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TWI658848B - 茲卡病毒疫苗組合物及其應用 - Google Patents

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TWI658848B
TWI658848B TW107105338A TW107105338A TWI658848B TW I658848 B TWI658848 B TW I658848B TW 107105338 A TW107105338 A TW 107105338A TW 107105338 A TW107105338 A TW 107105338A TW I658848 B TWI658848 B TW I658848B
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楊劭苹
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國立清華大學
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Abstract

本發明提供一種茲卡病毒套膜蛋白突變體及一種包含編碼該突變體的核苷酸序列的核酸分子。該茲卡病毒套膜蛋白突變體較佳為在一野生型茲卡病毒套膜蛋白的第105個胺基酸位置有一蘇胺酸取代，或在第248個及第250個胺基酸位置分別有一天冬醯胺酸及一蘇胺酸取代，因此具有一遮蔽茲卡病毒套膜蛋白的融合環區域的N-醣鏈。本發明亦提供一種疫苗組合物，其包含該茲卡病毒套膜蛋白突變體或一具有該核酸分子的重組病毒。本發明亦提供該茲卡病毒套膜蛋白突變體之用途，係用於製備預防茲卡病毒感染及降低登革病毒感染之抗體依賴性增強作用的疫苗組合物。

Description

茲卡病毒疫苗組合物及其應用
本發明係關於一種重組蛋白質、核酸分子及其用途，特別係關於一種茲卡病毒套膜蛋白突變體及具有其對應核苷酸序列的核酸分子、一種包含該套膜蛋白突變體或具有該核酸分子的重組病毒的疫苗組合物、及該套膜蛋白突變體用於製備疫苗組合物的用途。
茲卡病毒(Zika virus，ZIKV)是一種伊蚊傳播的病毒，自2015年在巴西爆發感染已成為全球公共衛生的關注焦點。據2016年世界衛生組織(World Health Organization)的統計，茲卡病毒已在亞洲、北美洲、非洲、及澳洲的熱帶和亞熱帶地區的70多個國家蔓延。由於蚊子媒介的廣泛傳播，全世界超過250萬人面臨茲卡病毒感染的危險。茲卡病毒感染的症狀通常是輕度的，例如發熱、紅疹、肌肉痛和關節痛。然而，已有報告顯示茲卡病毒會引起基蘭-巴瑞症候群(Guillain-Barré syndrome，GBS)和新生兒小頭畸形(neonatal microcephaly)等神經併發症。小頭畸形的發生率在2015年的巴西大爆發後增加了20倍，因而促使世界衛生組織在2016年2月宣佈國際公共衛生緊急狀況。
茲卡病毒屬於黃病毒科之(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)，該屬尚包含其他由蚊子攜帶的病毒，如登革病毒(dengue virus，DENV)、黃熱病病毒(yellow fever virus，YFV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、及西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)。茲卡病毒是一種帶有套膜的RNA病毒，其直徑約50nm且具有多達11kb之單股正鏈RNA基因體。該基因體編碼一多蛋白(polyprotein)，其經轉譯後修飾形成十個成熟病毒蛋白，包含三個結構蛋白及七個與病毒複製有關的非結構蛋白。該三個結構蛋白分別為殼蛋白(capsid，簡稱C 蛋白)、前膜蛋白(precursor membrane protein，簡稱prM蛋白)、及套膜蛋白(envelope protein，簡稱E蛋白)。野生型套膜蛋白在第154個胺基酸位置具有一N-醣鏈(N-glycan)，其會形成反向平行的同源二聚體(homodimer)以覆蓋茲卡病毒的套膜表面，並且參與病毒與宿主細胞受體之結合及調控病毒套膜與細胞膜之融合。套膜蛋白在黃病毒科病毒間有高度保守性與結構相似性，並且是宿主抗體反應的主要標靶。
