CN110174472B - 一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及茶树种类技术领域，为解决目前茶树种质筛选的参考指标较少的问题，本发明提供一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，当不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值大于2，且亚麻酸与棕榈酸含量的比值大于1.2，表明该品种茶树适制发酵类茶叶；当不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值大于2，且亚麻酸与棕榈酸含量的比值小于1.2，表明该品种适制不发酵茶类，本发明的方法缩短品种选育的时间，减轻育种工作量，从而为茶树品种适制性的评价体系完善提供参考依据。

Description

一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法

技术领域

本发明涉及茶树种类技术领域，具体涉及一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树适制性的方法。

背景技术

茶树良种选育工作是一项周期长，工作量大，难度较高的基础工作。选育一个国家级茶树良种少则十几年，多则几十年。从发现特异单株，到种间杂交，再到株系筛选等等，无数次的抽样测试，只为了获得适制各种茶类的新品种。目前，育种家对茶树品种的适制性评价，一般是依据茶叶感官品质(色、香、味、形等)的优劣和化学成分(水浸出物、茶多酚、氨基酸、酚氨比、可溶性糖、儿茶素、香气成分等)的高低。当然，也有其它的鉴定手段，如采用分子标记法能鉴定茶树种质加工乌龙茶的可行性(CN201510339164.1)，利用芽叶的发酵性能也可快速鉴定茶树品种的适制性(CN201210537226.6)，通过测定鲜叶中的香叶基樱草糖苷、苯甲醇樱草糖苷、苯乙醇樱草糖苷的含量来判定花果香型茶叶的适制种质(CN201711473307.3)，即通过分析香气前体来探究花果香茶的适制品种。

脂肪酸是茶叶香气品质形成的重要前体，近几年国内外专家学者又从多个方面验证了该论断。目前，研究表明脂肪酸含量随芽叶成熟度的增加而升高，在不同品种间、不同季节间、不同地域间存在明显差异(Kottur et al，2011；Wang et al，2013；Okal et al，2012)。在茶叶加工中可转变为香气活性较高的含有5个或6个的醇类、醛类、酮类，以及茉莉酮、茉莉酸甲酯、茉莉内酯等(Kobayashi et al，1988；Zhu et al，2015)。由于茶叶的加工工艺不同，脂肪酸的保留量也各异(王磊磊等，2009；马超龙，2017)。廖书娟等比较了不同品种茶树鲜叶的脂肪酸含量(2008)，却未得到脂肪酸组成与茶树品种适制性的关联性，可能受限于当时的分析手段，检测出的脂肪酸不能反映茶叶的真实含量。然而，茶叶品质成分如茶多酚、氨基酸、酚氨比等用作茶树种质筛选的参考指标，由来已久，但目前尚鲜见脂肪酸作为参考指标的报道。

发明内容

为解决目前茶树种质筛选的参考指标较少的问题，本发明提供一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树适制性的方法，缩短品种选育的时间，减轻育种工作量，从而为茶树品种适制性的评价体系完善提供参考依据。

本发明是通过一下技术方案实现的：一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法为以下步骤；

(1)获取茶鲜叶的脂肪酸组成及各组份含量；

脂肪酸(特别是12碳以上的长碳链脂肪酸)一般不直接进行气相色谱分析，其原因是脂肪酸的沸点高，高温下不稳定，易裂解，分析中易造成损失。因此，对脂肪酸的组分分析时，先将脂肪酸甲醇反映，制备脂肪酸甲酯，降低沸点，提高稳定性，然后进行气相色谱分析。

甲酯化方法包括酸、碱催化的两类常用的方法，硫酸—甲醇酯化适用面广，既适于游离脂肪酸，又适合于结合态脂肪酸，氢氧化钾—甲醇室温酯化法适合于脂肪的甲酯化，不能用于酯化游离脂肪酸。

作为优选，本发明采用硫酸-甲醇法分析法获得茶鲜叶的脂肪酸组成，具体制备方法为：首先将鲜茶叶磨碎成茶叶粉末装入离心管中，加入抗氧化剂、体积浓度为4％-6％的硫酸/甲醇溶液、内标十七烷酸及甲苯，充分混匀；然后在90℃-95℃下加热1.0h-1.5h使对脂肪酸进行充分甲酯化后冷却至室温；接着加入质量浓度为0.9％的氯化钠溶液和正己烷，强烈涡旋混匀，最后在室温下离心(离心力1500×g-1800×g/min)15min，取上清液至新的离心管，重复提取若干次，优选为1-2次，合并上清液，以氮气吹干或离心浓缩至干，用正己烷溶解，放于-20℃贮存(待测)。酯化的目的是使类脂中的脂肪酸变成相应的酶，并从非脂肪酸残基中游离出来。

