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CN116271036B - Prmt5抑制剂在制备治疗耐药实体瘤的药物中的用途 - Google Patents

Prmt5抑制剂在制备治疗耐药实体瘤的药物中的用途 Download PDF

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CN116271036B
CN116271036B CN202310010911.1A CN202310010911A CN116271036B CN 116271036 B CN116271036 B CN 116271036B CN 202310010911 A CN202310010911 A CN 202310010911A CN 116271036 B CN116271036 B CN 116271036B
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Abstract

本发明公开了PRMT5抑制剂在制备治疗耐药实体瘤的药物中的用途，属于医药领域；本发明构建化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，应用PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药，极大扭转了肿瘤患者在出现化学药物治疗耐药后无药可用的困境，延缓肿瘤进展速度，提升肿瘤患者的生存时间，具有重要的临床应用前景和需求。本发明将PRMT5抑制剂用于治疗化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，能够有效抑制肿瘤的增殖与生长，在治疗化学药物耐药细胞方面具有广泛的应用前景。

Description

PRMT5抑制剂在制备治疗耐药实体瘤的药物中的用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种PRMT5抑制剂在制备治疗耐药实体瘤的药物中的用途。
背景技术
化疗是化学药物治疗的简称，通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞达到治疗目的。化疗是目前治疗癌症最有效的手段之一，和手术、放疗一起并称癌症的三大治疗手段。其中应用最为广泛的药物之一，紫杉醇是一种天然的抗癌药物，分子式为C47H51NO14，在临床上已经广泛应用于多种实体肿瘤的治疗，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌及部分头颈癌。紫杉醇作为一个具有抗癌活性的二萜生物碱类化合物，其主要作用机制是使微管蛋白和组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，抑制癌细胞的有丝分裂并触发细胞凋亡。含有紫杉醇类药物的化疗方案，是国内外各大乳腺癌诊疗指南中，优先推荐应用于三阴性乳腺癌治疗中的方案，在临床中广泛应用。三阴性乳腺癌，因缺乏ER、PR、HER2的表达，缺乏有效的治疗靶点，化学药物尤其是紫杉醇类药物发挥着重要作用。
当化学药物治疗耐药，疾病进展后，按照国内外指南推荐，后续可选择的方案为戈沙妥珠单抗或其他类型的化学药物。前者为新型抗体偶联药物，目前国内尚未正式应用于临床。并且从相关的ASCENT临床试验数据看，当三阴性乳腺癌应用紫杉醇类药物进展后，戈沙妥珠单抗治疗组的中位PFS时间为5.6个月，虽高于其他化疗方案的1.7个月，但疗效仍远远不能满足患者治疗的需求。因此三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药后，亟需新机制及新靶点的药物来克服耐药，从而提高患者的生存。
因此，如何克服三阴性乳腺化学药物治疗耐药是目前包括临床医生、科研人员和医药公司研究的热点。目前我国尚无利用蛋白精氨酸甲基转移酶（PRMT）抑制剂，克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药的方法。
发明内容
本发明的目的在于将PRMT5抑制剂用于治疗化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，能够有效抑制肿瘤的增殖与生长，在治疗化学药物耐药细胞方面具有广泛的应用前景。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
具体地，本发明涉及PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤耐药的药物中的用途。本发明构建化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，利用PRMT5抑制剂对其进行治疗，能够有效抑制耐药细胞株的生长与增殖，延缓肿瘤的生长，即一定剂量的PRMT5抑制剂对化学药物耐药细胞株具有较好的治疗效果。
具体地，本发明涉及PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤耐药的药物中的用途，其中PRMT5抑制剂包括PRMT降解剂。
