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WO2015115310A1 - がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤 - Google Patents

がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤 Download PDF

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WO2015115310A1
WO2015115310A1 PCT/JP2015/051761 JP2015051761W WO2015115310A1 WO 2015115310 A1 WO2015115310 A1 WO 2015115310A1 JP 2015051761 W JP2015051761 W JP 2015051761W WO 2015115310 A1 WO2015115310 A1 WO 2015115310A1
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WO
WIPO (PCT)
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cancer stem
stem cell
osc19
cancer
active oxygen
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/051761
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English (en)
French (fr)
Inventor
秀行 佐谷
永野　修
章悟 岡崎
Original Assignee
学校法人慶應義塾
秀行 佐谷
永野　修
章悟 岡崎
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人慶應義塾, 秀行 佐谷, 永野　修, 章悟 岡崎 filed Critical 学校法人慶應義塾
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a cancer stem cell growth inhibitor and an intracellular active oxygen accumulation inducer.
  • cancer stem cells are highly resistant to various stresses, and the development of drugs targeting cancer stem cells is an urgent task for the cure of cancer.
  • the analysis of the molecular mechanisms of stress resistance of cancer stem cells for the development of treatments targeting cancer stem cells has just begun.
  • CD44 one of the markers of epithelial cancer stem cells, is known as a molecule involved in its stress resistance (Cancer Cell. 2011 2011 Mar 8; 19 (3): 387-400).
  • CD44 has a splice variant form (hereinafter, CD44v), and CD44v stably expresses cystine transporter xCT on the cell membrane. Since xCT has a function of taking cystine into cells, and the cystine taken up thereby is used for production of glutathione (GSH), the amount of GSH increases in cells that highly express CD44v. Since GSH has a strong antioxidant effect and has a role of reducing stress generated in cells, cancer stem cells that highly express CD44v are considered to be resistant to treatment.
  • GSH glutathione
  • An object of the present invention is to provide a cancer stem cell growth inhibitor and an intracellular active oxygen accumulation inducer.
  • One embodiment of the present invention comprises a cancer stem cell growth inhibitor comprising a compound represented by the following formula (1) or (2) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient: And a cancer stem cell active oxygen accumulation inducer.
  • the cancer stem cell preferably expresses CD44v.
  • the cancer stem cells are preferably contained in solid cancer.
  • the anticancer agent may be sulfasalazine.
  • Another embodiment of the present invention includes the step of administering a compound represented by the following formula (1) or (2) or a pharmacologically acceptable salt thereof to a vertebrate having cancer stem cells. Is a treatment method for cancer.
  • the cancer stem cell preferably expresses CD44v.
  • the cancer stem cells are preferably contained in solid cancer.
  • the compound represented by the formula (1) or (2) may be administered in combination with an anticancer agent.
  • the anticancer agent may be sulfasalazine.
  • Example of this invention it is a figure which shows the CD44v expression level of squamous cell carcinoma cell line HSC4, HSC3, HSC2, and OSC19. In one Example of this invention, it is a figure which shows glutathione content of squamous cell carcinoma cell lines HSC4, HSC3, HSC2, and OSC19. In one Example of this invention, it is a figure which shows the cell survival rate of squamous cell carcinoma cell lines HSC4, HSC3, HSC2, and OSC19 at the time of culture
  • Example of this invention it is a figure which shows the cell survival rate of the squamous cell carcinoma cell lines HSC4 and OSC19 at the time of culture
  • ROS reactive oxygen species
  • Example of this invention it is a figure which shows the cell survival rate of the squamous cell carcinoma cell lines HSC4 and OSC19 at the time of culture
  • a change in tumor volume is shown when 1 ⁇ 10 6 OSC19 cells are subcutaneously transplanted into a mouse and physiological saline or pimozide is administered intraperitoneally once a day from the fifth day of transplantation.
  • changes in tumor weight are shown when 1 ⁇ 10 6 OSC19 cells are subcutaneously transplanted into mice and physiological saline or pimozide is administered intraperitoneally once a day from the 5th day of transplantation.
  • FIG. In one Example of this invention it is a figure which shows the ROS amount of squamous cell carcinoma cell lines OSC19 and HSC-4 when pimozide or sulfasalazine is added.
  • Example of this invention it is a figure which shows the cell survival rate of the squamous cell carcinoma cell lines HSC4 and OSC19 at the time of culture
  • the pharmacologically acceptable salt in the present invention is not limited as long as it forms a salt with the compound according to the present invention, and specifically, for example, hydrochloride, sulfate, nitrate, hydrogen bromide.
  • the compound according to the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof includes not only anhydrides but also hydrates and crystal polymorphs.
  • US077 is an existing drug that has already been used for treatment of mental illness at home and abroad, and therefore, safety and blood dynamics are clear, and it is preferable because it is inexpensive.
  • SER Seltindole
  • the cancer stem cells are cancer cells that are particularly resistant to treatment in cancer tissues, but the cancer stem cells that are targets of the drug according to the present invention express CD44v. Is preferred.
