CN110156880B - 兹卡病毒疫苗组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种兹卡病毒套膜蛋白突变体及一种包含编码该突变体的核苷酸序列的核酸分子。该兹卡病毒套膜蛋白突变体较佳为在一野生型兹卡病毒套膜蛋白的第105个氨基酸位置有一苏氨酸取代，或在第248个及第250个氨基酸位置分别有一天冬酰氨酸及一苏氨酸取代，因此具有一遮蔽兹卡病毒套膜蛋白的融合环区域的N‑醣链。本发明亦提供一种疫苗组合物，其包含该兹卡病毒套膜蛋白突变体或一具有该核酸分子的重组病毒。本发明亦提供该兹卡病毒套膜蛋白突变体的用途，是用于制备预防兹卡病毒感染及降低登革病毒感染的抗体依赖性增强作用的疫苗组合物。
Description
技术领域
本发明是关于一种重组蛋白质、核酸分子及其用途，特别是关于一种兹卡病毒套膜蛋白突变体及具有其对应核苷酸序列的核酸分子、一种包含该套膜蛋白突变体或具有该核酸分子的重组病毒的疫苗组合物、及该套膜蛋白突变体用于制备疫苗组合物的用途。
背景技术
兹卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一种伊蚊传播的病毒，自2015年在巴西爆发感染已成为全球公共卫生的关注焦点。据2016年世界卫生组织(World Health Organization)的统计，兹卡病毒已在亚洲、北美洲、非洲、及澳洲的热带和亚热带地区的70多个国家蔓延。由于蚊子媒介的广泛传播，全世界超过250万人面临兹卡病毒感染的危险。兹卡病毒感染的症状通常是轻度的，例如发热、红疹、肌肉痛和关节痛。然而，已有报告显示兹卡病毒会引起基兰-巴瑞症候群(Guillain-Barrésyndrome，GBS)和新生儿小头畸形(neonatalmicrocephaly)等神经并发症。小头畸形的发生率在2015年的巴西大爆发后增加了20倍，因而促使世界卫生组织在2016年2月宣布国际公共卫生紧急状况。
兹卡病毒属于黄病毒科的(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，该属尚包含其他由蚊子携带的病毒，如登革病毒(dengue virus，DENV)、黄热病病毒(yellow fevervirus，YFV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、及西尼罗河病毒(WestNile virus，WNV)。兹卡病毒是一种带有套膜的RNA病毒，其直径约50nm且具有多达11kb的单股正链RNA基因体。该基因体编码一多蛋白(polyprotein)，其经转译后修饰形成十个成熟病毒蛋白，包含三个结构蛋白及七个与病毒复制有关的非结构蛋白。该三个结构蛋白分别为壳蛋白(capsid，简称C蛋白)、前膜蛋白(precursor membrane protein，简称prM蛋白)、及套膜蛋白(envelope protein，简称E蛋白)。野生型套膜蛋白在第154个氨基酸位置具有一N-糖链(N-glycan)，其会形成反向平行的同源二聚体(homodimer)以覆盖兹卡病毒的套膜表面，并且参与病毒与宿主细胞受体的结合及调控病毒套膜与细胞膜的融合。套膜蛋白在黄病毒科病毒间有高度保守性与结构相似性，并且是宿主抗体反应的主要标靶。
更具体而言，兹卡病毒套膜蛋白的胞外域(ectodomain)包含具有不同抗原性的三个区域，分别为第一区域(D I)、第二区域(D II)、及第三区域(D III)。该第二区域具有指状结构且包含一二聚体形成区域及一pH敏感性融合环(fusion loop，FL)。该融合环是一具有免疫优势(immunodominance)的高度保守胜肽，其可引发可与他类黄病毒的套膜蛋白产生交叉反应但是病毒中和能力弱的抗体。先前研究显示兹卡病毒与登革病毒的保守性抗原决定位(epitope)包含融合环及其邻近区域。
兹卡病毒与登革病毒的流行地域重迭，且抗兹卡病毒抗体会与登革病毒发生交叉反应，但欠缺中和登革病毒的能力，甚至可能透过与白血球的Fcγ受体(Fcγreceptor)结合而促进登革病毒侵入细胞，造成抗体依赖性增强作用(antibody-dependentenhancement，ADE)及导致更严重的登革病毒感染症状，例如致死率较高的出血性登革热(dengue hemorrhagic fever，DHF)与登革热休克症候群(dengue shock syndrome，DSS)。有鉴于此，兹卡病毒疫苗的研究着重于避免前述情况发生。换言之，研发一种预防性的兹卡病毒疫苗，以避免免疫接种者产生抗兹卡病毒抗体后因感染登革病毒而透过抗体依赖性增强作用发展为登革感染重症，实有迫切需要。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种兹卡病毒套膜蛋白突变体，其具有一遮蔽兹卡病毒套膜蛋白的融合环区域的N-糖链。