在本发明的一些优选实施方式中，PRMT5抑制剂包括CRISPR-Cas9敲除PRMT、慢病毒转染敲降PRMT（shPRMT）、小干扰RNA敲降PRMT（siPRMT）得到的PRMT5抑制剂。
在本发明的一个优选实施方式中，实体肿瘤包括良性实体瘤和恶性实体瘤；良性实体肿瘤包括错构瘤、平滑肌瘤、血管瘤、淋巴管瘤、腺瘤或腺瘤性息肉；恶性实体瘤包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌，还有头颈部恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤、子宫内膜癌、子宫颈癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、甲状腺癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤。
在本发明的一个优选实施方式中，实体瘤为三阴性乳腺癌。
在本发明的一个优选实施方式中，预防或治疗实体肿瘤耐药是乳腺癌对紫杉醇产生的耐药。
在本发明的一些优选实施方式中，PRMT5抑制剂选自LLY-283、GSK-591、GSK3326595，EPZ015938、JNJ-64619178、MRTX719、EPZ05666、SH3765、PF-06939999，GSK3326595中的至少一种。
在本发明的一些优选实施方式中，PRMT5抑制剂的剂量选自：体内为5-150mg、体外为0.5-15μM。
在本发明的一些优选实施方式中，PRMT5抑制剂的剂量选自：体内为10-100mg；具体优选10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg，65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg；体外为1-10μM；具体优选为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM。
本发明还公开了一种预防或治疗化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株的药物，包括：PRMT5抑制剂LLY-283、PRMT5抑制剂GSK-591中的至少一种。本发明采用PRMT5抑制剂LLY-283治疗化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，其能够明显抑制耐药细胞株的生长与增殖，以延缓肿瘤的生长速度。
本发明采用PRMT5抑制剂GSK-591治疗化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，相对于G9a抑制剂UNC0642，其对耐药细胞株具有较好的敏感性。
本发明利用PRMT5抑制剂能够有效抑制化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株的生长与增殖，扭转了肿瘤患者在出现化学药物治疗耐药后无药可用的困境，延缓肿瘤进展速度，提升肿瘤患者的生存时间，具有重要的临床应用前景和需求。因此，本发明是一种将PRMT5抑制剂用于治疗化学药物耐药的三阴性乳腺癌细胞株，能够有效抑制肿瘤的增殖与生长，在治疗化学药物耐药细胞具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为LLY-283对测试细胞MDA-MB-43的生长增殖影响；
图2为LLY-283对测试细胞HS-578T的生长增殖影响；
图3为LLY-283对测试细胞MDA-MB-231的生长增殖影响；
图4为GSK-591对测试细胞MDA-MB-436的生长增殖影响；
图5为GSK-591对测试细胞HS-578T的生长增殖影响；
图6为GSK-591对测试细胞MDA-MB-231的生长增殖影响；
图7为GSK591抑制剂、UNC0642抑制剂对耐药细胞株的生长情况影响；
图8为LLY-283抑制剂、GSK591抑制剂、LLY-283与GSK-591复配物对耐药细胞株的生长情况影响；
图9为LLY-283抑制剂、23-羟基白桦酸、LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物对耐药细胞株的生长情况影响；
图10为注射生理盐水、LLY-283后小鼠体内肿瘤增殖的体积大小；
图11为注射生理盐水、LLY-283后鼠体内肿瘤的体积随着时间增加的变化情况。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置5次重复实验，结果取平均值。
需要说明的是，本发明的PRMT5抑制剂选自LLY-283、GSK-591、GSK3326595，EPZ015938、JNJ-64619178、MRTX719、EPZ05666、SH3765、PF-06939999，式I是正在开展I临床试验用于评价治疗实体瘤及非霍奇金淋巴瘤（NCT02783300）的安全性及疗效的的PRMT5抑制剂Pemranmetostat(GSK3326595)中的至少一种。
。