  • the cancer containing the cancer stem cells is not particularly limited, but is preferably a solid cancer, and examples include colon adenocarcinoma, gastric adenocarcinoma, breast adenocarcinoma, lung adenocarcinoma, pancreatic adenocarcinoma, and squamous cell carcinoma of the head and neck. be able to.
  • the drug according to the present invention may be formulated into tablets, powders, granules, powders, capsules, liquids, emulsions, suspensions and the like by conventional methods because each of the above compounds is used as a pharmaceutical. .
  • the medicament according to the present invention is produced using pharmaceutically acceptable additives known to those skilled in the art, such as excipients and carriers.
  • the administration target of the drug according to the present invention is not particularly limited as long as it is a vertebrate, but is preferably a human cancer patient.
  • the required amount of the drug according to the present invention may be administered to the administration subject within a range of effective dose.
  • a dose having an effect can be appropriately determined finally based on the judgment of a doctor or veterinarian in consideration of the type of dosage form, the administration method, the age and weight of the administration subject, the medical condition of the administration subject, and the like.
  • the dose of the compound is preferably 0.3 mg / kg or more, more preferably 0.5 mg / kg or more, most preferably 0.8 mg / kg or more, and 2 mg / kg or less. It is preferably 1.5 mg / kg or less, and most preferably 1.3 mg / kg or less.
  • the method of administration is not particularly limited, and for example, it may be administered orally, parenterally by intraperitoneal or intravenous injection or infusion, or administered directly into cancer by injection or the like. Also good.
  • the drug according to the present invention can be used as a concomitant drug that enhances the effect of an anticancer drug by administering it in combination with other anticancer drugs that have been used conventionally.
  • the combination is preferably administered at the same time, but while one effect remains, as long as the other is administered, it may be administered independently around the time.
  • anticancer agent examples include cyclophosphamide, dacarbazine, chlorambutyl, methotrexate, cytarabine, actinomycin D, bleomycin, doxorubicin, vincristine, vinblastine, cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, irinotecan, streptozotocin, paclitaxel, docetaxel, docetaxel , Etoposide, gemcitabine, bevacizumab, rituximab, brefeldin A, trastuzumab, imatinib, pemetrexed, capecitabine, bortezomib, leuprorelin, erlotinib, sunitinib, cetuximab, goserenin, dasatinib .
  • the drug according to the present invention can continue to be administered after treatment with a conventional anticancer agent, thereby acting on cancer stem cells that could not be killed by a conventional anticancer agent, and suppressing cancer recurrence / metastasis. it can.
  • CD44 expression-suppressed strains were prepared for HSC2, HSC3, HSC4, and OSC19. That is, siRNA for CD44 prepared by annealing with oligonucleotides having the following sequences purchased from Japan Bioservice was introduced into HSC2, HSC3, HSC4 and OSC19 using Lipofectamine RNAi MAX (Invitrogen) and cultured for 72 hours. A clone with suppressed CD44 expression was obtained.
  • GSH-Glo registered trademark Glutathione Assay (Promega)
  • CD44v the intracellular GSH concentration was measured by GSH-Glo (registered trademark) Glutathione Assay (Promega), and the relationship with the expression level of CD44v was examined.
  • GSH-Glo registered trademark Glutathione Assay
  • each cell line was seeded in a 96-well plate at 2000 cells / well, and the following day, cisplatin was added at concentrations of 1, 2.5, 5, and 7.5 ⁇ M Added. 72 hours later, cell viability was measured by Celltiter-Glo (Promega).
  • FIG. 1 shows, all of HSC2, HSC3, HSC4 and OSC19 express CD44v, but the expression level of CD44v of OSC19 is significantly high. And in any cancer cell, it has confirmed that the expression level of CD44v fell by suppressing the expression of CD44.
  • GSH content in each cell line of HSC2, HSC3, HSC4 and OSC19 is shown.
  • the GSH content is expressed with the GSH content of HSC4 as 100%.
  • OSC19 the case where the expression of CD44 is suppressed by RNAi is indicated by (+), and the case where the expression of CD44 is not suppressed is indicated by ( ⁇ ).
  • the OSC19 GSH content was significantly higher than that of HSC2, HSC3, and HSC4, and a correlation with the expression level of CD44v was observed. And when the expression of CD44 of OSC19 was suppressed, the content of GSH decreased. Thus, overexpression of CD44 increases the cellular GSH content.
  • FIG. 3 shows the cell viability of HSC2, HSC3, HSC4, and OSC19 when cisplatin is added to the medium.
  • OSC19 having a significantly higher content of GSH than HSC2 to HSC4 was very less sensitive to cisplatin.
  • OSC19 contains many GSH due to high expression of CD44v, and has the property of cancer stem cells that are resistant to existing anticancer agents.
  • HSC4 as a representative example of normal cancer cells
  • OSC19 as a representative example of cancer stem cells.
