CN111849857B - 促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用，涉及微生态制剂技术领域，所述方法为在发酵培养的过程中加入诱导液，所述诱导液为凝结芽孢杆菌孢子液。鉴于现有凝结芽孢杆菌生产过程中，往往存在活菌浓度与产孢率两者很难兼顾的问题，本申请创造性的在发酵培养的过程中加入凝结芽孢杆菌孢子液作为诱导液进行发酵培养，进而有效提高了凝结芽孢杆菌的产孢率，缩短芽孢形成时间，大幅度提高了生产效率，降低了生产成本。

Description

促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用

技术领域

本发明涉及微生态制剂技术领域，尤其是涉及一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法及其微生态制剂与应用。

背景技术

随着饲料全面禁抗时代的到来，饲料中不允许再使用抗生素，因此，养殖行业面临着前所未有的挑战。微生态制剂作为替抗产品之一，具有调节肠道健康，提高免疫力，提高饲料消化利用率，减少废弃物排放等作用。微生态制剂常用的菌种有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、嗜酸乳酸菌、植物乳杆菌、酿酒酵母等，其中乳酸菌类由于其抗逆性差、货架期短等因素一直未得到广泛的使用。

近年来，一类新的益生菌菌株进入我们的视野，那就是凝结芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌是一类不仅可以产乳酸，而且可以形成芽孢的菌株，其具有抗逆性强，能耐高温，便于饲料生产加工中添加与应用的特点。然而与常用的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌相比，凝结芽孢杆菌的高密度发酵扩培与芽孢生成技术都比较困难，使得凝结芽孢杆菌培养后发酵液活菌数与芽孢率都比较低，最终导致凝结芽孢杆菌活菌制剂价格居高不下，未能得到很好的推广与应用。

同时，现有饲料领域中使用的凝结芽孢杆菌，其扩培后需要进行高温喷雾干燥处理生成粉剂后使用，只有形成芽孢后的凝结芽孢杆菌对高温才有耐受性，所以发酵液的活菌浓度与产孢率都显得极其重要。事实上，在实际生产中都会通过提高发酵培养基的浓度获得高密度的菌液，但是，营养丰富的培养基往往不利于芽孢的形成，只有在营养缺乏的情况下更有利于芽孢形成。

因此，研究开发一种可以兼顾活菌数和芽孢率的凝结芽孢杆菌的培养方法，变得十分必要和迫切。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，该方法在发酵培养的过程中加入凝结芽孢杆菌孢子液作为诱导液进行发酵培养，能够有效提高凝结芽孢杆菌的产孢率，缩短芽孢形成时间，大幅度提高了生产效率，降低了生产成本。

本发明的第二目的在于提供一种凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌由上述促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法制备得到，所述制得的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％。

本发明的第三目的在于提供一种微生态制剂，该微生态制剂包含上述凝结芽孢杆菌。

本发明的第四目的在于提供一种上述凝结芽孢杆菌、上述微生态制剂在制备饲料产品中的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供的一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括：在发酵培养的过程中加入诱导液；

所述诱导液包括凝结芽孢杆菌孢子液。

进一步的，所述凝结芽孢杆菌孢子液中，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为90～95％。

进一步的，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株接种于种液培养基中进行种液培养，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％，随后灭活未形成芽孢的菌体，得到凝结芽孢杆菌种液；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

(C)、芽孢诱导：将诱导液加入扩培发酵液中，诱导培养，得到芽孢形成率为95～98％的凝结芽孢杆菌；

优选地，所述步骤(C)中还包括加入补料培养基的步骤。

进一步的，所述步骤(A)凝结芽孢杆菌菌株接种于种液培养基中的接菌量为1-2％；

优选地，所述种液培养基主要由蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、氯化钠和磷酸氢二钾制得；

优选地，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，葡萄糖2～4g，氯化钠5～10g和磷酸氢二钾2～3g；

更优选地，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨9g，酵母浸粉4g，葡萄糖3g，氯化钠8g和磷酸氢二钾2g；

优选地，所述种液培养为摇瓶培养，所述摇瓶培养的反应条件至少满足如下中的一个：摇瓶培养的温度为35～40℃、时间为60～68h，摇瓶培养的转速为150～250r/min，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％；

更优选地，所述种液培养为摇瓶培养，所述摇瓶培养的反应条件至少满足如下中的一个：摇瓶培养的温度为38℃、时间为65h，摇瓶培养的转速为200r/min，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％；

