CN110478487B

CN110478487B - 一种大环内酯化合物在逆转肿瘤多药耐药增强抗肿瘤疗效方面的应用

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Publication number: CN110478487B
Application number: CN201910747522.0A
Authority: CN
Inventors: 许建华; 张志强; 马春玲; 李鹏; 叶胜难; 吴敏
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: Fujian Medical University
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2019-08-14
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2039-08-14
Also published as: CN110478487A

Abstract

本发明涉及一种大环内酯化合物在逆转肿瘤多药耐药增强抗肿瘤疗效方面的应用，该化合物具有抑制ABC转运蛋白活性，提高ABC转运蛋白的底物化疗药物在肿瘤细胞内的浓度，逆转肿瘤多药耐药，增强抗生素类肿瘤化疗药物、植物来源的肿瘤化疗药物以及小分子酪氨酸激酶抑制剂等ABC转运蛋白底物化疗药物的疗效，与抗肿瘤药物联合应用具有增强疗效的作用。以该化合物效剂量与有效剂量的抗肿瘤药物联合应用，包括与有效剂量的抗肿瘤药物混合制备成药学上可接受的复方制剂，用于包括白血病、淋巴瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤在内的肿瘤治疗。

Description

一种大环内酯化合物在逆转肿瘤多药耐药增强抗肿瘤疗效方面的应用

技术领域

本发明涉及一种大环内酯化合物在增强肿瘤化疗、抗肿瘤转移中的应用，属于药物新用途技术领域。

背景技术

式(Ⅰ)所示的大环内酯化合物，分子式为C₂₈H₃₈N₂O₆，英文名为Conglebatin(本申请简称为Con)

1979年报道，Conglebatin是由链霉菌Streptomyces conglobatus ATCC 31005产生的化合物，它无抗真菌、抗细菌、抗原虫、抗肿瘤活性，是一个低毒性药物，按小鼠1g/Kg给药，未发现毒性作用[J Antibiotics,1979,32(9):874-877.]。近年报道该化合物具有抑制热休克90蛋白功能的抗肿瘤作用[Mol Cancer,13(2014)150.]，但未见本专利所述应用的文献报道。

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命的全身性疾病，肿瘤复发与远处转移是致死的主要原因。化学药物治疗是肿瘤患者最常用的治疗手段之一，但是在肿瘤化疗过程中产生的耐药是化疗失败的主要原因之一，克服耐药是提高肿瘤化疗效果的关键。但是现有的抗肿瘤药物对肿瘤转移与耐药的效果均不够理想。

肿瘤耐药形成机制复杂，ABC转运蛋白的异常表达是肿瘤细胞产生多药耐药的重要原因，成为近年来研究耐药的焦点。人类ABC转运体由ABCA到ABCG七个亚家族组成，共有49个成员，其中与肿瘤耐药关系最密切有ABCB1/P-糖蛋白、ABCC1/多药耐药相关蛋白和ABCG2/乳腺癌耐药蛋白。ABC转运蛋白是一类特殊的跨膜转运蛋白，它能够利用水解ATP产生的能量，将已经进入肿瘤细胞的底物化疗药物从细胞内转运到细胞外，降低细胞内药物的浓度，使肿瘤细胞对这些底物化疗药物产生耐药。ABCB1的底物化疗药物有蒽环类抗生素、放线菌素、丝裂霉素等抗肿瘤抗生素以及紫杉烷类、长春碱类、喜树碱类、鬼臼毒素类等植物来源的肿瘤化疗药物，甚至还包括伊马替尼、索拉菲尼、吉非替尼、达沙替尼、厄洛替尼等一些小分子酪氨酸激酶抑制剂；ABCC1的底物化疗药物主要有蒽环类抗生素、甲氨蝶呤、长春碱类、鬼臼毒素类和喜树碱等；ABCG2的底物化疗药物主要有米托蒽醌、甲氨蝶呤、拓扑替康等。上述与肿瘤耐药密切相关的ABC转运蛋白在乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病细胞、骨髓瘤、膀胱癌、肉瘤、肾细胞癌、神经系统肿瘤等高表达，与这些肿瘤的耐药有关。

