[go: up one dir, main page]

CN110423718A - 利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用 - Google Patents

利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110423718A
CN110423718A CN201910744567.2A CN201910744567A CN110423718A CN 110423718 A CN110423718 A CN 110423718A CN 201910744567 A CN201910744567 A CN 201910744567A CN 110423718 A CN110423718 A CN 110423718A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trichoderma
medium
chlamydospore
chlamydospores
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910744567.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110423718B (zh
Inventor
孙佳楠
陈捷
贺安乐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiao Tong University
Original Assignee
Shanghai Jiao Tong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiao Tong University filed Critical Shanghai Jiao Tong University
Priority to CN201910744567.2A priority Critical patent/CN110423718B/zh
Publication of CN110423718A publication Critical patent/CN110423718A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110423718B publication Critical patent/CN110423718B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用；所述方法包括以下步骤：S1木霉菌种活化；S2木霉菌孢子悬液制备；S3芽孢杆菌发酵液的制备；S4生产木霉菌厚垣孢子。本发明主要利用了芽孢杆菌发酵液5‑20mL/L，使用了改良MS培养基4‑5g/L，蔗糖10‑20g/L，牛肉膏2.5‑5g/L，蛋白胨1‑5g/L。本发明的培养基营养丰富全面、厚垣孢子产量丰富，孢子萌发率高、获得的组培苗健壮、生根效果好、移栽成活率高的优点，具有良好的市场前景。

Description

利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其是农业生物技术领域。具体而言，本申请涉及利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用。
背景技术
木霉菌用于防治植物病害的历史已有70多年，其生防效果已得到公认，是全世界应用较为广泛的生防菌。木霉菌属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，是一类普遍存在于土壤中的真菌，是土壤微生物的重要群落，其可寄生于植物残体及动物粪便上，从植物根围、叶片及种子、球茎表面也经常可以分离到。木霉菌能够寄生于多种土传植物病原菌上。八十年代以来，随着分子生物学的快速发展，木霉菌的研究主要集中在如何提高其生物防效方面，如通过加强几丁质酶、葡聚糖酶基因的表达、种间融合等手段。
木霉菌PDA培养基固体发酵培养后，菌落开始为棉絮状或致密丛束状，颜色为白色至灰白色，无固定形状。当分生孢子成熟后，菌落自中央到边缘，渐渐变为不同程度的绿色，极少数为白色粉状。分生孢子梗从菌丝的侧枝生出，直立分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团。分生孢子球形，浅色或无色。
大部分木霉菌对营养的需求并不严格，它们可在各种碳源和氮源下生长，同时可转化和降解一些有害或持久有害的环境污染物；可直接利用各种单糖、单糖的衍生物、有机酸类；有显著的降解各种多糖(纤维素、半纤维素)和相关的多聚糖(几丁质)；还可转化和降解一些农药，如:马拉硫磷、茅草枯、五氯硝基苯等。木霉菌可利用复杂和简单的含氮化合物，水解酪蛋白氨基酸混合液、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸均能很好利用，在高氮条件下有利于木霉菌产生一些酶，如纤维素酶、乳糖酶等。
木霉菌是需氧菌，适合的氧压有利于菌丝的生长和孢子产生；最佳pH为4.0-6.5；生长温度因种而不同，大多数在25℃左右生长十分迅速，并自我调节环境的pH，使环境适应其生长条件。木霉菌的拮抗作用范围具有广谱性，相关研究显示，木霉菌至少对18个属29种病原真菌有拮抗作用。木霉菌能寄生的植物病原菌即拮抗对象包括丝核菌属(Rhizotonia)、小核菌(Sclerotium)、核盘菌属(Sclerotinia)、长蠕抱属(Helminthosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、毛盘孢属(Colletotrichum)、轮枝孢属(Verticillium)、黑星菌属(Venturia)、内座壳属(Endothia),腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、间座壳属(Diaporthe)和黑星孢属(Fusicladium)等等。
