CN109937052A

CN109937052A - 用于目标分子展示的共价融合的病毒外被蛋白

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Publication number: CN109937052A
Application number: CN201780069666.4A
Authority: CN
Inventors: S·托蒂; K·穆西丘克
Original assignee: Fraunhofer USA Inc
Current assignee: Fraunhofer USA Inc
Priority date: 2016-11-11
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2019-06-25
Also published as: EP3538147A1; EP3538147A4; CA3041888A1; US20210324015A1; BR112019009221A2; WO2018089814A1; US11618771B2; US20200181203A1; US11078240B2

Abstract

提供了融合蛋白，其包含第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽。所述第一重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的N‑末端连接。所述第二重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的C‑末端连接。所述第一和第二重组病毒外被蛋白衍生自苜蓿花叶病毒(AIMV)的外被蛋白(CP)。所述融合蛋白可以形成病毒样颗粒(VLP)。当所述融合蛋白进一步包含目标蛋白时，所述目标蛋白可以展示在所述VLP的表面上。还提供了生产所述融合蛋白和所述VLP的方法，以及所述融合蛋白和/或所述VLP的用途。

Description

用于目标分子展示的共价融合的病毒外被蛋白

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年11月11日提交的美国临时申请No.62/420,993的优先权，其完整公开内容为了所有目的通过引用以它们的整体合并在本文中。

技术领域

本发明涉及共价融合的病毒外被蛋白以及由此形成的病毒样颗粒，来展示目标分子。

背景技术

病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)疫苗是重组生产的疫苗，它们重复、高密度地展示期望的抗原，并且已经显示了提高针对抗原的免疫应答。所有商业上可获得的重组生产的疫苗都是VLP的形式。

Peyret等人报道，乙型肝炎核心蛋白HBcAg上的主要插入区(major insertionregion，MIR)容许插入外源序列，用于将该外源序列编码的外源蛋白(例如，单结构域抗体片段)展示在VLP外侧的表面刺突结构的尖端，VLP由两个HBcAg开放阅读框串联融合的单个多肽链组装而成，这种串联核心策略容许在各刺突的两个MIR之一中插入大的异源序列而不损害VLP形成。(Peyret等人(2015)PLoS ONE 10(4):e0120751.doi:10.1371/journal.pone.0120751；美国专利申请公开No.2016/0122420 A1)。由于MIR位点是暴露得最多的，由HBc颗粒诱导的大多数抗体识别该区域，该抗原位点的免疫显性(immunodominance)转移到插入MIR位点的外源序列。(Peyret等人(2015)PLoS ONE 10(4):e0120751.doi:10.1371/journal.pone.0120751)。

大多数病毒外被蛋白不具有用于制造VLP疫苗的HBcAg蛋白的抗原性MIR位点。因而，仍然需要对于制造有效的VLP疫苗有用的病毒外被蛋白如苜蓿花叶病毒(AIMV)外被蛋白(CP)的融合蛋白。

发明内容

本发明涉及融合蛋白，其包含两个或多个重组病毒外被蛋白和任选的目标蛋白，以及由所述融合蛋白形成的病毒样颗粒(VLP)。

本发明提供了融合蛋白，其包含第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽。所述第一重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的N-末端连接，所述第二重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的C-末端连接。所述第一重组病毒外被蛋白包含与苜蓿花叶病毒(AIMV)的外被蛋白(CP)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)至少80％相同的氨基酸序列。所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。所述第一连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。

本发明还提供了融合蛋白，其包含目标蛋白、第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽。所述目标蛋白处在所述第一重组病毒外被蛋白的N-末端。所述第一重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的N-末端连接。所述第二重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的C-末端连接。所述第一重组病毒外被蛋白包含与苜蓿花叶病毒(AIMV)的外被蛋白(CP)(SEQ ID NO:1)至少80％相同的氨基酸序列。所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。所述第一连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。

当所述融合蛋白包含所述目标蛋白时，所述融合蛋白可以进一步包含第二连接肽，其中所述目标蛋白与所述第二连接肽的N-末端连接，并且所述第一重组病毒外被蛋白与所述第二连接肽的C-末端连接。所述第二连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。

所述第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个胰蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。所述第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ IDNO:1至少80％相同的、具有胰凝乳蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。所述第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个植物内(in planta)消化位点的突变的氨基酸序列。

所述第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有SEQID NO:1的残基17-38处的缺失、插入或取代的氨基酸序列。SEQ ID NO:1的残基17-38可以用由SEQ ID NO:2组成的第三连接肽取代。所述第一重组病毒外被蛋白可以由SEQ ID NO:3组成。所述第一重组病毒外被蛋白可以进一步包含一个或多个胰蛋白酶位点的突变。

