KR100984785B1 - 살모넬라 티피무리움 검출용 프라이머 세트 및 프로브 - Google Patents
살모넬라 티피무리움 검출용 프라이머 세트 및 프로브 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 검출용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 티피무리움 검출용 키트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 대상 시료에서 살모넬라 티피무리움을 검출하는 방법, 살모넬라 티피무리움 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 및 상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면, 살모넬라 티피무리움을 정확하고 신속하고, 정량적으로 검출할 수 있다.
살모넬라 티피무리움, 프라이머 세트, 프로브, 키트, 마이크로어레이
Description
본 발명은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 검출용 프라이머 세트 및 프로브에 관한 것이다.
살모넬라속균은 그람 음성 박테리아로서, Salmonella enterica와 Salmonella bongori(subspecies Ⅴ) 2가지로 구성되어 있다. Salmonella enterica는 I, Ⅱ, Ⅲa, Ⅲb, Ⅳ 및 Ⅵ으로 6개의 subspecies로 나누어져 있다. 살모넬라(Salmonella)는 Kauffmann-White 표를 기준으로 2500개의 serovar로 분류되어 있다 (Popoff et al. 2001. Res . Microbiol . 152: 907-909). 살모넬라 subspecies Ⅰ 중, Salmonella enterica serovar Typhimurium은 세계적인 식중독 살모넬라 감염증으로부터 가장 자주 격리되는 혈청형이다. 그런 까닭에 이 혈청의 빠른 검출과 동정은 식품산업에서 필요하다.
박테리아 방법을 이용한 살모넬라의 검출은 3-4일 정도가 소요된다. 또한, 이 방법은 매우 노동집약적이며 비용이 많이 들고 복잡하며 시간 소모적이다. 식품으로부터 병원체 세균의 정확하고 빠른 동정은 식품산업과 공공의 건강을 위해 중 요하다. PCR은 미생물학적 진단법에 있어 잠재적으로 효과적인 방법으로 인식되는데 이는 그 간편성, 신속성, 정확성 때문이다 (Kang et al. 2007. J. Microbiol . Biotechnol. 17: 516-519). 최근에 실시간 (Real-time) PCR 방법은 살모넬라 정량, 민감성, 신속성의 이점과 함께 식중독의 검출방법이 보고되어 왔다. 이전에 발표되었던 대부분의 실시간 PCR 프라이머 쌍과 프로브는 다양한 타겟 유전자를 기반에 두었고, 살모넬라속균과 Salmonella enterica serovars에 반응하였다 (Cheung et al. 2004. Lett . Appl . Microbiol . 39: 509-515). 더구나, 실시간 PCR 방법은 식품 내의 살모넬라 검출을 위한 게놈 DNA 추출 이전에 농축(enrichment) 단계를 진행했었다 (Bhagwat, A. A. 2003. Food Microbiol . 21: 73-78).
Salmonella serovars들은 다양한 salmonella serovars의 유전체 서열의 비교분석을 통해 지노타이핑(genotyping) 되었고 주요한 식중독 Salmonella serovars의 새로운 동정표가 제시되었으며 유전자를 이용한 유전정보학기술로 식중독의 적절한 정량과 동정의 적용이 증명되었다.
한국특허등록 제10-671501호에는 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 프라이머와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 유전자 비교를 통해 S. Typhimurium LT2의 STM4497 유전자를 기반으로 특이적인 프라이머 및 프로브를 제작하였고, 다양한 Salmonella serovars 중 S. Typhimurium을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였으며, 또한, 실시간 PCR을 통해 농축(enrichment) 단계 없이 S. Typhimurium의 정량 검출법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 살모넬라 티피무리움을 정확하고 신속하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 포함하는 살모넬라 티피무리움 검출용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트를 이용하여 대상 시료에서 살모넬라 티피무리움을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 살모넬라 티피무리움 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면, 살모넬라 티피무리움을 정확하고 신속하게 검출할 수 있다. 또한, 실시간 PCR을 통해 농축(enrichment) 단계 없이 인위적으로 접종한 치킨 시료에서 추출된 DNA로 S. Typhimurium의 직접적인 정량을 평가하였다. 결과적으로, 이 실시간 PCR 법은 식품에 접종된 식중독 병원성 균의 검출에 적용할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)을 정확하고 신속하고 정량적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다. 상기 프라이머 세트는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
상기 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 가장 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트에서, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대상 시료에서 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 대상 시료는 예를 들면, 닭고기일 수 있으나, 살모넬라 티피무리움으로 감염되었을 것으로 의심되는 시료이면 제한되지 않는다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당 업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 서열은 살모넬라 티피무리움 LT2의 STM4497 유전자이다.
