CN110004241A

CN110004241A - 一种检测鲍曼不动杆菌的pcr试剂盒

Info

Publication number: CN110004241A
Application number: CN201910326879.1A
Authority: CN
Inventors: 邓珊珊; 贾旭; 刘超
Original assignee: Chengdu Medical College
Current assignee: Chengdu Medical College
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明提供了一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，所述试剂盒包括多重PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6所示。本发明通过合理的引物搭配，能排除大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的干扰，实现鲍曼不动杆菌的特异性检测。本发明还具有很高的检测灵敏度，当样品中的鲍曼不动杆菌DNA浓度低至1pg/μL时，仍能检测到鲍曼不动杆菌。

Description

一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及分子检测领域，尤其涉及一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒。

背景技术

不动杆菌属(Acinetobacter)为一群严格需氧型革兰氏阴性球杆菌，目前该菌属至少包含33个基因种，其中，最主要的感染菌种是鲍曼不动杆菌，约占72.9％。鲍曼不动杆菌广泛分布于自然界中，是引起多种院内感染的重要致病菌。其危险因素包括呼吸机依赖、机械通气、气管插管、侵入性操作、ICU环境、医务工作者手的交叉感染等。鲍曼不动杆菌患者死亡率高，预后差，可引起院内众多感染包括医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎，血液，泌尿道，伤口感染脑膜炎等，常有较高的死亡率和发病率。由于医院重症监护室里患者的免疫力与抵抗力低下，极易引发多重耐药鲍曼不动杆菌的感染与流行，甚至可能爆发院内感染，给临床治疗带来相当大的困难。

目前，大量的临床资料表明，快速准确确诊病原菌，给予合理而规范的抗生素治疗，对于节省治疗时间和确定最佳治疗方案是非常重要的。

传统的药敏性实验通常会耗费2、3天时间，会严重耽搁治疗的进程和效果。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括多重PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ IDNO.5～6所示。

如前所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，它还包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、去离子水。

如前所述的试剂盒，所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒还包括鲍曼不动杆菌DNA阳性对照品。

本发明还提供了前述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

1)DNA提取；

2)PCR反应；

3)电泳检测PCR产物；

若步骤3)检测到3个条带，即判断为检测到鲍曼不动杆菌。

如前述的使用方法，所述PCR反应的条件为：在94℃下预变性5min后，进行一下扩增循环：在94℃下变性30s，在55℃下退火30s，在72℃延伸30s，反应30个循环，最后在72℃延伸5min。

如前述的使用方法，所述电泳是在1.5％的琼脂糖胶中进行的电泳。

如前述的使用方法，所述3个条带的大小分别为191、347、524bp。

本发明通过合理的引物搭配，能排除大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌的干扰，实现鲍曼不动杆菌的特异性检测。

本发明还具有很高的检测灵敏度。当样品中的鲍曼不动杆菌DNA浓度低至1pg/μL时，仍能检测到鲍曼不动杆菌。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为本发明实施1中多重PCR产物16S-23S rRNA(大小为191bp)基因测序和BLAST比对结果。

图2为本发明实施1中多重PCR产物recA(大小为347bp)基因测序和BLAST比对结果。

图3为本发明实施1中多重PCR产物gyrB(大小为524bp)基因测序和BLAST比对结果。

图4是本发明引物的特异性检测和多重体系的特异性检测电泳图：其中泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1为扩增出191bp16S-23S rRNA产物；泳道2为扩增出的347bprecA产物；泳道3为扩增出的524bp gyrB产物；泳道4同时扩增出191bp、347bp和524bp产物。

图5为本发明中多重PCR法的特异性检测结果：其中泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1的模板为鲍曼不动杆菌，泳道2的模板为金黄色葡萄球菌，泳道3的模板为铜绿假单胞菌，泳道4的模板为肺炎克雷伯菌，泳道5的模板为大肠埃希菌。

图6为本发明中多重PCR对鲍曼不动杆菌的最低检出限试验结果：其中泳道M为DNA标准分子量标记；泳道1的模板为鲍曼不动杆菌的DNA，即含细菌基因组DNA10ng/μL，泳道2的模板含细菌基因组DNA lng/μL，泳道3的模板含细菌基因组DNA100pg/μL，泳道4的模板含细菌基因组DNA10pg/μL，泳道5的模板含细菌基因组DNA 1pg/μL，泳道6的模板含细菌基因组DNA 100fg/μL。

具体实施方式

实施例1多重PCR检测鲍曼不动杆菌

1.方法

1.1待检样品制备

随机选取鲍曼不动杆菌200株。所有菌株的种类均采用法国生物梅里埃公司VITEK2-Compact全自动细菌鉴定及姚敏仪再次鉴定，鉴定结果与所取菌株类型一致。

将鉴定后的细菌培养于血平板，待生长至单个菌落后，用takara的MiniBESTBacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0抽提细菌基因组，作为多重PCR的模板。

1.2检测

使用3对引物(如表1所示)对鲍曼不动杆菌进行PCR检测(包括单引物对扩增和多重PCR扩增)，具体方法如下：2×Taq Master Mix10μL，dd H₂O 6μL，3对正反方向引物各0.5μL(10umol/L)，模板1μL；PCR扩增条件为：95℃预变性5min95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共30个循环；72℃再延伸5min。然后通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分析反应结果。同时将PCR产物送生物公司测序。

表1参考引物

2.结果

多重PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测发现，多重耐药鲍曼不动杆菌同时含有191bp(16S-23S rRNA间隔区间)，347bp(recA)和524bp(gyrB)三个条带；单引物对的扩增分别出现前述条带中的一个(图4)。