所述第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个胰蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。所述第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ IDNO:1至少80％相同的、具有胰凝乳蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个植物内消化位点的突变的氨基酸序列。

所述第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有SEQID NO:1的残基17-38处的缺失、插入或取代的氨基酸序列。所述第二重组病毒外被蛋白可以由SEQ ID NO:4组成。SEQ ID NO:1的残基17-38可以用第四连接肽取代。所述第四连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。所述第二重组病毒外被蛋白可以进一步包含一个或多个胰蛋白酶位点的突变。

本发明的融合蛋白可以包含SEQ ID NO:5。

当所述融合蛋白包含目标蛋白时，所述目标蛋白可以是选自由免疫原性试剂、治疗试剂、诊断试剂和酶组成的组的试剂。所述目标蛋白可以是免疫原性试剂。所述目标蛋白可以是治疗试剂。所述目标蛋白可以是诊断试剂。所述目标蛋白可以是酶。

对于本发明的各融合蛋白，提供了生产所述融合蛋白的方法。所述方法包括向细胞中导入编码所述融合蛋白的核酸分子，并在所述细胞中表达所述融合蛋白。由此，生产所述融合蛋白。

当所述融合蛋白包含目标蛋白时，提供了生产所述融合蛋白的方法。所述方法包括向细胞中导入编码所述融合蛋白的核酸分子，并在所述细胞中表达所述融合蛋白。由此，生产所述融合蛋白。所述目标蛋白可以是选自由免疫原性试剂、治疗试剂、诊断试剂和酶组成的组的试剂。所述目标蛋白可以是免疫原性试剂。所述目标蛋白可以是治疗试剂。所述目标蛋白可以是诊断试剂。所述目标蛋白可以是酶。

所述融合蛋白生产方法可以进一步包括从所述细胞中纯化所述融合蛋白。所述细胞可以是在植物或其一部分中。所述细胞可以是酵母细胞。所述细胞可以是昆虫细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞。

对于本发明的各融合蛋白，提供了包含所述融合蛋白的组合物。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。

提供了由本发明的融合蛋白形成的病毒样颗粒(VLP)。当所述融合蛋白包含目标蛋白时，所述目标蛋白展示在所述病毒样颗粒的表面上。

VLP可以在细胞、生物体或生物体的一部分中形成。所述细胞可以选自由植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞组成的组。所述细胞可以在植物或其一部分中。所述植物可以是烟草属(Nicotiana)物种。所述细胞可以是酵母细胞。所述细胞可以是昆虫细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞。

对于本发明的VLP，提供了包含VLP的组合物。至少50％的病毒样颗粒的直径可以具有小于所述病毒样颗粒的平均直径的50％。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。

对于根据本发明的融合蛋白，提供了由所述融合蛋白生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括向细胞、生物体或生物体的一部分中导入编码所述融合蛋白的核酸分子，在所述细胞、生物体或生物体的一部分中表达所述融合蛋白，以及由所述融合蛋白形成VLP。由此，生产所述病毒样颗粒。

对于根据本发明的包含目标蛋白的融合蛋白，提供了由所述融合蛋白生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括向细胞、生物体或生物体的一部分中导入编码所述融合蛋白的核酸分子，在所述细胞、生物体或生物体的一部分中表达所述融合蛋白，以及由所述融合蛋白形成VLP。由此，生产所述VLP，所述目标蛋白展示在所述VLP的表面上。

在一个实施方案中，所述VLP在所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中形成。所述VLP生产方法可以进一步包括从所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中纯化所述VLP。

在另一个实施方案中，所述VLP生产方法进一步包括在VLP形成之前从所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中纯化所述融合蛋白。

根据本发明的VLP生产方法，至少50％的病毒样颗粒的直径可以小于所述病毒样颗粒的平均直径的50％。所述VLP可以由至少50％的融合蛋白形成。

提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含免疫原性试剂作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP。

提供了一种治疗受试者中的疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含治疗试剂作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP。

提供了一种检测来自受试者的样品中的生物标志物的方法。所述方法包括使所述样品与有效量的包含诊断试剂作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP接触。所述诊断试剂结合所述生物标志物。

提供了一种通过试剂催化反应的方法。所述方法包括使所述试剂与有效量的包含酶作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP接触。所述酶催化所述反应。