目前，许多研究者就对木霉菌的产孢条件进行了大量的探索，以期高效地将该类木霉菌应用于生产实践中。从木霉菌分生孢子的产生条件来看，其在多种固体或液体培养基中都能够产生分生孢子，而且城市垃圾、腐败的咖啡果皮、禽类的粪便以及混以牛粪的咖啡果皮、香蕉叶、甘蔗渣和麦麸等廉价物质均可作为木霉菌的固体培养基来生产分生孢子，且孢子产量都可达109cfu/g左右。由此来看，木霉菌产生分生孢子的生产条件相对要求较低。
近年来，国内外研究发现T.harzianum,T.viride等木霉菌种在糖蜜-玉米浆等液体培养基中进行深层发酵15d左右可产生107的厚垣孢子；在麦麸等、灭菌土壤、土壤浸出液及植物碎片等固体培养基中培养20d左右也可产生厚垣孢子达106。总体来看，目前报道的，各种木霉菌厚垣孢子的发酵时间均较长(>15d)，且成本较高，发酵的产率较低，并且发酵后生成的部分厚垣孢子的活性或作用能力可能会降低或丧失。
芽孢杆菌(Bacillus)是一种嗜温性的好氧产芽孢的杆状细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际、体表等外界环境中广泛存在，同时还是植物体内常见的植物内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌己经在水稻、辣椒、棉花、小麦、黄瓜、大豆、玉米等农作物上显现出很好的病害防治效果。芽孢杆菌最突出的特征是生长快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于其发酵液的制备，不仅生产周期短，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长。另外，芽孢杆菌产生的具有生防活性的抗菌物质，包括脂肤类、肤类、蛋白类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，它们对真菌、细菌、病毒等具有抑制作用。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的木霉菌厚垣孢子的发酵时间均较长(>15d)，且成本较高，发酵的产率较低，并且发酵后生成的部分厚垣孢子的活性或作用能力可能会降低或丧失等问题，提供一种利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用。该方法生产的木霉菌厚垣孢子能够用于农作物真菌性病害的防治，也可作为微生物肥料，具有改善植物生长状况的作用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种生产木霉菌厚垣孢子的方法，包括以下步骤：
S1、菌种活化：将木霉菌种接种在PDA固体培养基中，倒置培养；将解淀粉芽孢杆菌接种于LB固体培养基上，倒置培养；
S2、木霉菌孢子悬液制备：将S1培养得到的木霉菌分生孢子配制为3-4×107cfu/mL的木霉菌孢子悬液；
S3、解淀粉芽孢杆菌发酵液A1的制备：将S1培养的芽孢杆菌挑取单菌落接种于LB液体培养基中，摇瓶培养，将发酵液离心并收集上清，灭菌处理后的上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用；
S4、木霉菌厚垣孢子生产：分别取1-5mL所述木霉菌孢子悬液和5-20mL所述A1发酵液，同时加入到B1培养基中，环境温度为25-32℃，摇床速度控制在150-200r/min，光照培养6-8d，形成厚垣孢子。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中的木霉菌种为棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)GDSF1009。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ACCC11060。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中的木霉菌的倒置培养温度为25-32℃，倒置培养时长为2-4d。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中的解淀粉芽孢杆菌的倒置培养温度为30-40℃，倒置培养时长为12-24h。
作为本发明的一个实施方案，所述PDA固体培养基是通过如下方法制备而得的：将160-220g马铃薯去皮切成小块，蒸煮后纱布过滤，加18-22g葡萄糖，15-25g琼脂粉，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
作为本发明的一个实施方案，所述LB固体培养基是通过如下方法制备而得的：将蛋白胨8-10g/L，酵母粉3-5g/L,氯化钠5-10g/L,控制pH 6.5-7.5，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
作为本发明的一个实施方案，所述LB液体培养基包含蛋白胨5-10g/L，牛肉粉3-5g/L,氯化钠5-10g/L,控制pH 6.5-7.5；摇瓶培温度为30-40℃。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，所述灭菌处理的方法为：将发酵液离心，收集上清并通过无菌的0.22μm的PTFE微孔滤膜，该上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，摇瓶培养12-48h，控制pH 6.5-8.5，培养温度30-40℃。