在本发明的一实施例中，该兹卡病毒套膜蛋白突变体是在一野生型兹卡病毒套膜蛋白的第105个氨基酸位置有一苏氨酸(threonine)取代，或在第248个及第250个氨基酸位置分别有一天冬酰氨酸(asparagine)及一苏氨酸取代。
本发明的另一目的在提供一种核酸分子，其包含一编码兹卡病毒套膜蛋白突变体的核苷酸序列，其中，该兹卡病毒套膜蛋白突变体是在一野生型兹卡病毒套膜蛋白的第105个氨基酸位置有一苏氨酸取代，或在第248个及第250个氨基酸位置分别有一天冬酰氨酸及一苏氨酸取代。
本发明的又一目的在提供一种疫苗组合物，包含前述兹卡病毒套膜蛋白突变体或一具有编码兹卡病毒套膜蛋白突变体的核苷酸序列的核酸分子的重组病毒，例如重组腺病毒。
在本发明的一实施例中，该包含兹卡病毒套膜蛋白突变体的疫苗组合物进一步包含一兹卡病毒前膜蛋白，或该疫苗组合物中的重组病毒包含一兹卡病毒前膜蛋白基因。
本发明的又一目的在提供一种前述兹卡病毒套膜蛋白突变体的用途，是用于制备预防兹卡病毒感染及降低登革病毒感染的抗体依赖性增强作用的疫苗组合物。
在本发明的一实施例中，该疫苗组合物中的兹卡病毒套膜蛋白突变体可由一重组病毒表现，例如一重组腺病毒。
本发明的兹卡病毒套膜蛋白突变体因为特定点突变而具有额外的N-糖基化修饰。该套膜蛋白突变体藉由N-糖链遮蔽具有高保守性及交叉反应性的融合环区域，能在一个体引发可中和兹卡病毒但降低登革病毒感染的抗体依赖性增强作用的抗体，故而在提升个体对抗兹卡病毒感染的免疫力的同时，降低个体罹患登革病毒感染重症的可能。因此，该兹卡病毒套膜蛋白突变体或一具有编码该套膜蛋白突变体的核苷酸序列的核酸分子的重组病毒可用于制备具上述双重功效的疫苗组合物。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1为兹卡病毒套膜蛋白所形成二聚体的结构示意图(PDB：5JHM)，其标示本发明实施例的六种套膜蛋白突变体的氨基酸取代与N-糖链位置，以及野生型套膜蛋白的N154糖链所在的150环(150loop)。
图2以西方墨点法分析分别受七种重组腺病毒(分别标示为AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、及AdZ-prME-315)感染的293A细胞所表现的兹卡病毒套膜蛋白，包含未经N-糖酰氨酶(peptide-N-glycosidaseF，PNGaseF)处理或经PNGaseF处理的野生型套膜蛋白及六种套膜蛋白突变体。
图3显示BALB/c小鼠经过不同免疫注射后，其血清中对抗重组兹卡病毒套膜蛋白第三区域(简称ZDIII)的总免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)的效价；免疫注射是施予磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
图4A显示BALB/c小鼠经过不同免疫注射后，其血清中兹卡病毒中和抗体的中和曲线；免疫注射是施予PBS溶液、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
图4B是依据图4A计算经不同免疫注射的BALB/c小鼠血清中兹卡病毒中和抗体的效价；免疫注射是施予PBS溶液、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
图5显示BALB/c小鼠经过不同免疫注射后，其血清对第二型登革病毒感染K562细胞的增强效果；免疫注射是施予PBS溶液、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
具体实施方式
定义
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
本文中所谓兹卡病毒套膜蛋白或其突变体的「融合环区域」包含该套膜蛋白或该套膜蛋白突变体的融合环，以及在立体结构上邻近该融合环的区域，包含b股(b strand)、bc环(bc loop)、ij环(ij loop)、及A股(A strand)。该融合环是指第98个至第113个氨基酸的蛋白质片段，该b股是指第67个至第74个氨基酸的蛋白质片段，该bc环是指第75个至第89个氨基酸的蛋白质片段，该ij环是指第248至第256个氨基酸的蛋白质片段，该A股是指第313个至第320个氨基酸的蛋白质片段。