更具體而言，茲卡病毒套膜蛋白的胞外域(ectodomain)包含具有不同抗原性的三個區域，分別為第一區域(D I)、第二區域(D II)、及第三區域(D III)。該第二區域具有指狀結構且包含一二聚體形成區域及一pH敏感性融合環(fusion loop，FL)。該融合環是一具有免疫優勢(immunodominance)的高度保守胜肽，其可引發可與他類黃病毒的套膜蛋白產生交叉反應但是病毒中和能力弱的抗體。先前研究顯示茲卡病毒與登革病毒的保守性抗原決定位(epitope)包含融合環及其鄰近區域。
茲卡病毒與登革病毒的流行地域重疊，且抗茲卡病毒抗體會與登革病毒發生交叉反應，但欠缺中和登革病毒的能力，甚至可能透過與白血球的Fcγ受體(Fcγ receptor)結合而促進登革病毒侵入細胞，造成抗體依賴性增強作用(antibody-dependent enhancement，ADE)及導致更嚴重的登革病毒感染症狀，例如致死率較高的出血性登革熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)與登革熱休克症候群(dengue shock syndrome，DSS)。有鑑於此，茲卡病毒疫苗的研究著重於避免前述情況發生。換言之，研發一種預防性的茲卡病毒疫苗，以避免免疫接種者產生抗茲卡病毒抗體後因感染登革病毒而透過抗體依賴性增強作用發展為登革感染重症，實有迫切需要。
緣此，本發明之一目的在提供一種茲卡病毒套膜蛋白突變體，其具有一遮蔽茲卡病毒套膜蛋白的融合環區域的N-醣鏈。
在本發明之一實施例中，該茲卡病毒套膜蛋白突變體係在一野生型茲卡病毒套膜蛋白的第105個胺基酸位置有一蘇胺酸(threonine)取代，或在第248個及第250個胺基酸位置分別有一天冬醯胺酸(asparagine)及一蘇胺酸取代。
本發明之另一目的在提供一種核酸分子，其包含一編碼茲卡病毒套膜蛋白突變體的核苷酸序列，其中，該茲卡病毒套膜蛋白突變體係在一野生型茲卡病毒套膜蛋白的第105個胺基酸位置有一蘇胺酸取代，或在第248個及第250個胺基酸位置分別有一天冬醯胺酸及一蘇胺酸取代。
本發明之又一目的在提供一種疫苗組合物，包含前述茲卡病毒套膜蛋白突變體或一具有編碼茲卡病毒套膜蛋白突變體的核苷酸序列的核酸分子的重組病毒，例如重組腺病毒。
在本發明之一實施例中，該包含茲卡病毒套膜蛋白突變體的疫苗組合物進一步包含一茲卡病毒前膜蛋白，或該疫苗組合物中的重組病毒包含一茲卡病毒前膜蛋白基因。
本發明之又一目的在提供一種前述茲卡病毒套膜蛋白突變體之用途，係用於製備預防茲卡病毒感染及降低登革病毒感染之抗體依賴性增強作用的疫苗組合物。
在本發明之一實施例中，該疫苗組合物中的茲卡病毒套膜蛋白突變體可由一重組病毒表現，例如一重組腺病毒。
本發明之茲卡病毒套膜蛋白突變體因為特定點突變而具有額外的N-醣基化修飾。該套膜蛋白突變體藉由N-醣鏈遮蔽具有高保守性及交叉反應性的融合環區域，能在一個體引發可中和茲卡病毒但降低登革病毒感染之抗體依賴性增強作用的抗體，故而在提升個體對抗茲卡病毒感染之免疫力的同時，降低個體罹患登革病毒感染重症的可能。因此，該茲卡病毒套膜蛋白突變體或一具有編碼該套膜蛋白突變體的核苷酸序列的核酸分子的重組病毒可用於製備具上述雙重功效的疫苗組合物。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為茲卡病毒套膜蛋白所形成二聚體的結構示意圖(PDB：5JHM)，其標示本發明實施例之六種套膜蛋白突變體的胺基酸取代與N-醣鏈位置，以及野生型套膜蛋白的N154醣鏈所在的150環(150 loop)。
圖2係以西方墨點法分析分別受七種重組腺病毒(分別標示為AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、及AdZ-prME-315)感染的293A細胞所表現的茲卡病毒套膜蛋白，包含未經N-醣醯胺酶(peptide-N-glycosidase F，PNGaseF)處理或經PNGaseF處理的野生型套膜蛋白及六種套膜蛋白突變體。
圖3顯示BALB/c小鼠經過不同免疫注射後，其血清中對抗重組茲卡病毒套膜蛋白第三區域(簡稱ZDIII)之總免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)之效價；免疫注射係施予磷酸緩衝鹽溶液(PBS溶液)、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
圖4A顯示BALB/c小鼠經過不同免疫注射後，其血清中茲卡病毒中和抗體的中和曲線；免疫注射係施予PBS溶液、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