优选地，所述灭活包括水浴灭活，所述水浴灭活的温度为80～90℃，时间为30～35min；

更优选地，所述水浴灭活的温度为85℃，时间为30min。

进一步的，所述步骤(B)凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基的接菌量为0.5～1‰；

优选地，所述扩培培养基主要由蛋白胨、酵母浸粉、豆粕粉、玉米粉、麸皮、无水葡萄糖、浒苔粉、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、一水合硫酸锰、中性蛋白酶、中温淀粉酶和纤维素酶组成；

优选地，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3～5g、酵母浸粉2～4g、豆粕粉20～30g、玉米粉15～20g、麸皮20～25g、无水葡萄糖10～15g、浒苔粉5～8g、磷酸氢二钾2～3g、七水硫酸镁0.03～0.05g、一水合硫酸锰0.01～0.02g、中性蛋白酶0.3～0.5g、中温淀粉酶0.1～0.2g和纤维素酶0.2～0.3g；

更优选地，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨4g、酵母浸粉3g、豆粕粉25g、玉米粉18g、麸皮22g、无水葡萄糖12g、浒苔粉7g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.04g、一水合硫酸锰0.02g、中性蛋白酶0.4g、中温淀粉酶0.2g和纤维素酶0.3g；

优选地，所述发酵培养基还包括消泡剂，所述发酵培养基中消泡剂的含量为0.3～0.5mL/L；

优选地，所述扩培培养的反应条件至少满足如下中的一个：所述扩培培养的温度为40～45℃、扩培培养的时间为20～22h、扩培培养的pH为5.2～7.0、扩培培养的搅拌速度为100～200r/min、通气比为0.8-1.2(V/V·min)；

更优选地，所述扩培培养的方法包括以下步骤：

(a)、将凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，随后在温度为42℃、pH为5.2～5.5、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养6h，得到发酵液A；

(b)、将发酵液A在温度为42℃、pH为6.2～6.5、搅拌速度为200r/min、通气比为1.0(V/V·min)的条件下，培养8h，得到发酵液B；

(c)、将发酵液B在温度为42℃、pH为6.8～7.0、搅拌速度为200r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，得到扩培发酵液。

进一步的，所述步骤(C)诱导液加入扩培发酵液的加入量为0.1-0.2‰；

优选地，所述诱导培养的反应条件至少满足如下中的一个：

所述诱导培养的温度为50～55℃、时间为6～8h、搅拌速度为120～150r/min、通气比为0.6-0.8(V/V·min)。

进一步的，所述补料培养基的加入量为3-5％；

优选地，所述补料培养基主要由轻质碳酸钙和一水合硫酸锰制得；

更优选地，每L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙50～80g、一水合硫酸锰2.5～4.0g。

本发明提供的一种根据上述促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法制备得到的凝结芽孢杆菌；

所述凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％。

本发明提供的一种微生态制剂，所述微生态制剂包含上述凝结芽孢杆菌。

本发明提供的上述凝结芽孢杆菌、上述微生态制剂在制备饲料产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法为在发酵培养的过程中加入诱导液，所述诱导液为凝结芽孢杆菌孢子液。有鉴于现有用于饲料的微生态制剂中的凝结芽孢杆菌，需要进行高温喷雾干燥处理生成粉剂后使用，只有形成芽孢后的凝结芽孢杆菌对高温才有耐受性，而营养丰富的培养基往往不利于芽孢的形成，所以在现有的凝结芽孢杆菌的生产过程中，往往存在活菌浓度与产孢率两者很难兼顾的问题。本申请创造性的在发酵培养的过程中，加入凝结芽孢杆菌孢子液作为诱导液进行发酵培养。当遇到营养缺乏或极端环境时，凝结芽孢杆菌将生成芽孢，进行自我保护，在发酵培养液中的菌体形成芽孢的过程中，菌体代谢情况将发生改变，产生不同的代谢产物，这些代谢产物会给未形成芽孢的菌体传递一种信号，加快菌体向芽孢形式的转换。因此，该方法能够有效提高凝结芽孢杆菌的产孢率，缩短芽孢形成时间，大幅度提高了生产效率，降低了生产成本。

本发明提供的凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌由上述促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法制备得到，所述制得的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％。

本发明提供的微生态制剂，该微生态制剂包含上述凝结芽孢杆菌。

本发明提供的上述凝结芽孢杆菌、上述微生态制剂可以广泛应用于饲料产品的制备过程中。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括：在发酵培养的过程中加入诱导液；