附图说明

图1显示了苜蓿花叶病毒(AIMV)的外被蛋白(CP)(SEQ ID NO:1)、连接肽(SEQ IDNO:2)、第一重组病毒外被蛋白(SEQ ID NO:3)、第二重组病毒蛋白(SEQ ID NO:4)和融合蛋白(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列。

图2显示了Pfs230蛋白的示意图，突出了展示在VLP上的蛋白的区域(Pfs230-CP²)。

图3显示了Pfs230-CP²的电泳特征。通过gel code Blue染色的SDS-PAGE分析蛋白，并通过抗His标签mAb、抗230 2G5mAb和抗230 2B10mAb识别。

图4显示了Pfs230-CP²融合蛋白作为病毒样颗粒的特征。(A)分析性空间排阻层析分析。(B)纯化的Pfs230-CP² VLP的负染色透射电子显微镜图像。(C)显示抗原展示水平的Pfs230-CP² VLP的卡通图像。

图5显示了Pfs25蛋白作为CP²融合蛋白的特征。(A)Pfs25-CP²蛋白CMB-01053的Gelcode Blue染色的SDS-PAGE，和(B)在VLP上展示Pfs25蛋白的CMB-01053的负染色透射电子显微镜图像。

图6显示了CP²展示的抗原的gel code Blue染色的SDS-PAGE，(A)H1流感CP²融合蛋白CMB-02039，(B)H3流感CP²融合蛋白CMB-02079，(C)H5流感CP²融合蛋白CMB-02011，(D)H7流感CP²融合蛋白CMB-02059，或(E)在初步柱纯化之后的H1流感蛋白结构域CP²融合蛋白CMB-02047。(F)在VLP上展示流感抗原的CMB-02039、CMB-02079、CMB-02011、CMB-02059、CMB-02011和CMB-02059的负染色透射电子显微镜图像(从左到右)。

图7显示了西方马脑炎病毒(Western Equine encephalitis virus)结构域作为CP²融合蛋白的特征。A)西方马脑炎病毒结构域CP²融合蛋白CMB-02412的Gel code Blue染色的SDS-PAGE，由抗His抗体和抗西方马脑炎(WEE)病毒抗体识别。(B)展示作为VLP的西方马脑炎病毒结构域的CMB-02412的负染色透射电子显微镜图像。

图8显示了东方马脑炎病毒(Eastern Equine encephalitis virus)结构域作为CP²融合蛋白的特征。(A)东方马脑炎病毒结构域CP²融合蛋白CMB-02383的Gel code Blue染色的SDS-PAGE，由抗His抗体和抗东方马脑炎(EEE)病毒抗体识别。(B)展示作为VLP的东方马脑炎病毒结构域的CMB-02383的负染色透射电子显微镜图像。

图9显示了东方马脑炎病毒蛋白作为CP²融合蛋白的特征。(A)东方马脑炎病毒CP²融合蛋白CMB-02380的Gel code Blue染色的SDS-PAGE，由抗His抗体和抗东方马脑炎病毒抗体识别。(B)展示作为VLP的东方马脑炎病毒蛋白的CMB-02380的负染色透射电子显微镜图像。

图10显示了第一代VLP设计。(A)显示第一代A85分子的设计的示意图。(B)纯化的A85 VLP的SDS-PAGE凝胶。(C)显示抗原展示水平的A85 VLP的卡通图像。

图11显示了第二代VLP设计。(A)显示第二代分子的设计的示意图。(B)概述第二代分子的结果的表格。

图12显示了第三代VLP设计。(A)显示第三代分子的设计的示意图。(B)概述第三代分子的结果的表格。(ND＝未测定)。

图13显示了A85 VLP与CMB-01053 VLP的比较。(A)纯化的A85和CMB-01053 VLP的SDS-PAGE凝胶。(B)纯化的A85和CMB-01053 VLP的负染色透射电子显微镜图像。(C)显示抗原展示水平的A85和CMB-1053 VLP的卡通图像。

图14显示了Pfs25-CP融合蛋白B29、B30和CMB-01053形成的VLP的免疫学比较。(A)比较Pfs25-CP融合蛋白的动物研究设计。(B)第56天的抗Pfs25 IgG应答。(C)第168天的抗Pfs25 IgG应答。(D)第56天(D.56)和第168天(D.168)获得的样品的标准膜饲喂分析(standard membrane feeding assay，SMFA)。

图15显示了展示各种抗原的CP-CP VLP的gel code Blue染色PAGE和负染色透射电子显微镜图像：Pfs230亚结构域(左上图)、黄热病亚结构域(右上图)、流感亚结构域(左下图)和东方马脑炎病毒结构域(右下图)。