  • OSC19 was seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 24-well glass bottom plate, and the next day, each compound was added at 10 ⁇ M. Thereafter, the cells were cultured for 24 hours, stained with 2 ', 7'-dichlorohydrofluorescein diacetate (H2DCFDA), which is a redox fluorescent indicator, and observed with a fluorescence microscope. Moreover, the active oxygen induction ability was evaluated in four steps from the fluorescence intensity.
  • H2DCFDA 2 ', 7'-dichlorohydrofluorescein diacetate
  • FIG. 4 shows the cell viability of OSC19 and HSC4 cultured in a medium supplemented with each compound.
  • FIG. 5 shows the ratio of the cell viability of HSC4 to the cell viability of OSC19.
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph of OSC19 to which each compound shown in Table 1 was administered, and shows the results of evaluating the increase of ROS in OSC19 in four stages.
  • NT is a fluorescence micrograph of OSC19 not administered with any of the compounds shown in Table 1.
  • the “4-level criteria” are as follows. NT is a fluorescence micrograph of the compound not administered.
  • pimozide was added at 0 ⁇ M (no addition), 0.3 ⁇ M, 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M, or sulfasalazine was added to a concentration of 0 ⁇ M (not added), 10 ⁇ M, 30 ⁇ M, 100 ⁇ M, 300 ⁇ M, and 1000 ⁇ M. Thereafter, the cells were cultured for 72 hours, and the cell viability was measured by Celltiter-Glo (Promega).
  • FIG. 7 and 8 show cell viability versus OSC19 and HSC4 doses of pimozide or sulfasalazine, respectively.
  • OSC19 is more sensitive to pimozide than HSC4.
  • OSC19 showed higher sensitivity to sulfasalazine than HSC4, but pimozide has a cell growth inhibitory effect at a lower concentration than sulfasalazine.
  • FIG. 9 shows that 1 ⁇ 10 6 OSC19 cells were implanted subcutaneously into nude mice, and pimozide or physiological saline was administered intraperitoneally at a dose of 1 mg / kg once a day from the fifth day after transplantation. Shows the change in tumor volume.
  • FIG. 10 shows the tumor weight on day 35. As these figures show, administration of pimozide suppressed the growth of OSC19.
  • pimozide has a selective growth inhibitory effect on CD44v-positive cancer stem cells, thereby efficiently suppressing cancer growth.
  • OSC19 and HSC4 are seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well on a 24-well glass bottom plate, and the next day, pimozide is added at 0 ⁇ M (not added), 1 ⁇ M, 3 ⁇ M, 10 ⁇ M, or sulfasalazine is added at 300 ⁇ M. did. Thereafter, the cells were cultured for 24 hours, intracellular reactive oxygen species were stained with H2DCFDA, and observed using a fluorescence microscope.
  • FIG. 11 shows fluorescence micrographs of OSC19 and HSC4 cultured in medium administered with pimozide at 1, 3, 10 ⁇ M or sulfasalazine at 300 ⁇ M.
  • pimozide has an effect of inducing intracellular active oxygen accumulation selectively in OSC19 similarly to sulfasalazine, but has an extremely high concentration of inducing intracellular active oxygen at a very low concentration compared to sulfasalazine.
  • pimozide is a compound that can effectively suppress stress resistance, which is a characteristic of cancer stem cells.
  • OSC19 cells were seeded on a 96-well plate at 3000 cells / well and HSC4 at 2000 cells / well, and culture was started.
  • sertindole was added so as to be 0 ⁇ M (not added), 0.19 ⁇ M, 0.56 ⁇ M, 1.67 ⁇ M, 5.00 ⁇ M, 15.00 ⁇ M, or 45.00 ⁇ M.
  • the number of viable cells was measured using Celltiter-Glo (registered trademark) (Luminescent Cell Viability Assay: Promega), and the ratio of the number of viable cells to the number of cells on the first day of culture was calculated as the cell viability. .
  • FIG. 12 shows the cell viability with respect to the concentration of sertindole added to the medium. As shown in the figure, cell growth of OSC19 was suppressed by the addition of sertindol at a very low concentration compared to HSC4.
  • sertindole has a stronger growth inhibitory effect on CD44v-positive cancer stem cells than normal cancer cells.
  • OSC19 cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 24-well glass bottom plate, and culture was started. On the second day of culture, sertindole was added to a concentration of 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, or sulfasalazine was added to a concentration of 300 ⁇ M. DMSO was added as a control.
  • H2DCFDA 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate
  • Hoechst33342 that stains the cell nucleus were added to the cells.
  • sertindole is a compound that can effectively suppress stress resistance, which is a characteristic of cancer stem cells.
  • Example 7 In this example, the combined effect of pimozide and sulfasalazine was examined for the cell growth inhibitory effect.
  • a cancer stem cell growth inhibitor and an intracellular active oxygen accumulation inducer can be provided.

