CN104814934A - 一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，同时提供了该系统的制备方法，本发明采用改良的经典乳化溶剂挥发法制备PLGA/Lipid核壳结构的纳米粒（PLNs），发明了二元有机溶剂法制备载紫杉醇的聚合物脂质纳米粒，然后运用化学修饰法构建曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒（H=PCNs）。制得的T=PCNs体外释药24h内突发释放率达41.2%，120h内累积释放率73.4%，药物释放水平有利于肿瘤治疗。细胞实验结果表明，T=PCNs对HER2高表达的肿瘤细胞靶向性较好，对肿瘤细胞的杀伤作用明显。极大的提高了紫杉醇的安全性和靶向性。

Description

一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统

技术领域

本发明公开一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，同时提供了该系统的制备方法，属于肿瘤靶向与缓释给药系统技术领域。

背景技术

紫杉醇是临床上广泛应用的抗肿瘤药物，可以诱导和促进微管蛋白聚合，防止解聚，使微管蛋白保持稳定，抑制有丝分裂，发挥抗肿瘤作用。紫杉醇具有高效、低毒及广谱抗癌活性，尤其对乳腺癌和卵巢癌有独特疗效，其注射液是治疗乳腺癌、卵巢癌、肺癌等实体肿瘤的一线用药。但由于紫杉醇水溶性差，制成注射制剂有一定困难。目前临床常用的紫杉醇注射液（Taxol）采用聚氧乙烯蓖麻油等作为溶媒，可促进组胺释放，引起严重的过敏反应。此外注射型紫杉醇靶向性差，易引起全身毒性，因此临床上迫切需要研发紫杉醇的新型给药系统，以克服缺陷。

PLGA，生物可降解性聚乳酸-羟基乙酸共聚物，作为药物载体具有良好的生物相容性和稳定性，能够包裹疏水性的紫杉醇，但PLGA纳米粒粒径普遍较大，不利于静脉注射。由磷脂材料构成的脂质体，类似生物膜结构，具有粒径小，生物相容性好，增加细胞摄取及内体逃逸，延缓药物释放等优势，但稳定性较差。聚合物脂质纳米粒是结合了聚合物和磷脂二者优点开发的一种具有核壳结构的新型给药系统。将紫杉醇载入聚合物脂质纳米粒，存在以下优点：粒径小，药物包封率高，生物相容性好，释放行为学可控，结合配体分子后靶向性增强。从而提高了主动靶向，降低紫杉醇毒副作用，减少紫杉醇用量，增加患者顺应性。

某些肿瘤细胞表面过量表达受体，可以结合特异性配体。利用这种配体导向作用，可以将化疗药物递送到特定肿瘤组织或细胞，从而实现靶向治疗。曲妥珠单抗（Trastuzumab）是人表皮生长因子受体-2（HER2）的单克隆抗体，可以识别并结合HER2过表达的肿瘤细胞，如乳腺癌，卵巢癌，肺癌细胞等。曲妥珠单抗具有蛋白类大分子分子量大及空间结构复杂等特点，在纳米粒制备过程中易受到操作环境的影响，从而失去活性。在载药纳米粒基本形成后，通过纳米粒表面引入的Mal基团，与抗体在温和的条件下反应，从而将抗体连接在纳米粒表面，可以保持抗体的天然活性，从而提高靶向效应。因此，通过HER2受体介导的纳米传递系统，为HER2过表达的肿瘤治疗提供了潜力的途径。

发明内容

本发明提供一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，为特异性靶向HER2过表达肿瘤细胞的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，解决了目前紫杉醇制剂存在的缺陷及纳米粒载体材料单一的缺陷。

本发明进一步提供曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统的制备方法。

本发明所述的一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，通过以下技术方案实现：

由聚合物PLGA和磷脂为载体材料制备的核壳结构的聚合物脂质纳米粒、包载于纳米粒中的紫杉醇及纳米粒表面的修饰配体曲妥株单抗构成。

本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

PLGA为羧基封端，型号5050 1A或5050 1.5A，黏度为0.16 ~ 0.20 dL/g。

本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

其中的磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺。

本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

紫杉醇：PLGA：二棕榈酰磷脂酰胆碱：磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的质量比为（10~15）：60：（15~20）：10。

本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于其中的曲妥株单抗与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的摩尔比为1：5~1。