作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，每1升的B1培养基配方包括以下组成：改良MS培养基4-5g/L，蔗糖10-20g/L，牛肉膏2.5-5g/L，蛋白胨1-5g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
作为本发明的一个实施方案，每1升所述改良MS培养基包括如下组成：MgSO4·7H2O180-200mg/L，CaCl2·H2O 180-220mg/L，KNO3 300-700mg/L,(NH)4NO3500-600mg/L，KH2PO4180-220mg/L，余量为水。
本发明还涉及一种前述生产木霉菌厚垣孢子的方法形成的厚垣孢子在制备用以促进植物生长的生防制剂中的用途。
作为本发明的一个实施方案，所述生防制剂采用土壤灌根方式进行施用。
作为本发明的一个实施方案，所述生防制剂用于防治植物病害。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)基于常规培养基的改良后，本发明的培养基组成，修改了MS的配方，添加了牛肉膏和蛋白胨，在菌丝生长中期补料了抗菌肽含量丰富的芽孢杆菌发酵液，达到了既缩短了木霉菌产厚垣孢子的周期，增加了木霉菌厚垣孢子产量；
2)木霉菌孢子和残留的芽孢杆菌的抗菌肽，对植物抵御病害的抗性也有所提高；
3)本发明中，控制好芽孢杆菌的使用剂量，就能使木霉菌厚垣孢子的产量和质量达到最佳，同时保留其大部分抗菌物质的活性；因此，研究利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子方法，对研制以木霉菌厚垣孢子为主体的生防制剂具有重要意义。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述，所述实例是本发明的优选生产厚垣孢子的案例，仅用于说明本发明而非限制本发明的范围，对本领域技术人员来说，基于本发明的技术方案，在没有创造性的前提下获得的其他技术方案都落入本发明的保护范围。实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。见表1。
实施例1
本实施例涉及一种利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、菌种活化：将棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009菌种接种在放置了PDA固体培养基的PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养3d；将解淀粉芽孢杆菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养1d。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切成小块，蒸煮后纱布过滤，加20g葡萄糖，PDA中额外添加15g琼脂粉，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min；
LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,控制pH 7.5，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
S2、木霉菌孢子悬液制备：木霉菌在PDA固体培养基中培养生成木霉菌分生孢子，称取250mL去离子水在121℃下灭菌30min，然后使用灭菌后的去离子冲洗培养好的PDA培养皿，收集孢子，在显微镜下检测孢子并配制为3.5×107cfu/mL的孢子悬液。
S3、解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：将S1培养得到解淀粉芽孢杆菌挑取单菌落接种于LB液体培养基中，摇瓶培养18h，控制pH 7.0，培养温度37℃，完成培养后将发酵液以6000r/min离心，收集上清并使其通过无菌的0.22μm的PTFE微孔滤膜，该上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用。
上述LB液体培养基包含：蛋白胨8g/L，牛肉粉3g/L,氯化钠5g/L,控制pH 7.0。
S4、木霉菌厚垣孢子生产：向B1培养基中分别加入3mL S2中的孢子悬液和10mL/LA1发酵液，环境温度为28℃，摇床速度控制在180r/min，光照培养7d，形成厚垣孢子，用于生物防治制剂。
上述B1培养基，每1升该培养基由以下成分及其浓度的组分组成：
改良MS培养基5g/L，蔗糖20g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨3g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
其中，每1升改良MS培养基包括如下组成：
MgSO4·7H2O 200mg/L，CaCl2·H2O 180mg/L，KNO3 600mg/L，(NH)4NO3 550mg/L，KH2PO4 200mg/L，余量为水。
对比例1
本对比例涉及一种生产木霉菌厚垣孢子的方法，基本同实施例1，所述方法包括如下步骤：
S1、菌种活化：将棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009菌种接种在放置了PDA固体培养基的PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养3d。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切成小块，蒸煮后纱布过滤，加20g葡萄糖PDA中额外添加15g琼脂粉，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