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Abstract

　本発明は、がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤を提供することを目的とする。そのため、ピモジド又はセルチンドールを有効成分として含有する、がん幹細胞の増殖抑制剤およびがん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤とする。

Description

がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤
　本発明は、がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤に関する。
　がん治療においては、抗がん剤や放射線などの治療に対して抵抗性を持つ細胞が存在することが、再発や転移の原因となり、がんの治療を妨げている。このような治療抵抗性細胞として、近年がん幹細胞の存在が注目されている。がん幹細胞は、各種ストレスに対して抵抗性が高く、がん幹細胞を標的とした薬剤の開発ががんの根治のためには急務である。しかし、がん幹細胞を標的にした治療の開発のための、がん幹細胞のストレス抵抗性の分子機構の解析は端緒についたばかりである。
　上皮性がん幹細胞のマーカーの一つであるＣＤ４４は、そのストレス抵抗性に関与する分子として知られている（Cancer Cell. 2011 Mar 8;19(3):387-400）。ＣＤ４４には、スプライスバリアントフォーム（以下、ＣＤ４４ｖ）が存在し、ＣＤ４４ｖが細胞膜上にシスチントランスポーターｘＣＴを安定して発現させる。ｘＣＴは細胞内にシスチンを取り込む機能を有し、それによって取り込まれたシスチンはグルタチオン（ＧＳＨ）の産生に用いられるために、ＣＤ４４ｖを高発現している細胞では、ＧＳＨの量が増加する。ＧＳＨは強力な抗酸化作用を持ち、細胞に生じたストレスを減少させる役割を持つために、ＣＤ４４ｖを高発現するがん幹細胞は、治療に対して抵抗性を有するとされる。
　本発明は、がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤を提供することを課題とするものである。
　本発明の一実施態様は、下記式（１）または（２）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とするがん幹細胞の増殖抑制剤及びがん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
　　　　　　　　　　　　　（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　　　　　　　　　　　　　　（２）
ここで、前記がん幹細胞はＣＤ４４ｖを発現していることが好ましい。また、前記がん幹細胞は固形がんに含まれていることが好ましい。また、抗がん剤と併用して投与されてもよい。前記抗がん剤がスルファサラジンであってもよい。
　本発明の他の実施態様は、下記式（１）または（２）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を、がん幹細胞を有する脊椎動物に投与する工程を有する、がんの治療方法である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　　　　　　　　　　　　　（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
　　　　　　　　　　　　　　（２）

ここで、前記がん幹細胞はＣＤ４４ｖを発現していることが好ましい。また、前記がん幹細胞は固形がんに含まれていることが好ましい。また、前記工程では、式（１）または（２）で表される化合物を抗がん剤と併用して投与してもよい。前記抗がん剤がスルファサラジンであってもよい。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
　本出願は、２０１４年１月２９日付で出願した日本国特許出願２０１４－１４８５７に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施例において、扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４、ＨＳＣ３、ＨＳＣ２およびＯＳＣ１９の、ＣＤ４４ｖ発現量を示す図である。 本発明の一実施例において、扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４、ＨＳＣ３、ＨＳＣ２およびＯＳＣ１９の、グルタチオン含有量を示す図である。 本発明の一実施例において、シスプラチンを各濃度で添加した培地で７２時間培養した場合の、扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４、ＨＳＣ３、ＨＳＣ２およびＯＳＣ１９の細胞生存率を示す図である。 本発明の一実施例において、各種化合物を添加した培地において培養した場合の扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の細胞生存率を示す図である。 本発明の一実施例において、各種化合物を添加した培地において培養した扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の細胞生存率の比を示す図である。 本発明の一実施例において、扁平上皮がん細胞株ＯＳＣ１９を、各種化合物を添加した培地で培養した場合の活性酸素種 reactive oxygen species（ROS）レベルの変化を示す図である。 本発明の一実施例において、ピモジドを各濃度で添加した培地で７２時間培養した場合の、扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の細胞生存率を示す図である。 本発明の一実施例において、スルファサラジンを各濃度で添加した培地で７２時間培養した場合の、扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の細胞生存率を示す図である。 