发明人惊讶地发现，通过联合添加NOTCH通路拮抗剂/抑制剂可以增强MEK通路抑制的效果。具体而言，这种联合抑制降低了晚期增殖细胞(其代表脱靶谱系)的比例，降低了非神经细胞(如基质细胞，例如VLMC)的比例，并增加了神经元的比例。重要的是，本发明人发现，相对于细胞的发育阶段抑制MEK和NOTCH信号传导的时机对结局有影响。在优选的实施方案中，在抑制MEK和NOTCH信号传导时的神经细胞处于神经细胞包含神经干细胞、成神经细胞中间前体细胞和少量神经元的混合物的阶段。在优选的实施方案中，在抑制MEK信号传导之前的腹侧中脑NSC被神经诱导、腹侧化(ventralized)和尾侧化(caudalized)。在优选的实施方案中，所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的至少5％共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。包含这样的腹侧中脑神经细胞混合物的细胞群体可以通过任何方法产生。然而，在实施方案中，在抑制MEK和NOTCH信号传导之前，该细胞群体被神经诱导、尾侧化和腹侧化。该细胞群体可以衍生自多能细胞，如PSC。因此，在优选的实施方案中，PSC的细胞群体根据熟知的方法进行神经诱导、腹侧化和尾侧化，例如将PSC暴露于SMAD蛋白信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂和Wnt信号传导的抑制剂，并进一步使该细胞群体与FGF信号传导的激活剂接触。可以根据从启动神经诱导起持续例如16天的分化方法获得神经诱导细胞如腹侧中脑NSC的细胞群体，其中所得细胞群体主要包含神经干细胞。进一步培养该细胞群体，例如持续长达8天，可使更多神经干细胞进一步发育为成神经细胞中间前体细胞，但仍然保留通过使细胞与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触来引导腹侧中脑神经细胞进一步分化为神经元的机会窗口。在上述神经诱导PSC的方法中，已发现培养时间过长(例如超过28天)的细胞可能难以收获，例如，由于形成了无法分离的神经突网。

本领域技术人员将会认识到，细胞群体与抑制剂接触的最佳时机可能根据用于将PSC分化为腹侧中脑NSC的具体方案而不同。然而，本发明人已确定了包含腹侧中脑NSC的细胞群体的表达谱，该细胞群体提供改善的神经元结局。因此，在优选的实施方案中，在细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的40-60％表达ASCL1，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的45-65％表达KI67，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的少于10-15％表达INA，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的2-5％为INA+/SOX2-，并且包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的80-95％表达SOX2。由此可见，在细胞群体向包含腹侧中脑NSC的细胞群体分化的实施方案中，让细胞群体分化直到细胞群体获得前述表达谱，此时使该细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

根据所述方法获得的体外细胞群体可用于治疗帕金森病，并且由于细胞产品的较高纯度，可以缩短手术时间并减少颅脑注射。另外，产品纯度的提高和杂质的减少预计将提供增强的安全性和潜在的功效概况。

本发明的另一方面涉及MEK信号传导的抑制剂，其用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病。具体而言，所述腹侧中脑NSC共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。本发明人想到，在体外证实的MEK和NOTCH抑制的效果可以直接转化为体内效果，引导施用的腹侧中脑NSC向神经元分化。因此，本发明人认为，在例如通过手术将包含腹侧中脑NSC的细胞群体施用于受试者体内后，所施用的细胞可进一步被引导向神经元分化，从而降低晚期增殖细胞和非神经细胞如VLMC的比例，并增加神经元的比例。在实施方案中，所述MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib，一种经临床测试的小分子，其充当MEK抑制剂并穿过血脑屏障。在实施方案中，所述腹侧中脑NSC与所述MEK信号传导的抑制剂共同施用或在移植之前用抑制剂进行处理。

本发明的类似方面涉及联合用于治疗帕金森病的MEK信号传导的抑制剂、NOTCH信号传导的抑制剂和包含腹侧中脑NSC的细胞群体，以及用于治疗帕金森病的包含含有腹侧中脑NSC的细胞群体、MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂的组合物。在此，本发明人考虑将腹侧中脑NSC与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂共同施用。在共同施用之前，腹侧中脑NSC可能已经或可能尚未按照本文公开的方法在体外用MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂进行处理。已经证明，即使短时间暴露于MEK和NOTCH信号传导的抑制剂也会将包含腹侧中脑NSC的细胞群体向神经元命运引导，并且一次共同施用细胞和抑制剂可能足以在体内引导进一步的细胞成熟，从而减少患者所需的剂量施用。

附图说明

图1显示了说明VM分化阶段的简化示意图。该过程开始于hPSC(用白色图形表示)，hPSC在神经诱导、腹侧化和尾侧化后分化为VM NSC细胞(用垂直条纹图形表示)。在这些步骤之后，并且当VM IPC(用水平条纹图形表示)和VM神经元(用黑色图形表示)具有低表达时，施用本发明的化合物——MEK和/或NOTCH抑制剂。在神经诱导、腹侧化和尾侧化之后立即添加抑制剂被称为“早期施用”。

图2显示了在开始早期化合物施用时，细胞培养物的细胞内流式细胞术蛋白质分析结果的条形图。示出了NSC标志物SOX2和增殖标志物KI67的表达。还示出了VM和底板谱系标志物FOXA2、LMX1A和OTX2以及VM底板IPC标志物ASCL1和神经元标志物INA的表达。该图展示了细胞占总活细胞的百分比。

图3显示了在早期施用后体外第22天，细胞培养物的细胞内流式细胞术蛋白质分析结果的条形图。示出了以下培养物的结果：未进行干预(对照，黑色柱条)，施用MEK抑制剂(+MEKi，白色柱条)，施用NOTCH抑制剂(+NOTCHi，窄条纹柱条)，以及施用MEK和NOTCH抑制剂(+MEKi+NOTCHi，粗条纹柱条)。示出了NSC标志物SOX2和增殖标志物KI67、神经元标志物INA以及VM底板谱系标志物FOXA2和LMX1A的蛋白质表达。该图展示了细胞占总活细胞的百分比。

图4显示了接受早期施用并分化延长的一段时间至体外第35天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。用DAPI对所有细胞核的染色(A、C、E、G)和SOX2细胞的染色(B、D、F、H)。

图5显示了接受早期施用并分化延长的一段时间至体外第35天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。具有标志物INA的所有神经元纤维的染色(A、C、E、G)和具有KI67的所有增殖细胞的染色(B、D、F、H)。

图6显示了接受早期施用并分化延长的一段时间至体外第35天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。用DAPI对所有细胞核的染色(A、C、E、G)和具有酪氨酸羟化酶的所有多巴胺神经元的染色(B、D、F、H)。

图7显示了接受早期施用并分化延长的一段时间至体外第35天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。具有标志物LMX1A的所有腹侧中脑底板谱系细胞的染色(A、C、E、G)和具有标志物COL1A1的非神经元基质细胞的染色(B、D、F、H)。

图8显示了说明VM分化阶段的简化示意图。该过程开始于hPSC(用白色图形表示)，hPSC在神经诱导、腹侧化和尾侧化后分化为VM NSC细胞(用垂直条纹图形表示)。在这些步骤之后，并且在没有模式化因子的情况下在一段时间之后——此时VM IPC(用水平条纹图形表示)和VM神经元(用黑色图形表示)的比例增加并且VM NSC减少，施用本发明的化合物——MEK和/或NOTCH抑制剂。在模式化因子之后并且在没有模式化因子的情况下在神经诱导、腹侧化和尾侧化一段时间之后添加抑制剂被称为“晚期施用”。

图9显示了在对细胞进行晚期化合物施用(MEKi、NOTCHi或MEKi+NOTCHi)时，细胞培养物的细胞内流式细胞术蛋白质分析的条形图；注意这些细胞先前并未暴露于任何NOTCH或MEK抑制剂。示出了NSC标志物SOX2和增殖标志物KI67的表达。还示出了VM和底板谱系标志物FOXA2、LMX1A和OTX2以及VM底板IPC标志物ASCL1和神经元标志物INA的表达。该图展示了细胞占总活细胞的百分比。

图10显示了在开始晚期化合物施用时，细胞培养物的细胞内流式细胞术蛋白质分析结果的条形图。示出了NSC标志物SOX2和增殖标志物KI67的表达。还示出了VM和底板谱系标志物FOXA2、LMX1A和OTX2以及VM底板IPC标志物ASCL1和神经元标志物INA的表达。该图展示了细胞占总活细胞的百分比。

图11显示了在进行晚期化合物施用(MEKi、NOTCHi或MEKi+NOTCHi)的同时，细胞培养物的细胞内流式细胞术蛋白质分析的条形图，然而，这些细胞先前已经暴露于NOTCH抑制剂，如同本领域传统上进行的那样，并且对于施用MEKi和/或NOTCHi处理来说，这不是理想的情况并且不是优选的。示出了NSC标志物SOX2和增殖标志物KI67的表达。还示出了VM和底板谱系标志物FOXA2、LMX1A和OTX2以及VM底板IPC标志物ASCL1和神经元标志物INA的表达。该图展示了细胞占总活细胞的百分比。

图12显示了接受晚期施用并分化延长的一段时间至体外第40天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。用DAPI对所有细胞核的染色(A、C、E、G)和SOX2细胞的染色(B、D、F、H)。

图13显示了接受晚期施用并分化延长的一段时间至体外第40天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。具有标志物INA的所有神经元纤维的染色(A、C、E、G)和具有KI67的所有增殖细胞的染色(B、D、F、H)。

图14显示了接受晚期施用并分化延长的一段时间至体外第40天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。用DAPI对所有细胞核的染色(A、C、E、G)和具有酪氨酸羟化酶的所有多巴胺神经元的染色(B、D、F、H)。

图15显示了接受晚期施用并分化延长的一段时间至体外第40天的培养物的代表性免疫荧光图像。示出了对照条件(A-B)、施用NOTCH抑制剂后(C-D)、施用MEK抑制剂后(E-F)以及施用MEK和NOTCH抑制剂两者后(G-H)的结果。具有标志物LMX1A的所有腹侧中脑底板谱系细胞的染色(A、C、E、G)和具有标志物COL1A1的非神经元基质细胞的染色(B、D、F、H)。

图16显示了用于对PSC的细胞群体进行神经诱导、腹侧化和尾侧化以成为腹侧中脑NSC以及进一步引导细胞向神经元分化的方案。在(A)中，细胞群体在第16天与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。在(B)中，在去除模式化因子(即SMAD抑制剂、SHH激动剂、WNT激动剂和FGF8)后，在有意不存在NOTCHi的情况下，让细胞群体进一步分化一段时间，之后在第22天与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

图17显示了说明VM分化阶段的简化示意图。该过程开始于hPSC(用白色图形表示)，hPSC在神经诱导、腹侧化和尾侧化后分化为VM NSC细胞(用垂直条纹图形表示)。在这些步骤之后，并且在没有模式化因子的情况下在一段时间之后——此时VM IPC(用水平条纹图形表示)和VM神经元(用黑色图形表示)的比例增加并且VM NSC减少，施用本发明的化合物——NOTCH抑制剂。在模式化因子之后并且在没有模式化因子的情况下在神经诱导、腹侧化和尾侧化一段时间之后添加NOTCH抑制剂被称为“晚期施用单独的NOTCHi”。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。

需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。

除非另有声明，否则任何和全部示例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。

定义

一般定义

如本文所用的，“一个”或“一种”或“该”可表示一个(种)或多于一个(种)。除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。

如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。

干细胞

“干细胞”应被理解为具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新能力)但保持分化潜能的未分化细胞。根据其分化潜力，干细胞包括诸如多能干细胞、专能(multipotent)干细胞、单能干细胞等类别。

如本文所用的，术语“多能干细胞”(PSC)是指能够在体外培养并具有分化成属于三种胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的任何细胞谱系的潜能的干细胞，以及通常通过基因编辑而失去形成某些细胞类型、谱系或发育区域的能力的谱系限制性未分化干细胞。

多能干细胞可以从受精卵、体细胞核移植胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导或分离。多能干细胞(PSC)的实例包括胚胎干细胞(ESC)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、诱导多能干细胞(iPSC)等。

如本文所用的，术语“诱导多能干细胞”(也称为iPS细胞或iPSC)意指一种类型的多能干细胞，其可以直接从并非PSC并且具有细胞核的细胞生成。通过引入特定组的多能性相关基因的产物，可以将非多能细胞转化为多能干细胞。

如本文所用的，术语“胚胎干细胞”意指从胚泡的内细胞团衍生的多能干细胞。多能胚胎干细胞还可以衍生自孤雌生殖体(parthenotes)，如在例如WO 2003/046141中所述。另外，胚胎干细胞可以从单个卵裂球产生或通过培养在不破坏胚胎的情况下获得的内细胞团来产生。胚胎干细胞可从给定的组织机构获得，也可以商购获得。优选地，本发明的方法和产品基于人类PSC，即从人类诱导多能干细胞或人类胚胎干细胞(包括孤雌生殖体)衍生的干细胞。

如本文所用的，术语“专能干细胞”意指具有分化成多种类型的组织或细胞(但不是所有种类)的潜能的干细胞，并且通常局限于一个胚层。神经干细胞是局限于神经谱系的专能干细胞的实例。