图16显示了AIMV CP的N-末端的降解位点。(A)野生型AIMV CP(SEQ ID NO:1)的氨基酸2至50的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶敏感位点的基因芯片(in silico)鉴定。(B)野生型AIMV CP(SEQ ID NO:1)的氨基酸2至50，鉴定的植物内消化的位点由箭头指示。(C)来自修饰的AIMV CP的相应区域中(相应于SEQ ID NO:3的残基1-42)的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶敏感位点的基因芯片鉴定，显示去除大部分的蛋白酶敏感位点。

图17显示了Western印迹上、Sf21昆虫细胞的提取物中SEQ ID NO:5的融合蛋白的表达，其中M-分子量标志物；1-AIMV CP标准物；2-非转染的昆虫SF21细胞；3-转染的昆虫SF21细胞提取物，表达CP-CP融合物；4-HAI标准物，含有6×His标签。

图18显示了负染色透射电子显微镜(TEM)分析的、通过高速离心采集的VLP，确认了昆虫细胞中表达的SEQ ID NO:5的融合蛋白可以形成VLP。

图19显示通过Western印迹分析的、酵母(巴斯德毕赤氏酵母，Pichia pastoris)细胞的提取物中SEQ ID NO:5的融合蛋白的表达，其中M-分子量标志物；1-AIMV CP标准物；2-非诱导的酵母细胞的提取物，含有CP-CP融合物；3-诱导的酵母细胞的提取物，表达CP-CP融合物；4-HAI蛋白标准物，含有6×His标签。

图20显示了通过Western印迹分析的、哺乳动物细胞的提取物中融合蛋白的表达，其中M-分子量标志物；1、2-AIMV CP标准物；3-非转染的哺乳动物细胞的提取物；4-转染的哺乳动物细胞的提取物，表达CP-CP融合物；5、6-HAI蛋白标准物，含有6×His标签。箭头指示相应于CP-CP融合物的条带。

图21显示了CP²融合物的体外VLP形成。在体外颗粒形成之前和之后，在分析性空间排阻层析上解析的CP²融合蛋白，其中病毒样颗粒(VLP)在～9mL处解析。

图22显示了由(A)植物细胞、(B)酵母细胞和(C)昆虫细胞中产生的CP-CP形成的VLP的负染色透射电子显微镜图像。

图23显示了HRP-CP²融合蛋白的分析。通过IMAC层析分离HRP-CP²融合蛋白，通过(A)考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE，(B)抗His Western印迹、(C)化学发光分析检测HRP活性，和(D)透射电子显微镜图像进行表征。

具体实施方式

本发明基于以下发现，以串联形式表达、通过柔性接头连接以容许AIMV分子并排对齐、衍生自苜蓿花叶病毒(AIMV)的重组外被蛋白(CP)的新的融合蛋白可以在各种表达系统中表达，并且可以用于在体内或体外形成病毒样颗粒(VLP)。这种技术提供了用于制造VLP来呈递各种各样的目标蛋白的有效且生产性的工具。

本发明提供了融合蛋白。所述融合蛋白包含衍生自苜蓿花叶病毒(AIMV)的两个或多个重组外被蛋白(CP)，称为重组AIMV CP。重组AIMV CP可以是相同的或不同的。两个邻近的重组AIMV CP可以通过连接肽连接。重组AIMV CP按照有助于融合蛋白的VLP形成的方式对齐。所述融合蛋白可以进一步包含位于重组AIMV CP的N-末端的目标蛋白。在某些实施方案中，所述融合蛋白包含两个重组AIMV CP，也被称为CP-CP或CP²。

本文使用的术语“衍生自”是指起源或来源。重组外被蛋白(CP)衍生自苜蓿花叶病毒(AIMV)的外被蛋白(CP)(图1)。AIMV CP的氨基酸序列在图1中显示。重组AIMV CP可以包含部分的或完整的AIMV CP，并可以是AIMV CP的片段或变体。

本文使用的术语“突变”是指一个或多个氨基酸的缺失、插入或取代。氨基酸取代可以是保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是在其中氨基酸残基被替换为具有相似侧链的氨基酸残基的一种取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族是本领域已知的。这些家族包括带有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。