本発明の一実施例において、マウスに１×１０6個のＯＳＣ１９細胞を皮下移植し、移植５日目から１日１回生理食塩水又はピモジドを腹腔内投与した場合の腫瘍の体積変化を示す図である。 本発明の一実施例において、マウスに１×１０6個のＯＳＣ１９細胞を皮下移植し、移植５日目から１日１回生理食塩水又はピモジドを腹腔内投与した場合の腫瘍の重量変化を示す図である。 本発明の一実施例において、ピモジド又はスルファサラジンを添加した場合の、扁平上皮がん細胞株ＯＳＣ１９およびHSC－４のROS量を示す図である。 本発明の一実施例において、セルチンドールを添加した培地において培養した場合の、扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の細胞生存率を示す図である。 本発明の一実施例において、ＤＭＳＯ、セルチンドール、スルファサラジンを添加した場合の、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２により染色された細胞数に対するＨ２ＤＣＦＤＡにより染色された細胞数の比を示す図である。 本発明の一実施例において、ＯＳＣ１９に対する細胞増殖阻害効果について、ピモジドとスルファサラジンの併用効果を調べた結果を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
 なお、実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
＝＝がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤＝＝
　本発明にかかる薬剤は、がん幹細胞の増殖抑制剤及び細胞内活性酸素蓄積誘導剤であって、表１および表２に示される化合物の少なくともいずれか１種またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する。すなわち単剤であってもよいし、合剤であってもよい。
　これらの化合物は、医薬用原薬(バルク)、実験用試薬、工業原料などとして購入することもできるし、当業者はCAS登録番号に基づき化学合成方法が記載された文献を入手し、それに従って製造することもできる。
　なおこれらの化合物は、誘導体化(分子内の一部に、付加、置換、欠失)されていても良い。
　また、本発明における薬理学的に許容される塩とは、本発明にかかる化合物と塩を形成するものであれば限定されないが、具体的には例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸の付加塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩などの有機酸の付加塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などのスルホン酸の付加塩、アミノ酸の付加塩などを挙げることができ、好ましくは塩酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩である。
　さらに本発明にかかる化合物またはその薬理学的に許容される塩は、無水物のみならず水和物や結晶多形も含まれることは言うまでもない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　特に、ＵＳ０７７（ピモジド）は、既に国内外で精神疾患に対する治療のために用いられている既存薬であることから、安全性や血中動態などが明らかであり、しかも安価であることから好ましい。
　またSER(セルチンドール)も欧州や豪州などで精神疾患治療薬として承認され、臨床使用されており、ヒトでの安全性は確認されている。
　ここで、がん幹細胞とは、がん組織中で、特に治療抵抗性を示すがん細胞のことであるが、本発明にかかる薬剤の標的となるがん幹細胞はＣＤ４４ｖを発現していることが好ましい。このがん幹細胞が含まれるがんは特に限定されないが、固形がんであることが好ましく、大腸腺癌、胃腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵腺癌、頭頸部の偏平上皮癌を例示することができる。
＝＝抗がん剤＝＝
　本発明にかかる薬剤は、上記の各化合物を医薬品として用いるため、通常の方法により、錠剤、粉剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などに剤形化されてもよい。本発明にかかる薬剤は、当業者に知られた薬学的に許容できる添加剤、例えば賦形剤や担体を用いて製造される。
　本発明にかかる薬剤の投与対象は、脊椎動物であれば特に限定されないが、ヒトのがん患者であることが好ましい。本発明の薬剤を上記のようながんの患者に投与することによって、そのがんに含まれるがん幹細胞の増殖を抑制することおよびがん幹細胞内に活性酸素の蓄積を誘導し、ストレス抵抗性を下げることができる。
　本発明にかかる薬剤は、効果を有する投与量の範囲内において、投与対象に対し、必要量を適した方法で投与すればよい。効果を有する投与量は、剤形の種類、投与方法、投与対象の年齢や体重、投与対象の病状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。化合物の投与量は、０．３ｍｇ／ｋｇ以上であることが好ましく、０．５ｍｇ／ｋｇ以上であることがより好ましく、０．８ｍｇ／ｋｇ以上であることが最も好ましく、２ｍｇ／ｋｇ以下であることが好ましく、１．５ｍｇ／ｋｇ以下であることがより好ましく、１．３ｍｇ／ｋｇ以下であることが最も好ましい。投与方法は、特に限定されず、例えば、経口投与してもよいし、腹腔内や静脈内への注射や点滴により非経口投与してもよいし、注射等によりがん内に直接投与してもよい。