표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당 업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 실시간 PCR을 통해 정량적으로 수행할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 형광 프로브, SYBR Green I, Cy-5 또는 Cy-3이다. 형광 프로브의 경우에는 PCR 전에 프로브를 주형에 혼성화시키고, PCR이 진행되면서 프로브가 주형에서 떨어져 나오면서 형광을 발하게 되는 것이다. 형광 리포터 dye는 5' 끝부분엔 6-FAM(carboxyfluorescein), 비형광 물질인 quencher 3' 끝부분엔 MGB(minor groove binder)이 표지되어 있다. SYBR Green I의 경우에는 PCR 반응 혼합물에 상기 dye를 혼합하여 PCR을 실시하면 PCR이 진행되면서 SYBR Green I이 PCR 산물에 삽입되면서 형광을 띄게 된다. Cy-5 또는 Cy-3의 경우에는 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 3의 염기서열로 이루어진, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다.
본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 올리고뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 올리고뉴클레오티드 프로브가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시 킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
재료 및 방법
미생물 종류와 성장조건
ATCC(American Type Culture Collection)으로부터 주요한 식중독 균으로 알려진 병원성 미생물과 그 연관성이 있는 미생물을 구입하여 본 발명에 사용하였고, 그 종류는 표 1에 제시하였다.
표 1. 실시간 PCR 실험에 사용된 균주 목록과 결과.
| 종 (Species) | 균주 (Strain) | 결과 |
| Salmonella serovar Typhimurium | ATCC 19585 | + |
| Salmonella serovar Typhimurium | ATCC 14028 | + |
| Salmonella serovar Typhimurium | ATCC 13311 | + |
| Salmonella serovar Typhi | ATCC 6539 | - |
| Salmonella serovar Typhi | ATCC 33459 | - |
| Salmonella serovar Paratyphi C | ATCC 13428 | - |
| Salmonella serovar Paratyphi B | ATCC 10719 | - |
| Salmonella serovar Enteritidis | ATCC 4931 | - |
| Salmonella bongori | ATCC 43975 | - |
| Salmonella enterica salamae | ATCC 15793 | - |
| Salmonella enterica arizonae | ATCC 13314 | - |
| Salmonella enterica diarizonae | ATCC 43973 | - |
| Salmonella enterica houtenae | ATCC 43974 | - |
| Salmonella enterica indica | ATCC 43976 | - |
| Salmonella serovar Choleraesuis | ATCC 13312 | - |
| Salmonella serovar Gallinarum | ATCC 9184 | - |
| Salmonella serovar Pullorum | ATCC 9120 | - |
| Escherichia coli O157:H7 | ATCC 43894 | - |
| Escherichia coli | ATCC 27325 | - |
| Yersinia enterocolitica | ATCC 23715 | - |
| Bacillus cereus | ATCC11778 | - |
| Bacillus subtilis | ATCC 6633 | - |
| Enterococcus faecalis | ATCC 19433 | - |
| Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae | ATCC 8724 | - |
| Bacillus thuringiensis | ATCC 10792 | - |
| Bacillus anthracis | ATCC 14578 | - |
| Listeria monocytogenes | ATCC 19118 | - |
| Listeria ivanovii | ATCC 19119 | - |
| Listeria welshimeri | ATCC 35897 | - |
| Listeria inocua | ATCC 33090 | - |
| Listeria grayi | ATCC 25401 | - |
| Listeria seeligeri | ATCC 35967 | - |
| Staphylococcus aureus | ATCC 6538 | - |
| Staphylococcus haemolyticus | ATCC 29970 | - |
| Staphylococcus epidermidis | ATCC 14990 | - |
| Vibrio parahaemolyticus | ATCC 17802 | - |
| Vibrio cholerae | ATCC 14547 | - |
| Vibrio vulnificus | ATCC 33815 | - |
| Campylobacter jejuni | ATCC 43429 | - |
| Clostridium botulinum | ATCC 3502 | - |
| Clostridium perfringens | ATCC 3624 | - |
| Citrobacter frenudii | ATCC 8090 | - |
| Enterobacter aerogenes | ATCC 13048 | - |
| Enterobacter cloacae | ATCC 13047 | - |
| Enterobacter sakazakii | ATCC 29544 | - |
| Enterobacter cloacae | ATCC 13047 | - |
| Enterobacter sakazakii | ATCC 29544 | - |
| Proteus vulgaris | ATCC 29905 | - |
| Shigella flexneri | ATCC 12022 | - |
| Shigella sonnei | ATCC 25931 | - |
표준 배양조건을 사용하였다. Salmonella serovar Typhimurium ATCC19585는 표준 배양조건인 Luria-Bertani broth medium(Difco laboratories, Detroit, MI, U.S.A)에서 37℃ 하룻밤을 배양하였다.