如本文所用的，术语“单能干细胞”意指具有仅分化成一种特定细胞类型的潜能的干细胞。

如本文所用的，术语“在体外”意指细胞在人体或动物体之外提供和维持，例如在诸如烧瓶、多孔或培养皿的容器中。由此可见，细胞在细胞培养基中培养。

如本文所用的，术语“非天然的”是指细胞尽管衍生自可能具有人类来源的多能干细胞，却是在自然界中并不存在的人工构建体。一般来说，提供尽可能与人体细胞相似的细胞是干细胞治疗领域内的目标。然而，可能永远无法将多能干细胞在胚胎和胎儿阶段所经历的发育模拟到成熟细胞与人体天然细胞无法区分的程度。本质上，在本发明的实施方案中，细胞是人工的。

如本文所用的，与细胞有关的术语“人工的”可包括在自然界中天然存在但被修饰为非天然存在的构建体的材料。这包括人类干细胞，它们分化成模仿人体细胞的非天然存在的细胞。

方案

在整个本申请中，当涉及细胞培养或分化过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。

如本文所用的，与方案有关的术语“天”和类似的术语体外天(DIV)是指在分化程序期间执行某些步骤的具体时间。

一般而言，除非另有说明，否则“第0天”是指方案的起始，这是通过例如但不限于将干细胞涂布或将干细胞转移到培养器，或在转移干细胞之前使干细胞在其当前的细胞培养基中与化合物接触来进行的。通常，方案的起始是通过将未分化的干细胞转移到不同的细胞培养基和/或容器，例如但不限于通过涂布或孵育，和/或首先以启动分化过程的方式使未分化的干细胞与影响未分化干细胞的一种或多种化合物接触。

当在方法中提及“细胞”时，是指细胞群体的所有细胞，无论细胞类型如何。

当提及“第X天”，如第1天、第2天等时，它是相对于第0天的方案起始而言的。本领域普通技术人员将会认识到，除非另有指定，否则执行该步骤的当天的确切时间可能会有所不同。因此，“第X天”旨在涵盖诸如+/-10小时、+/-8小时、+/-6小时、+/-4小时、+/-2小时或+/-1小时的时间跨度。

培养干细胞

如本文所用的，术语“培养”是指连续的程序，在整个方法中采用该程序以保持细胞在其各个阶段的活力。在从例如但不限于活组织或胚胎中分离出目的细胞后，将它们维持在仔细控制的条件下。这些条件因每种细胞类型而异，但通常由合适的容器组成，该容器具有提供必需营养成分(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体(CO₂、O₂)以及调节理化环境(pH缓冲液、渗透压、温度)的基底和/或培养基。

如本文所用的，术语“细胞培养基”是指设计成支持细胞生长的液体或凝胶。细胞培养基通常包含适当的能量源和调节细胞周期的化合物。

如本文所用的，术语“培养器”是指可以支持细胞培养的任何合适的培养器。非限制性实例包括培养皿、培养平皿和板(6孔、24孔、48孔、96孔、384孔、9600孔等的微量滴定板、微孔板、深孔板等)、烧瓶、区室载片、管、细胞工厂系统(Cell Factory)、滚瓶、转瓶、中空纤维、微载体或珠子。

如本文所用的，术语“提供干细胞”当在方案中提及时意指通过诸如以上所述的方法获得一批细胞，并且任选地将细胞转移到不同的环境中，例如通过接种到新的基底上。本领域普通技术人员将会容易地认识到，干细胞对于这样的转移是脆弱的，因而该程序需要谨慎，并且在将细胞培养基替换为另一种更适合进一步分化过程的细胞培养基之前将干细胞维持在原细胞培养基中可以促进更可持续的细胞转移。

分化干细胞

如本文所用的，与基因或蛋白质相关的术语“表达”是指存在RNA分子，其可以使用诸如逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)、RNA测序等测定来检测，和/或存在蛋白质，其可以例如使用基于抗体的测定如流式细胞术、免疫细胞化学/免疫荧光等来检测。根据测定的灵敏度和特异性，当检测到最少一个分子(例如在RNA测序中)时，可以认为基因或蛋白质已表达，或者可以相对于对照样品定义高于背景/噪声水平的检测限，例如在流式细胞术中。本领域技术人员将容易地理解，当提及细胞群体的“表达”时，如“表达标志物Y的X％的细胞群体”，是指所述细胞群体中X％的细胞表达标志物Y。

如本文所用的，术语“共表达”是指单个细胞表达多种标志物。

如本文所用的，术语“标志物”是指由细胞进行的天然发生的可鉴别的表达，其可以与该细胞的某些性质相关。在优选的实施方案中，标志物是遗传表达或蛋白质组表达，其可以被检测并与细胞的身份相关联。标志物可以用基因来指称。这可以容易地翻译成相应mRNA和蛋白质的表达。

如本文所用的，当与本文公开的任何标志物如表面蛋白质或转录因子结合使用时，术语“阴性”或“-”是指该标志物在细胞或细胞群体中不表达，而术语“弱”或“低”是指与细胞群体中该标志物的平均表达相比或与参考样品相比，该标志物在细胞中以降低的水平表达。

如本文所用的，当与本文公开的任何标志物如表面蛋白质或转录因子结合使用时，术语“阳性”或“+”是指该标志物在细胞或细胞群体中表达，而术语“高”或“强”是指与细胞群体中该标志物的平均表达相比或与参考样品相比，该标志物在细胞中以增加的水平表达。

如本文所用的，术语“分化”泛指细胞从未分化状态或不同于预期分化状态的状态进展到特定分化状态的过程，例如从未成熟状态进展到较成熟状态或从未成熟状态进展到成熟状态的过程，这可以在执行该方法时连续发生。与多能干细胞有关的术语“分化”是指细胞从未分化状态进展到特定分化状态的过程，即从未成熟状态进展到较成熟状态或终末状态的过程。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“完全分化”或“终末分化”。“终末分化的”细胞是发育谱系的最后阶段，而不能进一步分化。

如本文所用的，与培养或分化细胞有关的术语“接触”是指通过将例如特定化合物放置在允许其触及细胞的位置而使细胞暴露于特定化合物，以便产生“接触的”细胞。接触可以使用任何合适的手段来完成。接触的非限制性实例是通过将化合物添加到细胞的细胞培养基中。只要细胞和特定化合物接近，例如，化合物以合适的浓度存在于细胞培养基中，就假定发生细胞的接触。

如本文所用的，术语“抑制剂”是指减少或抑制或下调某过程的化合物，该过程例如是可促进细胞分化的信号通路。

如本文所用的，术语“激活剂”是指诱导或刺激或上调某过程的化合物，该过程例如是可促进细胞分化的信号通路。

干细胞衍生的产品

如本文所用的，术语“分化的细胞”是指已从未分化状态进展至较成熟状态的细胞，如多能干细胞。分化的细胞可以是例如较成熟的特化细胞，如祖细胞，或完全成熟为特化/终末细胞类型。

如本文所用的，术语“细胞群体”是指同一培养物中的多个细胞。细胞群体可以是例如不同类型的细胞或处于不同发育阶段的细胞(例如处于通往相同或相似特化特征的不同成熟阶段的细胞)的混合物，或者它可以是具有共同标志物的更均质的细胞组合物。

如本文所用的，术语“神经细胞群体”是指包含神经细胞的细胞群体。

如本文所用的，与细胞有关的术语“遗传修饰的”和“基因工程的”可以互换使用，是指已经经历人工操作、修饰或者DNA或其他核酸分子的重组以改变该细胞的特征(表型)的细胞。这样的细胞不再被视为天然存在的细胞。对于遗传修饰的干细胞，即使干细胞进一步分化成特化细胞，基因编辑产生的性状仍然存在，因此使得该特化细胞成为遗传修饰的和人工的，即非天然存在的。遗传修饰的干细胞的一个实例是HLA缺陷型干细胞，其也被称为通用供体细胞，并且旨在克服移植排斥问题。WO/2020/260563中公开了一种获得HLA缺陷型干细胞的方法。

神经外胚层细胞

如本文所用的，术语“神经的”是指神经系统。

如本文所用的，术语“神经细胞”(除非另有说明)是指这样的细胞，其中天然对应物自然构成一部分外胚层，更具体地神经外胚层，并且旨在涵盖该胚层内处于任何发育阶段的细胞，如NSC一直到神经元和其他终末分化细胞类型(例如，神经胶质细胞)，即细胞阶段，如神经干细胞阶段和成神经细胞阶段。因此，神经元及其前体被认为是特定类型的神经细胞。

如本文所用的，术语“神经元”和“神经细胞”可互换使用，是指有丝分裂后的并最终分化成特化细胞的神经细胞。神经元的特征在于标志物INA或其他等同标志物如ELAVL3、ELAVL4(通常用抗体HuC/D检测)、RBFOX3(通常用抗体NeuN检测)、STMN2、NCMA1或其他此类广泛神经元标志物的表达。

如本文所用的，术语“神经干细胞”或“NSC”和“神经前体细胞”或“NPC”是可互换使用的术语，是指神经系统的自我更新、多能细胞，其能够产生大量更特化的CNS和PNS细胞。NSC和NPC通常表达转录因子，如SOX2、NES、PAX6、SOX1、OTX2、OTX1、NKX6.1、OLIG2、NKX2.2、FOXG1、FOXA2或LMX1A。

如本文所用的，术语“成神经细胞”是指中间前体细胞，其通常是专能的或仅仅是单能的并且只能在有限的程度上自我更新。成神经细胞最终产生终末分化的细胞类型，如神经元。术语“成神经细胞”和“中间前体细胞”和“中间祖细胞”和“放射状胶质细胞”可互换使用。

如本文所用的，术语“成神经细胞”或“中间前体细胞”是指已经表达与该阶段相关的基因的细胞，该基因例如是ASCL1、SOX4、MASH1、EOMES、NHLH1、NEUROD或NEUROG基因家族的任何成员或其他此类基因。这些细胞注定会成为神经元。

如本文所用的，术语“神经元祖细胞”、“神经元的前体”和“神经元前体”可互换使用，并且是指具有进一步特化为神经元的潜力或倾向的神经细胞。术语“神经元前体”和“非天然神经元前体”可互换使用。

根据本发明的神经细胞可具有特定的区域身份，如中脑特定的细胞。

如本文所用的，术语“前脑”是指神经管和CNS的喙区，其产生包括大脑皮层和纹状体在内的结构。

如本文所用的，术语“中脑”是指神经管和CNS的中间区域(在喙-尾轴上)，其产生包括黑质在内的结构。

如本文所用的，与细胞有关的术语“腹侧中脑”是指具有在腹侧中脑中天然存在的神经细胞的某些特性的神经细胞。通常，腹侧中脑神经细胞的特征在于诸如FOXA2和LMX1A等某些标志物的表达。具体而言，如本文所用的，术语“腹侧中脑神经干细胞”是指具有在腹侧中脑中天然存在的神经干细胞的特征的神经干细胞。腹侧中脑NSC或NPC的特征可以在于标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2的共表达。

如本文所用的，术语“后脑”和“脊髓”是指神经管的尾区，其位于峡组织体的尾侧。

如本文所用的，术语“多巴胺能(DA)细胞”或“多巴胺能神经元”或“多巴胺神经元”是指能够合成神经递质多巴胺的细胞。

如本文所用的，术语“基质细胞”是指具有成为结缔组织细胞或成纤维细胞身份细胞的能力的细胞。

如本文所用的，术语“VLMC”是指血管柔脑膜细胞，并且被认为是位于CNS中的一种类型的基质细胞。

如本文所用的，术语“神经胶质细胞”是指中枢神经系统(脑和脊髓)和周围神经系统中不产生电脉冲、对神经元起支持和保护作用的非神经元细胞。实例包括星形胶质细胞和少突胶质细胞及其前体、神经胶质前体细胞或成胶质细胞。

引导向腹侧中脑神经元的分化

在本发明的一般方面，提供了一种方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。具体而言，在实施方案中，该方法用于引导腹侧中脑NSC向神经元的分化。在进一步的实施方案中，该方法用于将腹侧中脑NSC分化为腹侧中脑神经元。在优选的实施方案中，腹侧中脑NSC被神经诱导、腹侧化和尾侧化。在实施方案中，对细胞群体进行神经诱导、腹侧化和尾侧化以获得腹侧中脑NSC。在实施方案中，该方法是体外的。

该方法旨在增加细胞群体中具有神经元命运的细胞的数目。如本文所用的，与细胞有关的术语“神经元命运”意指该细胞的发育命运受到限制，从而将发育成神经元。

如本文所用的，术语“引导分化”是指影响细胞向某种结局的发育命运。在本文公开的方法过程中，引导细胞分化不一定是连续的过程，并且细胞可能不一定发育成最终的命运。在优选的实施方案中，在体外引导细胞的分化，使得细胞随后可以在体内向特定命运、特别是神经元命运发育。

因此，在一般的实施方案中，所述方法用于增加分化为神经元的神经细胞的比例。在实施方案中，该方法用于降低分化为基质细胞如血管柔脑膜细胞(VLMC)、非vmDA神经元和/或星形胶质细胞的神经细胞的比例。

如本文所用的，术语“MEK”是指MAPK/ERK激酶，而术语“MEK信号传导”是指MAPK/ERK通路(也称为Ras-Raf-MEK-ERK通路)的激活。如本文所用的，术语“MEK信号传导的抑制剂”(MEKi)是指任何使MAPK/ERK通路失活的化合物。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂抑制MKK1(MEK1)和MKK2(MEK2)。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂抑制MEK的激活和下游信号传导。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂是抑制ERK磷酸化的有效抑制剂。这适用于本发明的所有方面。