所述诱导液为凝结芽孢杆菌孢子液。

本发明提供的促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法为在发酵培养的过程中加入诱导液，所述诱导液为凝结芽孢杆菌孢子液。鉴于现有用于饲料的微生态制剂中的凝结芽孢杆菌，需要进行高温喷雾干燥处理生成粉剂后使用，只有形成芽孢后的凝结芽孢杆菌对高温才有耐受性，而营养丰富的培养基往往不利于芽孢的形成，所以在现有的凝结芽孢杆菌的生产过程中，往往存在活菌浓度与产孢率两者很难兼顾的问题。本申请创造性的在发酵培养的过程中，加入凝结芽孢杆菌孢子液作为诱导液进行发酵培养。当遇到营养缺乏或极端环境时，凝结芽孢杆菌将生成芽孢，进行自我保护，在发酵培养液中的菌体形成芽孢的过程中，菌体代谢情况将发生改变，产生不同的代谢产物，这些代谢产物会给未形成芽孢的菌体传递一种信号，加快菌体向芽孢形式的转换。因此，该方法能够有效提高凝结芽孢杆菌的产孢率，缩短芽孢形成时间，大幅度提高了生产效率，降低了生产成本。

在本发明的一种优选实施方式中，所述凝结芽孢杆菌孢子液中凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为90～95％。

优选地，所述凝结芽孢杆菌孢子液的制备方法，包括以下步骤：

从斜面挑取菌苔2-3环凝结芽孢杆菌菌株，接种于装液量为100mL的种子液1000mL三角瓶中，转速200r/min，35～40℃培养60～68h，直至镜检芽孢形成率高于90％以上，制得凝结芽孢杆菌孢子液。

在本发明的一种优选实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株接种于种液培养基中进行种液培养，随后灭活未形成芽孢的菌体，得到凝结芽孢杆菌种液；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

(C)、芽孢诱导：将诱导液加入扩培发酵液中，诱导培养，得到芽孢形成率为95～98％的凝结芽孢杆菌；

优选地，所述步骤(C)中还包括加入补料培养基的步骤。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(A)凝结芽孢杆菌菌株接种于种液培养基中的接菌量为1％；

在本发明的一种优选实施方式中，所述种液培养基主要由蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、氯化钠和磷酸氢二钾制得；

在上述优选实施方式中，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，葡萄糖2～4g，氯化钠5～10g和磷酸氢二钾2～3g；

上述蛋白胨典型但非限制性的优选实施方案为：8g、8.5g、9g、9.5g和10g；上述酵母浸粉典型但非限制性的优选实施方案为：3g、3.5g、4g、4.5g和5g；上述葡萄糖典型但非限制性的优选实施方案为：2g、2.5g、3g、3.5g和4g；上述氯化钠典型但非限制性的优选实施方案为：5g、6g、7g、8g、9g和10g；上述磷酸氢二钾典型但非限制性的优选实施方案为：2g、2.25g、2.5g、2.75g和3g。

优选地，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨9g，酵母浸粉4g，葡萄糖3g，氯化钠8g和磷酸氢二钾2g；

在上述优选实施方式中，所述种液培养为摇瓶培养，所述摇瓶培养的反应条件至少满足如下中的一个：摇瓶培养的温度为35～40℃、时间为60～68h，摇瓶培养的转速为150～250r/min，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％；

上述摇瓶培养的温度典型但非限制性的优选实施方案为：35℃、36℃、37℃、38℃、39℃和40℃；上述摇瓶培养的时间典型但非限制性的优选实施方案为：60h、61h、62h、63h、64h、65h、66h、67h和68h；上述摇瓶培养的转速典型但非限制性的优选实施方案为：150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min、200r/min、210r/min、220r/min、230r/min、240r/min和250r/min。

优选地，所述种液培养为摇瓶培养，所述摇瓶培养的反应条件至少满足如下中的一个：摇瓶培养的温度为38℃、时间为65h，摇瓶培养的转速为200r/min；

在上述优选实施方式中，所述灭活包括水浴灭活，所述水浴灭活的温度为80～90℃，时间为30～35min；

作为一种优选的实施方式，上述种液在80～90℃下水浴处理30～35min，可以杀灭种液中未形成芽孢的菌体，保证种子液所在生长周期的一致性，提高后期的发酵效率。

优选地，所述水浴灭活的温度为85℃，时间为30min。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(B)凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基的接菌量为0.5‰；

在本发明的一种优选实施方式中，所述扩培培养基主要由蛋白胨、酵母浸粉、豆粕粉、玉米粉、麸皮、无水葡萄糖、浒苔粉、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、一水合硫酸锰、中性蛋白酶、中温淀粉酶和纤维素酶组成；