需要说明的是，本发明实体瘤包括良性实体瘤和恶性实体瘤；良性实体瘤包括但不限于：错构瘤、平滑肌瘤、血管瘤、淋巴管瘤，还有各种腺瘤和腺瘤性息肉，如脂肪瘤、子宫肌瘤、乳腺纤维瘤等；恶性实体瘤包括但不限于：霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌，还有头颈部恶性肿瘤、泌尿系统恶性肿瘤、子宫内膜癌、子宫颈癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、甲状腺癌、肝母细胞瘤、肾母细胞瘤。
需要说明的是，本发明实施方式中所述的给药途径选自经口给药、胃肠外给药、经皮给药，所述胃肠外给药包括但不限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射。
需要说明的是，PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤耐药的药物中的用途，其中PRMT5抑制剂的给药频次可以是一日一次、一日二次、一日三次、一周一次、二周一次、三周一次或一月一次。
以下结合一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
本发明下列实施例以三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞及动物模型实验为例。
实施例1：PRMT5抑制剂LLY-283克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283；
LLY-283配制方法：DMSO分别溶解PRMT5抑制剂LLY-283，最终浓度为10uM；设置成待测的10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM，共计8个浓度梯度；
2. 化学药物治疗耐药细胞株构建
测试所用乳腺癌细胞：MDA-MB-436、HS-578T、MDA-MB-231采购于ATCC细胞库；
所用培养基：高糖DMEM培养基（10%胎牛血清）；
所用药物：紫杉醇；
细胞培养：分别将测试细胞MDA-MB-436、HS-578T、MDA-MB-231置于培养基中在37℃，5%CO2条件下培养，得到处于正常生长状态的亲本细胞，贴壁状态；将紫杉醇溶解于DMSO中配制紫杉醇溶液，在培养基中加入紫杉醇，从5nM的浓度开始，药物处理24h后，更换培养基，PBS清洗漂浮的死细胞，继续加入含有紫杉醇5nM的细胞培养基，直至细胞生长正常并且能够稳定传代；当此浓度下细胞稳定后，进入下一个浓度（10nM）梯度诱导，直至最终维持浓度为20nM，此浓度下，细胞可稳定传代增殖。与亲本株对照，对于紫杉醇半抑制浓度IC50超过3-5倍，即可认定学药物治疗耐药三阴性乳腺癌细胞株构建成功。
3. 实验步骤
IncuCyte活细胞分析系统或CCK8检测实验，验证相较于三阴性乳腺癌亲本株，化学药物治疗耐药株细胞对于PRMT5抑制剂更为敏感；具体步骤如下：
将适量的细胞接种到384孔板或96孔板中；细胞粘附到平板上后，加入LLY-283抑制剂并处理5天；Incucyte活细胞分析系统：将细胞置于培养箱中，根据仪器说明，使用具有10X物镜的活细胞分析系统（Sartorius，Incucyte S3）分析细胞增殖；MTT方法：向每个孔中加入细胞活力测定试剂CCK8（Biosharp，BS350B）以达到10%的最终浓度。轻轻摇动平板并在37℃下避光孵育1小时后，在多模微板读取器（TECAN，Spark）中测量值。
实施例2：PRMT5抑制剂GSK-591克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：GSK-591；
GSK-591配制方法：DMSO分别溶解PRMT5抑制剂GSK-591，最终浓度为10μM；设置成待测的10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM，共计8个浓度梯度；
2. 化学药物治疗耐药细胞株构建
测试所用乳腺癌细胞：MDA-MB-436、HS-578T、MDA-MB-231；
所用培养基：高糖DMEM培养基（10%胎牛血清）；
细胞培养：分别将测试细胞MDA-MB-436、HS-578T、MDA-MB-231置于培养基中在37℃，5%CO2条件下培养，得到处于正常生长状态的亲本细胞，贴壁状态；将紫杉醇溶解于DMSO中配制紫杉醇溶液，在培养基中加入紫杉醇，从5nM的浓度开始，药物处理24h后，更换培养基，PBS清洗漂浮的死细胞，继续加入含有紫杉醇5nM的细胞培养基，直至细胞生长正常并且能够稳定传代；当此浓度下细胞稳定后，进入下一个浓度（10nM）梯度诱导，直至最终维持浓度为20nM，此浓度下，细胞可稳定传代增殖。与亲本株对照，对于紫杉醇半抑制浓度IC50超过3-5倍，即可认定学药物治疗耐药三阴性乳腺癌细胞株构建成功。
3. 实验步骤
IncuCyte活细胞分析系统或CCK8检测实验，验证相较于三阴性乳腺癌亲本株，化学药物治疗耐药株细胞对于PRMT5抑制剂更为敏感；具体步骤如下：
将适量的细胞接种到384孔板或96孔板中；细胞粘附到平板上后，加入GSK-591抑制剂并处理5天；Incucyte活细胞分析系统：将细胞置于培养箱中，根据仪器说明，使用具有10X物镜的活细胞分析系统（Sartorius，Incucyte S3）分析细胞增殖；MTT方法：向每个孔中加入细胞活力测定试剂CCK8（Biosharp，BS350B）以达到10%的最终浓度。轻轻摇动平板并在37℃下避光孵育1小时后，在多模微板读取器（TECAN，Spark）中测量值。