如本文所用的，术语“NOTCH”是指Notch受体的信号通路。如本文所用的，术语“NOTCH信号传导的抑制剂”(NOTCHi)是指任何使NOTCH通路失活的化合物。在实施方案中，NOTCH信号传导的抑制剂通过靶向γ-分泌酶或γ-分泌酶复合物来实现这一点。这适用于本发明的所有方面。本发明人进一步发现，为了将细胞群体向腹侧中脑神经元命运引导，使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触提供协同效应。

在实施方案中，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的至少5％，如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。本发明人发现，对于被神经诱导、腹侧化和尾侧化到它们共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2的程度的NSC来说，MEK信号传导的抑制在增加神经元分化中的效果尤为明显。

本发明人已经确定了包含腹侧中脑NSC的细胞群体的表达谱，该细胞群体提供改善的神经元结局。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的0.5-65％、5-65％、10-65％、15-65％、20-65％、25-65％、30-65％、35-65％或40-65％、优选30-65％、更优选40-65％表达ASCL1。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的25-65％、30-65％、35-65％、40-65％或45-65％、优选45-65％表达KI67。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的少于20％、优选少于15％表达INA。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的0-20％、0.1-20％、0-15％、0.1-15％、5-20％、10-20％、5-15％或10-15％、优选10-15％表达INA。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的少于10％、优选少于5％为INA+/SOX2-。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的0-10％、0-5％、1-5％或2-5％、优选2-5％为INA+/SOX2-。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的75-95％、优选80-95％表达SOX2。在优选的实施方案中，以上所有均适用，即，在细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的40-60％表达ASCL1，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的45-65％表达KI67，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的10-15％表达INA，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的2-5％为INA+/SOX2-，并且包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的80-95％表达SOX2。在优选的实施方案中，该细胞群体在具有上述优选的表达谱之前不与NOTCH信号传导的抑制剂如DAPT接触。

在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的超过70％或60％进一步发育成中间神经前体之前，该细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。在另一个实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的超过20％、15％、10％或5％进一步发育成中间神经前体或神经元之前，该细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。具体而言，在另一个实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的超过20％、15％、10％或5％表达标志物ASCL1和INA之一之前，该细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

如本文所用的，术语“中间神经前体”是指处于神经干细胞与神经元之间的发育阶段的细胞。此阶段的腹侧中脑神经细胞的特征在于标志物ASCL1的表达。本发明人发现，有效引导细胞群体向神经元发育的机会窗口是在细胞成熟到成为神经元或其他终末神经细胞如星形胶质细胞、基质细胞如VLMC等的阶段之前。

在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂选自PD0325901、曲美替尼(trametinib)(GSK1120212)、司美替尼(selumetinib)(AZD6244)、匹马塞替尼(pimasertib)(AS703026)、MEK162、考比替尼(cobimetinib)、PD184352、PD173074、BIX02189、AZD8330、PD318088、瑞法替尼(Refametinib)和PD98059。如本文所用的，PD0325901是指一种小分子，其化学名为N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺，CAS编号为391210-10-9，并且是一种有效的MKK1(MEK1)和MKK2(MEK2)抑制剂。

在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂的浓度为至少5μM，优选至少10μM。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂的浓度为5μM至100μM、5μM至50μM、5μM至40μM或5μM至30μM。

在实施方案中，NOTCH信号传导的抑制剂选自DAPT、Avagacestat、PF-03084014和LY450139。如本文所用的，术语“DAPT”是指一种小分子，其化学名为(2S)-N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰基-2-苯基]甘氨酸1,1-二甲基乙酯，CAS编号为208255-80-5。如本文所用的，术语“Avagacestat”是指CAS编号为1146699-66-2的化合物。如本文所用的，术语“PF-03084014”是指CAS编号为1290543-63-3的化合物。如本文所用的，术语“LY450139”和“司马西特(Semagacestat)”可以互换使用，是指CAS编号为425386-60-3的化合物。

在实施方案中，NOTCH信号传导的抑制剂的浓度为至少1μM，优选至少10μM。在进一步的实施方案中，NOTCH信号传导的抑制剂的浓度为1μM至100μM、1μM至50μM、1μM至40μM或1μM至30μM。

在实施方案中，细胞群体与MEK信号传导的抑制剂接触至少1/2小时、1小时、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或18小时，或24小时，或者至少2天、3天、4天、5天或6天。在实施方案中，细胞群体与MEK信号传导的抑制剂接触1/2小时至15天、1/2小时至10天、1/2小时至5天、1/2小时至2天、1小时至2天、3小时至2天、6小时至2天、12小时至2天、18小时至2天，或1至2天，或约2天至约15天。在实施方案中，细胞群体与NOTCH信号传导的抑制剂接触至少1/2小时、1小时、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或18小时，或24小时，或者至少2天、3天、4天、5天或6天。在实施方案中，细胞群体与NOTCH信号传导的抑制剂接触1/2小时至15天、1/2小时至10天、1/2小时至5天、1/2小时至2天、1小时至2天、3小时至2天、6小时至2天、12小时至2天、18小时至2天，或1至2天，或约2天至约15天。

在实施方案中，至少每48小时、36小时，优选至少每30小时，更优选至少每24小时，向细胞施用MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，至少每12至36小时，优选至少每18至30小时，更优选至少每24小时，更换MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。在优选的实施方案中，在细胞群体与抑制剂接触的过程中，确保细胞充分暴露于抑制剂。在实施方案中，通过足够的培养基更换，例如每24小时更换一次，来持续暴露细胞群体。或者，细胞群体可以通过确保抑制剂的持续释放的生物材料或物质而充分暴露于抑制剂。

在实施方案中，细胞群体至少部分地同时与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。在实施方案中，细胞群体同时与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

根据本发明，细胞在体外朝向分化成神经元被引导，以便适合随后施用至患者体内，其中体内的进一步发育导致神经元命运。在朝向神经元发育引导分化的方法之后，可能不会立即向患者进行施用。因此，在实施方案中，在MEK和NOTCH信号传导的抑制后冷冻保存细胞群体。在实施方案中，在MEK和NOTCH信号传导的抑制结束后4天内，如3天、2天、1天、12小时、6小时或3小时内，冷冻保存细胞群体。在实施方案中，在MEK和NOTCH信号传导的抑制结束后立即冷冻保存细胞群体。在实施方案中，在DMSO中或使用不含DMSO的冷冻保护剂冷冻保存细胞群体。本领域技术人员将知晓，此类冷冻保护剂是可商购获得的，并且用于冷冻保存细胞群体如包含神经细胞的细胞群体的技术是众所周知的。

根据本发明，使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触将细胞群体朝向腹侧中脑神经元命运引导。因此，当至少部分细胞已分化为腹侧中脑NSC时，使细胞群体与所述抑制剂之一或两者接触。尽管如此，细胞可在此阶段之前与所述抑制剂之一或两者接触，以实现类似的或其他效果。然而，在优选的实施方案中，在细胞群体被神经诱导、腹侧化和尾侧化之前，细胞群体不与MEK信号传导的抑制剂或NOTCH信号传导的抑制剂接触。在优选的实施方案中，在根据所述方法使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，细胞群体不与NOTCH信号传导的抑制剂如DAPT接触。

本发明人确定了包含NSC的细胞群体的表达谱特别适合于朝向神经元引导分化。因此，本发明的方面还涉及引导腹侧中脑NSC向神经元分化的体外方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触，其中包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的0.5-66％、优选40-60％表达ASCL1，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的25-65％、优选45-65％表达KI67，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的0-20％、优选10-15％表达INA，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的0-10％、优选2-5％为INA+/SOX2-，并且包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的75-95％、优选80-95％表达SOX2。本领域技术人员应当理解，上面提到的实施方案同样适用于该具体方面。

PSC向腹侧中脑NSC的分化

涉及引导腹侧中脑NSC向神经元分化的方法的一般方面需要包含腹侧中脑NSC的细胞群体作为起始材料。包含腹侧中脑NSC的细胞群体可以通过任何合适的方法获得。因此，在实施方案中，该方法包括将细胞群体分化为腹侧中脑NSC的初始步骤。在实施方案中，该细胞群体衍生自PSC。在这样的实施方案中，对细胞群体进行神经诱导、腹侧化和尾侧化以获得腹侧中脑NSC。因此，在实施方案中，在使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，培养该细胞群体以诱导向腹侧中脑NSC的分化。

在实施方案中，在使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，使该细胞群体与Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导的抑制剂、音猬因子(SHH)信号传导的激活剂、wingless(Wnt)信号传导的激活剂和/或成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的激活剂以及可选的抗坏血酸和/或可选的脑源性神经营养因子(BDNF)接触。

在将PSC分化为腹侧中脑NSC的实施方案中，通过使细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂如SMAD蛋白信号传导的至少两种抑制剂接触，从而对细胞群体进行神经诱导，来使细胞群体分化为腹侧中脑神经细胞。如本文所用的，术语“SMAD蛋白信号传导”是指SmallMothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号通路。本领域技术人员将会认识到，使PSC与SMAD信号通路的一种或多种抑制剂接触是一种将细胞分化成神经谱系的可靠技术。在实施方案中，SMAD信号通路的抑制剂选自头蛋白(Noggin)、LY364947、SB431542、RepSox和LDN-193189，或类似化合物。

在将PSC分化为腹侧中脑NSC的实施方案中，通过诱导细胞群体的腹侧化将细胞群体分化为腹侧中脑神经干细胞。如本文所用的，术语“腹侧化”和“腹侧模式化”可互换使用，是指多能细胞呈现与胚胎或胚胎结构即神经管的细胞等同的腹侧基因表达身份的过程。在实施方案中，通过使细胞与SHH信号通路的激活剂接触而对PSC进行腹侧化。如本文所用的，术语“音猬因子信号传导的激活剂”是指能够激活SHH信号通路的任何分子或化合物。众所周知，SHH通路的激活负责腹侧神经管结构的诱导和维持。在实施方案中，SHH信号传导的激活剂选自SHH、嘌吗啡胺(purmorphamine)和SAG，或类似化合物。

在将PSC分化为腹侧中脑NSC的实施方案中，通过诱导细胞群体的尾侧化将细胞群体分化为腹侧中脑神经细胞。如本文所用的，术语“尾侧化”是指多能细胞呈现与胚胎或胚胎结构即神经管的细胞等同的尾侧基因表达身份的过程。在实施方案中，通过使细胞与Wnt信号通路的激活剂接触而对PSC进行尾侧化。如本文所用的，术语“Wnt信号传导的激活剂”是指能够激活Wnt信号通路的任何分子或化合物。众所周知，Wnt信号传导的抑制剂负责神经细胞的尾侧化。在实施方案中，Wnt信号传导的激活剂降低GSK3-β以供激活Wnt信号传导。因此，在某些实施方案中，Wnt激活剂是GSK3-β的抑制剂。在实施方案中，Wnt信号传导的激活剂选自CHIR99021和重组Wnt蛋白。

在将PSC分化为腹侧中脑NSC的实施方案中，通过进一步诱导细胞群体的尾侧化将细胞群体分化为腹侧中脑神经细胞。因此，在实施方案中，使细胞群体与成纤维细胞生长因子(FGF)的激活剂接触。在实施方案中，FGF信号传导的激活剂是FGF8b。

在特定实施方案中，SMAD蛋白信号传导的抑制剂的浓度为1μM至50μM，SHH信号传导的激活剂的浓度为200ng/ml至800ng/ml，Wnt信号传导的抑制剂的浓度为0.1μM至1μM，FGF信号传导的激活剂的浓度为10ng/ml至200ng/ml，抗坏血酸的浓度为50μM至500μM，并且/或者BDNF的浓度为1ng/ml至50ng/ml。

在优选的实施方案中，PSC是人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞。

本发明进一步的方面涉及引导PSC细胞群体向腹侧中脑神经元分化的体外方法，其包括培养PSC的细胞群体，使PSC的细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂、FGF信号传导的激活剂、可选的抗坏血酸和可选的BDNF接触，以获得包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中该包含腹侧中脑NSC的细胞群体进一步与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触以引导向腹侧中脑神经元的分化。

在实施方案中，多能干细胞的细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂接触5至9天。在特定实施方案中，从第0天起，细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂接触5至9天。

在实施方案中，PSC的细胞群体与SHH信号传导的激活剂接触5至9天，如7至9天，优选9天。在优选的实施方案中，从第0天起，细胞群体与Wnt信号传导的抑制剂接触5至9天。在实施方案中，SHH信号传导的激活剂的浓度为200ng/ml至800ng/ml。

在实施方案中，多能干细胞的细胞群体与Wnt信号传导的抑制剂接触5至9天，如7至9天，优选9天。在优选的实施方案中，从第0天起，细胞群体与Wnt信号传导的抑制剂接触5至9天。在实施方案中，Wnt信号传导的激活剂的浓度为0.1μM至1μM。

在实施方案中，PSC的细胞群体在与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂和/或SHH信号传导的激活剂接触结束之后，与FGF信号传导的激活剂接触7至12天。在另一实施方案中，该细胞群体从第5至9天起，或者当与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂和/或SHH信号传导的激活剂接触结束时，与FGF信号传导的激活剂接触7至12天。在特定实施方案中，细胞群体从第0天至第9天与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂和Wnt信号传导的抑制剂接触，随后，该细胞群体从第9天至第16天与FGF信号传导的激活剂接触。在实施方案中，FGF信号传导的激活剂是FGF8b。在实施方案中，FGF信号传导的激活剂的浓度为10ng/ml至200ng/ml。