作为一种优选的实施方式，豆粕是除蛋白胨与酵母浸粉外主要的氮源，不仅营养丰富，而且价格便宜；玉米粉是一种缓释碳源，不易直接被利用的多糖物质，在发酵过程中不断被酶解释放出单糖或二糖供微生物利用；麸皮中不可溶物质含量高，满足细胞生长的贴壁习性，促进菌体的附着及芽孢的形成。浒苔是一种低污染、高蛋白和膳食纤维、低脂肪、矿物质丰富的海藻，不仅氨基酸齐全，比例适合，富含Fe、Cu、Zn、I等动物必须的微量元素，而且含有大量的浒苔多糖，有利于促进微生物发酵；中性蛋白酶：≥20000u/g，中温淀粉酶：≥5000u/g，纤维素酶≥2000u/g，葡萄糖是碳源中最容易利用的单糖，作为培养基的主要成分，并且也作为促进细胞快速生长的一种有效的糖类物质；磷酸氢二钾中的钾离子也与细胞渗透压和细胞膜的通透性有关，并且还是许多酶的激活剂，能促进糖代谢。

优选地，所述豆粕粉、玉米粉要求粉碎过100目，麸皮要求粉碎过80目。

在上述优选实施方式中，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3～5g、酵母浸粉2～4g、豆粕粉20～30g、玉米粉15～20g、麸皮20～25g、无水葡萄糖10～15g、浒苔粉5～8g、磷酸氢二钾2～3g、七水硫酸镁0.03～0.05g、一水合硫酸锰0.01～0.02g、中性蛋白酶0.3～0.5g、中温淀粉酶0.1～0.2g和纤维素酶0.2～0.3g；

作为一种优选的实施方式，蛋白胨、酵母粉属于优质氮源，价格比较贵，但是营养丰富，适合菌体前期的增殖需要，所以添加量不需要太多；豆粕粉、玉米粉、麸皮属于廉价的发酵原料，大量使用有利于降低生产成本；合理控制发酵液的干物质浓度，控制在10％以内，既能最大满足营养需要，又不会因为稠度降低通气效果。

上述蛋白胨典型但非限制性的优选实施方案为：3g、3.5g、4g、4.5g和5g；上述酵母浸粉典型但非限制性的优选实施方案为：2g、2.5g、3g、3.5g和4g；上述豆粕粉典型但非限制性的优选实施方案为：20g、22g、25g、28g和30g；上述玉米粉典型但非限制性的优选实施方案为：15g、16g、17g、18g、19g和20g；上述麸皮典型但非限制性的优选实施方案为：20g、22g、23g、24g和25g；上述无水葡萄糖典型但非限制性的优选实施方案为：10g、11g、12g、13g、14g和15g；上述浒苔粉典型但非限制性的优选实施方案为：5g、5.5g、6g、7g和8g；上述磷酸氢二钾典型但非限制性的优选实施方案为：2g、2.25g、2.5g、2.75g和3g；上述七水硫酸镁典型但非限制性的优选实施方案为：0.03g、0.04g和0.05g；上述一水合硫酸锰典型但非限制性的优选实施方案为：0.01g、0.015g、0.018g和0.02g；上述中性蛋白酶典型但非限制性的优选实施方案为：0.3g、0.35g、0.4g、0.45g和0.5g；上述中温淀粉酶典型但非限制性的优选实施方案为：0.1g、0.15g、0.18g、和0.2g；上述纤维素酶典型但非限制性的优选实施方案为：0.2g、0.225g、0.25g、0.28g和0.3g。

优选地，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨4g、酵母浸粉3g、豆粕粉25g、玉米粉18g、麸皮22g、无水葡萄糖12g、浒苔粉7g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.04g、一水合硫酸锰0.02g、中性蛋白酶0.4g、中温淀粉酶0.2g和纤维素酶0.3g；

在上述优选实施方式中，所述扩培培养基还包括消泡剂，所述发酵培养基中消泡剂的含量为0.3～0.5mL/L；

作为一种优选的实施方式，上述消泡剂由聚醚类与乳化硅胶消泡剂按照1：1的比例配置得到。聚醚类消泡剂的特点是：消泡能力快，抑泡能力差，乳化硅类消泡剂的特点是：消泡能力差，抑泡能力强。聚醚类消的是发酵液中表面的泡沫，乳化硅是消深层的泡沫效果较好，本发明将两者相结合，既能抑制泡沫产生，又能消除消泡。

在上述优选实施方式中，所述扩培培养的反应条件至少满足如下中的一个：所述扩培培养的温度为40～45℃、扩培培养的时间为20～22h、扩培培养的pH为5.2～7.0、扩培培养的搅拌速度为100～200r/min、通气比为0.8-1.2(V/V·min)；