S2、木霉菌孢子悬液制备：木霉菌在PDA固体培养基中培养生成木霉菌分生孢子，称取250mL去离子水在121℃下灭菌30min，然后使用移液枪反复冲洗培养好的PDA培养皿，在显微镜下检测孢子含量，配制为3.5×107cfu/mL的孢子悬液。
S3、木霉菌厚垣孢子生产：向B1培养基中加入3mL S2中的孢子悬液，环境温度为28℃，摇床速度控制在180r/min，光照培养7d，形成厚垣孢子。
上述B1培养基，每1升该培养基由以下成分及其浓度的组分组成：
改良MS培养基5g/L，蔗糖20g/L，牛肉膏5g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
其中，每1升改良MS培养基包括如下组成：
MgSO4·7H2O 200mg/L，CaCl2·H2O 180mg/L，KNO3 600mg/L，(NH)4NO3 550mg/L，KH2PO4 200mg/L，余量为水。
对比例2
本对比例涉及一种生产木霉菌厚垣孢子的方法，基本同实施例1，所述方法包括如下步骤：
S1、菌种活化：将棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009菌种接种在放置了PDA固体培养基的PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养3d。
(Trichoderma asperellum)GDSF1009接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养1d。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切成小块，蒸煮后纱布过滤，加20g葡萄糖PDA中额外添加15g琼脂粉，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30mi。
S2、木霉菌孢子悬液制备：木霉菌在PDA固体培养基中培养生成木霉菌分生孢子，称取250mL去离子水在121℃下灭菌30min，然后使用移液枪反复冲洗培养好的PDA培养皿，在显微镜下检测孢子含量，配制为3.5×107cfu/mL的孢子悬液。
S3、木霉菌厚垣孢子生产：向B1培养基中加入3mL S2中的孢子悬液，环境温度为28℃，摇床速度控制在180r/min，光照培养7d，形成厚垣孢子。
上述B1培养基，每1升该培养基由以下成分及其浓度的组分组成：
改良MS培养基5g/L，蔗糖20g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨3g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
其中，每1升改良MS培养基包括如下组成：
MgSO4·7H2O 200mg/L，CaCl2·H2O 180mg/L，KNO3 600mg/L，(NH)4NO3 550mg/L，KH2PO4 200mg/L，余量为水。
对比例3
本对比例涉及一种利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法，基本同实施例1，所不同之处仅在于：
所述B1培养基中选用的是MS培养基，而非改良MS培养基；即，每1升该培养基由以下成分及其浓度的组分组成：MS培养基5g/L，蔗糖20g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨3g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
其中，每1升MS培养基包括如下组成：
MgSO4·7H2O 370mg/L，CaCl2·H2O 4400mg/L，KNO3 1900mg/L，(NH)4NO31650mg/L，KH2PO4 170mg/L，余量为水。
实施例2
本实施例涉及一种利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、菌种活化：将棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009菌种接种在放置了PDA固体培养基的PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养3d；将解淀粉芽孢杆菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养18h。
(Trichoderma asperellum)GDSF1009接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养1d。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切成小块，蒸煮后纱布过滤，加20g葡萄糖PDA中额外添加15g琼脂粉，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,控制pH 7.5，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
S2、木霉菌孢子悬液制备：木霉菌在PDA固体培养基中培养生成木霉菌分生孢子，称取250mL去离子水在121℃下灭菌30min，然后使用移液枪反复冲洗培养好的PDA培养皿，在显微镜下检测孢子含量，配制为3.5×107cfu/mL的孢子悬液。