在实施方案中，从第10或11天起，细胞群体与抗坏血酸接触5至7天。在实施方案中，抗坏血酸的浓度为10μM至400μM，优选100μM至300μM，优选150μM至250μM，更优选约200μM。

在实施方案中，从第10或11天起，细胞群体与BDNF接触5至7天。在实施方案中，BDNF的浓度为1ng/ml至40ng/ml，优选10ng/ml至40ng/ml，优选15ng/ml至30ng/ml，更优选约20ng/ml。

在实施方案中，在使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，让该细胞群体向腹侧中脑NSC分化14至24天，如15至20天。在实施方案中，细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触1/2小时至15天、1/2小时至10天、1/2小时至5天、1/2小时至2天、1小时至2天、3小时至2天、6小时至2天、12小时至2天、18小时至2天，或1至2天，或约2天至约10天。在实施方案中，在细胞群体不再与FGF信号传导的激活剂接触之后0至10天，使该细胞群体与MEK和NOTCH的抑制剂接触。

在优选的实施方案中，在使细胞群体向腹侧中脑NSC分化时，该细胞群体不与NOTCH信号传导的抑制剂如DAPT接触。

在实施方案中，在使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，从第16天起，将包含腹侧中脑NSC的细胞群体在合适的培养基中培养6至8天，而不使该细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂、FGF信号传导的激活剂或NOTCH信号传导的抑制剂如DAPT接触。本领域技术人员将认识到，当细胞群体在没有这类组分的情况下进一步培养时，细胞将继续分化。

在替代实施方案中，细胞群体与Wnt信号传导的抑制剂接触至少14天，而不是使细胞群体与FGF的激活剂接触。在这样的实施方案中，在细胞群体不再与Wnt信号传导的抑制剂接触之后0至10天，使细胞与MEK和NOTCH的抑制剂接触。

在实施方案中，在从细胞群体开始向腹侧中脑NSC分化起28天之前，如27天、26天或25天之前，优选26天之前，收获细胞群体。

在实施方案中，在从细胞群体开始向腹侧中脑NSC分化起第28天、第27天、第26天或第25天，优选第25天，收获细胞群体。

如本文所用的，术语“收获”是指收集细胞并将其转移到新环境。这可以是将细胞重新接种到新的体外培养系统中。这也可以是细胞无法进一步发育成神经元的情况，如在实施方案中，在收获时冷冻保存细胞群体。因此，在实施方案中，在MEK信号传导的抑制和NOTCH信号传导的抑制后冷冻保存细胞群体。在实施方案中，在MEK信号传导的抑制和NOTCH信号传导的抑制结束后4天内，如3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内，冷冻保存细胞群体。在实施方案中，在收获后4天内，如3天、2天、1天、12小时、6小时或3小时内，冷冻保存细胞群体。

在实施方案中，细胞群体至少部分地同时与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。在特定实施方案中，细胞群体同时与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

在实施方案中，细胞群体在二维培养中培养。在进一步的实施方案中，最初将细胞群体接种在基底上。在实施方案中，该基底包含细胞外基质。在进一步的实施方案中，该基底包含聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-鸟氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白和/或胶原蛋白，和/或其片段。在更具体的实施方案中，该层粘连蛋白或其片段选自层粘连蛋白-111、层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-511。在实施方案中，细胞群体在层粘连蛋白-111基底上培养。在实施方案中，层粘连蛋白基底的浓度约为10μg/ml。

在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的0.5-65％、5-65％、10-65％、15-65％、20-65％、25-65％、30-65％、35-65％或40-65％、优选30-65％、更优选40-65％表达ASCL1。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的25-65％、30-65％、35-65％、40-65％或45-65％、优选45-65％表达KI67。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的少于20％、优选少于15％表达INA。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的0-20％、0.1-20％、0-15％、0.1-15％、5-20％、10-20％、5-15％或10-15％、优选10-15％表达INA。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的少于10％、优选少于5％为INA+/SOX2-。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的0-10％、0-5％、1-5％或2-5％、优选2-5％为INA+/SOX2-。在实施方案中，在包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，该细胞群体中的75-95％、优选80-95％表达SOX2。在优选的实施方案中，以上所有均适用，即，在细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的40-60％表达ASCL1，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的45-65％表达KI67，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的10-15％表达INA，包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的2-5％为INA+/SOX2-，并且包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的80-95％表达SOX2。

在实施方案中，通过获得神经微球来培养细胞群体，其包括以下步骤：获得神经干前体母细胞，聚集神经干前体母细胞以形成神经微球，以及让神经微球的神经干前体母细胞进一步成熟。在实施方案中，该方法在聚集神经干前体母细胞的步骤之前，包括将神经干前体母细胞接种在适合于在静态非贴壁培养中维持神经微球的孔中的额外步骤。在神经微球中培养细胞群体的方法详述于WO/2021/099532中，其通过引用并入本文。

使用NOTCH信号传导的抑制剂进行晚期神经分化

本发明的另一方面涉及引导细胞群体向腹侧中脑神经元分化的体外方法，其包括以下步骤：培养包含PSC的细胞群体，诱导该细胞群体向腹侧中脑NSC分化，让腹侧中脑NSC成熟，以及使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与NOTCH信号传导的抑制剂接触，其中所述腹侧中脑NSC表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。

在实施方案中，在最初诱导细胞群体向腹侧中脑NSC分化后至少20天，优选21天，更优选22天，使该细胞群体与NOTCH信号传导的抑制剂接触。

在实施方案中，在使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，让腹侧中脑NSC成熟至少4天。

在实施方案中，在细胞群体中的至少70％表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2之后不早于4天，使腹侧中脑NSC与NOTCH信号传导的抑制剂接触。

腹侧中脑神经细胞的细胞群体

本发明的一方面涉及可通过本文所述的任何方法获得的包含腹侧中脑神经细胞的细胞群体。在特定实施方案中，通过根据任一前述实施方案的方法获得包含腹侧中脑神经细胞的细胞群体。值得注意的是，本发明人还未能确定可区分在抑制MEK信号传导和抑制NOTCH信号传导后立即收获的细胞群体与未经历根据本发明朝向神经元引导分化的方法的细胞群体的参数。然而，显然细胞受到了信号传导的刺激，并且具有神经元命运的细胞的比例已经增加，一旦将细胞群体进一步培养，这会立即变得明显。因此，本发明的一方面涉及包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中当将该细胞群体在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少50％为神经元(根据HuCD、INA或相关标志物确定)并且<15％的细胞正在增殖(根据KI67、MKI67或其他此类增殖标志物确定)的细胞群体(实施例5)。在实施方案中，根据实施例7使用scRNAseq来测量细胞的标志物的表达。在实施方案中，根据如实施例8所述的免疫细胞化学(ICC)来测量细胞的标志物的表达。在实施方案中，根据如实施例2所述的流式细胞术来测量细胞的标志物的表达。在实施方案中，根据实施例6培养细胞群体。

因此，本发明的一方面涉及包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中当将该细胞群体在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少25％为HuCD+/SOX2-或HUCD+或NEUN+/SOX2-的细胞群体。在实施方案中，根据实施例7使用scRNAseq来测量细胞的标志物的表达。在实施方案中，根据如实施例8所述的免疫细胞化学(ICC)来测量细胞的标志物的表达。在实施方案中，根据如实施例2所述的流式细胞术来测量细胞的标志物的表达。在实施方案中，根据实施例6培养细胞群体。

在实施方案中，细胞群体是体外的。在实施方案中，腹侧中脑神经细胞是非天然的。在实施方案中，腹侧中脑神经细胞是人工的。在优选的实施方案中，腹侧中脑神经细胞是干细胞衍生的。在特定实施方案中，腹侧中脑神经细胞是从多能干细胞进行干细胞衍生的。在进一步的实施方案中，腹侧中脑神经细胞是从人类胚胎干细胞(hESC)或人类诱导多能干细胞(hiPSC)进行干细胞衍生的。

在实施方案中，细胞群体的细胞是遗传修饰的。在实施方案中，多能干细胞是遗传修饰的，并且该遗传修饰在根据本文描述的任何方法获得的腹侧中脑神经细胞中持续存在。在某些实施方案中，细胞群体的细胞被遗传修饰而变为低免疫原性的。如本文所用的，与细胞有关的术语“低免疫原性的”和“免疫逃避的”可以互换使用，是指使细胞不太容易受到移植有此类细胞的受试者的免疫排斥的细胞特性。通常，特定的表面标志物被过度表达或沉默化。在实施方案中，遗传修饰的细胞具有降低的MHC-I和/或MHC-II表达。在实施方案中，细胞被遗传修饰以表达一种或多种耐受原性因子或其类似物，如HLA-E、HLA-G、CD46、CD47、CD55、CD59和PD-L1。WO2012145384、WO2013158292、WO2016142532、WO2016183041、WO2018132783、WO2018175390、WO2019161271、WO2020018615、WO2020018620、WO2020049535、WO2020168317、WO2021195426、WO2022012591和WO2020260563中描述了对细胞进行遗传修饰以使其具有免疫逃避性的实例和方法。在一些方面，使用基因组编辑技术(例如，CRISPR/Cas或TALEN系统)调节(例如，降低、消除和/或增加)特定基因的表达。

在实施方案中，针对低免疫原性的遗传修饰包括：相对于野生型干细胞，MHC-I人类白细胞抗原的表达降低；相对于野生型干细胞，MHC-II人类白细胞抗原的表达降低；和/或相对于野生型干细胞，耐受原性因子的表达增加。在实施方案中，MHC-I人类白细胞抗原是HLA-A、HLA-B和HLA-C。在实施方案中，MHC-II人类白细胞抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。在实施方案中，耐受原性因子选自CD46、CD47、D55、CD59、PD-L1、HLA-E和HLA-G。

在实施方案中，细胞群体的细胞被遗传修饰为谱系限制性的。如本文所用的，与细胞有关的术语“谱系限制性的”是指该细胞在功能和/或结构上局限于分化成某些细胞类型。

在实施方案中，细胞群体被冷冻保存。在实施方案中，在DMSO中，或使用不含DMSO的冷冻保护剂冷冻保存细胞群体。

在实施方案中，细胞群体包含至少1,000个细胞、10,000个细胞、100,000个细胞、1,000,000个细胞或10,000,000个细胞。

用作药物的细胞群体

本发明的另一方面涉及根据本文所述的任一实施方案的体外细胞群体或其组合物，其用作药物。在实施方案中，该细胞群体包含已与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触的腹侧中脑神经细胞。在优选的实施方案中，该细胞群体用于治疗帕金森病。

另一方面涉及治疗或预防神经系统状况的方法，其包括向患者施用有效量的根据本发明的细胞群体。在优选的实施方案中，该神经系统状况是帕金森病。

另一方面涉及组合物，其包含含有腹侧中脑NSC的细胞群体、MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib。在实施方案中，该组合物用于治疗帕金森病。在实施方案中，包含腹侧中脑NSC的细胞群体的特征在于，当将在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少50％为INA+或HuCD+并且<15％为KI67+的细胞群体。在实施方案中，根据实施例6培养细胞群体。在实施方案中，包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中当将该细胞群体在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少25％为HuCD+/SOX2-或HUCD或NEUN+/SOX2-的细胞群体。在实施方案中，根据实施例6培养细胞群体。

在实施方案中，所述组合物进一步包含冷冻保护剂。在实施方案中，该冷冻保护剂是DMSO。在实施方案中，该冷冻保护剂不含DMSO。体内引导腹侧中脑神经细胞向神经元分化

另一方面涉及治疗帕金森病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的腹侧中脑NSC和MEK信号传导的抑制剂。在实施方案中，该方法进一步包括施用NOTCH信号传导的抑制剂。如本文所用的，术语“受试者”是指罹患帕金森病的人类患者。在实施方案中，与使用细胞产品治疗帕金森病有关的“治疗有效量”是指200,000至10,000,000个细胞的剂量。设想通过手术向受试者施用包含腹侧中脑NSC的细胞群体。在实施方案中，腹侧中脑NSC共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。在实施方案中，根据本文公开的方法获得腹侧中脑NSC。MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂的施用可以通过任何合适的方式进行，例如口服或皮下注射。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂的施用是口服。在优选的实施方案中，MEK信号传导的抑制剂是PD0325901。PD0325901还可被称为通用名称Mirdametinib。在实施方案中，NOTCH信号传导的抑制剂选自DAPT、MRK-560、MRK-003、LY900009、AL-101、Crenigacestat(LY3039478)、MK0752、Nirogacestat(PF-03084017、RO4929097(RG473)、CT16、PTG12、抗NRR1、抗NRR2、布隆妥珠单抗(Brontictuzumab)

(OMP-52M51)、他瑞妥单抗(Tarextumab)(OMP-59R5)、15D11、抗Jag1/2、抗DII1、YW152F、MMGZ01、mABL001、HMD4-2、登赛珠单抗(Demcizumab)(OMP-21M18)、依诺苏单抗(Enoticumab)(REGN421)、MEDI0639、那赛昔珠单抗(Navicixizumab)