圖4B係依據圖4A計算經不同免疫注射之BALB/c小鼠血清中茲卡病毒中和抗體之效價；免疫注射係施予PBS溶液、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
圖5顯示BALB/c小鼠經過不同免疫注射後，其血清對第二型登革病毒感染K562細胞的增強效果；免疫注射係施予PBS溶液、AdZ-prME-wt、AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本文中所謂茲卡病毒套膜蛋白或其突變體的「融合環區域」包含該套膜蛋白或該套膜蛋白突變體之融合環，以及在立體結構上鄰近該融合環的區域，包含b股(b strand)、bc環(bc loop)、ij環(ij loop)、及A股(A strand)。該融合環係指第98個至第113個胺基酸的蛋白質片段，該b股係指第67個至第74個胺基酸的蛋白質片段，該bc環係指第75個至第89個胺基酸的蛋白質片段，該ij環係指第248至第256個胺基酸的蛋白質片段，該A股係指第313個至第320個胺基酸的蛋白質片段。
本文中所謂「N-醣鏈」係指以一N-醣苷鍵(N-glycosidic bond)共價連接一蛋白質的天冬醯胺酸的醣鏈，包含約至少十個不同種類的單醣單元。N-醣鏈依單醣組成具有不同的分子量與結構。
材料及方法 細胞培養
以下實施例中使用細胞可購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)。該些細胞包含人類胚胎腎細胞株293A(ATCC CRL-1573)、人類慢性骨髓性白血病細胞株K562(ATCC CCL-243)、及來自非洲綠猴腎臟上皮的Vero細胞(ATCC CCL-81)及Vero E6細胞(ATCC CRL-1586)。293A細胞培養於添加5%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及100U/ml青黴素與鏈黴素(Invitrogen)之DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Essential Medium；Thermo Fisher Scientific)。K562細胞株培養於添加10%FBS及100U/ml青黴素與鏈黴素之IMDM培養基(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium；Thermo Fisher Scientific)。Vero細胞及Vero E6細胞培養於添加5%FBS及100U/ml青黴素與鏈黴素之MEM培養基(Minimum Essential Medium，Thermo Fisher Scientific)。前述細胞皆在37℃、5%CO2之條件下培養。
病毒
茲卡病毒為PRVABC59株(GeneBank：KU501215.1)；第二型登革病毒(DENV2)為NGC株(NGC M29095)。該些病毒係以Vero細胞複製。簡言之，Vero細胞以該些病毒感染後，在37℃、5%CO2之條件下於MEM培養基中培養5天，再收集該培養液離心後之上清液，即獲得病毒庫存，其係儲存於-80℃。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)
將樣品與SDS載入緩衝溶液(50mM三氫甲基氨基甲烷-氯化氫(Tris-HCl)，pH 6.8，2%SDS，0.05%二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，0.1%溴酚藍(bromophenol blue)，10%甘油)依3：1混合並煮沸5分鐘，再載入包含5%焦集膠體(315μL 1M Tris，pH 6.8，25μL 10%SDS，415μL 30%丙烯醯胺預混液(acrylamide mix)，1.7mL去離子水，25μL 10%過硫酸銨(ammonium persulfate，APS)，5μL四甲基乙二胺(TEMED))與10%分離膠體(1.25mL 1M Tris，pH 8.8，50μL 10%SDS，1.67mL 30%丙烯醯胺預混液，2mL去離子水，50μL 10%APS，5μL TEMED)之電泳膠體。電泳係在電壓80V下進行焦集且在120-150V下進行分離。
西方墨點法(Western blotting)