S3、解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：将S1培养得到解淀粉芽孢杆菌挑取单菌落接种于LB液体培养基中，摇瓶培养18小时，控制pH 7.5，培养温度37℃，完成培养后将发酵液以6000r/min离心，收集上清并使其通过无菌的0.22μm的PTFE微孔滤膜，该上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用。
上述LB液体培养基包含：蛋白胨8g/L，牛肉粉3g/L,氯化钠5g/L,控制pH 7.5。
S4、木霉菌厚垣孢子生产：向B1培养基中分别加入3mL S2中的孢子悬液含和5ml/LA1解淀粉芽孢杆菌发酵液，环境温度为28℃，摇床速度控制在180r/min，光照培养7d，形成厚垣孢子，用于生物防治制剂。
上述B1培养基，每1升该培养基由以下成分及其浓度的组分组成：
改良MS培养基4g/L，蔗糖10g/L，牛肉膏2.5g/L，蛋白胨1g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
其中，每1升改良MS培养基包括如下组成：
MgSO4·7H2O 180mg/L，CaCl2·H2O 180mg/L，KNO3 300mg/L，(NH)4NO3 500mg/L，KH2PO4 170mg/L。
实施例3
本实施例涉及一种利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、菌种活化：将棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009菌种接种在放置了PDA固体培养基的PDA培养皿中，28℃培养箱中倒置培养3d；将解淀粉芽孢杆菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养1d。
(Trichoderma asperellum)GDSF1009接种于LB固体培养基上，37℃倒置培养1d。
PDA固体培养基：将200g马铃薯去皮切成小块，蒸煮后纱布过滤，加20g葡萄糖PDA中额外添加15g琼脂粉，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,控制pH 7.5，使用去离子水定容1L，在121℃下灭菌30min。
S2、木霉菌孢子悬液制备：木霉菌在PDA固体培养基中培养生成木霉菌分生孢子，称取250mL去离子水在121℃下灭菌30min，然后使用移液枪反复冲洗培养好的PDA培养皿，在显微镜下检测孢子含量，配制为3.5×107cfu/mL的孢子悬液。
S3、解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：将S1培养得到解淀粉芽孢杆菌挑取单菌落接种于LB液体培养基中，摇瓶培养18h，控制pH 7.0，培养温度37℃，完成培养后将发酵液以6000r/min离心，收集上清并使其通过无菌的0.22μm的PTFE微孔滤膜，该上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用。
上述LB液体培养基包含：蛋白胨8g/L，牛肉粉3g/L,氯化钠5g/L,控制pH 7.5。
S4、木霉菌厚垣孢子生产：向B1培养基中分别加入3mL S2中的孢子悬液含和20mL/L A1解淀粉芽孢杆菌发酵液，环境温度为28℃，摇床速度控制在180r/min，光照培养7d，形成厚垣孢子，用于生物防治制剂。
上述B1培养基，每1升该培养基由以下成分及其浓度的组分组成：
改良MS培养基5g/L，蔗糖20g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
其中，每1升改良MS培养基包括如下组成：
MgSO4·7H2O 200mg/L，CaCl2·H2O 220mg/L，KNO3 700mg/L，(NH)4NO3 600mg/L，KH2PO4 200mg/L。
上述实施例1-3和对比例1-3分别对应的木霉菌厚垣孢子产量如表1所示：
表1不同配方下，木霉菌厚垣孢子产量对比(cfu/mL)
将实施例1-3和对比例1-3得到的微生物制剂，以厚垣孢子的量计算，施用量为4×105个厚垣孢子/平方米，将不添加任何制剂作为对照处理(表2中的对照组)。分别以实施例1-3和对比例1-3的制剂对三叶期的黄瓜进行灌根处理，观察黄瓜白粉病的发病率。结果如表2所示。对比了微生物制剂实施例1-3和对比例1-3，以及常规无处理对黄瓜白粉病的防治效果，其中实施例1的相对防效最高。
表2微生物制剂对黄瓜白粉病的防治
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一种生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种活化：将木霉菌种接种在PDA固体培养基中，倒置培养；将解淀粉芽孢杆菌接种于LB固体培养基上，倒置培养；
S2、木霉菌孢子悬液制备：将S1培养得到的木霉菌分生孢子配制为3-4×107cfu/mL的木霉菌孢子悬液；
S3、解淀粉芽孢杆菌发酵液A1的制备：将S1培养的芽孢杆菌挑取单菌落接种于LB液体培养基中，摇瓶培养，将发酵液离心并收集上清，灭菌处理后的上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用；
S4、木霉菌厚垣孢子生产：分别取1-5mL所述木霉菌孢子悬液和5-20mL所述A1发酵液，同时加入到B1培养基中，环境温度为25-32℃，摇床速度控制在150-200r/min，光照培养6-8d，形成厚垣孢子。
2.如权利要求1所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，步骤S1中的木霉菌种为棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)GDSF1009。