(OMP-305B83)、ABT-165、NOV1501(ABL001；HD105)、IMR-1、RIN1、SAHM1和CB-103。在实施方案中，选择已经过临床测试的NOTCH信号传导的抑制剂。所列NOTCH抑制剂的详细信息可见Front.Cell Dev.Biol.,2021年5月28日,Vol.9,2021(表1)。在实施方案中，在向患者施用腹侧中脑NSC的同一天开始施用MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，在移植细胞之前开始施用MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂，以便在施用细胞时在受试者中达到稳态。在实施方案中，从细胞移植前6天到细胞移植后6天开始施用MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，向受试者施用MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂至少2天，如至少3、4、5、6、7、8、9或10天。在实施方案中，向受试者施用MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂1至12天。剂量方案可以是任何合适的剂量，以使MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂的血浆浓度处于引导所施用的腹侧中脑NSC向神经元分化的有效窗口内。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib，并且剂量方案是1mg至30mgbid(每日两次)、1mg至20mg bid、1mg至10mg bid、1至5mg bid或2至4mg bid。

在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂与包含腹侧中脑NSC的细胞群体，例如已分化14至24天、优选至少16天的细胞群体共同施用，任选地，其中该细胞群体在施用到患者体内之前未与MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂接触。

因此，本发明的方面涉及MEK信号传导的抑制剂，其用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病。另一方面涉及MEK信号传导的抑制剂，其用于通过与治疗有效量的腹侧中脑NSC共同施用来治疗受试者的帕金森病。在实施方案中，进一步向受试者共同施用NOTCH信号传导的抑制剂。具体而言，一个方面涉及用于治疗帕金森病的Mirdametinib。更具体而言，一个方面涉及用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病的Mirdametinib，或涉及用于通过与治疗有效量的腹侧中脑NSC共同施用来治疗受试者的帕金森病的Mirdametinib。在优选的实施方案中，腹侧中脑NSC共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。

另一方面涉及MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂，其联合用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病。类似地，一个方面涉及MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂，其在引导腹侧中脑NSC向腹侧中脑神经元分化的方法中联合使用，其中该方法包括向已施用腹侧中脑NSC的受试者联合施用MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，至少在施用腹侧中脑NSC后6天内施用MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂施用至少2天，如至少4、5或6天。

另一方面涉及MEK信号传导的抑制剂、NOTCH信号传导的抑制剂和包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其联合用于治疗帕金森病。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂与包含腹侧中脑NSC的细胞群体一起共同施用。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其包含含有腹侧中脑NSC的细胞群体和MEK信号传导的抑制剂。在实施方案中，MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib。在实施方案中，该组合物进一步包含NOTCH信号传导的抑制剂。在具体实施方案中，NOTCH信号传导的抑制剂是DAPT。另一方面涉及一种组合物，其包含含有腹侧中脑NSC的细胞群体、MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。在实施方案中，该组合物是体外的。

本领域技术人员将理解，本节中提及的与治疗方法、作为药物的用途和第二医药用途相关的实施方案可同样地适用于所有提及的方面。

用于治疗帕金森病的细胞群体

本发明人意识到，获得包含腹侧中脑神经细胞的细胞群体而不使该细胞群体与NOTCH的抑制剂如DAPT接触，更好地反映了神经细胞的自然发育。尽管本发明人仍然偏好进一步使细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触，但是与现有技术方法相比，在使细胞与这些抑制剂接触时具有优选表达谱的细胞群体本身可能更适合治疗帕金森病。因此，本发明的另一方面涉及用于治疗帕金森病的细胞群体，其中该细胞群体中的80-95％表达SOX2，该细胞群体中的40-60％表达ASCL1，该细胞群体中的30-65％表达KI67，该细胞群体中的10-20％表达INA，并且该细胞群体中的2-5％为INA+/SOX2-(图9，表3)。在优选的实施方案中，细胞群体在与MEK抑制剂和NOTCH抑制剂两者接触之前尚未与DAPT或NOTCH信号传导的其他抑制剂接触。这些细胞是在使细胞群体与抑制剂接触之前根据本文公开的方法获得的，其中让细胞群体向腹侧中脑NSC分化至少20天，如22-24天。

所述细胞群体可以单独施用于患者，或者可以与MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂一起共同递送。因此，一个方面涉及包含上述细胞群体和MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂的组合物。

具体实施方案

现在通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明的方面：

1.一种方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

2.根据前述实施方案所述的方法，其中所述方法用于引导腹侧中脑NSC向神经元的分化。

3.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法用于将腹侧中脑NSC分化为腹侧中脑神经元。

4.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中对所述腹侧中脑NSC进行神经诱导、腹侧化和尾侧化。

5.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中对所述细胞群体进行神经诱导、腹侧化和尾侧化以获得腹侧中脑NSC。

6.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂抑制MEK1和MEK2。

7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂靶向y-分泌酶。

8.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的至少5％共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。

9.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，让所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化14至24天。

10.根据实施方案5至9中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的超过70％或60％进一步发育成中间神经前体之前，所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

11.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的0.5-65％、优选30-65％、更优选40-60％表达ASCL1。

12.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的25-65％、优选45-65％表达KI67。

13.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的少于20％、优选少于15％表达INA。

14.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的0-20％、优选10-15％表达INA。

15.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的少于10％、优选少于5％为INA+/SOX2-。

16.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的0-10％、优选2-5％为INA+/SOX2-。

17.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的75-95％、优选80-95％表达SOX2。

18.根据前述实施方案5至10中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的超过20％进一步发育成中间神经前体或神经元之前，所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

19.根据实施方案5至10和18中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的超过20％表达标志物ASCL1和INA之一之前，所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

20.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂选自PD0325901、曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼(AZD6244)、匹马塞替尼(AS703026)、MEK162、考比替尼、PD184352、PD173074、BIX02189、AZD8330、PD318088、瑞法替尼和PD98059，优选PD0325901。

21.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂的浓度为至少5μM，优选至少10μM。

22.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂的浓度为5μM至100μM。

23.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂选自DAPT、Avagacestat、PF-03084014和LY450139。

24.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂选自DAPT、MRK-560、MRK-003、LY900009、AL-101、Crenigacestat(LY3039478)、MK0752、Nirogacestat(PF-03084017、RO4929097(RG473)、CT16、PTG12、抗NRR1、抗NRR2、布隆妥珠单抗(Brontictuzumab)(OMP-52M51)、他瑞妥单抗(Tarextumab)(OMP-59R5)、15D11、抗Jag1/2、抗DII1、YW152F、MMGZ01、mABL001、HMD4-2、登赛珠单抗(Demcizumab)(OMP-21M18)、依诺苏单抗(Enoticumab)(REGN421)、MEDI0639、那赛昔珠单抗(Navicixizumab)(OMP-305B83)、ABT-165、NOV1501(ABL001；HD105)、IMR-1、RIN1、SAHM1和CB-103。

25.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂的浓度为至少1μM，优选至少10μM。

26.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂的浓度为1μM至100μM。

27.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂接触至少1/2小时、1小时、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或18小时，或24小时，或者至少2天、3天、4天、5天或6天。

28.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂接触1/2小时至15天、1/2小时至10天、1/2小时至5天、1/2小时至2天、1小时至2天、3小时至2天、6小时至2天、12小时至2天、18小时至2天，或1至2天，或约2天至约15天。

29.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与所述NOTCH信号传导的抑制剂接触至少1/2小时、1小时、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或18小时，或24小时，或者至少2天、3天、4天、5天或6天。

30.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与所述NOTCH信号传导的抑制剂接触1/2小时至15天、1/2小时至10天、1/2小时至5天、1/2小时至2天、1小时至2天、3小时至2天、6小时至2天、12小时至2天、18小时至2天，或1至2天，或约2天至约15天。

31.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂至少每36小时更换，优选地至少每30小时更换，更优选地至少每24小时更换。

32.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂至少每12至36小时更换，优选地至少每18至30小时更换，更优选地至少每24小时更换。

33.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体至少部分地同时与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

34.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体同时与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

35.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在根据所述方法使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，所述细胞群体不与NOTCH信号传导的抑制剂接触。

36.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在MEK和NOTCH信号传导的抑制后冷冻保存所述细胞群体。

37.根据前述实施方案所述的方法，其中在MEK和NOTCH信号传导的抑制结束后4天内，如3天、2天、1天、12小时、6小时或3小时内，冷冻保存所述细胞群体。

38.根据前述实施方案所述的方法，其中在MEK和NOTCH信号传导的抑制结束后立即冷冻保存所述细胞群体。

39.根据实施方案36至38中任一项所述的方法，其中将所述细胞群体冷冻保存在DMSO中，或使用不含DMSO的冷冻保护剂。

40.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，培养所述细胞群体以诱导向腹侧中脑NSC的分化。

41.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，使所述细胞群体与Small MothersAgainst Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导的抑制剂、音猬因子(SHH)信号传导的激活剂、wingless(Wnt)信号传导的激活剂和/或成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的激活剂以及可选的抗坏血酸和/或可选的脑源性神经营养因子(BDNF)接触。

42.根据前述实施方案所述的方法，其中所述细胞群体与至少两种SMAD蛋白信号传导抑制剂接触。

43.根据实施方案41和42中任一项所述的方法，其中所述SMAD信号传导的抑制剂选自头蛋白、LY364947、SB431542、RepSox和LDN-193189，或类似化合物。

44.根据实施方案41至43中任一项所述的方法，其中所述SHH信号传导的激活剂选自SHH、嘌吗啡胺、SAG或类似化合物。

45.根据实施方案41至44中任一项所述的方法，其中所述Wnt信号传导的激活剂是CHIR99021。

46.根据实施方案41至45中任一项所述的方法，其中所述FGF信号传导的激活剂是FGF8b。

47.根据实施方案41至46中任一项所述的方法，其中：

a)所述SMAD蛋白信号传导的抑制剂的浓度为1μM至50μM，

b)所述SHH信号传导的激活剂的浓度为200ng/ml至800ng/ml，

c)所述Wnt信号传导的抑制剂的浓度为0.1μM至1μM，

d)所述FGF信号传导的激活剂的浓度为10ng/ml至200ng/ml，

e)抗坏血酸的浓度为50μM至500μM，和/或

f)BDNF的浓度为1ng/ml至50ng/ml。

48.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述细胞群体衍生自PSC。

49.根据前述实施方案所述的方法，其中所述PSC是人类胚胎干细胞或人类诱导多能干细胞。

50.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法是体外的。

51.引导PSC细胞群体向腹侧中脑神经元分化的体外方法，其包括培养PSC细胞群体，使所述PSC细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂、FGF信号传导的激活剂、可选的抗坏血酸和可选的BDNF接触，以获得包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体进一步与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触以引导向腹侧中脑神经元的分化。

52.根据前述实施方案所述的方法，其中在使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，让所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化14至24天。

53.根据实施方案51和52中任一项所述的方法，其中在从所述细胞群体开始向腹侧中脑NSC分化起28天之前，如27天、26天或25天之前，优选26天之前，收获所述细胞群体。

54.根据实施方案51至53中任一项所述的方法，其中在从所述细胞群体开始向腹侧中脑NSC分化起第28天、第27天、第26天或第25天，优选第25天，收获所述细胞群体。

55.根据实施方案51至54中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触1/2小时至15天、1/2小时至10天、1/2小时至5天、1/2小时至2天、1小时至2天、3小时至2天、6小时至2天、12小时至2天、18小时至2天，或1至2天，或约2天至约10天。

56.根据实施方案51至55中任一项所述的方法，其中在所述细胞群体不再与FGF信号传导的激活剂接触之后0至10天起，使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

57.根据实施方案51至56中任一项所述的方法，其中在使所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，对所述细胞群体进行神经诱导、腹侧化和尾侧化16天，随后在合适的培养基中培养6至8天，而不使所述细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂、FGF信号传导的激活剂或NOTCH信号传导的抑制剂如DAPT接触。

58.根据前述实施方案51至57中任一项所述的方法，其中所述细胞群体至少部分地同时与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

59.根据实施方案51至58中任一项所述的方法，其中所述细胞群体同时与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

60.根据实施方案51至59中任一项所述的方法，其中多能干细胞的细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂接触5至9天。

61.根据实施方案51至60中任一项所述的方法，其中多能干细胞的细胞群体与Wnt信号传导的抑制剂接触5至9天。

62.根据实施方案51至61中任一项所述的方法，其中多能干细胞的细胞群体与SHH信号传导的激活剂接触5至9天。

63.根据实施方案51至62中任一项所述的方法，其中多能干细胞的细胞群体在与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂和/或SHH信号传导的激活剂接触结束之后，与FGF信号传导的激活剂接触7至12天。

64.根据实施方案51至63中任一项所述的方法，其中从第0天起，所述细胞群体与所述SMAD蛋白信号传导的抑制剂接触5至9天。

65.根据实施方案51至64中任一项所述的方法，其中从第0天起，所述细胞群体与所述Wnt信号传导的抑制剂接触5至9天。

66.根据实施方案51至65中任一项所述的方法，其中从第0天起，所述细胞群体与所述SHH信号传导的激活剂接触5至9天。

67.根据实施方案51至66中任一项所述的方法，其中从第5至9天起，或者当与所述SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂和/或SHH信号传导的激活剂接触结束时，所述细胞群体与FGF信号传导的激活剂接触7至12天。

68.根据实施方案51至67中任一项所述的方法，其中从第10或11天起，所述细胞群体与抗坏血酸接触5至7天。

69.根据实施方案51至68中任一项所述的方法，其中抗坏血酸的浓度为10μM至400μM。

70.根据实施方案51至69中任一项所述的方法，其中从第10或11天起，所述细胞群体与BDNF接触5至7天。

71.根据实施方案51至70中任一项所述的方法，其中BDNF的浓度为1ng/ml至40ng/ml。

72.根据实施方案51至71中任一项所述的方法，其中在MEK信号传导抑制和NOTCH信号传导抑制后，冷冻保存所述细胞群体

73.根据前述实施方案所述的方法，其中在MEK信号传导抑制和NOTCH信号传导抑制结束后4天内，如3天、2天、1天、12小时、6小时、3小时或1小时内，冷冻保存所述细胞群体。