实施例3：PRMT5抑制剂在化学药物治疗多药耐药三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：PRMT5抑制剂LLY-283；
药物溶液的配制：PRMT5抑制剂（LLY-283）溶解在DMSO中，现用现配；药物载体配制：0.4g HEC（1%）+0.1ml Tween80（0.25%）+0.02g Antifoam（0.05%）+PBS。PRMT5抑制剂最终给药量为60mg/kg。
2. 实验动物
裸鼠（Nudemouse），6-8周龄，雌性，饲养环境：SPF级；
饲养环境：控制温度为20~26℃；控制相对湿度为40%~70%；自动光照，每12h明暗交替。
3. 实验步骤
于中国科学院大学附属肿瘤医院乳腺外科获赠化学药物治疗多药耐药三阴性乳腺癌PDX模型：一位化学药物治疗多药耐药的三阴性乳腺癌患者，取肿瘤组织样本于裸鼠体内诱导形成。将增大至一定体积的裸鼠行安乐死，取出肿瘤组织，分割成大小均一的瘤块，经套管针接种于20只裸鼠右肋部皮下；待小鼠平均肿瘤体积可测量时，随机分成2组，每组10只。平行6次实验，分组后根据方案口服给予生理盐水（NC）、LLY-283。每两天1次测量肿瘤体积，称体重，记录数据。肿瘤体积（V）的计算公式如下：
V=0.52×a×b2
式中：a、b分别表示长、宽。
表1 实验分组及给药方案
组别 分组 剂量（mg/kg） 给药方案 给药方式
组1 对照组（生理盐水） -- QDx14 po
组2 LLY-283单药组 60 QDx14 po
注：QDx14：一天一次，给药14次；po：口服。
实施例4：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
本发明将PRMT5抑制剂LLY-283与GSK-591复配使用，其中LLY-283与GSK-591的重量比为1:1-2，两者按照特定比例进行复配使用，其进一步提高了PRMT5抑制剂对化学药物耐药的三阴性乳腺癌耐药细胞系的治疗效果。
1. 受试药物
药物名称：LLY-283与GSK-591复配物；其中LLY-283与GSK-591的重量比为1:1，记为S1；
LLY-283与GSK-591复配物的配制方法：DMSO分别溶解PRMT5抑制剂复配物，最终浓度为10μM；设置成待测的10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM，共计8个浓度梯度；
2. 化学药物治疗耐药细胞株构建
测试所用乳腺癌细胞：MDA-MB-436；
所用培养基：高糖DMEM培养基（10%胎牛血清）；
细胞培养：将测试细胞MDA-MB-436置于培养基中在37℃，5%CO2条件下培养，得到处于正常生长状态的亲本细胞，贴壁状态；将紫杉醇溶解于DMSO中配制紫杉醇溶液，在培养基中加入紫杉醇，从5nM的浓度开始，药物处理24h后，更换培养基，PBS清洗漂浮的死细胞，继续加入含有紫杉醇5nM的细胞培养基，直至细胞生长正常并且能够稳定传代；当此浓度下细胞稳定后，进入下一个浓度（10nM）梯度诱导，直至最终维持浓度为20nM，此浓度下，细胞可稳定传代增殖。与亲本株对照，对于紫杉醇半抑制浓度IC50超过3-5倍，即可认定学药物治疗耐药三阴性乳腺癌细胞株构建成功。
3. 实验步骤
IncuCyte活细胞分析系统或CCK8检测实验，验证相较于三阴性乳腺癌亲本株，化学药物治疗耐药株细胞对于LLY-283与GSK-591复配物更为敏感；具体步骤如下：
将适量的细胞接种到384孔板或96孔板中；细胞粘附到平板上后，加入LLY-283与GSK-591复配物抑制剂并处理5天；Incucyte活细胞分析系统：将细胞置于培养箱中，根据仪器说明，使用具有10X物镜的活细胞分析系统（Sartorius，Incucyte S3）分析细胞增殖；MTT方法：向每个孔中加入细胞活力测定试剂CCK8（Biosharp，BS350B）以达到10%的最终浓度。轻轻摇动平板并在37℃下避光孵育1小时后，在多模微板读取器（TECAN，Spark）中测量值。
实施例5：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283与GSK-591复配物；其中LLY-283与GSK-591的重量比为1:2，记为S2；
其他步骤均与实施例4相同。
实施例6：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283与GSK-591复配物；其中LLY-283与GSK-591的重量比为1:0.5，记为S3；
其他步骤均与实施例4相同。
实施例7：
药物名称：LLY-283与GSK-591复配物；其中LLY-283与GSK-591的重量比为1:2.5，记为S4；
其他步骤均与实施例4相同。
实施例8：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
本发明的优选技术方案中还包括：将PRMT5抑制剂LLY-283与23-羟基白桦酸联合使用，以治疗耐化学药物治疗的三阴性乳腺癌耐药细胞株，其中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:0.5-1.5；将LLY-283联合23-羟基白桦酸对耐化学药物治疗的三阴性乳腺癌耐药细胞株进行治疗，进一步提高了其治疗效果。