优选地，所述扩培培养的方法包括以下步骤：

(a)、将凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，随后在温度为42℃、pH为5.2、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养6h，得到发酵液A；

(b)、将发酵液A在温度为42℃、pH为6.2、搅拌速度为200r/min、通气比为1.0(V/V·min)的条件下，培养8h，得到发酵液B；

(c)、将发酵液B在温度为42℃、pH为6.8、搅拌速度为200r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，得到扩培发酵液。

作为一种优选的实施方式，上述扩培培养阶段单糖被利用，会产生大量的酸，使得pH降低，控制pH不低于5.0，使得发酵在酸性环境下进行，抑制杂菌生长。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(C)诱导液加入扩培发酵液的加入量为0.1～0.2％；

在上述优选实施方式中，所述诱导培养的反应条件至少满足如下中的一个：

所述诱导培养的温度为50～55℃、时间为6～8h、搅拌速度为120～150r/min、通气比为0.6-0.8(V/V·min)。

作为一种优选的实施方式，上述诱导培养通过提高温度、降低通气量的方式促进菌体形成芽孢。

在本发明的一种优选实施方式中，所述补料培养基的加入量为3～5％；

优选地，所述补料培养基与诱导液同时加入扩培发酵液中。补料培养基的体积不宜过大，不然将对扩培液的培养基浓度进行稀释，并且还会增加补料的难度，主要是通过补料培养基的浓度来控制其在扩培液中的添加量。

在本发明的一种优选实施方式中，所述补料培养基主要由轻质碳酸钙和一水合硫酸锰制得；

作为一种优选的实施方式，上述补料培养基主要由轻质碳酸钙和一水合硫酸锰制得，Mn²⁺是超氧化物歧化酶、黄嘌呤氧化酶、L－阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子，是微生物生长和芽孢形成所需的一种微量元素。发酵前期过多的Mn²⁺会抑制菌体的增殖，所以考虑在发酵的后期补入大量的Mn²⁺，促进芽孢的形成；同时芽孢富含钙离子，而且大多数钙离子与芽孢所特有的化学成分吡啶二羧酸结合，形成的钙－吡啶二羧酸复合物约占芽孢干重的10％，复合物通过降低芽孢含水量增加芽孢抗逆性。CaCO₃的添加可以为芽孢的形成提供大量的钙离子，可促进芽孢形成。由于凝结芽孢杆菌生长比其他芽孢菌缓慢，所以在发酵的前期需要控制较低的pH，抑制杂菌的生长，如果加入过量的CaCO₃，会中和发酵过程中大量的酸，发酵液无法维持酸性环境，增加感染杂菌的风险，然而在发酵的后期芽孢的形成需要大量的钙离子参与，所以本发明选择在后期补料时添加碳酸钙，促进芽孢的形成。

优选地，每1L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙50～80g、一水合硫酸锰2.5～4.0g。

优选地，所述促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，包括以下步骤：

(A)、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株接种于100mL的种液培养基中，在35～40℃的条件下，以150～250r/min的转速摇瓶培养60～68h，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％，随后80～90℃水浴处理30～35min，灭活未形成芽孢的菌体，得到凝结芽孢杆菌种液；

所述种液培养基中，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨8～10g，酵母浸粉3～5g，葡萄糖2～4g，氯化钠5～10g和磷酸氢二钾2～3g；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液以0.5-1‰的质量比接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述扩培培养的方法包括以下步骤：

(B1)、将凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，随后在温度为42℃、pH为5.2～5.5、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养6h，得到发酵液A；

(B2)、将发酵液A在温度为42℃、pH为6.2～6.5、搅拌速度为200r/min、通气比为1.0(V/V·min)的条件下，培养8h，得到发酵液B；

(B3)、将发酵液B在温度为42℃、pH为6.8～7.0、搅拌速度为200r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，得到扩培发酵液。

所述扩培培养基，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3～5g、酵母浸粉2～4g、豆粕粉20～30g、玉米粉15～20g、麸皮20～25g、无水葡萄糖10～15g、浒苔粉5～8g、磷酸氢二钾2～3g、七水硫酸镁0.03～0.05g、一水合硫酸锰0.01～0.02g、中性蛋白酶0.3～0.5g、中温淀粉酶0.1～0.2g和纤维素酶0.2～0.3g；

(C)、芽孢诱导：将诱导液和补料培养基以0.1-0.2‰和3-5％的加入量加入扩培发酵液中，在温度为50～55℃、搅拌速度为120～150r/min、通气比为0.6-0.8(V/V·min)的条件下，培养6～8h，镜检，当得到的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％时，完成发酵；