多重PCR反应191bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.7所示：

多重PCR反应347bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.8所示：

多重PCR反应524bp大小产物基因测序结果如SEQ.NO.ID.9所示：

测序结果在NCBI上的blast结果如图1～图3所示，可见所扩增序列是准确无误的。

实施例2特异性检测

1.方法

1.1待检样品制备

提取大肠埃希菌(Escherichia coil，美国模式菌种保藏中心，ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，美国模式菌种保藏中心，ATCC 25923)、铜绿假单胞菌(Psudomonas aeruginosa，美国模式菌种保藏中心，ATCC 47085)、鲍曼不动杆菌(Klebsiella pneumoniae，美国模式菌种保藏中心，ATCC 17978)、肺炎克雷伯菌(来源于复旦大学附属华山北院，XJ-K1)基因组DNA。

1.2检测

方法同实施例1第1.2节，但省略单引物对扩增。

2.结果

PCR反应产物经1.5％琼脂糖电泳分析结果如图5所示，使用本发明中针对16S-23SrRNA间隔区间，recA和gyrB基因的引物扩增，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌为模板的PCR产物，均无扩增条带。鲍曼不动杆菌模板扩增后于191bp，347bp和524bp处出现3个条带。测序结果与实施例1的测序结果一致。

说明本发明的引物具有非常好的特异性，能对鲍曼不动杆菌进行特异性检测。

实施例3多重PCR法的检测敏感度

1.方法

1.1待检样品制备

鲍曼不动杆菌于液体LB培养基中，37度下震荡培养至OD₆₀₀＝1，抽提基因组DNA。将上述基因组DNA以倍比稀释法配置成浓度为10ng/μL～100fg/μL的DNA标本，用于多重PCR检测。

1.2检测

方法同实施例1第1.2节，但省略单引物对扩增。

2.结果

PCR反应产物经1.5％琼脂糖电泳分析结果如图6所示，使用本发明中针对16S-23SrRNA间隔区间，recA和gyrB基因的引物扩增。阴性对照无条带，鲍曼不动杆菌扩增后于191bp，347bp和524bp处出现3个条带。当样品含有鲍曼不动杆菌基因组DNA1pg/μL时，可以用本方法检测出。其对应的条带经纯化后测序，仍能得到实施例1的序列。

以上结果表明，本发明对鲍曼不动杆菌具有很高的敏感度。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都医学院

<120> 一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒

<130> GYKH1088-2019P014375CC

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acggtaatta gtgtgatctg acg 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcacttaagc accgtacagc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgccttcatt gatgctgagc 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctaccaaa cataacacca att 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cggtagagca agcaatgaac a 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccaactcc ggcatttgac 20

<210> 7

<211> 191

<212> DNA

<213> Acinetobacter baumnnii

<400> 7

acggtaatta gtgtgatctg acgaagacac attaactcat taacagattg gcaaaattga 60

gtctgaaata aattgttcac tcaagagttt aggttaagca attaatctag atgaattgag 120

aactagcaaa ttaactgaat caagcgtttt ggtatatgaa tttagattga agctgtacgg 180

tgcttaagtg c 191

<210> 8

<211> 347

<212> DNA

<213> Acinetobacter baumnnii

<400> 8

tgccttcatt gatgctgagc acgccctaga ccctcaatat gcacgcaaac ttggtgtaga 60

tattgataac ctacttgttt cacaacccga caatggtgag caagcacttg aaattgctga 120

catgcttgtc cgttcaggcg caattgattt aatcgttgtg gactcggtag ctgcacttac 180

acctaaagca gaaatcgaag gtgagatggg cgactctcat atgggtctac aagcgcgtct 240

tatgagccag gcacttcgta aaattacggg taatgctaaa cgttcaaact gtatggttat 300

cttcattaac cagattcgta tgaaaattgg tgttatgttt ggtagcc 347

<210> 9

<211> 524

<212> DNA

<213> Acinetobacter baumnnii

<400> 9

cggtagagca agcaatgaac aaagagttct ctgcttactt acttgagaat ccacaagctg 60

caaaatcaat tgcaggcaag attattgatg ctgcacgcgc acgtgatgct gcacgtaaag 120

cacgtgaaat gacacgccgt aagagtgcat tagatattgc aggtttgcct ggtaaattgg 180

ctgactgtca ggaaaaagac ccagcgcttt ctgaattgta tcttgtcgag ggtgactctg 240

cgggtggtag tgccaaacaa ggccgtaacc gtaaaatgca ggctattcta cctttaaaag 300

gtaagatcct gaacgttgag cgtgcgcgct ttgacaaaat gatctctagt caggaagtgg 360

gtacattaat tacagcactt ggctgtggta ttggccgtga agaatataac cctgacaagc 420

tccgttatca taaaattatt attatgaccg atgccgatgt cgatggttcg cacatccgta 480

cattgttatt aacattcttc ttccgtcaaa tgccggagtt ggtg 524

Claims

1.一种检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括多重PCR引物，其序列分别如SEQ ID NO.1～2、SEQ ID NO.3～4、SEQ ID NO.5～6所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒还包括Taq聚合酶、dNTP、MgCl₂、PCR缓冲液、去离子水。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测鲍曼不动杆菌的PCR试剂盒还包括鲍曼不动杆菌DNA阳性对照品。

4.如权利要求1～3任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)DNA提取；

2)PCR反应；

3)电泳检测PCR产物；

若步骤3)检测到3个条带，即判断为检测到鲍曼不动杆菌。

5.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述PCR反应的条件为：在94℃下预变性5min后，进行一下扩增循环：在94℃下变性30s，在55℃下退火30s，在72℃延伸30s，反应30个循环，最后在72℃延伸5min。

6.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述电泳是在1.5％的琼脂糖胶中进行的电泳。

7.如权利要求4所述的使用方法，其特征在于，所述3个条带的大小分别为191、347、524bp。