例如，AIMV CP(SEQ ID NO:1)的残基6、7、11、17、18、27和/或37的一个或多个胰蛋白酶位点可以通过例如缺失、插入或取代进行突变。AIMV CP(SEQ ID NO:1)的残基22处的胰凝乳蛋白酶位点可以通过例如缺失、插入或取代进行突变。AIMV CP(SEQ ID NO:1)的残基24和25之间、残基25和26之间、和/或残基37和38之间的一个或多个植物内消化位点可以通过例如缺失、插入或取代进行突变。AIMV CP(SEQ ID NO:1)的残基17-38可以通过例如缺失、由SEQ ID NO:2组成的连接肽的插入或取代进行突变。

本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物，例如，小鼠或人类。优选地，所述受试者是人类。所述受试者可以是患有疾病或病症的患者。所述受试者可以需要诱导免疫应答、治疗疾病或病症、或检测生物标志物。

本文使用的术语“有效量”是指实现声称的目标(例如，诱导免疫应答、治疗疾病或病症、检测生物标志物、或催化反应)所需的融合蛋白、由融合蛋白形成的病毒样颗粒(VLP)、或包含融合蛋白或VLP的组合物的量。融合蛋白、VLP或组合物的有效量可以根据声称的目标，受试者的身体特征，疾病或失调的性质或严重度，相关或不相关医学病症的存在，融合蛋白、VLP或组合物的性质，向受试者施用融合蛋白、VLP或组合物的方式，和施用途径而变化。给定受试者的具体剂量一般可以通过医师的判断来设定。所述药物组合物可以以一个或多个剂量向受试者施用。

重组AIMV CP是包含衍生自AIMV CP的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的多肽，例如，与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。重组AIMV CP可以由除了一个或多个突变之外与SEQ ID NO:1相同的氨基酸序列组成。例如，重组AIMV CP可以由SEQ ID NO:3或4的氨基酸序列(图1)组成。

连接肽可以是允许所述融合蛋白的一种或多种期望性质的任何长度。例如，连接肽可以是允许由融合蛋白形成病毒样颗粒(VLP)、或在VLP的表面上展示目标蛋白的长度。连接肽可以具有至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸，或约1-50、5-30或10-20个氨基酸。连接肽可以由GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:2)组成。

目标蛋白可以是选自由免疫原性试剂、治疗试剂、诊断试剂和酶组成的组的试剂。目标蛋白可以是免疫原性试剂。免疫原性试剂可以是疟疾抗原(例如，Pfs230和Pfs25)、流感抗原(例如，血细胞凝集素的胞外域和亚结构域)、黄热病亚结构域、西方马脑炎病毒(WEE)抗原和东方马脑炎病毒(EEE)抗原。目标蛋白可以是治疗试剂。目标蛋白可以是诊断试剂。目标蛋白可以是酶。

在一个实施方案中，融合蛋白包含第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽。第一重组病毒外被蛋白与第一连接肽的N-末端连接。第二重组病毒外被蛋白与第一连接肽的C-末端连接。第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，融合蛋白包含目标蛋白、第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽。目标蛋白处在所述第一重组病毒外被蛋白的N-末端。第一重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的N-末端连接。第二重组病毒外被蛋白与第一连接肽的C-末端连接。第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。

第一和第二重组病毒外被蛋白可以按照有助于由融合蛋白形成VLP的方式对齐。第一连接肽可以是允许由融合蛋白形成病毒样颗粒(VLP)的任何长度。例如，第一连接肽可以具有至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸，或约1-50、5-30或10-20个氨基酸。第一连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。

当融合蛋白包含目标蛋白时，融合蛋白可以进一步包含第二连接肽，其中目标蛋白和第二连接肽的N-末端连接，并且第一重组病毒外被蛋白和第二连接肽的C-末端连接。第二连接肽可以是允许由融合蛋白形成的VLP的表面上展示目标蛋白的任何长度。例如，第二连接肽可以具有至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸，或约1-50、5-30或10-20个氨基酸。第二连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。

第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的、在例如残基6、7、11、17、18、27和/或37处具有一个或多个胰蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的、在例如残基22处具有胰凝乳蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％90％、95％或99％相同的、在例如残基24和25之间、残基25和26之间和/或残基37和38之间具有一个或多个植物内消化位点的突变的氨基酸序列。

第一重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的、具有残基17-38处的缺失、插入或取代的氨基酸序列。例如，残基17-38可以用第三连接肽取代。第三连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。第一重组病毒外被蛋白可以由SEQID NO:3组成。第一重组病毒外被蛋白可以进一步包含在例如残基6、7和/或11处的一个或多个胰蛋白酶位点的突变。