ABC转运蛋白的抑制剂可以通过抑制耐药肿瘤细胞膜上的ABC转运蛋白对其底物化疗药物的外排作用，提高细胞内的药物浓度，增强底物化疗药物对耐药肿瘤细胞的杀伤效果，达到逆转肿瘤细胞耐药的目的。因此开发高效低毒的ABC转运蛋白抑制剂，对高克服肿瘤细胞耐药，增强化疗效果具有重要的临床价值。

发明内容

本发明公开的大环内酯化合物Con具有抑制ABC转运体活性，提高ABC转运体的底物化疗药物在肿瘤细胞内的浓度，增强抗生素类肿瘤化疗药物、植物来源的肿瘤化疗药物以及小分子酪氨酸激酶抑制剂等的疗效，与各类抗肿瘤药物联合应用具有增强疗效的作用；

将大环内酯化合物Con有效剂量与有效剂量的抗肿瘤药物联合应用，制备成药学上可接受的复方制剂，用于包括白血病、淋巴瘤、胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤在内的肿瘤治疗。

式(Ⅰ)所示的大环内酯化合物，具有逆转多药耐药增强抗肿瘤药物疗效的用途。

有效剂量范围是5mg/kg～100mg/kg

所述的肿瘤为乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝细胞癌、卵巢癌、宫颈癌、白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肉瘤、肾细胞癌。

抗肿瘤药物包括：抗生素类肿瘤化疗药物(阿霉素等蒽环类抗生素、放线菌素、丝裂霉素等)；植物来源的肿瘤化疗药物(紫杉烷类、长春碱类、喜树碱类、鬼臼毒素类等)；作为ABC转运体底物的小分子酪氨酸激酶抑制剂(伊马替尼、索拉菲尼、吉非替尼、达沙替尼、厄洛替尼等)。

附图说明

图1化合物Con增强长春新碱对ABCB1介导的耐药细胞KBv200的体内抗肿瘤作用；

图1A各组动物肿瘤在用药过程中的生长曲线；

图1B用药结束处死动物分离肿瘤，各组动物肿瘤照片；

图1C各组动物体重变化曲线；

图1D各组动物的瘤重直方图；

说明Con具有体内逆转多药耐药的作用的抗肿瘤作用。

图2化合物Con对对ABCB 1或ABCG 2高表达的耐药细胞及其亲本细胞内DOX积累的影响；

图2A代表Con与ABCB 1抑制剂阳性对照药维拉帕米(Verapamil)对ABCB 1高表达的耐药细胞KBv200及其亲本KB细胞内DOX积累的影响；

图2B代表Con与ABCB 1抑制剂阳性对照药维拉帕米(Verapamil)对ABCB 1高表达的耐药细胞K562/adr及其亲本K562细胞内DOX积累的影响；

图2C代表Con与ABCB 1抑制剂阳性对照药维拉帕米(Verapamil)对ABCB 1高表达的耐药细胞MCF-7/adr及其亲本MCF-7细胞内DOX积累的影响；