本发明所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统的制备方法，包括以下步骤：

1）采用改良的乳化溶剂挥发法制备包裹并运载紫杉醇的PLGA /Lipid纳米粒；

2）采用化学偶联的方法，使用活化试剂将曲妥株单抗的某个氨基巯基化，与纳米粒表面的Mal基团发生加成反应，形成硫醚键，进而将配基与纳米粒连接。

本发明所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1）称取10~15 mg的紫杉醇和60 mg 的PLGA溶解于2.4 mL的丙酮中，称取15~20 mg的DPPC和10 mg DSPE-PEG2000-Mal溶解于1.6 mL的乙醇中；混合丙酮乙醇溶液（积比为3：2）形成二元有机相（O相），加入适量1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声分散制备O/W乳剂，再补充10~20 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌，过夜挥发除去二元有机相，过膜除去大粒径纳米粒，并离心收集纳米粒，冷冻干燥；

2）在20℃、pH 8.0缓冲液孵育条件下，使用活化试剂将曲妥珠单抗的一部分氨基巯基化，与纳米粒表面的Mal基团发生加成反应，形成硫醚键，进而将配基与纳米粒连接，离心洗涤除去未反应的单抗，并收集纳米粒，即得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统。

本发明所述的制备方法，其特征在于：

氨基活化试剂是2-亚氨氢氯化硫醇，使用浓度为6 ~ 7 mg/mL，用量范围为20 ~ 100 μL。

本发明所介绍的二元溶剂乳化挥发法制备的PLGA/Lipid纳米粒传递系统，包裹的药物不仅限于紫杉醇，还可拓展为其它与PLGA具有良好生物相容性的疏水性化疗药物；偶联的配体也不仅限于曲妥株单抗，还可包括那些具有靶向性的小分子多肽及其它种类的单克隆抗体。

本发明制备的靶向纳米粒（T=PCNs）为冻干制剂，属于静脉给药系统。对于静脉给药系统，溶剂通常为无菌水溶液。适当的调整溶液pH值并使溶液等渗（如加入氯化钠或葡萄糖），即适合静脉给药，纳米粒采取过0.22 μm无菌滤膜的方式灭菌。

        本发明的积极效果在于：结合了PLGA和磷脂的优点并与单克隆抗体联合，制备了具有核壳结构的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒（T=PCNs），形成具有核壳结构的纳米级微粒；解决了现有紫杉醇制剂存在的缺陷及纳米粒载体材料单一的不足。具有粒径小（150 ~ 200 nm），更有利于细胞摄取（<200 nm），药物包封率高（75 ~ 83%），在溶液中稳定性好（电位0 mV左右），生物相容性好，增加内体逃逸，释放行为学可维持紫杉醇治疗水平，结合曲妥株单抗后更实现了药物的主动靶向性。提高了HER2过表达的肿瘤细胞的摄取效率，极大的提高了紫杉醇的安全性和靶向性。本发明构建的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，是一种优良的递药系统，有望应用于HER2过表达的乳腺癌、卵巢癌及肺癌等实体肿瘤的治疗。

附图说明

图1为纳米粒的示意图；

图2为纳米粒的粒径电位分布图：（A）PCNs粒径分布；（B）T=PCNs粒径分布；（C）PCNs电位分布；（D）T=PCNs电位分布；

图3为纳米粒的SEM图；（A）PCNs；（B）T=PCNs；

图4为纳米粒的体外释药曲线；

图5为PTX，HER，PCNs，T=PCNs对SKBR3（A）和MCF7细胞（B）的细胞毒性；

图6为SKBR3和MCF7细胞对T=PCNs摄取的激光共聚焦结果；

图7为SKBR3和MCF7细胞对T=PCNs摄取的流式细胞仪结果：（A）直方图（B）柱形图。

具体实施方案

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

        实施例        1        ：

1、称取紫杉醇10 mg和PLGA 1A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取20 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、1 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        2        ：

1、称取紫杉醇15 mg和PLGA 1A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 15 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取20 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、1 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        3        ：

1、称取紫杉醇10 mg和PLGA 1.5A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取20 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、1 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        4        ：

1、称取紫杉醇15 mg和PLGA 1.5A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 15 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取20 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、1 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        5        ：

1、称取紫杉醇10 mg和PLGA 1A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取100 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、5 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        6        ：

1、称取紫杉醇15 mg和PLGA 1A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 15 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取100 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、5 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        7        ：