所述补料培养基，每1L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙50～80g、一水合硫酸锰2.5～4.0g。

所述诱导液的制备方法为：将凝结芽孢杆菌菌株以0.1-0.2‰的质量比接种于100mL的种液培养基中，在35～40℃的条件下，以150～250r/min的转速摇瓶培养60～68h，镜检，当芽孢形成率高于90％以上时，制得诱导液。

根据本发明的一个方面，一种根据上述促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法制备得到的凝结芽孢杆菌；

所述凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％。

本发明提供的凝结芽孢杆菌，所述凝结芽孢杆菌由上述促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法制备得到，所述制得的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％。

根据本发明的一个方面，一种微生态制剂，所述微生态制剂包含上述凝结芽孢杆菌。

本发明提供的微生态制剂，该微生态制剂包含上述凝结芽孢杆菌。

根据本发明的一个方面，上述凝结芽孢杆菌、上述微生态制剂在制备饲料产品中的应用。

本发明提供的上述凝结芽孢杆菌、上述微生态制剂可以广泛应用于饲料产品的制备过程中。

下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。

实施例1

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株以1％的质量比接种于100mL的种液培养基中，在35℃的条件下，以200r/min的转速摇瓶培养68h，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％，随后85℃水浴处理30min，灭活未形成芽孢的菌体，得到凝结芽孢杆菌种液；

所述种液培养基中，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨8g，酵母浸粉5g，葡萄糖2g，氯化钠5g和磷酸氢二钾2g；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液以0.5‰的质量比接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述扩培培养的方法包括以下步骤：

(1)、将凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，随后在温度为42℃、pH为5.2～5.5、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养6h，得到发酵液A；

(2)、将发酵液A在温度为42℃、pH为6.2～6.5、搅拌速度为200r/min、通气比为1.0(V/V·min)的条件下，培养8h，得到发酵液B；

(3)、将发酵液B在温度为42℃、pH为6.8～7.0、搅拌速度为200r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，得到扩培发酵液。

所述扩培培养基，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3g、酵母浸粉4g、豆粕粉20g、玉米粉15g、麸皮25g、无水葡萄糖15g、浒苔粉5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.03g、一水合硫酸锰0.01g、消泡剂1mL、中性蛋白酶0.3g、中温淀粉酶0.1g和纤维素酶0.2g；

(C)、芽孢诱导：将诱导液和补料培养基以0.1‰和3％的加入量加入扩培发酵液中，在温度为52℃、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养8h，镜检，当得到的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％时，完成发酵；

所述补料培养基，每1L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙50g、一水合硫酸锰2.5g。

所述诱导液的制备方法为：将凝结芽孢杆菌菌株以1％的质量比接种于100mL的种液培养基中，在35℃的条件下，以200r/min的转速摇瓶培养68h，镜检，当芽孢形成率高于90％以上时，制得诱导液。

实施例2

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：除种液培养基的组成不同外，其余同实施例1；

所述种液培养基中，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨9g，酵母浸粉4g，葡萄糖3g，氯化钠8g和磷酸氢二钾2.5g；

(B)、菌体扩培：除扩培培养基的组成不同外，其余同实施例1；

所述扩培培养基中，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨4g、酵母浸粉3g、豆粕粉25g、玉米粉18g、麸皮23g、无水葡萄糖13g、浒苔粉6g、磷酸氢二钾2.5g、七水硫酸镁0.04g、一水合硫酸锰0.015g、消泡剂0.3mL、中性蛋白酶0.4g、中温淀粉酶0.15g和纤维素酶0.25g；

(C)、芽孢诱导：除补料培养基的组成不同外，其余同实施例1；

所述补料培养基中，每1L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙65g、一水合硫酸锰3.0g。

实施例3

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：除种液培养基的组成不同外，其余同实施例1；

所述种液培养基中，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨10g，酵母浸粉3g，葡萄糖4g，氯化钠10g和磷酸氢二钾3g；

(B)、菌体扩培：除扩培培养基的组成不同外，其余同实施例1；

所述扩培培养基中，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨5g、酵母浸粉2g、豆粕粉30g、玉米粉20g、麸皮20g、无水葡萄糖10g、浒苔粉7g、磷酸氢二钾3g、七水硫酸镁0.05g、一水合硫酸锰0.02g、消泡剂0.4mL、中性蛋白酶0.5g、中温淀粉酶0.2g和纤维素酶0.3g；