图2D代表Con与ABCG2抑制剂阳性对照药KO134对ABCG2高表达的耐药细胞S1-MI-80及其亲本S1细胞内DOX积累的影响。

图3化合物Con对ABCB 1或ABCG 2高表达的耐药细胞DOX外排的影响；

图3A代表Con对ABCB 1高表达的耐药细胞KBv200阿霉素(DOX)外排的影响；

图3B代表Con对ABCG2高表达的耐药细胞S1-MI-80阿霉素(DOX)外排的影响。

具体实施方式

下列结合附图和实例对本发明进行详细说明

实施例1化合物Con增强ABCB1或ABCG2底物化疗药物对相应耐药细胞的体外抗肿瘤作用

1.1材料说明

肿瘤细胞株：人口腔癌细胞KB及其ABCB1过表达细胞系KBv200，人慢性粒细胞白血病细胞株K562及其ABCB1过表达细胞系K562/adr，人乳腺癌细胞株MCF-7及其ABCB1过表达细胞系MCF-7/adr,人结肠癌细胞株S1及其ABCG2过表达细胞系S1-M1-80,人非小细胞肺癌细胞株H460及其ABCG2过表达细胞系H460/MX20,人胚肾癌细胞株HEK293及其转染空载体细胞株HEK293/pcDNA3.1、ABCB1稳转细胞株HEK293/ABCB1、ABCG2稳转细胞株HEK293/ABCG2-R2。KBv200细胞在培养体系中加入终浓度为0.2mg/L的长春新碱，K562/adr、MCF-7/adr细胞加入终浓度为1mg/L的阿霉素以维持耐药性，转染细胞用2mg/mL G418维持。实验前停药1周，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。以上细胞株由中山大学肿瘤防治中心提供。

底物化疗药物：ABCB1的底物化疗药物阿霉素(DOX)、长春新碱(VCR)和紫杉醇(PTX)，ABCG2的底物化疗药物米托蒽醌(Mito)、拓扑替康(Topo)。

逆转剂阳性对照药：ABCB1耐药逆转剂阳性对照药：维拉帕米(VPR)，ABCG2耐药逆转剂的阳性对照药：KO134。

1.2实验方法

肿瘤细胞培养于含10％小牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100μg/ml的RPMI1640培养液中，置37℃，5％CO2饱和湿度孵育箱中培养。取对数生长期的各细胞以适当的密度分别接种于96孔培养板中，置37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养24h；培养24h后加入不同浓度的Con，用MTT法测细胞生存率，计算出Con细胞抑制率为10％的浓度(IC10)，以非细胞毒的IC10作为逆转剂浓度进行后续的逆转耐药实验。

以非细胞毒的Con或阳性逆转剂维拉帕米(VPR)预处理ABCB1或ABCG2高表达的耐药细胞株及其对应的敏感细胞株，观察ABCB1、ABCG2的底物化疗药物阿霉素(Dox)、长春新碱(VCR)、紫杉醇(PTX)、米托蒽醌(Mito)、拓扑替康(Topo)对耐药细胞和对应的敏感细胞增殖抑制的量效曲线，计算底物化疗药物对耐药及敏感细胞50％抑制浓度(IC50)，得到单独底物化疗药物的IC50值，及加入不同浓度Con或阳性对照逆转剂后细胞底物化疗药物的IC50值，IC50值的降低表示抗肿瘤活性的增强。按照以下公式计算耐药倍数、逆转倍数，实验均重复3次。

1.3结果

从表1可见，底物化疗药物单独应用时，对耐药肿瘤细胞的IC50值均显著高于对应的敏感肿瘤细胞，因此有较高的耐药倍数。当加入非细胞毒浓度的Con或逆转剂阳性对照药VPR时，底物化疗药物对耐药细胞的IC50均显著降低，表明Con能够增强底物化疗药物对耐药细胞的抗肿瘤活性，即能逆转ABCB1、ABCG2介导的肿瘤细胞对底物化疗药物的耐药性。其中非细胞毒浓度Con对多个ABCB1介导的耐药肿瘤细胞株的耐药逆转倍数显著高于阳性对照药VPR。而对于敏感的肿瘤细胞，非细胞毒浓度的Con并不能显著降低底物化疗药物的IC50。

表1 Con增强底物化疗药物对ABCBl或ABCG2介导的耐药细胞的抗肿瘤作用

实施例2化合物Con增强底物化疗药物对ABCB1介导的耐药细胞的体内抗肿瘤作用

2.1材料

人口腔上皮癌耐长春新碱细胞KBv200，5-6周龄的BALB/C-nu裸鼠，无特殊致病菌(SPF)级，雄性，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK(沪)2012-0002；实验动物饲养设施使用许可证号：SYXK(闽2016-0007)。