本文中所谓「N-糖链」是指以一N-糖苷键(N-glycosidic bond)共价连接一蛋白质的天冬酰氨酸的糖链，包含约至少十个不同种类的单糖单元。N-糖链依单糖组成具有不同的分子量与结构。
材料及方法
细胞培养
以下实施例中使用细胞可购自美国典型培养物保存中心(American TypeCulture Collection，ATCC)。该些细胞包含人类胚胎肾细胞株293A(ATCC CRL-1573)、人类慢性骨髓性白血病细胞株K562(ATCC CCL-243)、及来自非洲绿猴肾脏上皮的Vero细胞(ATCC CCL-81)及Vero E6细胞(ATCC CRL-1586)。293A细胞培养于添加5％胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)及100U/ml青霉素与链霉素(Invitrogen)的DMEM培养基(Dulbecco’sModified Essential Medium；Thermo Fisher Scientific)。K562细胞株培养于添加10％FBS及100U/ml青霉素与链霉素的IMDM培养基(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium；Thermo Fisher Scientific)。Vero细胞及Vero E6细胞培养于添加5％ FBS及100U/ml青霉素与链霉素的MEM培养基(Minimum Essential Medium，Thermo Fisher Scientific)。前述细胞皆在37℃、5％ CO2的条件下培养。
病毒
兹卡病毒为PRVABC59株(GeneBank：KU501215.1)；第二型登革病毒(DENV2)为NGC株(NGC M29095)。该些病毒是以Vero细胞复制。简言之，Vero细胞以该些病毒感染后，在37℃、5％ CO2的条件下于MEM培养基中培养5天，再收集该培养液离心后的上清液，即获得病毒库存，其是储存于-80℃。
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)
将样品与SDS载入缓冲溶液(50mM三氢甲基氨基甲烷-氯化氢(Tris-HCl)，pH 6.8，2％ SDS，0.05％二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，0.1％溴酚蓝(bromophenol blue)，10％甘油)依3:1混合并煮沸5分钟，再加载包含5％焦集胶体(315μL 1M Tris，pH 6.8，25μL10％ SDS，415μL 30％丙烯酰胺预混液(acrylamide mix)，1.7mL去离子水，25μL 10％过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)，5μL四甲基乙二胺(TEMED))与10％分离胶体(1.25mL 1MTris，pH 8.8，50μL 10％ SDS，1.67mL 30％丙烯酰胺预混液，2mL去离子水，50μL 10％APS，5μL TEMED)的电泳胶体。电泳是在电压80V下进行焦集且在120-150V下进行分离。
西方墨点法(Western blotting)
将经SDS-PAGE分离的样品以电压135V转印至硝化纤维膜(nitrocellulosemembrane)，再将该膜置于添加5％脱脂奶的含Tween-20的三羟甲基氨基缓冲食盐水(简称TBST溶液；50mM Tris，150mM氯化钠，0.05％ Tween-20)，并震荡至少1小时以阻断与抗体间的非专一性结合。该膜经TBST溶液清洗3次，以抗兹卡病毒套膜蛋白的兔多株抗体(GeneTex)依稀释倍数1：5000于4℃的TBST溶液中处理隔夜，再经TBST溶液清洗3次，以连结山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)的山羊抗兔免疫球蛋白G(goat anti-rabbit IgG)二级抗体(GeneTex)依稀释倍数1：10000于TBST溶液中处理，而后以TBST溶液清洗3次。检测时，将增强型化学发光试剂(Western Lighting ECL；PerkinElmer)添加至该膜以产生冷光讯号，并显影至医用X射线胶片(Medical X-ray Film；Fujifilm)。