將經SDS-PAGE分離之樣品以電壓135V轉印至硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)，再將該膜置於添加5%脫脂奶的含Tween-20之三羥甲基氨基緩衝食鹽水(簡稱TBST溶液；50mM Tris，150mM氯化鈉，0.05%Tween-20)，並震盪至少1小時以阻斷與抗體間的非專一性結合。該膜經TBST溶液清洗3次，以抗茲卡病毒套膜蛋白的兔多株抗體(GeneTex)依稀釋倍數1：5000於4℃的TBST溶液中處理隔夜，再經TBST溶液清洗3次，以連結山葵過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)之山羊抗兔免疫球蛋白G(goat anti-rabbit IgG)二級抗體(GeneTex)依稀釋倍數1：10000於TBST溶液中處理，而後以TBST溶液清洗3次。檢測時，將增強型化學發光試劑(Western Lighting ECL；PerkinElmer)添加至該膜以產生冷光訊號，並顯影至醫用X射線膠片(Medical X-ray Film；Fujifilm)。
重組腺病毒之效價(titer)測定
重組腺病毒的效價係利用病毒溶斑試驗(plaque assay)測定腺病毒在單層293A細胞造成的病毒溶斑數目。簡言之，293A細胞依細胞密度106個細胞/孔接種於6孔培養盤，於37℃下培養一天後，各孔加入以DMEM培養基進行十倍連續稀釋之重組腺病毒庫存，再於37℃下隔夜培養。其後，移除含病毒之培養基，以添加1%洋菜之DMEM培養基覆蓋細胞(2mL/孔)，於37℃下培養1-3天，再次加入該DMEM培養基。細胞感染腺病毒7-10天後可直接觀察及計數病毒溶斑，其值以病毒溶斑形成單位(plaque forming unit，PFU)表示。
小鼠免疫注射及樣本採集
免疫實驗係使用6週齡之BALB/c小鼠。每隻小鼠以腹腔注射(intraperitoneal injection)方式施予200μL含108PFU重組腺病毒的磷酸緩衝鹽溶液(簡稱PBS溶液；137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，4.3mM磷酸氫二鈉，1.4mM磷酸二氫鉀，溶於去離子水中，pH7.4)或PBS溶液本身。各組小鼠皆予以二次免疫注射，間隔約為三週。在第二次注射二週後自小鼠尾部採集血液樣本。該血液樣本以3000rpm離心30分鐘可分離得血清。該血清在56℃加熱處理30分鐘以去除補體活性，並儲存於-20℃供後續分析。
抗體含量測定
免疫小鼠血清中免疫球蛋白G(IgG)之效價係以酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定。首先，將含有0.2μg/mL重組蛋白的結合溶液(0.05M碳酸緩衝溶液，pH 9.6)加入96孔盤以形成重組蛋白塗層。該96孔盤以TBST溶液清洗後，以含有1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS溶液在室溫下阻斷(blocking)1小時，再以TBST溶液清洗。其後，將前述血清由稀釋倍數1：40或1：100開始以稀釋緩衝液(含1%BSA及0.05%Tween 20的PBS溶液)進行三倍連續稀釋及加入該96孔盤，於室溫培養1小時。經TBST溶液清洗後，該96孔盤與連結山葵過氧化酶之山羊抗小鼠IgG抗體(稀釋倍數1：5000)於室溫下培養1小時，再以TBST溶液清洗。最終，將山葵過氧化酶之受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-Tetramethyl-benzidine，TMB；Biolegend)加入該96孔盤，於暗處進行呈色反應15分鐘後，以2N硫酸終止反應。使用ELISA讀盤機測定各孔在450nm之吸光值(OD450)。統計上顯著差異係以雙變量變異數分析(two-way ANOVA)判斷。
病毒溶斑中和試驗(plaque reduction neutralization test，PRNT)