作为优选，上述方法中甲酯化过程操作需在通风厨中进行。

作为优选，茶叶粉、氧化剂、硫酸/甲醇溶液、十七烷酸、甲苯、氯化钠、正己烷的质量体积比为：20mg-60mg茶粉：20μL抗氧化剂：1mL硫酸/甲醇溶液：100μg十七烷酸：300μL甲苯：1mL氯化钠溶液：2mL正己烷。

作为优选，抗氧化剂为BHT(二丁基羟基甲苯)，质量浓度为0.2％，BHT作为抗氧剂，它能够与自动氧化中的链增长自由基反应，消灭自由基，从而使链式反应中断。BHT在抗氧化过程中既可以作为氢的给予体也可以作为自由基俘获剂。由于2,6位上有2个强力推电子基团，因此，BHT具有很强的抗氧化效果。

作为优选，本发明采用气相色谱-火焰离子化检测器法(GC-FID)分析茶鲜叶的脂肪酸含量。氢火焰离子化检测器(FID)，简称氢焰检测器，在气相色谱仪检测分析试验中应用较为广泛，它是以氢气与空气中氧气燃烧产生火焰为能源，当有机物质进入火焰时，在火焰的高能作用下，被激发而产生离子。气相色谱分析-火焰离子化检测器或GC-FID是一种十分常用的分析技术。与其他的气相色谱技术一样，该分析方法要求载气中的水和氧气杂质含量极低，因为水和氧气会干扰固定相，并造成输出的气相色谱图出现高基线噪声和柱流失等严重问题，从而降低分析灵敏度，同时缩短色谱柱寿命。FID还对向火焰供应的氢气和空气中的烃类杂质极为敏感。烃类杂质会导致基线噪声增大并降低检测器的灵敏度。

其中GC-FID的分析条件是色谱柱：DB-23(60m×0.25mm×0.25μm)；自动进样，进样量：lμL；采用分流进样，分流比为10：1；进样口温度：250℃；载气：氮气，20.0mL/min；氢气，30mL/min；空气，400mL/min。程序升温：初始温度120℃，以6.5℃/min升到170℃，保持12min，然后以2.75℃/min升到215℃保持3min，最后以4℃/min升到230℃保持3min；检测器：火焰离子检测器，温度为280℃；每个样品检测43min，样品检测间隔2min。

(2)根据茶树鲜叶脂肪酸各组份的含量，计算不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值、亚麻酸与棕榈酸含量的比值进行茶树品种适制性判定。

不饱和脂肪酸(USFA)和饱和脂肪酸(SFA)分别指所有的不饱和脂肪酸(单不饱和、双不饱和及多不饱和脂肪酸)、饱和脂肪酸。USFA/SFA值、亚麻酸与棕榈酸的比值可以用峰面积之比，也可用其含量之比。

茶树鲜叶中主要含有棕榈酸(16：0)、棕榈油酸(16：1)、十六碳三烯酸(16：3)、硬脂酸(18：0)、油酸(18：1)、亚油酸(18：2)和亚麻酸(18：3)等脂肪酸，鲜叶中以不饱和脂肪酸为主，脂肪酸的含量在不同品种间差异明显。脂肪酸类本身具有香气，对茶叶展现的香气具有重要贡献。其中，A:B的A和B分别指脂肪酸中碳原子数和不饱和双键数。

当不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值大于2，且亚麻酸与棕榈酸含量的比值大于1.2，表明该品种茶树适制发酵类茶叶，如红茶、乌龙茶等；当不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值小于2，且亚麻酸与棕榈酸含量的比值小于1.2，表明该品种适制不发酵茶类，如绿茶等。

绿茶中不饱和脂肪酸酸随品质下降而升高，饱和脂肪酸随品质下降而降低，亚麻酸与品质呈负相关，棕榈酸与品质呈正相关，均达到显著水平。发酵类茶中的脂肪酸以不饱和脂肪酸为主，其中以亚麻酸、棕榈酸含量最高。

本发明提出一种基于茶鲜叶中的脂肪酸组成筛选茶树良种的方法，即采用硫酸-甲醇法制备脂肪酸甲酯，通过GC-FID检测样品的全部脂肪酸(包含游离脂肪酸)，计算出饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比值，以及亚麻酸与棕榈酸的比值，进而根据比值区间确定茶树新品种的适制性，