닭으로부터 시료의 준비와 게놈
DNA
의 추출
포장되어 있는 닭의 가슴살을 인근 마트에서 구입하고 같은 날 분석을 위해 무균 팩에 옮겨 보관하였다. 닭고기는 흐르는 물에 세척하고 여러 조각으로 잘게 썰었다. 그 후 무균 여과 팩(BA6141/STR filter bag, Seward Laboratories, West Sussex, U.K)에 PBS (phosphate buffered saline) 225ml와 25g의 닭고기를 넣고 혼합하였다. 600nm로 광학 밀도를 0.66을 맞춘 108 CFU/ml의 균 배양액 1ml을 9ml씩 담은 PBS 용액에 넣고 순차적 희석을 한다. 닭 시료와 PBS 용액에 1ml의 순차적으로 희석한 균 배양액을 담고 인위적으로 접종을 하여 박테리아-PBS 용액으로 만든다. 6개의 시료는 4.5X105 CFU/ml에서 4.5X100 닭고기-PBS 시료로 준비하였다. 표준 대조구 시료로 1ml의 PBS 버퍼를 넣고 닭고기와 PBS 용액을 넣어 혼합하였다. 접종 후 시료를 즉각 스토마커(stomacher 400 circulator, Seward Laboratories, West Sussex, U.K.)를 이용하여 230rpm에서 30초 동안 혼합한다. 실시간 PCR을 위해 10분 동안 10,000g에서 1ml의 시료를 수확한다. 실시간 PCR을 위해 수확한 시료를 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN, Hilden, Germany)를 이용하여 매뉴얼의 지시에 따라 게놈 DNA를 추출한다. 60㎕의 3차 멸균수(GIBCOTM, Grand Island, NY, U.S.A)를 게놈 DNA의 분리를 위하여 스핀 칼럼에 넣은 후 10분 동안 원심분리기를 이용한다. 플레 이트 카운트를 위해 십진법으로 희석한 균체 부유물을 3번 반복실험을 통해 결정한다.
실시간
PCR
을 이용한
Salmonella
Typhimurium
의 게놈
DNA
의 표준 곡선
S. Typhimurium ATCC19585의 정제된 게놈 DNA를 사용하여 실시간 PCR의 표준곡선을 그렸다. 그 후 밤새 배양한 S. Typhimurium ATCC 19585의 게놈 DNA를 추출하고 QubitTM Fluorometer와 Qubit-itTM dsDNA HS assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A)를 이용하여 정량하였다. 정제된 게놈 DNA는 5㎕에 최종농도를 4X105, 4X104, 4X103, 4X102, 4X101, 4X100 과 0 genome equivalent로 정량하였다. DNA genome equivalent 는 다음과 같은 식에 의해 계산하였다: DNA genome equivalent = (A x 6.023 x 1023) (660 x B)-1, A 는 DNA의 농도이고 B는 게놈 DNA의 길이이다.
Salmonella
Typhimurium
의 정량을 위한
프라이머와
프로브
Salmonella Typhimurium의 정량과 검출을 위해 사용한 프라이머와 프로브는 표 2에 제시하였다.
표 2. PCR에 사용된 프라이머와 프로브.
| 올리고뉴클레오티드 | 서열 (5'-3') |
| Sal-F | GCG CAC CTC AAC ATC TTT C (서열번호 1) |
| Sal-R | CGG TCA AAT AAC CCA CGT TCA (서열번호 2) |
| Sal-Probe | FAMa ATC ATC GTC GAC ATG C MGB/NFQ (서열번호 3) |
aFAM, 6-carboxyfluorescein (reporter dye).
TaqMan 분석에 사용될 PCR 프라이머와 형광 프로브의 경우 프라이머 Express 2.0 software (Applied Biosystems, Forest City, CA, U.S.A)를 사용하여 S. Typhimurium LT2의 특이한 DNA 단편의 증폭을 위해 제작되었다. Applied Biosystem(Applied Biosystems, Forest City, CA, U.S.A)을 통해 프로브를 구입하였고 프라이머는 bionics Corp (Seoul, Korea)을 통해 구입하였다. 그 프로브는 형광 리포터 dye는 5' 끝부분엔 6-FAM(carboxyfluorescein), 비형광 물질인 quencher 3' 끝부분엔 MGB(minor groove binder)이 표지 되었다.