1、称取紫杉醇10 mg和PLGA 1.5A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取100 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、5 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        8        ：

1、称取紫杉醇15 mg和PLGA 1.5A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 15 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

2、取100 μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、5 mg/mL曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒。

        实施例        9        ：

纳米粒的表征

采用激光粒度仪分析PCNs及T=PCNs的粒径及电位分布，其粒径及电位分布如图2所示。粒径检测结果显示，PCNs的平均粒径在130 ~ 160 nm之间，电位在 -10 mV左右。T=PCNs的平均粒径在 150 ~ 200 nm之间，电位在 0 mV左右（表1）。

采用扫描电子显微镜观测PCNs及T=PCNs的形貌，冻干纳米粒放置在硅片上喷金处理，结果如图3所示。扫面电镜结果显示，PCNs及T=PCNs均呈圆球形，大小均一，在100 ~ 200 nm之间，T=PCNs组微粒之间有少量聚集。

表1.实施例1 ~ 8所制得的纳米粒粒径、电位分布及药物包封率

        

*¹ T：PCNs为曲妥株单抗与纳米粒的比例；*² EE为紫杉醇包封率。

        实施例        10        ：

纳米粒的载药量及体外释放行为考察

采用高效液相色谱（HPLC）测定PCNs的包封率：称取10 mg冻干PCNs，溶解在1 mL 乙腈中，蜗旋溶解10 min，加入9 mL的75%甲醇溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，过滤液进行色谱分析。HPLC条件，流动相甲醇：水（75：25，v/v）溶液，流速1 mL/min，检测波长230 nm，进样量20 μL。根据以下公式计算包封率(EE, %) =测得紫杉醇的质量 / 投入紫杉醇的质量 × 100%。测得包封率为75% ~ 83%（表1）。

采用透析的方法分析PCNs及T=PCNs的体外释放行为：称取20 mg的冻干纳米粒，分散在1 mL pH 7.4 PBS（1% Tween-80，v/v）溶液中，装入透析袋（MWCO，10 kD）。将透析袋置入含40 mL pH 7.4 PBS（1% Tween-80，v/v）溶液中，置于37℃恒温摇床中，120 rpm持续震摇。分别于0.5 h，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，1 d，2 d，3 d，4 d取出透析液1 mL备用，同时补充1 mL新鲜的PBS溶液。透析液过μm微孔滤膜，过滤液HPLC检测紫杉醇含量，并计算紫杉醇的累积释放率。以市售紫杉醇注射液（Taxol）为对照，比较缓释纳米粒的释放能力，结果如图4所示。在起始的6 h内，三种制剂均呈现了不同程度的突释行为（61.2%，43.3%，34.4%），紫杉醇注射液组突释现象最明显，24 h内即释放完毕，无缓释行为。PCNs及T=PCNs组在突释后出现缓慢释放行为，T=PCNs组在96 h内累计释放率达78.2%。T=PCNs释放行为学先突释再缓释，且缓释效果明显。这归功于其PLGA与磷脂形成的核壳结构，PLGA表面的单分子磷脂层调节紫杉醇的释放，表面偶联单抗后，更进一步延缓了紫杉醇的释放，在一定时间内维持了紫杉醇的治疗浓度。

        实施例        11        ：

纳米粒的细胞毒实验

人类乳腺癌细胞SKBR3及MCF7分别培养于含10% 胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM细胞培养液中，培养瓶置于37℃，含5% CO₂培养箱中。取对数生长期的细胞进行以下实验。其中，SKBR3细胞过度表达HER2抗原，MCF7细胞低表达HER2抗原。

以1×10⁴个/孔的密度将处于对数期的癌细胞接种于在96微孔板中，37℃培养24 h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入100 μL含药培养基（PTX，HER，PCNs及T=PCNs），37℃孵育4 h后，去除含药培养基，更换新鲜培养基，分别继续培养24 h，48 h和72 h。去除培养基，每孔加入10 μL、5mg/mL MTT试剂，37℃孵育4 h，DMSO溶解生成的甲瓒结晶，酶标仪492 nm分析溶液吸光度，并计算细胞存活率。