重组腺病毒的效价(titer)测定
重组腺病毒的效价是利用病毒溶斑试验(plaque assay)测定腺病毒在单层293A细胞造成的病毒溶斑数目。简言之，293A细胞依细胞密度106个细胞/孔接种于6孔培养盘，于37℃下培养一天后，各孔加入以DMEM培养基进行十倍连续稀释的重组腺病毒库存，再于37℃下隔夜培养。其后，移除含病毒的培养基，以添加1％洋菜的DMEM培养基覆盖细胞(2mL/孔)，于37℃下培养1-3天，再次加入该DMEM培养基。细胞感染腺病毒7-10天后可直接观察及计数病毒溶斑，其值以病毒溶斑形成单位(plaque forming unit，PFU)表示。
小鼠免疫注射及样本采集
免疫实验是使用6周龄的BALB/c小鼠。每只小鼠以腹腔注射(intraperitonealinjection)方式施予200μL含108PFU重组腺病毒的磷酸缓冲盐溶液(简称PBS溶液；137mM氯化钠，2.7mM氯化钾，4.3mM磷酸氢二钠，1.4mM磷酸二氢钾，溶于去离子水中，pH7.4)或PBS溶液本身。各组小鼠皆予以二次免疫注射，间隔约为三周。在第二次注射二周后自小鼠尾部采集血液样本。该血液样本以3000rpm离心30分钟可分离得血清。该血清在56℃加热处理30分钟以去除补体活性，并储存于-20℃供后续分析。
抗体含量测定
免疫小鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)的效价是以酵素结合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定。首先，将含有0.2μg/mL重组蛋白的结合溶液(0.05M碳酸缓冲溶液，pH 9.6)加入96孔盘以形成重组蛋白涂层。该96孔盘以TBST溶液清洗后，以含有1％牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS溶液在室温下阻断(blocking)1小时，再以TBST溶液清洗。其后，将前述血清由稀释倍数1：40或1：100开始以稀释缓冲液(含1％ BSA及0.05％ Tween 20的PBS溶液)进行三倍连续稀释及加入该96孔盘，于室温培养1小时。经TBST溶液清洗后，该96孔盘与连结山葵过氧化酶的山羊抗小鼠IgG抗体(稀释倍数1：5000)于室温下培养1小时，再以TBST溶液清洗。最终，将山葵过氧化酶的受质3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethyl-benzidine，TMB；Biolegend)加入该96孔盘，于暗处进行呈色反应15分钟后，以2N硫酸终止反应。使用ELISA读盘机测定各孔在450nm的吸光值(OD450)。统计上显著差异是以双变量变异数分析(two-way ANOVA)判断。
病毒溶斑中和试验(plaque reduction neutralization test，PRNT)
免疫小鼠血清的中和抗体效价是利用病毒溶斑中和试验测定。首先，小鼠血清由稀释倍数1:4开始以PBS溶液进行二倍连续稀释，取100μL稀释液与100PFU兹卡病毒等体积混合，于37℃培养1小时。其次，将该血清与病毒的混合物添加至一天前依5×105个细胞/孔接种Vero细胞的6孔培养盘，于37℃培养1小时。其后，移除6孔培养盘内混合物，以添加1％甲基纤维素、7.5％碳酸氢钠、100U/mL青霉素-链霉素、及1M 2-[4-(羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES)的MEM培养基覆盖细胞(2mL/孔)。在37℃培养4-6天后，移除该覆盖培养基并以含有1％结晶紫(crystal violet)与2％甲醛(formaldehyde)的0.64％氯化钠溶液在室温固定及染色细胞至少1小时，再以水退染以便计数病毒溶斑。相比仅以病毒处理细胞时的病毒溶斑数，因血清-病毒混合物处理而减少的病毒溶斑数可用于计算不同稀释倍数血清的中和百分比并绘制中和曲线。中和抗体的效价定义为使病毒溶斑数减少50％的血清稀释倍数，以PRNT50表示，其值是基于中和试验数据使用软件Graph Pad Prism version 6以回归分析计算。
抗体依赖性增强作用(ADE)试验