第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％90％、95％或99％相同的、在例如残基6、7、11、17、18、27和/或37处具有一个或多个胰蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的、在例如残基22处具有胰凝乳蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％90％、95％或99％相同的、在例如残基24和25之间、残基25和26之间和/或残基37和38之间具有一个或多个植物内消化位点的突变的氨基酸序列。

第二重组病毒外被蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的、具有残基17-38处的缺失、插入或取代的氨基酸序列。第二重组病毒外被蛋白可以由SEQ ID NO:4组成。SEQ ID NO:1的残基17-38可以用第四连接肽取代。第四连接肽可以是任何长度，例如，具有至少约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。第四连接肽可以由SEQ ID NO:2组成。第二重组病毒外被蛋白可以进一步包含在例如残基6、7和/或11处的一个或多个胰蛋白酶位点的突变。

在一个实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:5。在另一个实施方案中，融合蛋白由SEQ ID NO:5组成。

对于各融合蛋白，提供了生产融合蛋白的方法。所述方法包括向细胞中导入核酸分子，其中所述核酸分子编码所述融合蛋白，以及在所述细胞中表达所述融合蛋白。由此，生产所述融合蛋白。核酸分子可以瞬时地或稳定地导入细胞。所述方法可以进一步包括从细胞中纯化融合蛋白。所述细胞可以是所述融合蛋白可以在其中表达的任何细胞。所述细胞可以在植物或其一部分中。所述细胞可以是酵母细胞。所述细胞可以是昆虫细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞。

对于各融合蛋白，提供了包含所述融合蛋白的组合物。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。

提供了由本发明的融合蛋白形成的病毒样颗粒(VLP)。当融合蛋白包含目标蛋白时，目标蛋白展示在VLP的表面上。VLP可以在细胞、生物体或生物体的一部分中形成。所述细胞可以选自由植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞组成的组。所述细胞可以在植物或其一部分中。所述植物可以是烟草属物种。所述烟草属物种可以选自由本生烟草(Nicotiana benthamiana)和普通烟草(Nicotiana tabacum)组成的组。所述细胞可以是酵母细胞。所述细胞可以是昆虫细胞。所述细胞可以是哺乳动物细胞。

提供了包含本发明的病毒样颗粒(VLP)的组合物。至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的VLP的直径可以小于VLP的平均直径约50％、40％、30％、20％、10％或5％。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。

提供了生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所述方法包括向细胞、生物体或生物体的一部分中导入核酸分子，其中所述核酸分子编码本发明的融合蛋白，在所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中表达所述融合蛋白，以及由所述融合蛋白形成病毒样颗粒。从而，生产所述VLP。所述核酸分子可以瞬时地或稳定地导入所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分。当融合蛋白包含目标蛋白时，目标蛋白展示在所述VLP的表面上。至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的VLP的直径可以小于VLP的平均直径约50％、40％、30％、20％、10％或5％。VLP可以由至少约50％、60％、70％、80％、90％或95％的融合蛋白形成。

当VLP在细胞、生物体或生物体的一部分中形成时，所述方法可以进一步包括从细胞、生物体或生物体的一部分中纯化VLP。

当VLP不在细胞、生物体或生物体的一部分的内部形成时，所述方法可以进一步包括在形成VLP之前从细胞、生物体或生物体的一部分中纯化融合蛋白。

提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的包含免疫原性试剂作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP。所述受试者可以是需要诱导所述免疫应答的患者。

提供了一种治疗受试者中的疾病或病症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的包含治疗试剂作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP。所述受试者可以是患有所述疾病和病症的患者。

提供了一种检测来自受试者的样品中的生物标志物的方法。所述方法包括使所述样品与有效量的包含诊断试剂作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP接触。所述诊断试剂结合所述生物标志物。所述生物标志物可以是所述受试者怀疑罹患的疾病或病症的指示物。

提供了一种通过试剂催化反应的方法。所述方法包括使所述试剂与有效量的包含酶作为目标蛋白的根据本发明的融合蛋白或由所述融合蛋白形成的VLP接触。所述酶催化所述反应。所述反应可以在体外或在体内催化。

本文使用的术语“约”当涉及可测量值如量和百分比等时，意指包括离指定值±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、还更优选±0.1％的变动，而这种变动是适当的。