2.2方法

2.2.1裸鼠KBv200移植瘤模型的建立

收集处于对数生长期KBv200细胞1×10⁸/mL，取3只裸鼠作为种鼠，每只裸鼠注入0.2mL的细胞悬液于右前肢皮下。待瘤块形成，进行建模，建模过程于无菌操作台内进行。建模前，对裸鼠进行麻醉处理即用40mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射，取一只瘤块较好的裸鼠剥瘤并将KBv200瘤块剪碎成约10mm³～20mm³的小瘤块，利用接种针将小瘤块种于35只裸鼠的右前肢皮下。

2.2.2分组

待肿瘤长至70mm³～100mm³左右，选出接种成功的裸鼠，将裸鼠按肿瘤大小随机分成4组，每组8只。设溶剂对照组；长春新碱单独用药组(0.5mg/kg)；Con单独用药组(100mg/kg)；长春新碱+Con联合用药组(VCR 0.5mg/kg+Con 100mg/kg)。给药方式为长春新碱i.v.,q3d，Con i.g.,q3d。联合用药组在给予Con l h后再给予长春新碱。分组后第二天开始给药，于给药间期注意观察裸鼠的饮食、饮水、瘤体积和体重变化等情况。实验过程中每3天称体重1次并用游标卡尺测量肿瘤的长径(L)和短径(W)，按公式计算肿瘤体积(V)。

以肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线。于给药28天最后一次测量肿瘤体积后，颈椎脱臼将裸鼠处死，剥离肿瘤称瘤重，按以下公式计算抑瘤率。实验过程中同时记录药物对裸鼠毒性及裸鼠耐受性。

2.3结果

结果见图1，在用药过程中，每3天测一次肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(图1A)，可见联合用药组的瘤体积明显低于溶剂对照组、Con和长春新碱(VCR)单独用药组，于给药28天处死动物取出瘤块称重，测得联合用药组人口腔上皮癌耐药细胞KBv200移植瘤抑瘤率为57.39％(p<0.05)，Con和VCR单独用药组的抑瘤率分别为23.12％以及0.41％(p<0.05)，结果见图1B，图1D。表明能够增强底物化疗药物长春新碱对ABCB1介导的耐药细胞KBv200的体内抗肿瘤作用，提示具有体内逆转多药耐药的作用。而治疗过程中Con组的动物体重与对照组接近(图1C)。

实施例3化合物Con增加ABCB1或ABCG2过表达细胞中底物化疗药物DOX的细胞内积累

3.1材料

人口腔癌细胞KB及其ABCB1过表达细胞系KBv200，人慢性粒细胞白血病细胞株K562及其ABCB1过表达细胞系K562/adr，人乳腺癌细胞株MCF-7及其ABCB1过表达细胞系MCF-7/adr,人结肠癌细胞株S1及其ABCG2过表达细胞系S1-M1-80。

3.2方法

取对数生长期的敏感细胞株KB、K562、MCF-7、S1与对应的耐药细胞株KBv200、K562/adr、MCF-7/adr、S1-M1-80(60万/孔)接种到六孔板；培养24小时后分别加入含0、1/4IC₁₀、1/2IC₁₀、IC₁₀不同终浓度的Con或者10μM VPR、2.5μM Ko134的培养液；37℃孵育3h后，加入阿霉素(10μM)孵育3h，以两药都不加的孔作为阴性对照；收集细胞(2000rpm,5min,弃去上清)，用冷PBS洗涤细胞2次；将洗涤后的细胞重悬于200μL冷PBS中，制成单细胞悬液；立即用流式细胞仪测定细胞内阿霉素的蓄积水平。依据以下公式计算药物作用后的荧光蓄积倍数。以上实验均重复3次。