实验结果如图5所示，T=PCNs对SKBR3细胞72 h后的杀伤作用（47.2%）明显高于PTX（76.3%）和PCNs（85.5%）。这归功于SKBR3过度表达的HER2抗原，说明其肿瘤靶向性良好。以MCF7细胞作为对照组实验，T=PCNs对MCF7细胞的杀伤作用（54.9%）与PCNs（56.6%）在作用72 h后并没有明显区别。细胞毒结果说明，T=PCNs体外抗肿瘤效果明显，离不开其载体材料良好的生物相容性及单抗的靶向作用。

        实施例        12        ：

纳米粒的细胞摄取实验

细胞摄取实验中使用双荧光标记的T=PCNs，罗丹明B标记PCNs，FITC标记曲妥株单抗，再进行化学偶联，具体制备工艺如下：

（A）载罗丹明B的PCNs的制备：称取罗丹明B 2 mg和PLGA 1A 60mg溶解于2.4 mL丙酮中，称取DPPC 20 mg和DSPE-PEG2000-Mal 10 mg 溶解于1.6 mL的乙醇中。混合丙酮乙醇溶液形成二元有机相（O相），加入15 mL 1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声（100 W，150 s）分散制备O/W乳剂，再补充15 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌（150 rpm），过夜挥发除去二元有机相，0.22 μm微孔滤膜过滤，并离心洗涤并收集纳米粒（18000 rpm，15 min），冷冻干燥；

（B）FITC标记的曲妥株单抗的制备：（1）使用pH 9.0的交联液（NaHCO3，Na₂CO₃，NaCl）配制曲妥株单抗溶液，浓度为10 mg/mL。（2）FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/mL。（3）将FITC溶液缓慢滴加到抗体溶液中，轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应6 h。（4）加入5 mol/L的NH4Cl至终浓度50 mmol/L，4℃终止反应1 h。（5）FITC-曲妥株单抗交联液pH 7.4 PBS中透析，除去未连接的FITC。

（C）载罗丹明B的PCNs与FITC标记的曲妥株单抗的偶联：取20μL、6 mg/mL Traut’s Reagent，加入1 mL、1 mg/mL FITC-曲妥株单抗溶液（pH 8.0 PBS），20℃条件下活化2 h，再加入5 mg 上述纳米粒，20℃条件下孵育18 h，离心洗涤除去未连接的单抗（18000 rpm，15 min），冷冻干燥，即获得双荧光标记的曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒，避光保存。

激光共聚焦显微成像

以2×10⁴个/孔的密度将处于对数期的癌细胞接种于玻底培养皿中，37℃培养24 h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入1 mL无血清含药培养基（双荧光标记T=PCNs），37℃孵育2 h后，去除含荧光纳米粒的培养基，pH 7.4 PBS清洗三次。4%甲醛固定细胞，DAPI溶液进行细胞核染色，激光共聚焦显微镜下成像。罗丹明B激发波长Ex=540 nm，发射波长Em=625 nm。FITC激发波长Ex=488 nm，Em=525 nm。

流式细胞仪定量分析

以1 ~ 2×10⁵个/孔的密度将处于对数期的癌细胞接种于在24孔板中，37℃培养24 h使其贴壁，第二天去除培养液，分别加入1 mL无血清含药培养基（双荧光标记T=PCNs），37℃孵育3 h后，去除含荧光纳米粒的培养基，pH 7.4 PBS清洗三次。0. 25%胰酶（w/v）收集细胞，重悬于4%甲醛固定液中，进行流式细胞分析。分别采用激光通道FL1和FL3，检测FITC和罗丹明B的荧光。

细胞摄取实验结果如图6，7所示。罗丹明B标记的PCNs呈现红色荧光，FITC标记的曲妥株单抗呈现绿色荧光，当二者结合后，出现黄色的荧光（T=PCNs），其鲜艳程度取决于肿瘤细胞摄取的含量。这也间接的表明，曲妥株单抗成功的偶联在纳米粒的表面，并且在细胞摄取过程中，二者并没有分离。在SKBR3细胞中，亮黄色荧光出现在细胞质区域，说明肿瘤细胞对T=PCNs有较高的摄取率。对比MCF7细胞，黄色荧光极不明显，说明MCF7细胞对T=PCNs摄取率较低，T=PCNs不能发挥其靶向作用（图6）。在流式细胞分析中，肿瘤细胞对T=PCNs的摄取被定量分析。如图7 B所示，SKBR3细胞对罗丹明B-PCNs和FITC-HER的摄取均高于MCF7细胞。细胞实验结果说明了T=PCNs对HER2过表达的癌细胞具有良好的靶向性和细胞毒性。