(C)、芽孢诱导：除补料培养基的组成不同外，其余同实施例1；

所述补料培养基中，每1L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙80g、一水合硫酸锰4g。

实施例4

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株以2％的质量比接种于100mL的种液培养基中，在40℃的条件下，以200r/min的转速摇瓶培养60h，染色镜检凝结芽孢杆菌的芽孢形成率大于90％，随后85℃水浴处理30min，灭活未形成芽孢的菌体，得到凝结芽孢杆菌种液；

所述种液培养基同实施例1；

(B)、菌体扩培：同实施例1。

(C)、芽孢诱导：除诱导液的制备方法不同外，其余同实施例1；

所述诱导液的制备方法为：将凝结芽孢杆菌菌株以2％的质量比接种于100mL的种液培养基中，在40℃的条件下，以200r/min的转速摇瓶培养60h，镜检，当芽孢形成率高于90％以上时，制得诱导液。

实施例5

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：同实施例1；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液以0.8‰的质量比接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述扩培培养的方法包括以下步骤：

(1)、将凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，随后在温度为45℃、pH为5.2～5.4、搅拌速度为150r/min、通气比为0.9(V/V·min)，培养6h，得到发酵液A；

(2)、将发酵液A在温度为45℃、pH为6.2～6.4、搅拌速度为200r/min、通气比为1.1(V/V·min)，培养8h，得到发酵液B；

(3)、将发酵液B在温度为45℃、pH为6.8～6.9、搅拌速度为200r/min、通气比为1.2(V/V·min)，培养8h，得到扩培发酵液。

所述扩培培养基同实施例1；

(C)、芽孢诱导：将诱导液和补料培养基以0.15‰和4％的加入量加入扩培发酵液中，在温度为55℃、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养8h，镜检，当得到的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％时，完成发酵；

所述补料培养基和诱导液的制备方法同实施例1。

实施例6

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：同实施例1；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液以1‰的质量比接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述扩培培养的方法包括以下步骤：

(1)、将凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，随后在温度为42℃、pH为5.2～5.5、搅拌速度为120r/min、通气比为1.0(V/V·min)的条件下，培养6h，得到发酵液A；

(2)、将发酵液A在温度为42℃、pH为6.2～6.5、搅拌速度为150r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，得到发酵液B；

(3)、将发酵液B在温度为42℃、pH为6.8～7.0、搅拌速度为150r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，得到扩培发酵液。

所述扩培培养基同实施例1；

(C)、芽孢诱导：将诱导液和补料培养基以0.2‰和5％的加入量加入扩培发酵液中，在温度为52℃、搅拌速度为120r/min、通气比为0.7(V/V·min)的条件下，培养8h，镜检，当得到的凝结芽孢杆菌的芽孢形成率为95～98％时，完成发酵；

所述补料培养基和诱导液的制备方法同实施例1。

对比例1

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株以1％的质量比接种于100mL的种液培养基中，在35～40℃的条件下，以200r/min的转速摇瓶培养68h，得到凝结芽孢杆菌种液；

所述种液培养基同实施例1；

(B)、菌体扩培：同实施例1；

(C)、芽孢诱导：同实施例1；

本对比例除步骤(A)中不进行灭活未形成芽孢的菌体的步骤外，其余同实施例1。

对比例2

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：同实施例1；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液以0.5‰的质量比接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述扩培培养的方法同实施例1；

所述扩培培养基，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3g、酵母浸粉4g、豆粕粉30g、玉米粉30g、无水葡萄糖15g、浒苔粉5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.03g、一水合硫酸锰0.01g、消泡剂0.5mL、中性蛋白酶0.3g、中温淀粉酶0.1g和纤维素酶0.2g；

(C)、芽孢诱导：同实施例1；

本对比例除扩培培养基的组成与实施例1不同外，其余同实施例1。

对比例3

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：同实施例1；

(B)、菌体扩培：同实施例1；

(C)、补料培养：将补料培养基以3％的加入量加入扩培发酵液中，在温度为52℃、搅拌速度为150r/min、通气比为0.8(V/V·min)的条件下，培养8h，完成发酵；

本对比例除发酵过程中不包含诱导液外，其余同实施例1。

对比例4

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：同实施例1；

(B)、菌体扩培：将步骤(A)得到的凝结芽孢杆菌种液以3％的质量比接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述扩培培养基，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3g、酵母浸粉4g、豆粕粉30g、玉米粉30g、无水葡萄糖15g、浒苔粉5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.03g、一水合硫酸锰0.01g、消泡剂0.3mL；