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)操作方便，易于控制；

(2)缩短品种选育的时间，减轻育种工作量。

附图说明

图1为不同茶树品种鲜叶加工的红茶样；

图2为不同茶树品种鲜叶加工的红茶样汤色。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。

实施例1-实施例6

称取50mg不同品种茶树的一芽四叶标准的鲜叶(铁观音、金观音、黄金桂、紫玫瑰、黄观音、紫牡丹)制成的茶粉，分别放入10mL的离心管，加入20μL的BHT、1mL的6％硫酸/甲醇溶液(体积比)、100μg十七烷酸和300μL甲苯，混匀。然后在90℃下加热1.5h，冷却至室温，加入1mL的0.9％氯化钠溶液(质量比)和2mL正己烷，涡旋混匀。室温下离心15min(1800g/min)，取上清液。再加入2mL正己烷，再提取一次。合并两次提取的上清液(无色的)，氮气吹干后，用正己烷溶解，进行GC-FID分析。试验重复6次。其中GC-FID的分析条件是色谱柱：DB-23(60m×0.25mm×0.25μm)；自动进样，进样量：lμL；采用分流进样，分流比为10：1；进样口温度：250℃；载气：氮气，20.0mL/min；氢气，30mL/min；空气，400mL/min。程序升温：初始温度120℃，以6.5℃/min升到170℃，保持12min，然后以2.75℃/min升到215℃保持3min，最后以4℃/min升到230℃保持3min；检测器：火焰离子检测器，温度为280℃；每个样品检测43min，样品检测间隔2min。脂肪酸含量如表1所示：

表1.不同品种茶树鲜叶中的脂肪酸含量及组成

研究表明，铁观音、金观音、黄金桂、紫玫瑰、黄观音、紫牡丹等茶树鲜叶中的脂肪酸主要有亚麻酸(18：3)、亚油酸(18：2)、油酸(18：1)、硬脂酸(18：0)、棕榈油酸(16：1)、棕榈酸(16：0)等(见表1)。亚麻酸、亚油酸、油酸和棕榈酸含量均高于1.0mg.g-1，且亚麻酸含量最高达15.0±1.5mg.g-1。所有样品中USFA/SFA值大于3.0的仅有JGY和ZMG，但均大于2。同时，亚麻酸与棕榈酸的比值也均大于1.2。因此判定它们均适宜加工发酵茶类，此结果与茶叶生产实际是一致的，即铁观音、金观音、黄金桂、紫玫瑰、黄观音、紫牡丹均适制乌龙茶。铁观音和金观音茶树，不仅是适制乌龙茶的典型代表，也是适制红茶的良种。黄金桂又名黄旦，按本发明的判定方法，认为适合加工发酵茶如乌龙茶和红茶等。

实施例7-9

称取白叶1号、翠峰茶树、中黄1号的一芽二叶标准的鲜叶(均为国家审定的优良茶树品种，适制绿茶)0.04g，分别放入10mL的离心管，加入20μL的BHT、1mL的5％硫酸/甲醇溶液(体积比)、200μg十七烷酸和300μL甲苯，混匀。然后在90℃下加热1.5h，冷却至室温，加入1mL的0.9％氯化钠溶液(质量浓度)和2mL正己烷，涡旋混匀。室温下离心15min(1800g/min)，取上清液。再加入2mL正己烷，再提取一次。合并两次提取的上清液，氮气吹干后，用正己烷溶解，进行GC-FID分析。试验重复6次。其中GC-FID的分析条件是色谱柱：DB-23(60m×0.25mm×0.25μm)；自动进样，进样量：lμL；采用分流进样，分流比为10：1；进样口温度：250℃；载气：氮气，20.0mL/min；氢气，30mL/min；空气，400mL/min。程序升温：初始温度120℃，以6.5℃/min升到170℃，保持12min，然后以2.75℃/min升到215℃保持3min，最后以4℃/min升到230℃保持3min；检测器：火焰离子检测器，温度为280℃；每个样品检测43min，样品检测间隔2min。脂肪酸含量如表2所示：

表2.白叶1号、翠峰鲜叶、中黄1号的脂肪酸分析

脂肪酸(mg/g)	白叶1号	翠峰	中黄1号
				14:0	0.059±0.002	0.043±0.007	0.041±0.002
16:0	10.368±0.128	8.450±0.593	5.481±0.177
				16:1	0.182±0.006	0.219±0.013	0.076±0.003
18:0	0.465±0.044	0.397±0.051	0.535±0.013
				18:1	0.772±0.042	1.071±0.100	0.230±0.021
18:2	5.088±0.287	5.637±0.345	7.561±0.264
				18:3	8.386±0.552	8.332±0.500	9.663±0.344
USFA	16.306±0.439	16.624±0.539	18.058±0.598
				SFA	10.797±0.304	10.518±0.047	6.287±0.183
USFA/SFA	1.34	1.74	2.88
				18:3/16:0	0.81	0.986	1.76