실시간
PCR
조건
증폭반응은 25㎕로 최종부피를 맞추고 시료는 각각 3번 반복으로 진행한다. 하나의 실시간 PCR 반응 튜브에 12.5㎕의 Mastermix (TaqMan® Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems), 0.4 μM 프라이머, 0.2 μM 프로브, 5 ㎕의 시료 DNA, 및 5㎕ 의 3차증류수 (GIBCO™, Grand Island, NY, U.S.A.)를 첨가한다. Thermal cycling은 2단계 PCR 프로토콜을 이용해 다음과 같이 진행한다: 50℃ 2 min, 95℃ 10 min, 및 95℃ 15 sec 및 60℃ 1 min의 50 사이클, 그리고 형광 시그날은 연장 단계의 마지막에서 각각의 사이클에 측정된다.
실시예
1:
Salmonella
Typhimurium
을 위한
프라이머쌍의
Inclusivity
및
Exclusivity
사용한 프라이머와 프로브의 특이성의 증명, 평가를 위해 표 2에 제시된 프라이머쌍과 프로브를 실시간 PCR을 이용하여 다양한 미생물 균주들과 S. Typhimurium의 DNA와 함께 확인하였다. 그리고 본 발명에서 사용된 제작된 프라이머와 프로브는 S. Typhimurium의 특이적인 PCR 산물을 증폭하고, 표 2에 제시되어있다.
실시예
2:
Salmonella
Typhimurium
의 정량된 게놈
DNA
의 실시간
PCR
결과
증폭곡선과 실시간 PCR의 표준곡선은 S. Typhimurium ATCC 19585의 1/10로 순차적 희석된 게놈 DNA로부터 결과를 얻었고 도 1, 2 및 표 3에 제시하였다. Rn은 PCR 산물의 농도와 관련되고, Rn이 클수록 PCR 산물의 농도가 높음을 의미한다. 5번의 개별적인 실험을 3번씩 반복 분석하여 하나의 증폭 곡선을 도 1에 제시하였다. 완전한 S. Typhimurium ATCC 19585의 알려진 크기(4.99 Mb)에 따라 하나의 genome equivalent는 5.46904 fg(펨토그램)으로 계산되었다. 실시간 PCR을 이용하여 3번 반복한 하나의 개별 실험에서 S. Typhimurium ATCC 19585의 정량된 게놈 DNA는 4.5X105 에서 0 genome equivalents까지 나타내었다. 도 1과 표 3에서 제시된 것처럼 S. Typhimurium ATCC 19585의 0 genome equivalent의 DNA는 증폭되지 않았고, 4.5X105 부터 4.5 게놈 DNA의 증폭곡선은 제시된 것과 같이 나타났다.
1/10로 희석된 게놈 DNA는 3번의 반복실험에 threshold cycle(Ct) 값은 거의 동일하게 나타났다. Ct란 실시간 PCR 반응에서 검출 가능한 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말한다. 즉, 초기 DNA 농도가 클수록 낮은 Ct에서 증폭량이 많아서 형광 신호가 검출가능하고, 초기 DNA 농도가 작을수록 Ct가 크다. 그리고 S. Typhimurium ATCC 19585의 DNA genome equivalent를 근본으로 한 threshold cycle의 평균값과 표준편차는 표 3에 나타내었다.
표 3. Salmonella Typhimurium ATCC 19585의 게놈 DNA Genome equivalents 정량에 따른 실시간 PCR Threshold cycle (Ct) 결과
| Genome equivalentsa | Ct 값 | 평균 | 표준편차 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||
| 400000 | 17.99 | 17.65 | 17.41 | 17.51 | 17.31 | 17.57 | 0.26 |
| 40000 | 21.55 | 21.12 | 20.99 | 21.08 | 20.79 | 21.11 | 0.28 |
| 4000 | 25.05 | 24.94 | 24.53 | 24.61 | 24.42 | 24.71 | 0.27 |
| 400 | 28.64 | 28.49 | 28.74 | 28.62 | 28.44 | 28.59 | 0.12 |
| 40 | 31.81 | 31.18 | 32.53 | 32.11 | 32.09 | 31.94 | 0.50 |
| 0 | N. D. | N. D. | N. D | N. D. | N. D. | ||
a Salmonella Typhimurium ATCC 19585의 Genome equivalents.
b N. D. : 검출되지 않음.