实施例1.植物产生的恶性疟原虫(P.falciparum)有性阶段蛋白的抗体展现传播阻断活性

传播阻断疫苗(TBV)被认为是在世界范围内控制和最终消灭疟疾的总体策略中的关键成分。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)表达的有性阶段蛋白Pfs230和Pfs25是经过了临床试验开发的主要的传播阻断抗原。在使用这些的任一种进行免疫接种时产生的抗体引起蚊子中孢子发育的中断，并传播到下一个宿主。使用基于植物的瞬时表达系统，我们在本生烟草中产生了与各种载体蛋白融合的Pfs25和Pfs230，纯化并表征了蛋白，在动物模型中评估了疫苗候选物的传播降低活性(transmission reducing activity，TRA)/传播阻断活性(transmission blocking activity，TBA)的生成。Pfs25和Pfs230疫苗候选物以高水平表达，并诱导TBA在免疫后持续长达6个月。这些数据证明了新的疟疾疫苗候选物的潜力，支持了在基于植物的系统中表达疟原虫抗原的可行性。

在过去五年中，疟疾事件有所减少，估计流行地区减少了50-75％(2015年WHO世界疟疾报告)。蚊帐、基于青蒿素的疗法和残留喷雾的联合使用减少了疟疾相关的死亡人数，降低至2015年的估计400,000人死亡。这些工具和疟疾疫苗RTS,S/AS01被认为是实现新设定目标的关键干预措施，所述目标为到2030年将疟疾死亡率降低90％。专注于打破寄生虫传播周期的其他治疗性疫苗，例如传播阻断疫苗，也被认为是重要的关键领域。

这些可选择的疫苗降低或阻断疟疾寄生虫从蚊子到人的传播，并将在减少高流行地区的传播负担方面发挥重要作用。前导的传播阻断抗原是Pfs25和Pfs230。当寄生虫处在人类宿主中时Pfs25不由寄生虫表达，因而免疫应答完全由主动免疫驱动。可选地，当寄生虫处在人类宿主中时Pfs230在血液阶段感染期间由寄生虫表达，因而它的免疫原性被天然地强化，并在感染周期期间维持。临床前的动物研究已经显示，用Pfs230候选物免疫产生TBA，未免疫的恢复期疟疾患者具有天然获得的抗Pfs230抗体。

Pfs230构建体设计

Pfs230一级序列示意图(图2)。半胱氨酸基序(CM)结构域基本上如Williamson等人(1995)Mol Biochem Parasitol,75(1):33-42所描述的。氨基末端部分(444-730)表达为带有羧基末端6×His标签和KDEL序列(Pfs230-AM)。突变一个推定的N-连接的糖基化位点(N→Q)。Pfs230-AM序列也表达为与氨基末端苜蓿花叶病毒外被蛋白(CP)的融合物。这种构建体是不稳定的，导致Pfs230抗原降解。产生了新的设计，其中Pfs230-AM分子融合到串联的CP-CP融合物的氨基末端，其中CP用柔性的接头间隔。这种构建体Pfs230-CP²自我组装成病毒样颗粒(VLP)，并在VLP表面上展示Pfs230抗原，具有最小的Pfs230降解。

Pfs230-CP² VLP的纯化和表征

Pfs230-CP² DNA序列克隆到植物表达载体中，并渗透到植物中。在孵育四天之后，收获植物，均质化，通过IMAC层析纯化Pfs230-CP² VLP，之后是颗粒形成步骤，此时Pfs230-CP²蛋白自组装成VLP(图4A和B)。非共价连接的肽在SDS-PAGE上显示出两个主要的蛋白条带，在Western印迹中被抗His和两种抗Pfs230单克隆抗体(mAb)2G5和2B10识别(图3)。负染色透射电子显微镜显示了预期的VLP形状的颗粒(图4B)，其在预期的～2M道尔顿大小下从SEC中洗脱(图4A)。

Pfs230动物研究设计

Pfs230疫苗候选物Pfs230-CP² VLP在初步的兔免疫原性研究中进行试验。在第0天和第28天，五只兔子用10μg的Pfs230免疫(表1)。

表1.兔免疫原性研究设计。

免疫的血清的传播阻断活性

在免疫后56天采集血清，在离体标准膜饲喂分析(SMFA)中进行试验以检查免疫的兔血清的传播阻断活性。纯化的免疫球蛋白(IgG)与含有饲喂给蚊子的血粉的配子母细胞组合(终浓度3.75mg/mL)。抗Pfs25mAb 4B7用作阳性对照。Pfs230-CP²疫苗候选物在免疫的兔的血清中产生了高水平的传播阻断活性(表2)。