免疫小鼠血清之中和抗體效價係利用病毒溶斑中和試驗測定。首先，小鼠血清由稀釋倍數1：4開始以PBS溶液進行二倍連續稀釋，取100μL稀釋液與100PFU茲卡病毒等體積混合，於37℃培養1小時。其次，將該血清與病毒之混合物添加至一天前依5×105個細胞/孔接種Vero細胞的6孔培養盤，於37℃培養1小時。其後，移除6孔培養盤內混合物，以添加1%甲基纖維素、7.5%碳酸氫鈉、100U/mL青黴素-鏈黴素、及1M 2-[4-(羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES)之MEM培養基 覆蓋細胞(2mL/孔)。在37℃培養4-6天後，移除該覆蓋培養基並以含有1%結晶紫(crystal violet)與2%甲醛(formaldehyde)之0.64%氯化鈉溶液在室溫固定及染色細胞至少1小時，再以水退染以便計數病毒溶斑。相比僅以病毒處理細胞時的病毒溶斑數，因血清-病毒混合物處理而減少的病毒溶斑數可用於計算不同稀釋倍數血清的中和百分比並繪製中和曲線。中和抗體之效價定義為使病毒溶斑數減少50%的血清稀釋倍數，以PRNT50表示，其值係基於中和試驗資料使用軟體Graph Pad Prism version 6以迴歸分析計算。
抗體依賴性增強作用(ADE)試驗
免疫小鼠血清對登革病毒感染的增強作用係以表現Fcγ受體的K562細胞株測試。首先，將小鼠血清或4G2抗體由稀釋倍數1：10開始以IMEM培養基進行四倍連續稀釋，取100μL稀釋液與第二型登革病毒(MOI=1)等體積混合，於37℃培養1小時。其次，將該血清或抗體與病毒之混合物添加至K562細胞，於37℃培養2小時。經IMDM培養基清洗後，該細胞接種於24孔盤並於37℃培養48小時。其後，該細胞以含有4%三聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS溶液在室溫下固定30分鐘及在4℃放置隔夜，再以含有0.1%Triton X-100的PBS溶液處理5分鐘以增加細胞通透性。該細胞以標記螢光染劑Alexa Flour 488之4G2抗體(稀釋倍數1：200)在室溫下染色30分鐘且再懸浮於PBS溶液中，以供流式細胞儀(CytoFLEX；Beckmen)分析。感染增強倍數係以僅經病毒處理之K562細胞的感染程度為比較基準。
實施例1 表現套膜蛋白突變體的重組腺病毒之製備
為遮蔽具有交叉反應性的茲卡病毒套膜蛋白融合環及其鄰近區域，本實施例中設計六種在融合環區域具有一N-醣鏈修飾的套膜蛋白突變體，其N-醣基化位置如圖1所示。相比野生型茲卡病毒套膜蛋白的胺基酸序列(SEQ ID NO：1)，該六種套膜蛋白突變體具有一或二個胺基酸取代以實現N-醣基化，包含將第74個與第75個胺基酸位置的半胱胺酸(cysteine)與脯胺酸(proline)以天冬醯胺酸與纈胺酸(valine)取代、將第105個胺基酸位置的半胱胺酸以蘇胺酸取代、將第248個與第250個胺基酸位置的二個丙胺酸(alanine)以天冬醯胺酸與蘇胺酸取代、將第252個胺基酸位置的精胺酸(arginine)以天冬醯胺酸取代、將第313個 胺基酸位置的蘇胺酸以天冬醯胺酸取代、或將第315個與第317個胺基酸位置的蘇胺酸與異白胺酸(isoleucine)以天冬醯胺酸與蘇胺酸取代(表1)。該六種套膜蛋白突變體分別名為ZEC74NP75V、ZEC105T、ZEA248NA250T、ZER252N、ZET313N、及ZET315NI317T，其可藉由攜帶對應基因之重組腺病毒感染一宿主細胞後，於受感染細胞內表現，並覆蓋於複製的腺病毒表面。
為建構包含該套膜蛋白突變體基因的腺病毒表現載體(adenoviral expression vector)，首先，以合成方式製備一經密碼子優化(codon-optimized)的去氧核醣核酸(DNA)，其由5’端至3’端包含一編碼C蛋白末端訊息胜肽的DNA片段(SEQ ID NO：2)、一野生型茲卡病毒前膜蛋白基因(SEQ ID NO：3)、及一野生型茲卡病毒套膜蛋白基因(SEQ ID NO：4)。利用該DNA及表2所列引子對(primers)進行基於聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)之定點突變(site-directed mutagenesis)以獲得包含套膜蛋白突變體基因的DNA。該包含套膜蛋白突變體基因的DNA經DNA定序確認其序列後選殖至經限制酶Kpn I與Xho I處理之轉入載體pENTR1A(Invitrogen)，再以選殖酶預混試劑(LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix)選殖至腺病毒表現載體pAd/CMV/V5-DEST(Thermo Fisher Scientific)。
為獲得可用於製備疫苗的重組腺病毒顆粒，前述腺病毒表現載體以限制酶Pac I切割而暴露出末端反向重複序列(inverted terminal repeats，ITRs)後，以轉染試劑Turbofect(Fermentas)轉染至293A細胞。經轉染細胞在37℃下培養11-14天至約95%呈現細胞病變後，收集該細胞與培養基，對其進行冷凍溶解(-80℃及37℃)三次以破壞細胞並釋放細胞內病毒顆粒，再以離心方式(3000rpm，10分鐘，4℃)收集細胞裂解液的上清液，即獲得重組腺病毒之庫存，儲存於-80℃。可用於表現茲卡病毒前膜蛋白(具有SEQ ID NO：17之胺基酸序列)以及套膜蛋白突變體ZEC74NP75V、ZEC105T、ZEA248NA250T、ZER252N、ZET313N、或ZET315NI317T之重組腺病毒分別標示為AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、及AdZ-prME-315。作為對照，同時製備可用於表現野生型茲卡病毒前膜蛋白及套膜蛋白的重組腺病毒，標示為AdZ-prME-wt。
人類細胞以前述重組腺病毒感染後能否表現帶有N-醣鏈的套膜蛋白突變體係以西方墨點法驗證。首先，將106個293A細胞接種於6孔培養盤，培養一天後以前述重組腺病毒依病原/細胞感染倍率(multiplicity of infection，MOI)為2之比例感染該細胞24小時。其後，該受感染細胞以細胞裂解液(Glo lysis buffer；Promega)處理5分鐘，並以離心方式(10000 xg，20分鐘，4℃)收集細胞裂解液的上清液。為檢驗套膜蛋白突變體上N-醣鏈的存在，前述上清液經煮沸後以N-醣醯胺酶(PNGaseF；NEB)於37℃處理1-2小時，再以SDS-PAGE及西方墨點法分析。如圖2所示，在未以PNGaseF處理的情況下，使用抗茲卡病毒套膜蛋白抗體可偵測到受重組腺病毒感染的細胞所表現的野生型套膜蛋白或套膜蛋白突 變體，其訊號在分子量約為54kDa處。當使用PNGaseF切除N-醣鏈後，野生型套膜蛋白因失去N154醣鏈而在略低於54kDa處被偵測到，相對地，AdZ-prME-74、AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、及AdZ-prME-313組的訊號有較明顯位移，由此證明套膜蛋白突變體ZEC74NP75V、ZEC105T、ZEA248NA250T、及ZET313N上有基於突變的額外N-醣鏈存在。然而，AdZ-prME-252及AdZ-prME-315組的訊號僅有稍許位移，顯示套膜蛋白突變體ZER252N及ZET315NI317T有較少量的額外N-醣鏈。
實施例2 重組腺病毒免疫注射引發抗原專一性IgG
為檢驗本發明之茲卡病毒套膜蛋白突變體的免疫效果，以腹腔注射方式對BALB/c小鼠(各組4-5隻)施予二劑之PBS溶液(負控制組)或實施例1之重組腺病毒(108PFU/200μL)，並以酵素結合免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清中抗茲卡病毒套膜蛋白第三區域(簡稱ZDIII)之總IgG效價。二次免疫注射間隔約為三週，在第二次注射二週後採集小鼠血液樣本。總IgG之終點效價(endpoint titer)係為ELISA實驗中使OD450測量值達0.2之血清稀釋倍數。
圖3顯示免疫小鼠血清中抗ZDIII重組蛋白之總IgG效價，圖中N.D.表示未檢出。依據圖3，相比重組腺病毒AdZ-prME-wt之注射可引發效價約為1980的抗ZDIII IgG，AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315之注射可引發同樣高效價的抗ZDIII IgG；AdZ-prME-105或AdZ-prME-248之注射引發較少量的抗ZDIII IgG(效價約為260-1020)，但與AdZ-prME-wt之組別無顯著差異。相對地，AdZ-prME-74之免疫注射無法引發抗ZDIII IgG。此結果顯示除了套膜蛋白突變體ZEC74NP75V，本發明之融合環區域被N-醣鏈遮蔽之茲卡病毒套膜蛋白突變體可引發一個體的抗原專一性IgG。
實施例3 重組腺病毒免疫注射引發茲卡病毒中和抗體
本實施例利用病毒溶斑中和試驗(PRNT)測定小鼠依實施例2所述方法進行不同免疫注射後，其免疫血清中對抗茲卡病毒之中和抗體之效價。實驗時，將十倍稀釋免疫血清或其二倍連續稀釋液與100PFU茲卡病毒混合培養，再以該血清與病毒之混合物感染Vero細胞以計算病毒溶斑數及獲取中和曲 線。中和抗體之效價定義為使病毒溶斑數減少50%的血清稀釋倍數，以PRNT50表示。
圖4A顯示免疫小鼠血清中茲卡病毒中和抗體的中和曲線；圖4B顯示由圖4A計算而得之中和抗體之效價。依據圖4A，PBS溶液或AdZ-prME-74的免疫血清在任何稀釋倍數皆無法中和茲卡病毒。相對而言，AdZ-prME-wt的免疫血清在十倍稀釋時可中和病毒達65%，且其病毒中和能力隨稀釋倍數增加而減少。同樣地，AdZ-prME-105、AdZ-prME-248、AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315的免疫血清於稀釋十倍時可中和病毒達55-85%，且可以劑量依賴方式中和病毒。依據圖4B，AdZ-prME-wt、AdZ-prME-105、或AdZ-prME-248所引發中和抗體之效價約為10，AdZ-prME-252所引發中和抗體之效價約為5，AdZ-prME-313或AdZ-prME-315所引發中和抗體之效價約為20。該些結果顯示除了套膜蛋白突變體ZEC74NP75V，本發明之融合環區域被N-醣鏈遮蔽之茲卡病毒套膜蛋白突變體可引發一個體的茲卡病毒中和抗體。
實施例4 重組腺病毒免疫血清降低登革病毒感染增強
本實施例利用抗體依賴性增強作用(ADE)試驗測定小鼠依實施例2所述方法進行不同免疫注射後，其免疫血清是否降低登革病毒感染的抗體依賴性增強作用。實驗時，將十倍稀釋免疫血清或其二倍連續稀釋液與第二型登革病毒(DENV2)混合培養，再以該血清與病毒之混合物感染K562白血病細胞以測量感染增強倍數。該增強倍數係以僅經病毒處理之K562細胞的感染程度為比較基準。本實施例使用抗黃病毒套膜蛋白之4G2抗體作為登革病毒ADE試驗的正控制組，此抗體已經證實可辨識登革病毒及茲卡病毒的套膜蛋白。
圖5顯示免疫小鼠血清對第二型登革病毒感染K562細胞的增強效果。依據該圖，PBS溶液的免疫血清在任何稀釋倍數皆不會造成感染增強，但4G2抗體在640倍至10240倍稀釋時造成感染增強，特別是在2560倍稀釋時使感染增強60倍。AdZ-prME-wt的免疫血清在10倍、40倍、及160倍稀釋時分別增強DENV2感染達65倍、80倍、及40倍，顯示血清中的抗茲卡病毒抗體與登革病毒間有交叉反應，因此促進登革病毒的感染。相對地，AdZ-prME-105或AdZ-prME-248的免疫血清不會造成感染增強，該二組的曲線與PBS組幾乎重 疊。AdZ-prME-252、AdZ-prME-313、或AdZ-prME-315的免疫血清雖會造成感染增強，但其10倍及40倍稀釋液的增強效果明顯低於AdZ-prME-wt組。此結果說明本發明之融合環區域被N-醣鏈遮蔽之茲卡病毒套膜蛋白突變體所引發抗體與登革病毒間有較差的交叉反應，因此能降低甚至避免登革病毒感染的抗體依賴性增強作用，例如ZEC105T及ZEA248NA250T突變體可引發徹底避免登革病毒感染增強的抗體。
綜上所述，本發明之茲卡病毒套膜蛋白突變體因為特定點突變而具有額外的N-醣基化修飾。相比野生型套膜蛋白所引發抗體可中和茲卡病毒卻大幅增強登革病毒感染，該套膜蛋白突變體藉由N-醣鏈遮蔽具有高保守性及交叉反應性的融合環區域，能在一個體引發可中和茲卡病毒且降低登革病毒感染之抗體依賴性增強作用的抗體，故而在提升個體對抗茲卡病毒感染之免疫力的同時，降低個體罹患登革病毒感染重症的可能。因此，該茲卡病毒套膜蛋白突變體，特別是包含C105T之單取代或A248N與A250T之雙取代的套膜蛋白突變體，或一具有編碼該套膜蛋白突變體的核苷酸序列的核酸分子的重組病毒可用於製備具上述雙重功效的疫苗組合物。
<110> 國立清華大學
<120> 茲卡病毒疫苗組合物及其應用
<130> 106B0581-I1
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 504
<212> PRT
<213> 茲卡病毒
<400> 1
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> C蛋白末端訊息胜肽
<400> 2
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<212> DNA
<213> 茲卡病毒
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<212> DNA
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<210> 5
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<223> 定點突變之PCR引子
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<213> 茲卡病毒
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Claims (10)

  1. 一種茲卡病毒套膜蛋白突變體，係在一野生型茲卡病毒套膜蛋白的第105個胺基酸位置有一蘇胺酸取代，或在第248個及第250個胺基酸位置分別有一天冬醯胺酸及一蘇胺酸取代。
  2. 一種核酸分子，包含一編碼如申請專利範圍第1項所述之茲卡病毒套膜蛋白突變體的核苷酸序列。
  3. 一種疫苗組合物，包含如申請專利範圍第1項所述之茲卡病毒套膜蛋白突變體。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之疫苗組合物，進一步包含一茲卡病毒前膜蛋白。
  5. 一種疫苗組合物，包含一具有如申請專利範圍第2項所述之核酸分子的重組病毒。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之疫苗組合物，其中該重組病毒包含一茲卡病毒前膜蛋白基因。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之疫苗組合物，其中該重組病毒係為一重組腺病毒。
  8. 一種茲卡病毒套膜蛋白突變體之用途，係用於製備預防茲卡病毒感染及登革病毒感染之抗體依賴性增強作用的疫苗組合物，其中該茲卡病毒套膜蛋白突變體係在一野生型茲卡病毒套膜蛋白的第105個胺基酸位置有一蘇胺酸取代，或在第248個及第250個胺基酸位置分別有一天冬醯胺酸及一蘇胺酸取代。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該茲卡病毒套膜蛋白突變體係由一重組病毒所表現。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該重組病毒係為一重組腺病毒。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694686A (zh) * 2023-06-08 2023-09-05 宁波大学 乙型脑炎重组腺病毒穿梭质粒、腺病毒质粒、病毒及其制备方法和应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12064476B2 (en) 2018-10-26 2024-08-20 New York Blood Center, Inc. Zika virus immunogenic compositions
CN112980805B (zh) * 2021-02-25 2022-11-08 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种重组寨卡病毒减毒株及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017201543A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 ANDERSON, Koren Variant flavivirus envelope sequences and uses thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017070624A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
WO2017109227A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Valneva Austria Gmbh Zika virus purification

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017201543A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 ANDERSON, Koren Variant flavivirus envelope sequences and uses thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694686A (zh) * 2023-06-08 2023-09-05 宁波大学 乙型脑炎重组腺病毒穿梭质粒、腺病毒质粒、病毒及其制备方法和应用

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