3.如权利要求1所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，步骤S1中的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)ACCC11060。
4.如权利要求1所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，步骤S3中，LB液体培养基包含蛋白胨5-10g/L，牛肉粉3-5g/L,氯化钠5-10g/L,控制pH6.5-7.5；摇瓶培温度为30-40℃。
5.如权利要求1所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，步骤S3中，所述灭菌处理的方法为：将发酵液离心，收集上清并通过无菌的0.22μm的PTFE微孔滤膜，该上清液作为A1发酵液存放于-20℃保存待用。
6.如权利要求1所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，步骤S4中，每1升的B1培养基配方包括以下组成：改良MS培养基4-5g/L，蔗糖10-20g/L，牛肉膏2.5-5g/L，蛋白胨1-5g/L，且pH由氢氧化钠标定至6±0.2。
7.如权利要求9所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法，其特征在于，每1升所述改良MS培养基包括如下组成：MgSO4·7H2O 180-200mg/L，CaCl2·H2O 180-220mg/L，KNO3 300-700mg/L,(NH)4NO3 500-600mg/L，KH2PO4 180-220mg/L，余量为水。
8.一种如权利要求1所述的生产木霉菌厚垣孢子的方法形成的厚垣孢子在制备用以促进植物生长的生防制剂中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述生防制剂采用土壤灌根方式进行施用。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述生防制剂用于防治植物病害。
CN201910744567.2A 2019-08-13 2019-08-13 利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用 Active CN110423718B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910744567.2A CN110423718B (zh) 2019-08-13 2019-08-13 利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910744567.2A CN110423718B (zh) 2019-08-13 2019-08-13 利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110423718A true CN110423718A (zh) 2019-11-08
CN110423718B CN110423718B (zh) 2021-10-15

Family

ID=68415940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910744567.2A Active CN110423718B (zh) 2019-08-13 2019-08-13 利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110423718B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110938562A (zh) * 2019-12-04 2020-03-31 上海交通大学 木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途
CN111004764A (zh) * 2019-12-30 2020-04-14 上海万力华生物科技有限公司 一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法
CN111088191A (zh) * 2020-01-08 2020-05-01 华东理工大学 一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用
CN111849857A (zh) * 2020-08-06 2020-10-30 福建傲农生物科技集团股份有限公司 促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589646A (zh) * 2012-08-13 2014-02-19 北京中农广袤农业科技有限公司 一种木霉菌株及其用途和厚垣孢子及其制备方法
CN103740634A (zh) * 2014-01-03 2014-04-23 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途
CN108359631A (zh) * 2018-05-25 2018-08-03 上海交通大学 一种木霉厚垣孢子的生产方法
CN108575994A (zh) * 2018-03-13 2018-09-28 上海交通大学 促生型木霉与芽孢杆菌复合可湿性粉剂的制备与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103589646A (zh) * 2012-08-13 2014-02-19 北京中农广袤农业科技有限公司 一种木霉菌株及其用途和厚垣孢子及其制备方法