74.根据实施方案72和73中任一项所述的方法，其中所述细胞群体在收获时冷冻保存。

75.根据前述实施方案所述的方法，其中在收获后4天内，如3天、2天、1天、12小时、6小时或3小时内，冷冻保存所述细胞群体。

76.根据实施方案51至75中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的0.5-65％、优选30-65％、更优选40-60％表达ASCL1。

77.根据实施方案51至76中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的25-65％、优选45-65％表达KI67。

78.根据实施方案51至77中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的少于20％、优选少于15％表达INA。

79.根据实施方案51至78中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的0-20％、优选10-15％表达INA。

80.根据实施方案51至79中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的少于10％、优选少于5％为INA+/SOX2-。

81.根据实施方案51至80中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的0-10％、优选2-5％为INA+/SOX2-。

82.根据实施方案51至81中任一项所述的方法，其中在所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触时，所述细胞群体中的75-95％、优选80-95％表达SOX2。

83.引导细胞群体向腹侧中脑神经元分化的体外方法，其包括以下步骤：

-培养包含PSC的细胞群体，

-诱导所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化，

-使所述腹侧中脑NSC成熟，以及

-使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与NOTCH信号传导的抑制剂接触，

其中所述腹侧中脑NSC表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。

84.根据前述实施方案所述的方法，其中在最初诱导所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化后至少20天，优选21天，更优选22天，使所述细胞群体与所述NOTCH信号传导的抑制剂接触。

85.可通过根据实施方案1至84中任一项所述的方法获得的包含腹侧中脑神经细胞的细胞群体。

86.通过根据实施方案1至84中任一项所述的方法获得的包含腹侧中脑神经细胞的细胞群体。

87.包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中当将所述细胞群体在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少50％为INA+或HUCD+并且少于15％为KI67+的细胞群体。

88.包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中当将所述细胞群体在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少25％为HuCD+/SOX2-或HUCD+或NEUN+/SOX2-的细胞群体。

89.根据实施方案87和88中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞的标志物的表达使用单细胞RNA测序、核酸RNA测序、免疫细胞化学(ICC)、qPCR或FACS来测量。

90.根据实施方案87至89中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞的标志物的表达根据实施例7来测量。

91.根据实施方案87至89中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞的标志物的表达根据实施例8来测量。

92.根据实施方案87至89中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞的标志物的表达根据实施例9来测量。

93.根据实施方案87至92中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体根据实施例6进行培养。

94.根据实施方案85至93中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体是体外的。

95.根据实施方案85至94中任一项所述的细胞群体，其中所述腹侧中脑神经细胞是非天然的。

96.根据实施方案85至95中任一项所述的细胞群体，其中所述腹侧中脑神经细胞是人工的。

97.根据实施方案85至96中任一项所述的细胞群体，其中所述腹侧中脑神经细胞是干细胞衍生的。

98.根据实施方案85至97中任一项所述的细胞群体，其中所述腹侧中脑神经细胞是从多能干细胞进行干细胞衍生的。

99.根据前述实施方案所述的细胞群体，其中所述多能干细胞是遗传修饰的，并且其中所述遗传修饰在所述腹侧中脑神经细胞中持续存在。

100.根据实施方案98和99中任一项所述的细胞群体，其中所述腹侧中脑神经细胞是从人类胚胎干细胞(hESC)或人类诱导多能干细胞(hiPSC)进行干细胞衍生的。

101.根据实施方案85至100中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体的细胞是遗传修饰的。

102.根据前述实施方案所述的细胞群体，其中所述细胞群体的细胞被遗传修饰为低免疫原性的和/或谱系限制性的。

103.根据前述实施方案所述的细胞群体，其中针对低免疫原性的遗传修饰包括：相对于野生型干细胞，MHC-I人类白细胞抗原的表达降低；相对于野生型干细胞，MHC-II人类白细胞抗原的表达降低；和/或相对于野生型干细胞，耐受原性因子的表达增加。

104.根据前述实施方案所述的细胞群体，其中所述MHC-I人类白细胞抗原是HLA-A、HLA-B和HLA-C。

105.根据实施方案103和104中任一项所述的细胞群体，其中所述MHC-II人类白细胞抗原是HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR。

106.根据实施方案103至105中任一项所述的细胞群体，其中所述耐受原性因子选自CD46、CD47、CD55、CD59、PD-L1、HLA-E和HLA-G。

107.根据实施方案85至106中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体包含至少1,000个细胞、10,000个细胞、100,000个细胞、1,000,000个细胞或10,000,000个细胞。

108.根据实施方案85至107中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞群体被冷冻保存。

109.一种组合物，其包含根据实施方案85至108中任一项所述的细胞群体。

110.根据前述实施方案所述的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。

111.根据前述实施方案所述的组合物，其中所述冷冻保护剂是DMSO，或者其中所述冷冻保护剂不含DMSO。

112.根据实施方案85至108中任一项所述的体外细胞群体，其用作药物。

113.根据前述实施方案所述的体外细胞群体，其用于治疗帕金森病。

114.治疗神经系统状况的方法，其包括向患者施用有效量的根据实施方案85至108中任一项所述的细胞群体。

115.根据前述实施方案所述的方法，其中所述神经系统状况是帕金森病。

116.治疗帕金森病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的腹侧中脑NSC和MEK信号传导的抑制剂。

117.根据前述实施方案所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂是PD0325901。

118.根据实施方案116和117中任一项所述的方法，其中所述腹侧中脑NSC共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2。

119.根据实施方案116至118中任一项所述的方法，其进一步包括施用NOTCH信号传导的抑制剂。

120.根据前述实施方案所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂选自DAPT、MRK-560、MRK-003、LY900009、AL-101、Crenigacestat(LY3039478)、MK0752、Nirogacestat(PF-03084017、RO4929097(RG473)、CT16、PTG12、抗NRR1、抗NRR2、布隆妥珠单抗(Brontictuzumab)(OMP-52M51)、他瑞妥单抗(Tarextumab)(OMP-59R5)、15D11、抗Jag1/2、抗DII1、YW152F、MMGZ01、mABL001、HMD4-2、登赛珠单抗(Demcizumab)(OMP-21M18)、依诺苏单抗(Enoticumab)(REGN421)、MEDI0639、那赛昔珠单抗(Navicixizumab)(OMP-305B83)、ABT-165、NOV1501(ABL001；HD105)、IMR-1、RIN1、SAHM1和CB-103。

121.根据前述实施方案所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂是DAPT。

122.MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂，其联合用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病。

123.根据前述实施方案所述的MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂，其中所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂至少在施用所述腹侧中脑NSC后6天内施用。

124.根据实施方案122和123中任一项所述的联合使用的MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂，其中所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂施用至少2天，如至少4、5或6天。

125.MEK信号传导的抑制剂、NOTCH信号传导的抑制剂和包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其联合用于治疗帕金森病。

126.根据前述实施方案所述的MEK信号传导的抑制剂、NOTCH信号传导的抑制剂和细胞群体，其中所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂与所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体一起共同施用。

127.根据前述实施方案所述的MEK信号传导的抑制剂、NOTCH信号传导的抑制剂和细胞群体，其中所述MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib。

128.MEK信号传导的抑制剂，其用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病。

129.根据前述实施方案所述的MEK信号传导的抑制剂，其中所述腹侧中脑NSC已通过手术施用。

130.用于治疗帕金森病的Mirdametinib。

131.用于治疗已施用治疗有效量的腹侧中脑NSC的受试者的帕金森病的Mirdametinib。

132.一种组合物，其包含含有腹侧中脑NSC的细胞群体、MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。

133.根据前述实施方案所述的组合物，其中所述MEK信号传导的抑制剂是Mirdametinib。

134.根据实施方案132和133中任一项所述的组合物，其用于治疗帕金森病。

135.根据实施方案132至134中任一项所述的组合物，其中所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体是根据实施方案87和/或88所述的。

136.根据实施方案132至135中任一项所述的组合物，其中所述组合物是体外的。

137.用于治疗帕金森病的体外细胞群体，其中所述细胞群体中的80-95％表达SOX2，所述细胞群体中的40-60％表达ASCL1，所述细胞群体中的30-65％表达KI67，所述细胞群体中的10-20％表达INA，并且所述细胞群体中的2-5％为INA+/SOX2-。

138.根据前述实施方案所述的细胞群体，其中所述细胞群体尚未与DAPT接触。

139.一种组合物，其包含根据实施方案137或138所述的细胞群体和MEK信号传导的抑制剂和/或NOTCH信号传导的抑制剂。

实施例

以下是用于实施本发明的非限制性实施例。

实施例1：人类多能干细胞向腹侧中脑神经细胞的分化

hPSC可根据自2011年Lorenz Studer的研究小组发表题为“Dopamine neuronsderived from human ES cells efficiently engraft in animal models ofParkinson’s disease”的开创性论文以来已发表的几种方案来分化为腹侧中脑神经细胞。下面显示了一种执行分化程序的方式，其遵循本节参考文献中描述的出版物(Nolbrant等人，2017和Kirkeby等人，2017)。

人类胚胎干细胞(hESC)系RC17(Roslin CT)和3053(Novo Nordisk A/S)以及由Novo Nordisk开发的其他hESC系在人层粘连蛋白-521基质(0.7-1.2μg/cm²；Biolamina)包被的培养器皿上在补充有60U/mL青霉素-链霉素(P-S；Thermo Fisher Scientific)的iPSBrew XF培养基(Miltenyi Biotec)中培养。每天更换培养基，并且每4-6天用EDTA 0.5mM(Thermo Fisher Scientific)进行细胞传代。将培养物维持在37℃、湿度95％和5％ CO₂水平下。

根据确立的方案(Nolbrant等人，2017；Kirkeby等人，2017)，使hESC向腹侧中脑神经元分化。简言之，使hESC生长至70-90％汇合，然后用0.5mM EDTA解离。将细胞以10⁴个细胞/cm²接种在用人层粘连蛋白-111(1.2μg/cm²；BioLamina)包被的细胞培养瓶或培养板中，并立即与分化培养基接触。从体外第0-8天(DIV 0-8)起，将细胞暴露于基于N2的培养基：50％ DMEM/F12+Glutamax(Gibco)、50％ Neurobasal(Gibco)、1％ N2补充剂CTS(ThermoFisher Scientific)、5％ GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)、0.2％ P-S(ThermoFisher Scientific)并补充SMAD抑制剂SB431542(10μM；Miltenyi Biotec)、用于神经诱导的头蛋白(100ng/mL；Miltenyi Biotec)、用于腹侧命运的音猬因子C24II(SHH；500ng/mL；Miltenyi Biotec)、用来促进尾侧化的GSK3β抑制剂CHIR99021(CHIR；0.5-0.6μM；MiltenyiBiotec)。从DIV9-11起，向基于N2的培养基中补充成纤维细胞生长因子8b(FGF8b；100ng/mL；Miltenyi Biotec)。在DIV11，用accutase(Thermo Fisher Scientific)解离细胞，并以0.8×10⁶个细胞/m²接种在用人层粘连蛋白-111(1.2μg/cm²)包被的细胞培养瓶或培养板中补充有10μM的Y-27632(Miltenyi Biotec)的DIV11-16培养基(Neurobasal、2％不含维生素A的B27补充剂CTS(Thermo Fisher Scientific)、5％ GlutaMAX、0.2％ P-S，并补充有FGF8b(100ng/mL)、L-抗坏血酸(AA；200μM；Sigma)、人脑源性神经营养因子(BDNF；20ng/mL；Miltenyi Biotec))中。在体外第16天(DIV 16)，用accutase解离细胞，并冷冻保存或重新接种在用聚-L-鸟氨酸(0.002％)和层粘连蛋白-521(1.5μg/cm²)包被的细胞培养瓶/板中补充有BDNF(20ng/mL)、GDNF(20ng/mL)、L-抗坏血酸(200μM)、dcAMP(500μM)、DAPT(10μM)和Y-27632(10μM)的B27培养基中用于延长的体外培养，从而允许腹侧中脑神经干细胞进一步分化并成熟为神经元。

参考文献：

·Nolbrant S,Heuer A,Parmar M,Kirkeby A.Generation of high-purityhuman ventral midbrain dopaminergic progenitors for in vitro maturation andintracerebral transplantation.Nat Protoc.2017年9月；12(9):1962-1979.doi:10.1038/nprot.2017.078.Epub 2017年8月31日.PMID:28858290.

·Kirkeby A,Nolbrant S,Tiklova K,Heuer A,Kee N,Cardoso T,Ottosson DR,Lelos MJ,Rifes P,Dunnett SB,Grealish S,Perlmann T,Parmar M.Predictive MarkersGuide Differentiation to Improve Graft Outcome in Clinical Translation ofhESC-Based Therapy for Parkinson's Disease.Cell Stem Cell.2017年1月5日；20(1):135-148.doi:10.1016/j.stem.2016.09.004.Epub 2016年10月27日.PMID:28094017；PMCID:PMC5222722.