免疫小鼠血清对登革病毒感染的增强作用是以表现Fcγ受体的K562细胞株测试。首先，将小鼠血清或4G2抗体由稀释倍数1:10开始以IMEM培养基进行四倍连续稀释，取100μL稀释液与第二型登革病毒(MOI＝1)等体积混合，于37℃培养1小时。其次，将该血清或抗体与病毒的混合物添加至K562细胞，于37℃培养2小时。经IMDM培养基清洗后，该细胞接种于24孔盘并于37℃培养48小时。其后，该细胞以含有4％三聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS溶液在室温下固定30分钟及在4℃放置隔夜，再以含有0.1％Triton X-100的PBS溶液处理5分钟以增加细胞通透性。该细胞以标记荧光染剂Alexa Flour 488的4G2抗体(稀释倍数1：200)在室温下染色30分钟且再悬浮于PBS溶液中，以供流式细胞仪(CytoFLEX；Beckmen)分析。感染增强倍数是以仅经病毒处理的K562细胞的感染程度为比较基准。
实施例1
表现套膜蛋白突变体的重组腺病毒的制备
为遮蔽具有交叉反应性的兹卡病毒套膜蛋白融合环及其邻近区域，本实施例中设计六种在融合环区域具有一N-糖链修饰的套膜蛋白突变体，其N-糖基化位置如图1所示。相比野生型兹卡病毒套膜蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，该六种套膜蛋白突变体具有一或二个氨基酸取代以实现N-糖基化，包含将第74个与第75个氨基酸位置的半胱氨酸(cysteine)与脯氨酸(proline)以天冬酰氨酸与缬氨酸(valine)取代、将第105个氨基酸位置的半胱氨酸以苏氨酸取代、将第248个与第250个氨基酸位置的二个丙氨酸(alanine)以天冬酰氨酸与苏氨酸取代、将第252个氨基酸位置的精氨酸(arginine)以天冬酰氨酸取代、将第313个氨基酸位置的苏氨酸以天冬酰氨酸取代、或将第315个与第317个氨基酸位置的苏氨酸与异白氨酸(isoleucine)以天冬酰氨酸与苏氨酸取代(表1)。该六种套膜蛋白突变体分别名为ZEC74NP75V、ZEC105T、ZEA248NA250T、ZER252N、ZET313N、及ZET315NI317T，其可藉由携带对应基因的重组腺病毒感染一宿主细胞后，于受感染细胞内表现，并覆盖于复制的腺病毒表面。
表1
为建构包含该套膜蛋白突变体基因的腺病毒表现载体(adenoviral expressionvector)，首先，以合成方式制备一经密码子优化(codon-optimized)的脱氧核糖核酸(DNA)，其由5’端至3’端包含一编码C蛋白末端信息胜肽的DNA片段(SEQ ID NO:2)、一野生型兹卡病毒前膜蛋白基因(SEQ ID NO:3)、及一野生型兹卡病毒套膜蛋白基因(SEQ ID NO:4)。利用该DNA及表2所列引物对(primers)进行基于聚合酶链锁反应(Polymerase chainreaction，PCR)的定点突变(site-directed mutagenesis)以获得包含套膜蛋白突变体基因的DNA。该包含套膜蛋白突变体基因的DNA经DNA定序确认其序列后选殖至经限制酶Kpn I与Xho I处理的转入载体pENTR1A(Invitrogen)，再以选殖酶预混试剂(LR Clonase IIEnzyme Mix)选殖至腺病毒表现载体pAd/CMV/V5-DEST(Thermo Fisher Scientific)。
表2
为获得可用于制备疫苗的重组腺病毒颗粒，前述腺病毒表现载体以限制酶Pac I切割而暴露出末端反向重复序列(inverted terminal repeats，ITRs)后，以转染试剂Turbofect(Fermentas)转染至293A细胞。经转染细胞在37℃下培养11-14天至约95％呈现细胞病变后，收集该细胞与培养基，对其进行冷冻溶解(-80℃及37℃)三次以破坏细胞并释放细胞内病毒颗粒，再以离心方式(3000rpm，10分钟，4℃)收集细胞裂解液的上清液，即获得重组腺病毒的库存，储存于-80℃。可用于表现兹卡病毒前膜蛋白(具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列)以及套膜蛋白突变体ZEC74NP75V、ZEC105T、ZEA248NA250T、ZER252N、ZET313N、或ZET315NI317T的重组腺病毒分别标示为AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、及AdZ-prME-315。作为对照，同时制备可用于表现野生型兹卡病毒前膜蛋白及套膜蛋白的重组腺病毒，标示为AdZ-prME-wt。