        讨论

本发明结合了PLGA和磷脂的优点并与单克隆抗体联合，制备了具有核壳结构的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒（T=PCNs）。磷脂包被在PLGA/紫杉醇的核心外形成单分子磷脂层，磷脂表面偶联单抗分子，从而形成具有核壳结构的纳米级微粒。T=PCNs具备了PLGA和磷脂的优点：具有粒径小（150 ~ 200 nm），更有利于细胞摄取（<200 nm），药物包封率高（75 ~ 83%），在溶液中稳定性好（电位0 mV左右），生物相容性好，增加内体逃逸，释放行为学可维持紫杉醇治疗水平，结合曲妥株单抗后更实现了药物的主动靶向性。对肿瘤细胞的杀伤作用明显高于PTX和PCNs，提高了HER2过表达的肿瘤细胞的摄取效率，极大的提高了紫杉醇的安全性和靶向性。尤其在治疗HER2高表达的乳腺癌十分见效。

本发明所介绍的二元溶剂乳化挥发法制备的PLGA/Lipid纳米粒传递系统，包裹的药物不仅限于紫杉醇，还可拓展为其它与PLGA具有良好生物相容性的疏水性化疗药物；偶联的配体也不仅限于曲妥株单抗，还可包括那些具有靶向性的小分子多肽及其它种类的单克隆抗体。

本发明制备的靶向纳米粒（T=PCNs）为冻干制剂，属于静脉给药系统。对于静脉给药系统，溶剂通常为无菌水溶液。适当的调整溶液pH值并使溶液等渗（如加入氯化钠或葡萄糖），即适合静脉给药，纳米粒采取过0.22 μm无菌滤膜的方式灭菌。

本发明构建的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，是一种优良的递药系统，有望应用于HER2过表达的乳腺癌、卵巢癌及肺癌等实体肿瘤的治疗。

Claims (8)

1.一种曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

由聚合物PLGA和磷脂为载体材料制备的核壳结构的聚合物脂质纳米粒、包载于纳米粒中的紫杉醇及纳米粒表面的修饰配体曲妥株单抗构成。

2. 如权利要求1所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

PLGA为羧基封端，型号5050 1A或5050 1.5A，黏度为0.16 ~ 0.20 dl/g。

3. 如权利要求1所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

其中的磷脂为二棕榈酰磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺。

4. 如权利要求1所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于：

紫杉醇：PLGA：二棕榈酰磷脂酰胆碱：磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的质量比为（10~15）：60：（15~20）：10。

5. 如权利要求1所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统，其特征在于其中的曲妥株单抗与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺的摩尔比为1：5~1。

6. 如权利要求1所述的曲妥株单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统的制备方法，包括以下步骤：

1）采用改良的乳化溶剂挥发法制备包裹并运载紫杉醇的PLGA /Lipid纳米粒；

2）采用化学偶联的方法，使用活化试剂将曲妥株单抗的某个氨基巯基化，与纳米粒表面的Mal基团发生加成反应，形成硫醚键，进而将配基与纳米粒连接。

7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

1）称取10~15 mg的紫杉醇和60 mg的PLGA溶解于2.4 mL的丙酮中，称取15~20 mg的DPPC和10 mg的DSPE-PEG2000-Mal溶解于1.6 mL的乙醇中；混合丙酮乙醇溶液（积比为3：2）形成二元有机相（O相），加入适量1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液（W相）, 0 ~ 4℃下间断超声分散制备O/W乳剂，再补充10~20 mL的1.0 ~ 2.0% 泊洛沙姆188水溶液，室温低速搅拌，过夜挥发除去二元有机相，过膜除去大粒径纳米粒，并离心收集纳米粒，冷冻干燥；

2）在20℃、pH 8.0缓冲液孵育条件下，使用活化试剂将曲妥珠单抗的一部分氨基巯基化，与纳米粒表面的Mal基团发生加成反应，形成硫醚键，进而将配基与纳米粒连接，离心洗涤除去未反应的单抗，并收集纳米粒，即得曲妥珠单抗修饰的载紫杉醇的靶向纳米粒传递系统。

8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：

氨基活化试剂是2-亚氨氢氯化硫醇，使用浓度为6 ~ 7 mg/mL，用量范围为20 ~ 100 μL。