1. 受试药物
药物名称：LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物；其中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:0.5，记为Y1；
LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物的配制方法：DMSO分别溶解LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物，最终浓度为10μM；设置成待测的10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM，共计8个浓度梯度；
2. 化学药物治疗耐药细胞株构建
测试所用乳腺癌细胞：MDA-MB-231；
所用培养基：高糖DMEM培养基（10%胎牛血清）；
细胞培养：将测试细胞MDA-MB-436置于培养基中在37℃，5%CO2条件下培养，得到处于正常生长状态的亲本细胞，贴壁状态；将阿霉素溶解于DMSO中配制阿霉素溶液，在培养基中加入阿霉素，从5nM的浓度开始，药物处理24h后，更换培养基，PBS清洗漂浮的死细胞，继续加入含有阿霉素5nM的细胞培养基，直至细胞生长正常并且能够稳定传代；当此浓度下细胞稳定后，进入下一个浓度（10nM）梯度诱导，直至最终维持浓度为20nM，此浓度下，细胞可稳定传代增殖。与亲本株对照，对于阿霉素半抑制浓度IC50超过3-5倍，即可认定学药物治疗耐药三阴性乳腺癌细胞株构建成功。
3. 实验步骤
IncuCyte活细胞分析系统或CCK8检测实验，验证相较于三阴性乳腺癌亲本株，化学药物治疗耐药株细胞对于LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物更为敏感；具体步骤如下：
将适量的细胞接种到384孔板或96孔板中；细胞粘附到平板上后，加入LLY-283与GSK-591复配物抑制剂并处理5天；Incucyte活细胞分析系统：将细胞置于培养箱中，根据仪器说明，使用具有10X物镜的活细胞分析系统（Sartorius，Incucyte S3）分析细胞增殖；MTT方法：向每个孔中加入细胞活力测定试剂CCK8（Biosharp，BS350B）以达到10%的最终浓度。轻轻摇动平板并在37℃下避光孵育1小时后，在多模微板读取器（TECAN，Spark）中测量值。
实施例9：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物；其中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:1，记为Y2；
其他步骤均与实施例8相同。
实施例10：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物；其中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:1.5，记为Y3；
其他步骤均与实施例8相同。
实施例11：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物；其中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:0.25，记为Y4；
其他步骤均与实施例8相同。
实施例12：PRMT5抑制剂克服三阴性乳腺癌化学药物治疗耐药细胞系的体外药效作用研究
1. 受试药物
药物名称：LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物；其中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:2，记为Y5；
其他步骤均与实施例8相同。
对比例1：
1. 受试药物
药物名称：G9a抑制剂UNC0642；
UNC0642配制方法：DMSO分别溶解G9a抑制剂UNC0642，最终浓度为10μM；设置成待测的10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM，共计8个浓度梯度；
2. 化学药物治疗耐药细胞株构建
测试所用乳腺癌细胞：MDA-MB-436；
所用培养基：高糖DMEM培养基（10%胎牛血清）；
细胞培养：将测试细胞MDA-MB-436置于培养基中在37℃，5%CO2条件下培养，得到处于正常生长状态的亲本细胞，贴壁状态；将紫杉醇溶解于DMSO中配制紫杉醇溶液，在培养基中加入紫杉醇，从5nM的浓度开始，药物处理24h后，更换培养基，PBS清洗漂浮的死细胞，继续加入含有紫杉醇5nM的细胞培养基，直至细胞生长正常并且能够稳定传代；当此浓度下细胞稳定后，进入下一个浓度（10nM）梯度诱导，直至最终维持浓度为20nM，此浓度下，细胞可稳定传代增殖。与亲本株对照，对于紫杉醇半抑制浓度IC50超过3-5倍，即可认定学药物治疗耐药三阴性乳腺癌细胞株构建成功。
3. 实验步骤