研究表明，白叶1号、翠峰、中黄1号中也可检测7种脂肪酸(见表2)，棕榈酸含量最多，其次是亚麻酸和亚油酸。二者的亚麻酸与棕榈酸的比值分别是0.81和0.986，即均小于1.2。并且白叶1号与翠峰的USFA/SFA值分别是1.34和1.74，即均小于2。采用本发明的方法判定两个品种均不适合加工发酵茶，更适宜加工绿茶等不发酵茶。这个判定结果与《中国无性系茶树品种志》的结论是一致。中黄1号中亚麻酸与棕榈酸的比值为1.76，并且USFA/SFA值达到2.88，故按本发明判定中黄1号更适制发酵茶类；然而采用中黄1号茶树鲜叶加工的绿茶和红茶，品质都很好。之所以会出现这种情况，可能是因为中黄1号为光敏感型茶树，含有较高的氨基酸。

实施例10-17

称取30mg不同品种茶树的一芽四叶标准的鲜叶(紫鹃、金萱、菊花春、中茶302、碧云、寒绿、萍云、苔香紫)制成的茶粉，分别放入10mL的离心管，加入20μL的BHT、1mL的4％硫酸/甲醇溶液(体积比)、100μg十七烷酸和300μL甲苯，混匀。然后在95℃下加热1h，冷却至室温，加入1mL的0.9％氯化钠溶液(质量比)和2mL正己烷，涡旋混匀。室温下离心15min(1600g/min)，取上清液。再加入2mL正己烷，再提取一次。合并两次提取的上清液(无色的)，氮气吹干后，用正己烷溶解，进行GC-FID分析。试验重复6次。其中GC-FID的分析条件是色谱柱：DB-23(60m×0.25mm×0.25μm)；自动进样，进样量：lμL；采用分流进样，分流比为10：1；进样口温度：250℃；载气：氮气，20.0mL/min；氢气，30mL/min；空气，400mL/min。程序升温：初始温度120℃，以6.5℃/min升到170℃，保持12min，然后以2.75℃/min升到215℃保持3min，最后以4℃/min升到230℃保持3min；检测器：火焰离子检测器，温度为280℃；每个样品检测43min，样品检测间隔2min。脂肪酸含量如表3所示：

表3不同茶树品种鲜叶的脂肪酸组成及含量

将上述茶鲜叶(菊花春、寒绿、萍云、碧云、苔香紫和中茶302)发酵做成红茶，干茶和其汤色泽如图1和图2所示，颜色、品质符合红茶要求，与本申请判定茶树适制性的方法一致。

Claims (8)

1.一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，判定方法为以下步骤：

（1）获取茶鲜叶的脂肪酸组成及各组份含量；

具体步骤为：首先将鲜茶叶磨碎成茶叶粉末装入离心管中，加入抗氧化剂、硫酸/甲醇溶液、十七烷酸及甲苯混匀；然后在90℃-95℃下加热1.0 h-1.5 h后冷却至室温；接着加入氯化钠溶液和正己烷混匀，最后在室温下离心取上清液至新的离心管，重复提取若干次，合并上清液，以氮气吹干或离心浓缩至干，用正己烷溶解，放于-20℃贮存待测；然后采用气相色谱-火焰离子化检测器法分析茶鲜叶的脂肪酸含量；

（2）根据茶树鲜叶脂肪酸各组份的含量，计算不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值、亚麻酸与棕榈酸含量的比值进行茶树品种适制性判定；

当不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值大于2，且亚麻酸与棕榈酸含量的比值大于1.2，表明该品种茶树适制发酵类茶叶；当不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸含量的比值小于2，且亚麻酸与棕榈酸含量的比值小于1.2，表明该品种适制不发酵茶类。

2.根据权利要求1所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，离心过程为：在1500×g-1800×g/min条件下离心15 min。

3.根据权利要求1所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，茶叶粉、抗氧化剂、硫酸/甲醇溶液、十七烷酸、甲苯、氯化钠、正己烷的质量体积比为：20mg-60mg茶粉：20μL抗氧化剂：1 mL硫酸/甲醇溶液：100μg十七烷酸：300μL甲苯：1mL氯化钠溶液：2 mL正己烷。

4.根据权利要求1或3所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，抗氧化剂为BHT，质量浓度为0.2wt%。

5.根据权利要求1或3所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，硫酸/甲醇溶液的体积浓度为4%-6%，氯化钠溶液的质量浓度为0.9%。

6.根据权利要求1所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，分析条件是色谱柱：采用分流进样，分流比为10：1；进样口温度：250℃；载气：氮气，20.0 mL/min；氢气，30 mL/min；空气，400 mL/min。

7.根据权利要求6所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，程序升温：初始温度120℃，以6.5℃/min升到170℃，保持12 min，然后以2.75℃/min升到215℃保持3 min，最后以4℃/min升到230℃保持3 min；检测器：火焰离子检测器，温度为280℃。

8.根据权利要求1或6或7所述的一种基于鲜叶的脂肪酸组成判定茶树品种适制性的方法，其特征在于，每个样品检测43 min，样品检测间隔2 min。

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