　本発明にかかる薬剤は、従来用いられている他の抗がん剤と併用して投与することにより、抗がん剤の効果を増強する併用薬剤として使用することができる。ここで、併用とは、時間的に同時に投与することが好ましいが、一方の効果が残っている間に、他方を投与する限り、時間的に前後してそれぞれ単独で投与しても良い。併用する抗がん剤としては、例えば、シクロフォスファミド、ダカルバジン、クロラムブチル、メトトレキサート、シタラビン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、イリノテカン、ストレプトゾトシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、ベバシズマブ、リツキシマブ、ブレフェルジンＡ、トラスツズマブ、イマチニブ、ペメトレキセド、カペシタビン、ボルテゾミブ、リュープロレリン、エルロチニブ、スニチニブ、セツキシマブ、ゴセレニン、ダサチニブ、ソラフェニブ、5-FUなどであるが、これらに限定されない。
　本発明にかかる薬剤は、従来の抗がん剤による治療後に投与しつづけることによって、従来の抗がん剤では殺しきれなかったがん幹細胞に働きかけ、がんの再発・転移を抑制することができる。
＜実験例１＞
　本実施例では、口腔扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の、ＣＤ４４ｖ発現量とＧＳＨ含有量および抗がん剤シスプラチンに対する感受性を調べた。
（方法）
　まず、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９について、ＣＤ４４の発現抑制株を作成した。すなわち、日本バイオサービスから購入した下記配列を有するオリゴヌクレオチドでアニーリングして作製したＣＤ４４に対するｓｉＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ　ＲＮＡｉ ＭＡＸ（Invitrogen社）を用いてＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９に導入して７２時間培養して、ＣＤ４４の発現が抑制されたクローンを得た。
(Sense) 5'-GUAUGACACAUAUUGCUUCTT-3' 
(Antisense) 5'-GAAGCAAUAUGUGUCAUACTT-3'
　これらのクローンで、ＣＤ４４の発現が抑制されていることを確認した。すなわち、細胞をＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒを用いて溶解した溶解物を用いて、イムノブロットを行った。
　次に、細胞内ＧＳＨ濃度をGSH-Glo(登録商標) Glutathione Assay（Promega社）により測定し、ＣＤ４４ｖの発現量との関連を検討した。さらに、シスプラチンに対するＣＤ４４の発現抑制株の感受性を検討するため、各細胞株を２０００個／ウエルで９６ウエルプレートに播種し、翌日１、２．５、５、７．５μＭの各濃度でシスプラチンを添加した。その７２時間後、Celltiter-Glo（Promega社）によって細胞生存率の測定を行った。
（結果）
　図１が示すように、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９はいずれもＣＤ４４ｖを発現しているが、ＯＳＣ１９のＣＤ４４ｖの発現量が有意に多い。そして、いずれのがん細胞においても、ＣＤ４４の発現を抑制することによりＣＤ４４ｖの発現量が低下することが確認できた。
　次に、図２において、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の各細胞株におけるＧＳＨ含有量を示す。ＧＳＨ含有量は、ＨＳＣ４のＧＳＨ含有量を１００％として表したものである。ＯＳＣ１９については、ＲＮＡｉによりＣＤ４４の発現を抑制した場合を（＋）で示し、ＣＤ４４の発現を抑制していない場合を（－）で示す。
　図２が示すように、ＯＳＣ１９のＧＳＨの含有量は、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４に比べて有意に多く、ＣＤ４４ｖの発現量との相関がみられた。そして、ＯＳＣ１９のＣＤ４４の発現を抑制すると、ＧＳＨの含有量が低下した。このように、ＣＤ４４の過剰発現は、細胞のＧＳＨ含有量を増加させる。
　そして、図３において、シスプラチンを培地に添加した場合のＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４およびＯＳＣ１９の細胞生存率を示す。図３が示すように、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３およびＨＳＣ４に比べて、ＧＳＨの含有量がＨＳＣ２～ＨＳＣ４に比べて有意に多いＯＳＣ１９はシスプラチンに対する感受性が非常に低かった。
　このように、ＯＳＣ１９はＣＤ４４ｖの高発現によりＧＳＨを多く含有し、既存の抗がん剤に抵抗性を有するがん幹細胞の性質を有している。以下、通常のがん細胞の代表例としてＨＳＣ４を、がん幹細胞の代表例としてＯＳＣ１９をもちいて、実験を行った。
＜実験例２＞
　本実験例では、表１に示した各化合物の細胞増殖阻害効果および細胞内活性酸素蓄積誘導効果を示す。
（方法）
　９６ウエルプレートにＯＳＣ１９を３０００個／ウエル、ＨＳＣ４を２０００個／ウエルでそれぞれ播種し、培養を開始した。培養開始２日後、表１に示した各化合物を１０μＭで添加し、いずれの化合物も添加していないものをコントロールとして用意した。その４８時間後、４％ＰＦＡ－ＰＢＳにて細胞を固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２による核染色を行った。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の蛍光強度をプレートリーダーにて測定し、コントロールの細胞生存数を１００％として、各化合物を添加した場合の細胞生存率を算出した。また、ＨＳＣ４の細胞生存率とＯＳＣ１９の細胞生存率の比を算出することで化合物のＯＳＣ１９選択性の評価を行った。