정량된 살모넬라 게놈 DNA의 실시간 PCR 표준곡선은 3번 반복실험 하였고 그 평균 결과는 도 2에 log cell 수와 관계를 직선으로 증명하였다. 표준 곡선의 Ct 값은 0.9951의 높은 상관계수 값을 보였고 산출된 기울기의 값은 -3.4037이었다.
실시예
3: 닭고기에
Salmonella
enteric
serovar
Typhimurium
을 인위적으로 접종하여 실시간
PCR
과 플레이트 카운트를 이용한 정량
닭고기에 인위적으로 접종하여 게놈 DNA를 추출한 증폭 곡선의 정량은 도 3에 나타내었다. 정량곡선은 닭-PBS 용액의 4.5X105 부터 4.5X100 CFU/ml까지를 제시하였다. 6번의 실험의 Ct 값의 범위는 20.72±0.23 부터 36.25±0.63이고, 각각의 Ct 값은 3번의 반복실험으로 평균을 구하였다. 도 2에 있는 표준 증폭곡선으로부터 이 Ct 값을 genome equivalent로 바꾼 값은 표 4에 제시하였다.
표 4. S. Typhimurium ATCC 19585을 닭에 인위적으로 접종하여 정량한 실시간 PCR 결과.
| 접종된 S. Typhimurium 수 (닭-PBS 용액의 CFU/ml) |
TaqMan 실시간 PCR | 플레이트 카운트 |
| 4.5X105 | (6.3±0.9) X 105 | (4.3±0.3) X 105 |
| 4.5X104 | (6.8±0.6) X 104 | (3.3±1.6) X 104 |
| 4.5X103 | (7.2±0.9) X 103 | (4.0±1.2) X 103 |
| 4.5X102 | (8.1±0.1) X 102 | (5.5±1.4) X 102 |
| 4.5X101 | (1.2±0.6) X 102 | (1.2±1.0) X 102 |
| 4.5X100 | 35±15 | 15±8 |
| N.I.a | N.D.b | N.D. |
aN. I. : 접종하지 않음, bN. D. : 검출되지 않음.
정량된 S. Typhimurium 의 실시간 PCR 결과는 닭고기에 S. Typhimurium 을 인위적으로 접종한 것보다 더 높게 나타났다. 닭고기에 인위적으로 접종된 S. Typhimurium 은 전통적인 플레이트 카운트 방법에 의해 그 양이 결정되었다(표 4). 플레이트 카운트방법으로부터 계산된 세포 수는 시료에 실시간 PCR에 인위적으로 오염시킨 S. Typhimurium 과 비슷하게 측정되었다.
도 1은 실시간 PCR을 이용하여, 400,000 내지 0 genome equivalents 범위의 S. Typhimurium ATCC 19585의 10배씩 연속적으로 희석된 게놈 DNA의 증폭 플롯이다. Delta Rn은 Y-축에 플롯팅하고, 증폭 사이클 수는 X-축에 플롯팅한다.
A, 400,000; B, 40,000; C, 4,000; D, 400; E, 40; F, 0; S. Typhimurium의 DNA genome equivalents.
도 2는 3회 반복된 실시간 PCR 실험의 평균 결과를 이용하여 작성된 S. Typhimurium ATCC 19585의 10배씩 연속적으로 희석된 게놈 DNA의 표준 곡선이다. Threshold cycle (Ct)는 Y-축에 플롯팅하고, Log genome equivalent는 X-축에 플롯팅한다.
도 3은 실시간 PCR을 이용하여, 닭-PBS 용액의 450,000 내지 0 CFU/ml 범위의 10배씩 연속적으로 접종된 닭 시료에서 추출된 게놈 DNA의 증폭 플롯이다. A, 4.5X105; B, 4.5X104; C, 4.5X103; D, 4.5X102; E, 4.5X101; F, 4.5X100; G, 0; 접종된 S. Typhimurium의 수 (닭-PBS 용액의 CFU/ml).
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University
<120> Primer set and probe for detecting Salmonella typhimurium
<130> PN08100
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sal-F primer
<400> 1
gcgcacctca acatctttc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sal-R primer
<400> 2
cggtcaaata acccacgttc a 21
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sal-probe
<400> 3
atcatcgtcg acatgc 16
Claims (7)
- 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 이루어진, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 특이적 검출용 프라이머 세트.
- 삭제
- 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 특이적 검출용 키트.
- 대상 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 대상 시료에서 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)을 특이적으로 검출하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 실시간 PCR을 통해 정량적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
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