实施例2：流式细胞术分析单细胞蛋白质标志物表达测定

如实施例1所述，并使用表1中所述的试剂，在二维体外培养中由hESC生成腹侧中脑多巴胺能(vmDA)祖细胞。在开始分化后的不同天数，使用Accutase将细胞培养物解离成单细胞悬液，在NucleoCounter NC-200上计数，并收集在N2培养基(补充有1％ CTS^TMN-2补充剂的CTS^TMNeurobasal^TM培养基)中。使用LIVE/DEAD^TM可固定近红外死细胞染色试剂盒标记死细胞。然后将细胞重悬于B27培养基(补充有1％不含维生素A的B-27^TM补充剂、2mMGlutaMAX^TM、60U/mL青霉素-链霉素、10μM ROCK抑制剂的CTS^TMNeurobasal^TM培养基)中。然后按照制造商的说明，使用BD转录因子缓冲液套组(BD Biosciences)固定并透化细胞。然后用荧光偶联的抗体对固定的细胞进行染色，并在BD LSR Fortessa或BD FACSymphony(BDBiosciences)上获取样品。导出fcs文件并在FlowJo 10.5.03中进行分析。

为了确定细胞在标志物的蛋白质表达方面是否被视为阳性，如常规所做的那样，将门设置在阴性对照样品的荧光信号边缘处的场中。所用的阴性对照样品的示例包括未染色的对照、荧光减一(FMO)对照和最优选的生物阴性对照样品；当实验样品运行时所有存在于这些阈值门以上的细胞都被认为是阳性的。抗体：FOXA2(1:320，Miltenyi)，OTX2(1:320，Miltenyi)，SOX2(1:40，BD)，LMX1A(1:2500，Novo Nordisk生产)，EN1(1:40，AtlasAntibodies)，ASCL1(1:2500，Mitlenyi)，INA(1:3000，AtlasAntibodies)。

表1：用于FACS、ICC和细胞培养的试剂列表

实施例3：MEKi和/或NOTCHi的早期体外施用

为了生成富含腹侧中脑多巴胺能神经元且消耗了其他细胞类型(即，其他神经元、神经胶质前体、神经胶质细胞、基质细胞、增殖细胞)的hPSC衍生的细胞培养物或细胞产品，将新型抑制剂和抑制剂组合施用至腹侧中脑神经细胞培养物。在hPSC神经/外胚层特化(用小分子SMAD抑制剂进行，添加头蛋白)阶段后、腹侧化(用SHH通路激动剂如SHH、嘌吗啡胺或SAG进行)后和尾侧化(用WNT激动剂如WNT蛋白、小分子CHIR999021进行)后立即将VM NPC的培养物暴露于MEK抑制剂和/或NOTCH抑制剂。在神经外胚层模式化、腹侧化和尾侧化后立即进行的这种暴露被称为“早期施用”(图1)。早期施用是指此时培养物主要由VM NSC组成，并且观察到与实施例1中的方案的DIV16相对应的VM IPC和/或VM神经元标志物的最小表达(图1)。

通过流式细胞术对早期施用MEK抑制剂和/或NOTCH抑制剂的细胞进行概况分析(图2)，以评估腹侧中脑底板区域身份转录因子(FOXA2、LMX1A、OTX2、EN1)和细胞阶段标志物(KI67，其标识高度增殖细胞，如NSC；SOX2，其标识NSC；ASCL1，其标识IPC；INA，其标识神经元)的蛋白质表达水平。

表2：FCM概况VM DIV16

观察到所分析的培养物在其区域身份上属于腹侧中脑，这通过其相关腹侧中脑底板标志物FOXA2(总细胞的>50％)、LMX1A(总细胞的>45％)和OTX2(总细胞的>70％)以及EN1(总细胞的>50％)的表达而得到证明(图2和表2)。这些细胞仍处于NSC阶段，如其NSC标志物SOX2(>70％)和增殖标志物KI67(>30％)的高表达所示。这些培养物到暴露时就开始以低水平表达腹侧中脑IPC的标志物(ASCL1，0.48-2.86％)以及通过INA总表达所确定的神经元的标志物(1.43-3.12％)，但尚未表达INA+/SOX2-(0％)(图2和表2)。

在单独暴露于MEKi、单独暴露于NOTCHi或暴露于MEKi和NOTCHi两者5天后，使用流式细胞术重新分析培养物以评估关键基因的蛋白质表达水平，并与未处理的对照进行比较(图3和表3)。

表3：FCM结果，早期处理(DIV16-22)

表3(续)

发现所有组均保持腹侧中脑底板谱系标志物FOXA2和LMX1A的高表达(总细胞的>72.4)(图3，表3)。观察到对照细胞保持NSC标志物SOX2的高表达(78.2-93.7％)和增殖标志物KI67的高水平(46.1-73.3％)，伴随着低水平的神经元标志物INA(图3，黑色柱条)。综合起来，这表明对照培养物主要是腹侧中脑底板神经干细胞。相比之下，仅用MEKi处理的培养物(图3，空心柱条，和表3)和仅用NOTCHi处理的培养物(图3，窄条纹柱条)均观察到NSC和增殖标志物SOX2和KI67的表达下调；表明与对照相比，这些细胞正在响应于这些抑制剂以更高的速度向神经元分化。对于向培养物联合施用MEKi和NOTCHi，观察到最引人注目的结果(图3，粗条纹柱条，和表3)。联合施用在更大程度上降低了NSC标志物SOX2的表达(32.4-53％)，并显著降低了增殖标志物KI67的水平(所有细胞的4.24-5.55％)，并且伴随着神经元标志物INA的表达水平的显著增加(42％)(图3和表3)。综合起来，这些结果表明，MEKi和NOTCHi的双重施用在增加神经元比例和减少NSC和增殖细胞比例方面具有协同作用(图3和表3)。

这些结果支持以下假设：早期添加MEKi、NOTCHi，尤其是联合施用MEKi和NOTCHi，能够促进腹侧中脑底板NSC分化为腹侧中脑底板神经元，而不会改变底板谱系转录因子的表达和细胞类型(图1、图2和图3，表2和表3)。

在施用化合物以及如图2和图3所示进行流式细胞术分析后，所有组在体外再分化11天，然后在4％低聚甲醛中固定，并用识别所有细胞核的DAPI和针对SOX2(1:300)、Ki-67(1:250)、LMX1A(1:3000)、INA(1:200)、酪氨酸羟化酶(TH；1:500)和COL1A1(1:300)的第一抗体以及随后用荧光标记的第二抗体进行染色。使用CellSens软件在Olympus IX81显微镜上获取图像。免疫荧光(IF)染色证实了图3的流式细胞术结果，其中延长的分化表明，与未处理的对照相比，仅用NOTCHi处理减少了被SOX2标识的NSC的量(图4A-D)和被KI67标识的增殖细胞的量(图5B、D)，而保持被INA标识的神经元细胞的量(图5A、C)。

另外与较早时间点的流式细胞术结果进行匹配，延长的分化证实，与未处理的对照相比，仅用MEKi处理减少了被SOX2标识的NSC的量(图4A-B、E-F)和被KI67标识的增殖细胞的量(图5B、F)，而保持被INA标识的神经元细胞的量(图5A、E)。进一步与较早时间点的流式细胞术结果进行匹配，延长的分化证实，与未处理的对照相比，用MEKi和NOTCHi处理减少了被SOX2标识的NSC的量(图4A-B、G-H)和被KI67标识的增殖细胞的量(图5B、H)，而保持被INA标识的神经元细胞的量(图5A、G)。

延长的分化允许分析感兴趣的亚型谱系的标志物，特别是酪氨酸羟化酶(TH)——标识多巴胺神经元的限速酶，以及COL1A1——由非神经元基质细胞表达的基因。延长的分化的IF染色结果显示，仅用NOTCHi处理、仅用MEKi处理或用MEKi和NOTCHi进行双重处理未阻止多巴胺神经元的形成(图6B、D、F、H)，并且与用DAPI标识的总细胞数的比较显示，在抑制剂处理条件下，TH神经元的比例增加(图6A-H)。延长的分化的IF染色结果还显示，仅用NOTCHi处理、仅用MEKi处理或用MEKi和NOTCHi进行双重处理未阻止腹侧中脑谱系标志物LMX1A的表达(图7A、C、E、G)。最明显的是，与未处理的对照培养物相比，仅用MEKi或仅用NOTCHi抑制剂处理显著降低了基质COL1A1细胞的比例(图7B、D-F)，而MEKi和NOTCHi的双重施用进一步降低了它们的比例(图7H)。

这些结果支持以下假设：早期添加MEKi、NOTCHi，尤其是联合施用MEKi和NOTCHi，能够以非神经元细胞如基质细胞为代价，促进腹侧中脑底板NSC分化为腹侧中脑底板神经元，特别是多巴胺神经元，而不会改变底板谱系转录因子如LMX1A的表达(图4-图7)。

实施例4：MEKi和/或NOTCHi的晚期体外施用

为了评估MEKi和/或NOTCHi以非神经元细胞如基质细胞为代价促进腹侧中脑底板NSC分化为腹侧中脑底板神经元、特别是多巴胺神经元的范围和能力，还在较晚的体外时间点对已分化到后期发育阶段的培养物进行了进一步的研究(在图8和图11以及表4和表5中概述)。

让已完成hPSC神经/外胚层特化、腹侧化和尾侧化阶段的VM NPC培养物在没有这些模式化因子的情况下在体外进一步分化6天的时间。在这段时间内(体外第16-22天)以及在此之前的所有时间点(体外第0-22天)，细胞培养物均未暴露于MEK抑制剂和/或NOTCH抑制剂(图8)。在第16-22天这段时间内，与图1-图2和表2中早期施用时相比，细胞获得了更大比例的具有更成熟发育身份的细胞，如IPC和神经元，因为SOX2的水平下降，并且表达中间前体和神经元标志物ASCL1和INA以及INA+/SOX2-的细胞的百分比增加(图9，表4)。然后将细胞暴露于MEK抑制剂和/或NOTCH抑制剂(图8)，这被称为“晚期施用”。

我们设想，为了恢复功能的目的，可以将该群体移植到帕金森病动物模型中，而为了治疗目的，可以将其移植到人类患者中。

表4：FCM概况VM DIV22(没有早期NOTCHi)

	FOXA2	SOX2	Ki67	ASCL1	INA	INA+/SOX2-
							#1	83.8	90.1	52.4	42.3	13.9	2.61
#2	90.6	91.2	60.8	61.6	13.1	3.71
							#3	89.5	92.2	56.2	58.9	12.4	3.53
#4	63.4	79.6	50.9	44.4	13	3.3
							#5	88.4	84.9	29.1	39.1	11.8
平均值	82.1	86.2	51.0	48.0	12.8	3.29
							SEM	4.27	2.36	4.61	3.95	0.35	0.24

在晚期施用之前，通过流式细胞术对细胞进行概况分析(图9和表4)，以评估腹侧中脑底板区域身份转录因子(FOXA2)和细胞阶段标志物(NSC和增殖标志物SOX2和KI67；ASCL1，其标识IPC；INA，其标识神经元)的蛋白质表达水平。观察发现，这些分析的培养物在其区域身份上属于腹侧中脑，表达腹侧中脑底板标志物FOXA2(所有细胞的>60％)(图9)。这些细胞仍处于NSC阶段，如其NSC标志物SOX2和KI67的高表达(>79％和>50％，图9、表4)所示。值得注意的是，这些培养物比图1-图2中处理的早期施用培养物更加成熟，因为ASCL1的水平急剧升高至48％，INA总表达增加至12.8％，并且一些细胞现在是INA+/SOX2-，占3.28％，(图9和表4)。

在单独暴露于MEKi、单独暴露于NOTCHi或暴露于MEKi和NOTCHi两者5天后，使用流式细胞术重新分析培养物以评估关键基因的蛋白质表达水平，并与未处理的对照进行比较(图10，表5)。另外，在不存在任何NOTCH抑制剂的情况下，使培养物再分化7天，并使用识别所有细胞核的DAPI和针对FOXA2(1:200)、LMX1A(1:1000)、SOX2(1:300)、Ki-67(1:250)和HuC/D(1:100)的第一抗体进行ICC。

表5：FCM/ICC结果，晚期施用(DIV22-29)

表5(续)

发现所有组均保持腹侧中脑底板谱系标志物FOXA2(>68％)和LMX1A(>80％)的高表达(占总细胞的比例)(图10和表5)。观察到对照细胞保持NSC标志物SOX2的高表达(平均74％)和增殖标志物KI67的高水平(平均34.6％)，伴随着中等水平的神经元标志物INA(平均30.5％)(图10，空心柱条，和表5)。综合起来，这表明在该较晚的体外时间点，对照培养物主要是腹侧中脑底板神经干细胞，而一部分是神经元。相比之下，仅用MEKi处理的培养物(图10，窄条纹柱条，和表5)和仅用NOTCHi处理的培养物(图10，粗条纹柱条，和表5)均观察到NSC和增殖标志物SOX2和KI67的表达下调；表明与对照相比，这些细胞正在响应于这些抑制剂以更高的速度向神经元分化。向培养物联合使用MEKi和NOTCHi(图10，黑色/实心柱条，表5)也降低了NSC标志物SOX2的表达(平均45.4％)，并显著降低了增殖标志物KI67的水平(所有细胞的平均3.7％)，并且伴随着神经元标志物INA的表达水平的显著增加(平均68.8％)(图10，表5)。综合起来，这些结果表明，MEKi、NOTCHi，尤其是这两种通路抑制剂的双重施用，具有增加神经元比例和降低NSC和增殖细胞比例的效果。用MEKi和NOTCHi早期和晚期处理VM神经细胞的结果之间的比较表明，与早期施用(平均42％)相比，晚期施用产生更大量的INA神经元(平均68.8％)。