　次に、ＯＳＣ１９選択性が高かった化合物による細胞内活性酸素種濃度の変化を検討した。２４ウエルのガラス底プレートにＯＳＣ１９を１×１０5個／ウエルで播種し、翌日、各化合物を１０μＭで添加した。その後、２４時間培養し、酸化還元蛍光指示薬である2',7'-ジクロロハイドロフルオレッセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ）による染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察した。また、その蛍光強度より、４段階で活性酸素誘導能の評価を行った。
（結果）
　図４において、各化合物を添加した培地で培養したＯＳＣ１９およびＨＳＣ４の細胞生存率を示す。図５は、ＯＳＣ１９の細胞生存率に対するＨＳＣ４の細胞生存率の比を示したものである。このように、ここで調べた表１の化合物は全て、ＨＳＣ４に対するより、ＯＳＣ１９に対して、細胞増殖抑制効果が高い。
　図６は、表１に示した各化合物を投与したＯＳＣ１９の蛍光顕微鏡写真であり、ＯＳＣ１９におけるＲＯＳの上昇を４段階で評価した結果を示す。ＮＴは、表１に示した化合物のいずれも投与していないＯＳＣ１９の蛍光顕微鏡写真である。「４段階の基準」は次の通りである。なお、ＮＴは化合物を投与していないものの蛍光顕微鏡写真である。
　０：明らかなＲＯＳレベルの上昇が認められない。
　１：明らかなＲＯＳレベルの上昇が認められる。
　２：比較的高いＲＯＳレベルの上昇が認められる。
　３：非常に高いＲＯＳレベルの上昇が認められる。
　図が示すように、表１に示した化合物は全て、ＯＳＣ１９のＲＯＳレベルを上昇させたが、特に、ピモジド含有培地で培養したＯＳＣ１９は、非常に高いＲＯＳレベルの上昇が認められた。
＜実験例３＞
　本実験例では、ＵＳ０７７（ピモジド）の細胞増殖阻害効果を示す。
（方法）
　ＵＳ０７７（ピモジド）を添加した培地においてＯＳＣ１９およびＨＳＣ４を培養した場合の、細胞生存率を調べた。陽性対照として、ＣＤ４４ｖ陽性の癌細胞に対して選択的に抑制効果を有することが確認されているスルファサラジン（Cancer Cell. 2011 Mar 8;19(3):387-400参照）を添加した培地においても、ＯＳＣ１９およびＨＳＣ４を培養し、細胞生存率を調べた。
　ＯＳＣ１９を３０００個／ウエル、ＨＳＣ４を２０００個／ウエルにて９６ウエルプレートに播種し、翌日にピモジドを０μＭ（添加せず）、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、または、スルファサラジンを０μＭ（添加せず）、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、１０００μＭとなるように添加した。その後７２時間培養し、Celltiter-Glo（Promega社）により細胞生存率を測定した。
　次に、１×１０6個のＯＳＣ１９細胞をヌードマウス皮下に移植し、移植後５日目よりピモジド又は生理食塩水を１日１回、１ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与し、３５日目まで続けた。３～４日おきに、腫瘍の短径、長径を測定し、以下の式により腫瘍体積を算出した。
　腫瘍体積＝（長径×（短径）2）／２
　比腫瘍体積＝測定日の腫瘍体積／投与開始日の腫瘍体積
　腫瘍体積の統計解析は、Ｔｗｏ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡにより行った。また、治療実験終了後に腫瘍を取り出し、その腫瘍重量を測定した。腫瘍重量の統計解析はｔ検定を行った。結果を図９および１０に示す。
（結果）
　図７および図8はそれぞれ、ＯＳＣ１９およびＨＳＣ４のピモジド又はスルファサラジン投与量に対する細胞生存率を示す。図７が示すように、ＯＳＣ１９はＨＳＣ４と比べてピモジドに高い感受性を示す。また、図８が示すように、ＯＳＣ１９はＨＳＣ４と比べてスルファサラジンにも高い感受性を示したが、ピモジドは、スルファサラジンよりも低濃度で細胞増殖阻害効果を有する。
　図９は、１×１０6個のＯＳＣ１９細胞をヌードマウス皮下に移植し、移植後５日目よりピモジド又は生理食塩水を１日１回、１ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与を行った場合の、腫瘍体積変化を示す。図１０は、その３５日目の腫瘍重量を示す。これらの図が示すように、ピモジドを投与することによりＯＳＣ１９の増殖が抑制された。
　このように、ピモジドはＣＤ４４ｖ陽性がん幹細胞に対して選択的に増殖抑制効果を有し、それによって、がんの増殖が効率よく抑制される。
＜実験例４＞
　本実験例では、ＵＳ０７７（ピモジド）の細胞内活性酸素蓄積誘導効果を示す。
（方法）
　２４ウエルのガラス底プレートにOSC19とHSC４をそれぞれ１×１０5個／ウエルで播種し、翌日、ピモジドを０μＭ（添加せず）、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、または、スルファサラジンを３００μＭとなるように添加した。その後、２４時間培養し、H2DCFDAによる細胞内活性酸素種の染色を行い、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
（結果）
　図１１は、ピモジドを１、３、１０μＭとなるように又はスルファサラジンを３００μＭとなるように投与した培地で培養したＯＳＣ１９およびＨＳＣ４の蛍光顕微鏡写真を示す。図に示されるように、ピモジドは、スルファサラジンと同様にＯＳＣ１９に選択的に細胞内活性酸素蓄積誘導効果を有するが、スルファサラジンと比べて非常に低濃度で、極めて高い細胞内活性酸素蓄積誘導効果を有する。
　このように、ピモジドは、がん幹細胞の特性であるストレス抵抗性を効果的に抑制することができる化合物である。
＜実験例５＞
　次に、セルチンドールの細胞増殖阻害効果の一例を示す。
（方法）
　ＯＳＣ１９細胞は３０００個／ウエル、ＨＳＣ４は２０００個／ウエルで９６ウエルプレート上に播種し、培養を開始した。培養２日目に、セルチンドールを０μＭ（添加せず）、０．１９μＭ、０．５６μＭ、１．６７μＭ、５．００μＭ、１５．００μＭ、又は、４５．００μＭとなるように添加した。その後７２時間培養した後にCelltiter-Glo（登録商標）（Luminescent Cell Viability Assay: Promega社）を用いて生存細胞数を測定し、培養初日の細胞数に対する生存細胞数の比を細胞生存率として算出した。