(C)、芽孢诱导：同实施例1；

本对比例除扩培培养基的组成不包含中性蛋白酶、中温淀粉酶和纤维素酶外，其余同实施例1。

对比例5

一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)、制备种液：同实施例1；

(B)、菌体扩培：同实施例1；

(C)、芽孢诱导：将诱导液和补料培养基以0.1‰和3％的加入量加入扩培发酵液中，在温度为55℃、搅拌速度为200r/min、通气比为1.2(V/V·min)的条件下，培养8h，完成发酵；

所述补料培养基和诱导液的制备方法同实施例1。

实验例1

为表明本申请促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法能够有效提高凝结芽孢杆菌的产孢率，缩短芽孢形成时间，大幅度提高了生产效率。现将实施例1～6以及对比例1～5发酵制备得到的凝结芽孢杆菌进行检测，具体结果如下：

由上述结果可知，实施例1-6在从活菌数量或芽孢率方面有明显的优势，其中实施例1效果最佳，对比例1-5中，对种子液制备、诱导剂、扩培培养基、发酵参数等方面进行调整对比，都未能兼顾活菌量与芽孢率两个方面的效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述方法包括：（A）、制备种液：将凝结芽孢杆菌菌株接种于种液培养基中进行种液培养，随后灭活未形成芽孢的菌体，得到凝结芽孢杆菌种液；

所述步骤（A）凝结芽孢杆菌菌株接种于种液培养基中的接菌量为1~2%；

每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨8~10g，酵母浸粉3~5g，葡萄糖2~4g，氯化钠5~10g和磷酸氢二钾2~3g；

所述种液培养为摇瓶培养，所述摇瓶培养的反应条件为：摇瓶培养的温度为35~40℃、摇瓶培养的转速为150~250r/min，时间为60~68h，芽孢形成率大于90%；

（B）、菌体扩培：将步骤（A）得到的凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基中，进行扩增培养，得到扩培发酵液；

所述步骤（B）凝结芽孢杆菌种液接种于扩培培养基的接菌量为0.5-1‰；

每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨3~5g、酵母浸粉2~4g、豆粕粉20~30g、玉米粉15~20g、麸皮20~25g、无水葡萄糖10~15g、浒苔粉5~8g、磷酸氢二钾2~3g、七水硫酸镁0.03~0.05g、一水合硫酸锰0.01~0.02g、中性蛋白酶0.3~0.5g、中温淀粉酶0.1~0.2g和纤维素酶0.2~0.3g；

所述扩培培养的反应条件为：所述扩培培养的温度为40~45℃、扩培培养的时间为20~22h、扩培培养的pH为5.2~7.0、扩培培养的搅拌速度为100~200 r/min、通气比为0.8-1.2（V/V·min）；

（C）、芽孢诱导：将诱导液加入扩培发酵液中，诱导培养，得到芽孢形成率为95~98%的凝结芽孢杆菌；

所述步骤（C）诱导液加入扩培发酵液的加入量为0.1~0.2‰；

所述诱导培养的反应条件为：所述诱导培养的温度为50~55℃、时间为6~8h、搅拌速度为120~150r/min、通气比为0.6-0.8（V/V·min）；

所述步骤（C）中还包括加入补料培养基的步骤；

所述补料培养基的加入量为3~5%；

每1L补料培养基中包含以下组分：轻质碳酸钙50~80g、一水合硫酸锰2.5~4.0g；

所述诱导液包括凝结芽孢杆菌孢子液。

2.根据权利要求1所述的促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于，每1L种液培养基包括以下组分：蛋白胨9g，酵母浸粉4g，葡萄糖3g，氯化钠8g和磷酸氢二钾2g；

所述种液培养为摇瓶培养，所述摇瓶培养的反应条件为：摇瓶培养的温度为38℃、时间为65h，摇瓶培养的转速为200r/min，芽孢形成率大于90%；

所述灭活包括水浴灭活，所述水浴灭活的温度为80~90℃，时间为30~35min。

3.根据权利要求2所述的促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于，所述水浴灭活的温度为85℃，时间为30min。

4.根据权利要求1所述的促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法，其特征在于，每1L扩培培养基中包含以下组分：蛋白胨4g、酵母浸粉3g、豆粕粉25g、玉米粉18g、麸皮22g、无水葡萄糖12g、浒苔粉7g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.04g、一水合硫酸锰0.02g、中性蛋白酶0.4g、中温淀粉酶0.2g和纤维素酶0.3g；

所述扩培培养基还包括消泡剂，所述扩培培养基中消泡剂的含量为0.3~0.5mL/L。

5.权利要求1-4任一项所述的促进凝结芽孢杆菌芽孢形成的方法在制备饲料产品中的应用。