将适量的细胞接种到384孔板或96孔板中；细胞粘附到平板上后，加入G9a抑制剂UNC0642并处理5天；Incucyte活细胞分析系统：将细胞置于培养箱中，根据仪器说明，使用具有10X物镜的活细胞分析系统（Sartorius，Incucyte S3）分析细胞增殖；MTT方法：向每个孔中加入细胞活力测定试剂CCK8（Biosharp，BS350B）以达到10%的最终浓度。轻轻摇动平板并在37℃下避光孵育1小时后，在多模微板读取器（TECAN，Spark）中测量值。
【性能测试】
1. PRMT5抑制剂对耐药三阴性乳腺癌细胞株的治疗效果
其中PAR代表亲本细胞株；20A、20B、20C分别为构建成功的耐药细胞株，不同的克隆株。
（1）LLY-283测试结果，
图1、图2、图3分别为LLY-283对测试细胞MDA-MB-436、HS-578T、MDA-MB-231的生长增殖影响；由图1可以看出，随着LLY-283浓度的增加，相对于亲本细胞株，耐药MDA-MB-436细胞株的生长增殖情况明显降低，增殖速率较为缓慢，说明PRMT5抑制剂LLY-283对耐药MDA-MB-436细胞株具有较好的治疗效果；同样地，由图2、图3可以看出，相对于亲本细胞株，RMT5抑制剂LLY-283对耐药HS-578细胞株、耐药MDA-MB-231细胞株的生长增殖均具有较好的抑制作用，即RMT5抑制剂LLY-283治疗耐药HS-578细胞株、耐药MDA-MB-231细胞株具有优良的敏感性。
（2）GSK-591测试结果
图4、图5、图6分别为GSK-591对测试细胞MDA-MB-436、HS-578T、MDA-MB-231的生长增殖影响；由图4可以看出，随着GSK-591浓度的增加，相对于亲本细胞株，耐药MDA-MB-436细胞株的生长增殖情况明显降低，增殖速率较为缓慢，说明PRMT5抑制剂LLY-283对耐药MDA-MB-436细胞株具有较好的治疗效果；同样地，由图5、图6可以看出，相对于亲本细胞株，PRMT5抑制剂LLY-283治疗耐药HS-578细胞株、耐药MDA-MB-231细胞株具有较好的敏感性。
图7为GSK591抑制剂、UNC0642抑制剂对耐药细胞株的生长情况影响；由图7可以看出，与GSK591相比较，G9a抑制剂UNC0642（对比例1）对于耐药MDA-MB-231细胞没有杀伤性，再次验证了PRMT5抑制剂LLY-283、GSK-591对本发明中构建的耐药三阴性乳腺癌细胞具有较好的治疗作用。
（3）LLY-283与GSK-591复配物测试结果
图8为LLY-283抑制剂、GSK591抑制剂、LLY-283与GSK-591复配物对耐药细胞株的生长情况影响；由图8可以看出，与单独使用LLY-283抑制剂、GSK591相比较，使用LLY-283与GSK-591复配物对本发明中构建的耐药三阴性乳腺癌细胞具有较好的治疗作用，且当LLY-283与GSK-591复配物中LLY-283与GSK-591的重量比为1:1-2时，对耐药三阴性乳腺癌细胞具有更为优良的治疗效果。
（4）LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物测试结果
图9为LLY-283抑制剂、23-羟基白桦酸、LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物对耐药细胞株的生长情况影响；由图9可以看出，与单独使用LLY-283抑制剂、23-羟基白桦酸相比较，使用LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物对本发明中构建的耐药三阴性乳腺癌细胞具有更好的治疗作用，且当LLY-283联合23-羟基白桦酸复合物中LLY-283与23-羟基白桦酸的重量比为1:0.5-1.5时，对耐药三阴性乳腺癌细胞具有更为优良的治疗效果。
2. 耐药三阴性乳腺癌PDX模型中的体内药效作用
图10为注射生理盐水、LLY-283后小鼠体内肿瘤增殖的体积大小；由图8可以看出，注射LLY-283后小鼠的肿瘤体积明显低于对照组（NC）；这说明了PRMT5抑制剂LLY-283能够有效抑制三阴性乳腺癌化学药物耐药PDX模型中的肿瘤增殖。
图11为注射生理盐水、LLY-283后鼠体内肿瘤的体积随着时间增加的变化情况；由图9可以看出，随着时间的增加，注射LLY-283的小鼠体内肿瘤体积增殖速率明显低于注射生理盐水的小鼠，进一步说明了PRMT5抑制剂LLY-283能够有效抑制三阴性乳腺癌化学药物耐药PDX模型中的肿瘤增殖。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.PRMT5抑制剂在制备预防或治疗实体肿瘤耐药的药物中的用途，所述PRMT5抑制剂选自LLY-283、GSK-591；所述预防或治疗实体肿瘤耐药是乳腺癌对紫杉醇产生的耐药；所述实体肿瘤为三阴性乳腺癌。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述PRMT5抑制剂的剂量选自：体内为5-150mg、体外为0.5-15μM。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述PRMT5抑制剂的剂量选自：体内为10-100mg、体外为1-10μM。
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