人类细胞以前述重组腺病毒感染后能否表现带有N-糖链的套膜蛋白突变体是以西方墨点法验证。首先，将106个293A细胞接种于6孔培养盘，培养一天后以前述重组腺病毒依病原/细胞感染倍率(multiplicity of infection，MOI)为2的比例感染该细胞24小时。其后，该受感染细胞以细胞裂解液(Glo lysis buffer；Promega)处理5分钟，并以离心方式(10000xg，20分钟，4℃)收集细胞裂解液的上清液。为检验套膜蛋白突变体上N-糖链的存在，前述上清液经煮沸后以N-糖酰胺酶(PNGaseF；NEB)于37℃处理1-2小时，再以SDS-PAGE及西方墨点法分析。如图2所示，在未以PNGaseF处理的情况下，使用抗兹卡病毒套膜蛋白抗体可侦测到受重组腺病毒感染的细胞所表现的野生型套膜蛋白或套膜蛋白突变体，其讯号在分子量约为54kDa处。当使用PNGaseF切除N-糖链后，野生型套膜蛋白因失去N154糖链而在略低于54kDa处被侦测到，相对地，AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、及AdZ-prME-313组的讯号有较明显位移，由此证明套膜蛋白突变体ZEC74NP75V、ZEC105T、ZEA248NA250T、及ZET313N上有基于突变的额外N-糖链存在。然而，AdZ-prME-252及AdZ-prME-315组的讯号仅有稍许位移，显示套膜蛋白突变体ZER252N及ZET315NI317T有较少量的额外N-糖链。
实施例2
重组腺病毒免疫注射引发抗原专一性IgG
为检验本发明的兹卡病毒套膜蛋白突变体的免疫效果，以腹腔注射方式对BALB/c小鼠(各组4-5只)施予二剂的PBS溶液(负控制组)或实施例1的重组腺病毒(108PFU/200μL)，并以酵素结合免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中抗兹卡病毒套膜蛋白第三区域(简称ZDIII)的总IgG效价。二次免疫注射间隔约为三周，在第二次注射二周后采集小鼠血液样本。总IgG的终点效价(endpoint titer)是为ELISA实验中使OD450测量值达0.2的血清稀释倍数。
图3显示免疫小鼠血清中抗ZDIII重组蛋白的总IgG效价，图中N.D.表示未检出。依据图3，相比重组腺病毒AdZ-prME-wt的注射可引发效价约为1980的抗ZDIII IgG，AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315的注射可引发同样高效价的抗ZDIII IgG；AdZ-prME-105或AdZ-prME-248的注射引发较少量的抗ZDIII IgG(效价约为260-1020)，但与AdZ-prME-wt的组别无显著差异。相对地，AdZ-prME-74的免疫注射无法引发抗ZDIII IgG。此结果显示除了套膜蛋白突变体ZEC74NP75V，本发明的融合环区域被N-糖链遮蔽的兹卡病毒套膜蛋白突变体可引发一个体的抗原专一性IgG。
实施例3
重组腺病毒免疫注射引发兹卡病毒中和抗体
本实施例利用病毒溶斑中和试验(PRNT)测定小鼠依实施例2所述方法进行不同免疫注射后，其免疫血清中对抗兹卡病毒的中和抗体的效价。实验时，将十倍稀释免疫血清或其二倍连续稀释液与100PFU兹卡病毒混合培养，再以该血清与病毒的混合物感染Vero细胞以计算病毒溶斑数及获取中和曲线。中和抗体的效价定义为使病毒溶斑数减少50％的血清稀释倍数，以PRNT50表示。
图4A显示免疫小鼠血清中兹卡病毒中和抗体的中和曲线；图4B显示由图4A计算而得的中和抗体的效价。依据图4A，PBS溶液或AdZ-prME-74的免疫血清在任何稀释倍数皆无法中和兹卡病毒。相对而言，AdZ-prME-wt的免疫血清在十倍稀释时可中和病毒达65％，且其病毒中和能力随稀释倍数增加而减少。同样地，AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315的免疫血清于稀释十倍时可中和病毒达55-85％，且可以剂量依赖方式中和病毒。依据图4B，AdZ-prME-wt、AdZ-prME-105、或AdZ-prME-248所引发中和抗体的效价约为10，AdZ-prME-252所引发中和抗体的效价约为5，AdZ-prME-313或AdZ-prME-315所引发中和抗体的效价约为20。该些结果显示除了套膜蛋白突变体ZEC74NP75V，本发明的融合环区域被N-糖链遮蔽的兹卡病毒套膜蛋白突变体可引发一个体的兹卡病毒中和抗体。