（結果）
　図１２は培地中に添加したセルチンドール濃度に対する細胞生存率を示す。図で示されるように、ＯＳＣ１９はＨＳＣ４に比べて非常に低濃度のセルチンドールの添加により細胞増殖が抑制された。
　このように、セルチンドールは、通常のがん細胞より、ＣＤ４４ｖ陽性がん幹細胞に対してより強い増殖抑制効果を有する。
＜実験例６＞
　次に、セルチンドールの活性酸素蓄積誘導効果を調べた。
（方法）
　２４ウエルのガラス底プレートにＯＳＣ１９細胞を１×１０5個／ウエルで播種し、培養を開始した。培養２日目に、セルチンドールを０．１μＭ、１μＭ、１０μＭとなるように、または、スルファサラジンを３００μＭとなるように添加した。なお、コントロールとしてＤＭＳＯを添加した。その後２４時間培養し、細胞に活性酸素種により酸化され蛍光を発する酸化還元蛍光指示薬である2',7'－ジクロロジハイドロフルオレッセインジアセテート（H2DCFDA）および細胞の核を染色するHoechst33342を添加した。Hoechst33342により染色された細胞の数に対するH2DCFDAにより染色された細胞の数の比を算出した。結果を図１３に示す。
（結果）
　図１３が示すとおり、セルチンドールを１０μＭとなるように添加した場合には、その３０倍もの濃度のスルファサラジンを添加した場合よりも細胞内のＲＯＳレベルが高かった。
　このように、セルチンドールは、がん幹細胞の特性であるストレス抵抗性を効果的に抑制することができる化合物である。
＜実施例７＞
　本実施例では、細胞増殖阻害効果について、ピモジドとスルファサラジンの併用効果を調べた。
（方法）
　口腔扁平上皮癌細胞株ＯＳＣ１９を３０００個／ウエルにて９６ウエルプレートに播種し、翌日にピモジドを０μＭ（添加せず、ＤＭＳＯのみ）、１μＭ、２μＭ、３μＭ、および、スルファサラジンを０μＭ（添加せず、ＤＭＳＯのみ）、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭの組み合わせとなるように添加した。その後７２時間培養し、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayキット（Promega社）を使用して細胞生存率を測定した。各濃度におけるピモジドとスルファサラジンの効果を図１４のグラフに示した。
（結果）
　図１４に示すように、ピモジドとスルファサラジンの併用では、それらの相乗効果が観察された。一例として、ピモジド２μＭでの細胞の致死率が約４０％、スルファサラジン１５０μＭでの致死率が約３０％であるのに、これらの併用では、細胞致死率は９０％以上に達する。
　このように、細胞増殖阻害効果については、ピモジドとスルファサラジンには相乗効果が見られる。
産業状の利用可能性
　本発明によれば、がん幹細胞の増殖抑制剤および細胞内活性酸素蓄積誘導剤を提供することができる。

Claims (11)

  1. 　下記式（１）または（２）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん幹細胞の増殖抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    　　　　　　　　　　　　　（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    　　　　　　　　　　　　　　（２）
  2. 　前記がん幹細胞がＣＤ４４ｖを発現している、請求項１に記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
  3. 　前記がん幹細胞は固形がんに含まれている、請求項１または２に記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
  4. 　抗がん剤と併用して投与される、請求項１～３のいずれか１項に記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
  5. 　前記抗がん剤がスルファサラジンである、請求項４に記載のがん幹細胞の増殖抑制剤。
  6. 　下記式（１）または（２）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、がん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    　　　　　　　　　　　　　（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    　　　　　　　　　　　　　　（２）
  7. 　前記がん幹細胞がＣＤ４４ｖを発現している、請求項６に記載のがん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤。
  8. 　前記がん幹細胞は固形がんに含まれている、請求項６または７に記載のがん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤。
  9. 　抗がん剤と併用して投与される、請求項６～８のいずれか１項に記載のがん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤。
  10. 　前記抗がん剤がスルファサラジンである、請求項９に記載のがん幹細胞内活性酸素蓄積誘導剤。
  11. 　下記式（１）または（２）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、抗がん剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    　　　　　　　　　　　　　（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    　　　　　　　　　　　　　　（２）
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