3.3结果

结果见图2，图2A、B、C、D分别代表Con与ABCB 1或ABCG 2抑制剂阳性对照药维拉帕米(Verapamil)或KO134对ABCB 1或ABCG 2高表达的耐药细胞及其亲本细胞内DOX积累的影响。结果可见，ABCB 1或ABCG 2高表达的耐药细胞内DOX的积累量明显低于其亲本敏感细胞，当用Con或Verapamil、KO134处理时，可使耐药细胞内DOX的细胞内积累明显增加，且这一效应具有Con的浓度依赖性，在非细胞毒浓度范围内随着Con浓度的提高，Dox的细胞内积累随之提高。而Con处理对亲本敏感细胞内DOX的细胞内积累则无影响。结果显示Con能够增加ABCB 1或ABCG 2高表达的耐药细胞内底物化疗药物DOX的积累。

实施例4化合物Con抑制ABCB1或ABCG2过表达细胞中DOX的外排

4.1材料

ABCB1过表达的细胞系KBv 200细胞，ABCG2过表达的细胞系S1-MI-80细胞。

4.2方法

首先，KBv 200或S1-MI-80细胞用10μm DOX在37℃中预处理3h，用PBS冲洗3次。然后，对于KBv 200细胞，一组用含5μm Con的新鲜培养基在37℃分别孵育0、15、30、60和90min，另一组用新鲜培养基在37℃分别孵育0、15、30、60和90min；对于S1-MI-80细胞，一组用含10μm Con的新鲜培养基在37℃孵育0、15、30、60和90min，另一组用新鲜培养基在37℃分别孵育0、15、30、60和90min；在不同的时间点收集细胞，用冰冷PBS冲洗三次。最后，将细胞悬于冰凉的PBS缓冲液中，用流式细胞仪检测细胞内DOX的含量。

4.3结果

将阿霉素与ABCB1过表达KBv200细胞或ABCG2过表达S1-MI-80细胞孵育3h后，换含或不含FW-04-806的培养液，用流式细胞仪测细胞内蓄积的阿霉素的变化，反映阿霉素外排情况。结果见附图3，90min后KBv200细胞的DOX保留率从100％(0min)下降到37.9％(90min)，外排率62.1％(图3A)。S1-MI-80细胞的DOX保留率从100％(0min)到48.5％(90min)外排率51.5％(图3B)。而用5μM Con预处理KBv200细胞，用10μM Con预处理S1-MI-80细胞后，DOX的外排被显著抑制,导致在90分钟的时间点，KBv200细胞阿霉素保留从37.9％增加到66.8％，即外排率从62.1％降到33.2％(图3A)，S1-MI-80细胞阿霉素保留从48.5％增加到76.8％，即外排率从48.5％降到23.2％(图3B)。

实施例5化合物Con与抗肿瘤药物联合应用具有协同作用

5.1材料

肝癌细胞QGY7703、肝癌细胞HepG2、肝癌细胞SK-Hep1。

5.2方法

肝癌细胞株QGY7703、HepG2以6000个/孔种于96孔板，过夜贴壁后加药，作用48h后加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃培养箱孵育4h后加入二甲基亚砜150μl/孔，震荡10min后，酶标仪570nm检测吸光度。计算细胞抑制率，抑制率＝(对照孔吸光度-用药孔吸光度)/对照孔吸光度×100％。应用CompuSyn软件计算协同指数，该协同指数小于1，表示两药合用具有协同作用。

5.3结果

从表2可见，Con 25μM分别与索拉非尼10μM、阿霉素3μM、紫杉醇0.003μM合用，对人肝癌胞细胞QGY7703、HepG2，可产生明显强于单药的抑制率，且联合用药的协同指数均显著小于1，提示Con与索拉非尼、阿霉素、紫杉醇合用可以产生显著的协同抗肿瘤作用。

表2 Con与抗肿瘤药的协同抗肿瘤作用

Claims

1.Conglebatin用于制备肿瘤多药耐药逆转剂的用途，所述药为阿霉素时，所述肿瘤为口腔癌、白血病、乳腺癌、肾癌；所述药为长春新碱、紫杉醇时，所述肿瘤为口腔癌、白血病；所述药为米托蒽醌、拓扑替康时，所述肿瘤为结肠癌、肺癌。

2.Conglebatin与阿霉素共用在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。

3.Conglebatin与紫杉醇共用在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。