实施例4
重组腺病毒免疫血清降低登革病毒感染增强
本实施例利用抗体依赖性增强作用(ADE)试验测定小鼠依实施例2所述方法进行不同免疫注射后，其免疫血清是否降低登革病毒感染的抗体依赖性增强作用。实验时，将十倍稀释免疫血清或其二倍连续稀释液与第二型登革病毒(DENV2)混合培养，再以该血清与病毒的混合物感染K562白血病细胞以测量感染增强倍数。该增强倍数是以仅经病毒处理的K562细胞的感染程度为比较基准。本实施例使用抗黄病毒套膜蛋白的4G2抗体作为登革病毒ADE试验的正控制组，此抗体已经证实可辨识登革病毒及兹卡病毒的套膜蛋白。
图5显示免疫小鼠血清对第二型登革病毒感染K562细胞的增强效果。依据该图，PBS溶液的免疫血清在任何稀释倍数皆不会造成感染增强，但4G2抗体在640倍至10240倍稀释时造成感染增强，特别是在2560倍稀释时使感染增强60倍。AdZ-prME-wt的免疫血清在10倍、40倍、及160倍稀释时分别增强DENV2感染达65倍、80倍、及40倍，显示血清中的抗兹卡病毒抗体与登革病毒间有交叉反应，因此促进登革病毒的感染。相对地，AdZ-prME-105或AdZ-prME-248的免疫血清不会造成感染增强，该二组的曲线与PBS组几乎重迭。AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315的免疫血清虽会造成感染增强，但其10倍及40倍稀释液的增强效果明显低于AdZ-prME-wt组。此结果说明本发明的融合环区域被N-糖链遮蔽的兹卡病毒套膜蛋白突变体所引发抗体与登革病毒间有较差的交叉反应，因此能降低甚至避免登革病毒感染的抗体依赖性增强作用，例如ZEC105T及ZEA248NA250T突变体可引发彻底避免登革病毒感染增强的抗体。
综上所述，本发明的兹卡病毒套膜蛋白突变体因为特定点突变而具有额外的N-糖基化修饰。相比野生型套膜蛋白所引发抗体可中和兹卡病毒却大幅增强登革病毒感染，该套膜蛋白突变体藉由N-糖链遮蔽具有高保守性及交叉反应性的融合环区域，能在一个体引发可中和兹卡病毒且降低登革病毒感染的抗体依赖性增强作用的抗体，故而在提升个体对抗兹卡病毒感染的免疫力的同时，降低个体罹患登革病毒感染重症的可能。因此，该兹卡病毒套膜蛋白突变体，特别是包含C105T的单取代或A248N与A250T的双取代的套膜蛋白突变体，或一具有编码该套膜蛋白突变体的核苷酸序列的核酸分子的重组病毒可用于制备具上述双重功效的疫苗组合物。
Claims (10)
1.一种兹卡病毒套膜蛋白突变体，其具有遮蔽兹卡病毒套膜蛋白的融合环区域的N-糖链，是在野生型兹卡病毒套膜蛋白的第248个及第250个氨基酸位置分别有天冬酰氨酸及苏氨酸取代；
所述野生型兹卡病毒套膜蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种核酸分子，其编码如权利要求1所述的兹卡病毒套膜蛋白突变体。
3.一种疫苗组合物，包含如权利要求1所述的兹卡病毒套膜蛋白突变体。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，进一步包含兹卡病毒前膜蛋白。
5.一种疫苗组合物，包含具有如权利要求2所述的核酸分子的重组病毒。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述重组病毒包含兹卡病毒前膜蛋白基因。
7.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述重组病毒是重组腺病毒。
8.一种兹卡病毒套膜蛋白突变体的用途，是用于制备预防兹卡病毒感染及降低登革病毒感染的抗体依赖性增强作用的疫苗组合物，其中该兹卡病毒套膜蛋白突变体具有遮蔽兹卡病毒套膜蛋白的融合环区域的N-糖链；
所述兹卡病毒套膜蛋白突变体是在野生型兹卡病毒套膜蛋白的第248个及第250个氨基酸位置分别有天冬酰氨酸及苏氨酸取代；
所述野生型兹卡病毒套膜蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
9.根据权利要求8项所述的用途，其特征在于，所述兹卡病毒套膜蛋白突变体是由重组病毒所表现。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述重组病毒是重组腺病毒。
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