CN103740634A (zh) * 2014-01-03 2014-04-23 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所 一种棘孢木霉菌厚垣孢子粉剂及其制备方法与它的用途
CN108575994A (zh) * 2018-03-13 2018-09-28 上海交通大学 促生型木霉与芽孢杆菌复合可湿性粉剂的制备与应用
CN108359631A (zh) * 2018-05-25 2018-08-03 上海交通大学 一种木霉厚垣孢子的生产方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIONG WU等: "Co-culture of Bacillus amyloliquefaciens ACCC11060 and Trichoderma asperellum GDFS1009 enhanced pathogen-inhibition and amino acid yield", 《MICROBIAL CELL FACTORIES》 *
彭珍荣等: "《现代微生物学进展》", 30 June 1995 *
王玉英等: "《植物组织培养技术手册》", 31 March 2006 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110938562A (zh) * 2019-12-04 2020-03-31 上海交通大学 木霉菌和芽孢杆菌共培养方法及其共代谢产物的用途
CN111004764A (zh) * 2019-12-30 2020-04-14 上海万力华生物科技有限公司 一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法
CN111088191A (zh) * 2020-01-08 2020-05-01 华东理工大学 一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用
CN111849857A (zh) * 2020-08-06 2020-10-30 福建傲农生物科技集团股份有限公司 促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用
CN111849857B (zh) * 2020-08-06 2022-02-08 福建傲农生物科技集团股份有限公司 促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110423718B (zh) 2021-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8476057B2 (en) Antagonistic bacteria for preventing and eliminating the bacterial wilt of continuous cropping tobacco and their microbial organic fertilizer
AU684809B2 (en) Use of (streptomyces) WYEC 108 to control plant pathogens
CN110423718A (zh) 利用芽孢杆菌发酵液生产木霉菌厚垣孢子的方法及应用
CN102027998B (zh) 芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用
CN107287130B (zh) 一种微白黄链霉菌菌株及其在农药中的应用
CN106591157B (zh) 一株防病促生的塔宾曲霉及其代谢产物的制备和应用
CN105950509A (zh) 一种生物菌剂及其制备方法和应用
CN110982765B (zh) 一株内生解淀粉芽孢杆菌jl-b05及其应用
CN107881129A (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其菌剂、菌剂制备方法与应用
CN110172429A (zh) 一种提高生防芽孢杆菌对植物病原真菌抑菌活性的培养基及培养方法
CN103667114A (zh) 一株防治猕猴桃溃疡病的菌株及其制备方法
CN106479943A (zh) 一株高效防治美国白蛾的爪哇棒束孢be01及其应用
CN105087399B (zh) 一种秸秆还田纤维分解性生防真菌及菌剂和应用
CN101886055A (zh) 用于防除连作烟草青枯病的拮抗菌njl-14
CN105695342B (zh) 康氏木霉菌tg-72及其在黄曲霉菌生物防治中的应用
CN108504581B (zh) 短密木霉的固体培养和液体发酵工艺
CN101695255B (zh) 用中华被毛孢培育冬虫夏草子座的方法
CN103992958B (zh) 一株水稻秸秆降解真菌拟康宁木霉zjc-1及其菌剂
CN107043711B (zh) 一株黄绿木霉t-321010菌株及其培养方法与应用
CN102242066B (zh) 一种顶孢霉菌株及顶孢霉菌可湿性粉剂
WO2022100701A1 (zh) 一种罗伯茨虫草的培养方法
CN101724572A (zh) 高产胞壁降解酶和抗菌肽的绿色木霉菌株及其生防试剂
CN1219051C (zh) 用稗草基质生产稗草生防菌孢子的方法
CN118165841B (zh) 一种莱氏绿僵菌Mrysms2308及其对粘虫生物防治的方法与应用
CN110438026A (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌gld-191及其菌剂、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant