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CN110051650A - 用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒药物 - Google Patents

用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒药物 Download PDF

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CN110051650A
CN110051650A CN201910353060.4A CN201910353060A CN110051650A CN 110051650 A CN110051650 A CN 110051650A CN 201910353060 A CN201910353060 A CN 201910353060A CN 110051650 A CN110051650 A CN 110051650A
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CN
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dexamethasone
bevacizumab
nanoparticle
plga
intravitreal injection
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CN201910353060.4A
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李又欣
孙凤英
刘佳欣
李鸽
徐飞
李爽
滕乐生
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Nanjing Keen Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Nanjing Keen Biotechnology Co Ltd
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Publication date
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Abstract

本发明公开一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒药物,通过以PLGA为基质的纳米粒将地塞米松和贝伐单抗联合，制备了贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒（Bev/Dex‑PLGA NPs），形成了具有核壳结构的的纳米药物递送系统。解决了地塞米松半衰期短的不足，保证了制备过程中贝伐单抗的高活性，通过二者协同作用有效提高抗血管生成效果。本发明构建的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统，是一种优良的递药系统，有望应用于年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗。

Description

用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒药物
技术领域
本发明公开一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒药物递送系统，同时还提供了该纳米粒药物递送系统的制备方法，涉及医药技术领域。
背景技术
糖皮质激素类药物是眼科临床常用药物，对视网膜脉络膜新生血管等眼内增生性病变以及葡萄膜炎、视网膜血管炎等眼内炎具有确切疗效。鉴于其全身性毒副作用，以及眼球特有的屏障结构，一般认为玻璃体给药途径优于口服或静脉注射给药。但玻璃体内单词给药后药物代谢消除较快，药效短暂；多次给药则会增大眼内出血、白内障、视网膜脱离等并发症的发生率。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米粒是具有生物降解性和生物相容性的新型缓释给药系统，可望在眼内局部达到长效、稳定的药物浓度。
地塞米松是糖皮质激素类药物，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，故广泛应用于各科治疗多种疾病，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮喘及皮肤科以及眼科疾病。研究表明，糖皮质激素能够通过释放局部去甲肾上腺素收缩血管、降低或沉默血管内皮生长因子（VEGF）的表达、诱导血管内皮细胞凋亡、抑制血管内皮增殖。糖皮质激素同时具有快速、强大而非特异性的抗炎作用。对各种炎症均有效。
贝伐单抗（Avastin®）是重组的人源化单克隆抗体，其包含了人源抗体的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区，能与人血管内皮生长因子（VEGF）结合并阻断其生物活性。是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。近年来美国陆续有医生临床治疗时发现，由于Avastin®作用对象为抗血管内皮增生因子（VEGF），可中和黄斑部不正常的高浓度眼疾VEGF，从而抑制年龄相关性黄斑变性（AMD）恶化，用来治疗这一老年人常见的，可导致严重视力损伤的眼病成功性很大。Avastin®因被临床实践证实具有治疗眼底病功效且价格低廉，一直被眼科医生广泛应用。
药物联合治疗因可能会产生明显优于药物单一治疗的治疗效果而备受关注。合理的联合用药可以有效地发挥药物的协同作用以提高疗效，还可以通过减少单个药剂量来降低不良反应。
发明内容
本发明公开一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物，解决了地塞米松半衰期短的不足，保证了制备过程中贝伐单抗的高活性。
本发明提供了一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒药物，为用于玻璃体注射的表面连接贝伐单抗，内部装载地塞米松的纳米粒药物递送系统。纳米粒基质中的PLGA能够使得地塞米松缓慢平稳释放；贝伐单抗通过共价键连接在以PLGA为基质的纳米粒表面，依旧保证了贝伐单抗和VEGF作用的活性；两种药物协同作用，联合用药显著提高抗血管生成效果。
本发明进一步提供了一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物的制备方法。
本发明所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物，通过以下技术方案实现：
由以高分子聚合物PLGA为载体材料制备的核壳结构的聚合物纳米粒、纳米粒中的地塞米松及纳米粒表面连接的贝伐单抗构成。
本发明所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
1）采用乳化溶剂挥发法制备包载地塞米松的PLGA纳米粒；
2）采用化学偶联的方法，使用活化剂使纳米粒的PLGA的中的羧基与贝伐单抗的氨基发生共价反应，将抗体与纳米粒连接。
本发明所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
1）分别称取5～20mg地塞米松，20mg PLGA溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5～20mL 0.5%~5%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5～20mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接3～24h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
本发明所述的PLGA为羧基封端，型号为7525 1.5A或5050 2A。
本发明所述的地塞米松与PLGA质量比为（1～4）: 4。
本发明所述的贝伐单抗与地塞米松-PLGA纳米粒质量比为2 :（1～4）。
本发明所述的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒（Bev/Dex-PLGA NPs）为冻干制剂，属于玻璃体给药系统，溶剂通常为无菌等渗水溶液。
本发明的积极效果在于：
通过以PLGA为基质的纳米粒将地塞米松和贝伐单抗联合，制备了贝伐单抗和地塞米松共载的纳米粒（Bev/Dex-PLGA NPs），形成了具有核壳结构的的纳米药物递送系统。解决了地塞米松半衰期短的不足，保证了制备过程中贝伐单抗的高活性，通过二者协同作用有效提高抗血管生成效果。本发明构建的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统，是一种优良的递药系统，有望应用于年龄相关性黄斑变性（AMD）的治疗。
附图说明：
图1为纳米粒的粒径分布图；
图2为纳米粒的电位分布图；
图3为纳米粒的SEM图；
图4为纳米粒的体外释药曲线；
图5为贝伐单抗高效液相色谱实验；
图6为贝伐单抗圆二色谱实验；
图7为贝伐单抗荧光光谱实验；
图8为纳米粒的细胞毒性实验；
图9为纳米粒的体内抗血管生成实验。
具体实施方式
本发明的具体实施方法，由下列实施实例举例说明，但本发明的保护范围不局限于此。
实施例1
1）分别称取5mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 0.5%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接12h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例2
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 0.5%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接12h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例3
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 2%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接12h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例4
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取10mL 2%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接12h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例5
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 5050 2A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 2%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接12h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例6
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 2%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和10mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接12h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例7
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 2%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和10mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接6h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
实施例8
1）分别称取10mg地塞米松，20mg PLGA 7525 1.5A溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5mL 2%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和10mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接18h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统。
效果实验例1 （纳米粒的表征：粒径、电位、形态）
实验材料：
实施例1的Bev/Dex-PLGA NPs、硅片、去离子水等。
实验步骤：
用去离子水稀释实施例1的Bev/Dex-PLGA NPs浓度至1 mg/mL，采用激光粒度仪分析其粒径及电位分布。
用去离子水稀释实施例1的Bev/Dex-PLGA NPs浓度至1 mg/mL，滴加一滴至硅片载体上后于室温挥发除尽水。硅片上的样品喷金处理后，在3 kV电压下采用扫描电子显微镜（SEM）观测纳米粒表面形态
实验结果：
采用激光粒度仪分析实施例1的Bev/Dex-PLGA NPs的粒径及电位分布，其粒径分布如图1所示，电位分布如图2所示。粒径检测结果显示，Bev/Dex-PLGA NPs的平均粒径在150-200nm之间，电位在0mV左右。
采用扫描电子显微镜（SEM）观测实施例6中的Bev/Dex-PLGA NPs的表面形态，如图3所示。SEM结果显示，Bev/Dex-PLGA NPs呈圆球形，表面光滑，大小在150-200nm之间。
效果实验例2 （纳米粒的载药量及体外释放行为考察）
实验材料：
实施例1～8中的Bev/Dex-PLGA NPs、地塞米松、乙腈、0.22μm微孔滤膜、BCA试剂盒等。
实验步骤：
采用高效液相色谱（HPLC）测定实施例1～8中的Bev/Dex-PLGA NPs中地塞米松的包封率：
1）称取10mg冻干Bev/Dex-PLGA NPs，溶解在1mL乙腈中，蜗旋溶解 10 min，加入9mL的40%乙腈溶液，0.22μm微孔滤膜过滤，过滤液进行色谱分析。
2）HPLC条件:流动相乙腈：水（40：60，v/v）溶液，流速1mL/min，检测波长240nm，进样量20μL。
3）根据以下公式计算载药量（DL%）=测得地塞米松的质量/投入纳米粒的总质量×100%，包封率（EE%）=测得地塞米松的质量/投入地塞米松的质量×100%。
采用BCA试剂盒方法测定实施例1～8中的Bev/Dex-PLGA NPs中贝伐单抗的连接率：
1）收集纳米粒抗体连接过程中的上清液，通过BCA试剂盒检测上清液中的游离的贝伐单抗。
2）根据以下公式计算抗体连接率（CB%）=投入的贝伐单抗总质量-游离的贝伐单抗质量/ Bev/Dex-PLGA纳米粒总质量。测得连接率为20～40%（表1）
采用透析的方法分析实施例6中的Bev/Dex-PLGA NPs的体外释放行为：
1）体外释放介质：pH 7.4 PBS（1% Tween-80），透析袋截留分子量（MWCO，8kD）。
2）取样点：0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，1d，2d，3d。HPLC检测地塞米松含量，并计算地塞米松的累积释放率。
实验结果：
采用高效液相色谱（HPLC）测定实施例1～8中的Bev/Dex-PLGA NPs中地塞米松的包封率，测得包封率为50%~75%（表1）。
采用BCA试剂盒方法测定实施例1～8中的Bev/Dex-PLGA NPs中贝伐单抗的连接率，测得连接率为20～40%（表1）
采用透析的方法分析实施例6中的Bev/Dex-PLGA NPs的体外释放行为，结果如图4所示Bev/Dex-PLGA NPs在突释后出现缓慢释放行为，在72 h内累计释放率达81.3%。释放行为表现为先突释再缓释，且缓释效果明显。这归功于纳米粒的核壳结构以及表面抗体的存在，PLGA的降解特性延缓了地塞米松的释放，表面偶联单抗后，更进一步延缓了地塞米松的释放，在一定时间内维持了地塞米松的治疗浓度。
表1 实施例1～8所制得的纳米粒地塞米松载药量、包封率以及贝伐单抗连接率
DL(%) EE(%) CB(%)
实施例1 10.64±0.56 53.24±0.77 22.47±0.13
实施例2 19.08±0.06 57.83±0.46 25.72±0.09
实施例3 22.07±0.47 66.88±0.03 36.67±0.08
实施例4 20.89±0.54 63.32±0.67 29.87±0.04
实施例5 18.56±0.61 56.23±0.08 24.32±0.37
实施例6 23.21±0.35 70.33±0.09 32.74±0.08
实施例7 23.61±0.42 71.56±0.78 33.33±0.52
实施例8 24.71±0.66 74.87±0.33 37.64±0.12
*DL为地塞米松载药量；EE为地塞米松包封率；CB为贝伐单抗连接率。
效果实验例3 （贝伐单抗稳定性研究）
实验材料：
施例6中的Bev/Dex-PLGA NPs的纳米粒孵育液中的游离贝伐单抗、乙腈、BCA试剂盒、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等。
实验步骤：
为考察Bev/Dex-PLGA NPs制备过程对贝伐单抗稳定性的影响，我们取施例6中的Bev/Dex-PLGA NPs的纳米粒孵育液中的游离贝伐单抗，分别通过HPLC、圆二色谱、荧光光谱考察其一级、二级、三级结构的稳定性。
用HPLC检测贝伐单抗一级结构的稳定性，检测前将曲妥珠单抗溶液稀释或者浓缩到0.5mg/mL，HPLC条件:流动相乙腈：水（40：60，v/v）溶液，流速1mL/min，检测波长240nm，进样量20μL。
采用圆二色谱仪检测贝伐单抗二级结构的稳定性，检测前将曲妥珠单抗溶液稀释或者浓缩到10-5 mol/L，圆二色谱扫描波长范围190~260nm，检测温度25℃。采用Jasco软件扣除背景溶液信号，将结果转化成平均残基椭圆率。
采用荧光光谱仪检测贝伐单抗三级结构的稳定性，检测前将曲妥珠单抗溶液稀释或者浓缩到1mol/L，荧光光谱激发波长280nm，发射波长305~550nm。测试前扣除背景溶液信号，记录荧光光谱图。
实验结果：
纳米粒孵育液中贝伐单抗一级结构的稳定性结果如图5，与天然抗体出峰时间几乎一致，说明孵育液中的抗体保持着完整的抗体结构，没有发生变性聚集。
蛋白质的二级结构是保证其生物活性的基础，二级结构的改变可能影响蛋白质的活性。贝伐单抗二级结构变化如图6，PBS（pH 7.4）中的贝伐单抗在212nm处呈现明显的负峰，而在孵育液中的抗体负峰依旧明显，说明二级结构几乎未发生改变。
蛋白质的活性保持依赖其特有的三级结构，当蛋白质的三级结构改变，其活性必将遭到破坏。贝伐单抗三级结构变化如图7，PBS（pH 7.4）中的贝伐单抗在330nm处出现荧光光谱峰，而在孵育液中的抗体荧光光谱峰与PBS基本吻合，说明三级结构几乎未发生改变。
以上结果证明了本发明的Bev/Dex-PLGA NPs保证了其中贝伐单抗的高活性。
效果实验例4 （细胞毒性实验）
实验材料：
人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19细胞）、DMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、96微孔板、地塞米松、贝伐单抗、实施例6的Bev/Dex-PLGA NPs、MTT、DMSO等。
实验步骤 ：
ARPE-19细胞培养于DMEM/F12培养基（10%胎牛血清、1% 青霉素-链霉素）中，培养瓶置于37℃，5% CO2培养箱中。取对数生长期的细胞进行实验。以1×104个/孔的密度将处于对数期的细胞接种于在96微孔板中，37℃培养24h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入含药（地塞米松，贝伐单抗，实施例6的Bev/Dex-PLGA NPs）培养基，37℃孵育24h后，加入MTT试剂，检测并计算细胞存活率。
实验结果：
结果如图8所示，地塞米松，贝伐单抗，Bev/Dex-PLGA NPs均表现为几乎没有毒性，证明其眼部用药安全可行，对眼部细胞ARPE-19无毒性作用。
效果实验例5 （抗血管生成实验）
实验材料：
受精鸡蛋、甲基纤维素、地塞米松、贝伐单抗、实施例6的Bev/Dex-PLGA NPs、生理盐水等。
实验步骤：
采用鸡胚尿囊膜（CAM）实验评价Bev/Dex-PLGA NPs对抗血管生成的影响。在胚胎发育的第4天，每个鸡蛋的气室开一个小窗(直径:~10mm)。以直径约2毫米羧甲基纤维素薄膜为药物载体。在胚胎期第6天，含药地塞米松，贝伐单抗，实施例6的Bev/Dex-PLGA NPs）载体轻轻植入每个CAM。孵育第8天，3.7%甲醛固定并拍照。计算每个CAM中的血管数量。对于血管量化，阴性对照组(生理盐水)值设为100%。
实验结果：
CAM实验结果如图9所示贝伐珠单抗和地塞米松均可以抑制新血管的生长，从而促进了血管密度的显著降低。贝伐单抗组和地塞米松组的血管数减少至65.2%和83.4%，而Bev/Dex-PLGA NPs组减少至42.7%。这些数据表明，本发明的Bev/Dex-PLGA NPs抗血管新生效果最佳，两种药物协同作用，联合用药显著提高抗血管生成效果。
结论：
本发明的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统Bev/Dex-PLGA NPs表面呈光滑圆球形，平均粒径在150-200nm之间，电位在0mV左右。低塞米松包封率在50%至75%范围内，贝伐单抗连接率在20%至40%范围内。释放行为表现为先突释再缓释，且缓释效果明显。这归功于纳米粒的核壳结构以及表面抗体的存在，PLGA的降解特性延缓了地塞米松的释放，表面偶联单抗后，更进一步延缓了地塞米松的释放，在一定时间内维持了地塞米松的治疗浓度。Bev/Dex-PLGA NPs抗血管新生效果极佳，两种药物协同作用，联合用药显著提高抗血管生成效果。

Claims (7)

1.一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物，其特征在于：由以高分子聚合物PLGA为载体材料制备的核壳结构的聚合物纳米粒、纳米粒中的地塞米松及纳米粒表面连接的贝伐单抗构成。
2.如权利要求1所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物递送系统，其特征在于：PLGA为羧基封端，型号为7525 1.5A或5050 2A。
3.如权利要求1所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物，其特征在于：地塞米松与PLGA质量比为（1～4）: 4。
4.贝伐单抗与地塞米松-PLGA纳米粒质量比为2 :（1～4）。
5.如权利要求1所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物，其特征在于：贝伐单抗与地塞米松-PLGA纳米粒质量比为2 :（1～4）。
6.如权利要求1所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
1）采用乳化溶剂挥发法制备包载地塞米松的PLGA纳米粒；
2）采用化学偶联的方法，使用活化剂使纳米粒的PLGA的中的羧基与贝伐单抗的氨基发生共价反应，将抗体与纳米粒连接。
7.如权利要求5所述的一种用于玻璃体注射的贝伐单抗和地塞米松共载的纳米药物的制备方法，其具体包括以下步骤：
1）分别称取5～20mg地塞米松，20mg PLGA溶解于丙酮中，超声溶解，作为有机相；
2）取5～20mL 0.5%~5%的聚乙烯醇（PVA）水溶液，作为水相；
3）于磁力搅拌条件下将有机相逐滴加入到水相中，室温继续低速搅拌，挥发除尽二氯甲烷，离心清洗3次，收集地塞米松-PLGA纳米粒并冻干；
4）取10mg 上述纳米于在10ml 1mol/L盐酸中，并加入5mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和20mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），活化纳米粒4h后，离心除去上清；
5）活化的纳米粒和5～20mg贝伐单抗共同孵育在pH7.4 PBS中，连接3～24h，离心清洗3次以除去未连接的贝伐单抗和缓冲液中盐离子，收集并冻干，即得。
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