这些结果支持以下假设：晚期添加MEKi或NOTCHi，或联合施用MEKi和NOTCHi，能够促进腹侧中脑底板NSC分化为腹侧中脑底板神经元，而不会改变底板谱系转录因子的表达。综上所述，数据表明，对于将VM细胞转变为VM神经元而言，MEKi和NOTCHi的晚期施用是优选的且更好的。

在施用化合物以及如图所示进行流式细胞术分析后，所有组在体外再分化11天，然后在4％低聚甲醛中固定，并用识别所有细胞核的DAPI和针对SOX2(1:300)、Ki-67(1:250)、LMX1A(1:1000)、酪氨酸羟化酶(TH；1:500)和COL1A1(1:300)的第一抗体以及随后用荧光标记的第二抗体进行染色。使用CellSens软件在Olympus IX81显微镜上获取图像。免疫荧光(IF)染色证实了流式细胞术结果，其中延长的分化表明，与未处理的对照相比，仅用NOTCHi处理减少了被SOX2标识的NSC的量(图12A-D)和被KI67标识的增殖细胞的量(图13B、D)，而保持被INA标识的神经元细胞的量(图13A、C)。

另外与较早时间点的流式细胞术结果进行匹配，延长的分化证实，与未处理的对照相比，仅用MEKi处理减少了被SOX2标识的NSC的量(图12A-B、E-F)和被KI67标识的增殖细胞的量(图13B、F)，而保持被INA标识的神经元细胞的量(图13A、E)。进一步与较早时间点的流式细胞术结果进行匹配，延长的分化证实，与未处理的对照相比，用MEKi和NOTCHi处理减少了被SOX2标识的NSC的量(图12A-B、G-H)和被KI67标识的增殖细胞的量(图13B、H)，而保持被INA标识的神经元细胞的量(图13A、G)。

延长的分化允许分析感兴趣的亚型谱系的标志物，特别是酪氨酸羟化酶(TH)——标识多巴胺神经元的限速酶，以及COL1A1——由非神经元基质细胞表达的基因。延长的分化的IF染色结果显示，仅用NOTCHi处理、仅用MEKi处理或用MEKi和NOTCHi进行双重处理未阻止多巴胺神经元的形成(图14B、D、F、H)，并且与用DAPI标识的总细胞数的比较显示，在抑制剂处理条件下，TH神经元的比例增加(图14A-H)。延长的分化的IF染色结果还显示，仅用NOTCHi处理、仅用MEKi处理或用MEKi和NOTCHi进行双重处理未阻止腹侧中脑谱系标志物LMX1A的表达(图15A、C、E、G)。最明显的是，与未处理的对照培养物相比，仅用MEKi或仅用NOTCHi抑制剂处理显著降低了基质COL1A1细胞的比例(图15B、D、F)，而MEKi和NOTCHi的双重施用进一步降低了它们的比例(图15H)。

这些结果支持以下假设：晚期添加MEKi、NOTCHi，尤其是联合施用MEKi和NOTCHi，能够以非神经元细胞如基质细胞为代价，促进腹侧中脑底板NSC分化为腹侧中脑底板神经元，特别是多巴胺神经元，而不会改变底板谱系转录因子如LMX1A的表达(图12-图15)。

实施例5：在DIV16-22用NOTCHi早期处理的晚期VM神经细胞的概况

在该实施例中，让已完成hPSC神经/外胚层特化、腹侧化和尾侧化阶段的VM NPC培养物在没有这些模式化因子的情况下从第16天起在体外进一步分化6天的时间，并在DIV16-22之间每48-72小时暴露于NOTCH抑制剂(DAPT)。在本领域中通常在停止使用一种或多种或所有模式化因子后立即将培养物暴露于NOTCH抑制剂；例如，模式化因子是用来诱导胚胎的神经外胚层的因子(即头蛋白(NOGGIN)、SMAD抑制剂)和/或背-腹侧模式化因子(即BMP、SHH、SAG、嘌吗啡胺)和/或喙-尾侧模式化因子(即WNT蛋白、CHIR、FGF8)，如出版物Nolbrant等人,2017、Kriks等人,2011、Nishimura等人,2023中所述。在这段时间内(DIV16-22)以及在此之前的所有时间点(体外第0-16天)，细胞培养物均未暴露于MEK抑制剂。

在DIV16，当培养物主要是NPC并且不包含或包含<2％的INA+/SOX2-细胞(图2，表1)时，在去除模式化因子后立即添加NOTCH抑制直到DIV22，这导致对细胞阶段/成熟有深刻影响，意味着对DIV22时IPC和神经元的比例有深刻影响。这可通过流式细胞术概况在蛋白质水平上观察到，参见图9和表4，其中显示了在没有任何早期NOTCH抑制的情况下在DIV22时的概况，并与采用早期NOTCHi的图11和表6进行了比较。值得注意的是，采用NOTCH抑制的早期(DIV16-22)处理导致更高比例的作为INA+细胞(使用NOTCHi为24.7％，不使用NOTCHi为12.8％)或INA+/SOX2-细胞(使用NOTCHi为8.4％，不使用NOTCHi为3.3％)的神经元。因此，我们想到，在撤除模式化因子后立即用NOTCHi进行这种早期处理，会导致培养物对于暴露于双重MEKi/NOTCHi处理和转化为神经元而言不是较佳的，因为有更多的细胞已经处于神经元阶段。此外，我们预计，具有更多神经元的这种群体对于移植来说不是较佳的(因为神经元脆弱并且对移植应激敏感)，并且我们预计，图9和表4中包含许多ASCL1+IPC(51.8％)且具有最少神经元(INA+或INA+/SOX2-)细胞的群体对于移植和/或添加双重MEK和NOTCH抑制来说是更佳的。

参考文献：

·Kaneyasu Nishimura,Shanzheng Yang,Ka Wai Lee,Emilia SifAsgrimsdottir,Kasra Nikouei,Wojciech Paslawski,Sabine Gnodde,Guochang Lyu,Lijuan Hu,Carmen Salto,PerSvenningsson,Jens Hjerling-Leffler,Sten Linnarsson和Ernest Arenas.Single-cell transcriptomics reveals correct developmentaldynamics and high quality midbrain cell types by improved hESCdifferentiation.2023.Stem Cell Reports.https://doi.org/10.1016/ j.stemcr.2022.10.016

·Sonja Kriks,Jae-Won Shim,Jinghua Piao,Yosif M Ganat,Dustin RWakeman,Zhong Xie,Luis Carrillo-Reid,Gordon Auyeung,Chris Antonacci,AmandaBuch,Lichuan Yang,M Flint Beal,D James Surmeier,Jeffrey H Kordower,VivianeTabar,Lorenz Studer.Dopamine neurons derived from human ES cells efficientlyengraft in animal models of Parkinson's disease.2011.Nature.10.1038/nature10648

表6：FCM概况VM DIV22(+早期NOTCHi)

	FOXA2	SOX2	Ki67	ASCL1	INA	INA+/SOX2-
							#1	85.4	72	5.9	50.4	23.6	7.3
#2	98.2	70.5	4.8	57.1	34.2	13.6
							#3	82.1	64.7	6.0	40.5	19	5.7
#4	94.9	65.7	6.6	51.8	45.6	20.1
							#5	67.6	69.5	6.1	36.0	18.3	7.0
#6	69.7	70.9	6.4	41.1	30.5	13.8
							#7	76.2	86.3	8.1	41.7	19.2	4.7
#8	82.7	88.3	9.7	45.8	22.4	6.2
							#9	78.0	77.2	7.8	16.2	13.8	2.6
#10	75.5	78.5	5.2	17.3	13.3	5.0
							#11	35.2	76.4	19.8	25.6	32.0	6.0
平均值	76.9	74.5	7.9	38.5	24.7	8.4
							SEM	5.04	2.32	1.27	4.11	2.97	1.58

实施例6：MEK/NOTCH抑制后进一步培养细胞群体以评估表达谱

施用MEK和NOTCH抑制剂后，将细胞在补充有BDNF(20ng/ml)、GDNF(20ng/ml)、L-抗坏血酸(200μM)、dcAMP(500μM)的神经支持培养基或其他此类支持培养基中，在聚-L-鸟氨酸(0.002％)和层粘连蛋白-521(1.5μg/cm²)包被的孔中以二维培养再培养5天，该时间为神经前体和中间体的转变以及最终分化为腹侧中脑神经元留出了时间。培养5天后，可以根据实施例7、实施例8和实施例9中描述的任一种方法来评估细胞群体的表达谱。

实施例7：RNA测序方法

为了进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)或单细胞核RNA测序，用accutase、trypleselect或其他此类试剂将未分化的PSC以及分化的细胞解离成单细胞悬液，并且使用10XGenomics Chromium Platform处理3000-10000个细胞，并在NextSeq550上进行测序。使用10X cellranger和R编程语言的Seurat分析包处理数据。对样品进行分析，过滤低质量或多重态细胞，并针对每个单独的实验分别进行分析，然后将选定的分化细胞谱系的细胞以及hPSC组合成一个数据集，然后使用如针对Seurat版本3所概述的标准Seurat工作流程进行分析，即使用SCTransform进行归一化，最后对统一的tSNE图使用前29个主成分进行分析。

实施例8：免疫细胞化学(ICC)

将细胞在室温下在4％低聚甲醛(Alfa Aesar)中固定10分钟。通过将细胞与PADT缓冲液——不含Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Gibco)，含有0.02％叠氮化钠溶液(Ampliqon)、0.5％ Triton X-100(Sigma)和5％驴血清(Jackson Labs)——一起孵育30分钟，然后在4℃下与第一抗体(见表X)孵育过夜，来阻断非特异性抗体结合。用不含Ca²⁺和Mg² ⁺的PBS洗涤细胞3次，用PADT缓冲液封闭15分钟，并在室温下与荧光团偶联的第二抗体(见表X)避光孵育2小时。然后在室温下用DAPI(10μg/mL)对细胞进行复染5分钟，用不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS洗涤3次，并在不含Ca²⁺和Mg²⁺但补充有0.02％叠氮化钠的PBS中储存于4℃。使用配备有Axiocam 512相机和ZEN 3.2(Pro)软件(Zeiss)的Zeiss Axio Observer显微镜捕获图像。

实施例9：定量实时PCR(qPCR或qRT-PCR)

为了进行qPCR，用Trizol从细胞中提取RNA，并将其转化为cDNA，随后使用定量实时聚合酶链反应(qPCR)分析感兴趣的基因，如SOX2、KI67、HuCD、NeuN、INA、ASCL1、FOXA2、TH、LMX1A、EN1或腹侧中脑神经细胞的其他相关标志物。通常对3个或更多个独立生物学重复中每一个的三次技术重复进行qPCR，并针对管家基因如GAPDH或HPRT1进行归一化。

虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。

Claims

1.引导PSC细胞群体向腹侧中脑神经元分化的体外方法，其包括培养PSC细胞群体，使所述PSC细胞群体与SMAD蛋白信号传导的抑制剂、Wnt信号传导的抑制剂、SHH信号传导的激活剂、FGF信号传导的激活剂、可选的抗坏血酸和可选的BDNF接触，以获得包含腹侧中脑NSC的细胞群体，其中所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体进一步与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触以引导向腹侧中脑神经元的分化，并且其中在使所述细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，让所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化14至24天。

2.引导腹侧中脑NSC向神经元分化的体外方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触，其中所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的至少5％共表达标志物FOXA2、LMX1A、EN1、OTX2和SOX2，并且其中在使所述细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触之前，让所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化14至24天。

3.引导腹侧中脑NSC向神经元分化的体外方法，其包括使包含腹侧中脑NSC的细胞群体与MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触，其中所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的40-60％表达ASCL1，所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的45-65％表达KI67，所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的10-15％表达INA，所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的2-5％为INA+/SOX2-，并且所述包含腹侧中脑NSC的细胞群体中的80-95％表达SOX2。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括最初让所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化，其中在从最初让所述细胞群体向腹侧中脑NSC分化起的第28天、第27天、第26天或第25天，优选第25天，收获所述细胞群体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述MEK信号传导的抑制剂选自PD0325901、曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼(AZD6244)、匹马塞替尼(AS703026)、MEK162、考比替尼、PD184352、PD173074、BIX02189、AZD8330、PD318088、瑞法替尼和PD98059，优选PD0325901。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NOTCH信号传导的抑制剂选自DAPT、Avagacestat、PF-03084014和LY450139。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触至少1/2小时、1小时、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时，或18小时，或24小时，或者至少2天、3天、4天、5天或6天。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体至少部分地同时与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞群体同时与所述MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂接触。

10.根据前述权利要求所述的方法，其中在MEK信号传导抑制和NOTCH信号传导抑制结束后4天内冷冻保存所述细胞群体。

11.包含腹侧中脑NSC的体外细胞群体，其中当将所述细胞群体在适合于维持神经细胞的培养基中体外培养5天时，产生其中至少50％为INA+或HuCD+并且少于15％为KI67+的细胞群体。

12.根据前述权利要求所述的细胞群体，其中所述细胞群体是根据实施例6培养的。

13.根据权利要求11和12中任一项所述的细胞群体，其中所述细胞的标志物的表达根据实施例8中描述的方法来测量。

14.组合物，其包含含有腹侧中脑NSC的细胞群体、MEK信号传导的抑制剂和NOTCH信号传导的抑制剂。

15.根据前述权利要求所述的组合物，其用于治疗帕金森病。