表2.用Pfs230-CP²疫苗候选物免疫的兔的SMFA结果。

实施例2.CP-CP形式的其他应用实施例

疟疾Pfs25抗原

疟疾Pfs25抗原表达为CP²融合物(CMB-01053)，产生单一多肽，其自组装成VLP颗粒(图5)。相比之下，当表达单个CP融合物时，蛋白具有高水平的切割，产生比预期更低的Pfs25装饰。

流感抗原-H1亚型

血细胞凝集素的胞外域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图6A)。构建体代码：CMB-02039。流感CP²构建体显示了比单一的CP融合物更好的表达和回收。

流感抗原-H3亚型

血细胞凝集素的胞外域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图6B)。构建体代码：CMB-02079。流感CP²构建体显示了比单一的CP融合物更好的表达和回收。

流感抗原-H5亚型

血细胞凝集素的胞外域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图6C)。构建体代码：CMB-02011。流感CP²构建体显示了比单一的CP融合物更好的表达和回收。

流感抗原-H7亚型

血细胞凝集素的胞外域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图6D)。构建体代码：CMB-02059。流感CP²构建体显示了比单一的CP融合物更好的表达和回收。

流感抗原-H1亚型

血细胞凝集素的亚结构域(HA3)表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图6E)。构建体代码：CMB-02047。流感CP²构建体显示了比单一的CP融合物更好的表达和回收。

西方马脑炎病毒(EEV)抗原

EEV E2糖蛋白的Western株系的亚结构域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图7)。构建体代码：CMB-02412。这些构建体作为单一的CP融合物是不良表达或不可表达的。

东方马脑炎病毒(EEV)抗原

EEV E2糖蛋白的Eastern株系的亚结构域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图8)。构建体代码：CMB-02383。这些构建体作为单一的CP融合物是不良表达或不可表达的。

东方马脑炎病毒(EEV)抗原

EEV E2糖蛋白的Eastern株系的胞外域表达为CP²融合物，产生稳定的重组蛋白(图9)。构建体代码：CMB-02380。这些构建体作为单一的CP融合物是不良表达或不可表达的。

实施例3.第一代VLP

为了提高疟疾传播阻断Pfs25疫苗抗原的免疫原性，通过与苜蓿花叶病毒(AIMV)外被蛋白(CP)的氨基末端融合，将抗原展示在VLP上(图10A)。该第一代Pfs25-VLP称为A85，显示形成稳定的VLP，是高度免疫原性的，在动物模型中有效预防疟疾的传播。该分子通过1期临床试验进行了试验，其中没有显示有害的反应性。然而，该VLP的有效性受到CP分子内的植物内切割事件的影响，导致来自VLP的Pfs25抗原的相当大的损失(图10B-C)。

实施例4.第二代VLP

为了解决这种抗原损失，进行了工作来鉴定CP分子内的切割位点。进行了氨基末端测序，CP切割的位点鉴定为处在CP分子的位置24和36。第三个可能的AIMV CP切割位点在公开的文献中鉴定为处在位置26。

产生了三个不同版本的CP分子以防止CP降解和提高VLP上展示的抗原(图11)。

·B29三个鉴定的切割位点点突变为丙氨酸。

·B30含有降解位点的22-氨基酸区域移除，产生较短的d22CP分子。

·B64含有降解位点的22-氨基酸区域被替换为包含氨基酸GGGGSGGGGSGGGGSGG的柔性接头(FL1)。

构建体B30和B64具有高得多的蛋白回收，纯化为单一的蛋白质而没有降解。然而，这些分子不形成VLP。纯化的B29蛋白具有一定的蛋白降解，但是可以成功地形成VLP。与原始的A85分子相比，B29分子具有各VLP上展示的更多的Pfs25抗原，产生了改进的免疫原性和疟疾传播阻断能力。

根据这项工作，确定的是

1.可以通过CP分子的蛋白设计改进VLP上的抗原展示。

2.鉴定的22-氨基酸区域含有所有的植物内CP分子切割位点。

3.如果蛋白仅是抗原-CP融合蛋白，例如B30或B64，它可能不形成VLP。

然而，如果存在其他的无抗原CP，例如通过抗原-CP融合蛋白的内部切割，则VLP形成是可能的。

实施例5.第三代VLP

开发了八种不同的第三代VLP构建体以进一步改进VLP上展示的抗原(图12)。

·CMB-01045B64分子进行修饰以用包含氨基酸GGGGSAAALGAAGGGGSAAGTSAAGGGGSAAALGAA的更长的柔性接头(FL2)替换FL1。

·CMB-01047CP分子的前27个氨基酸移除并用FL2接头替换。

·CMB-01049B64分子进行修饰以用包含氨基酸EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK的α螺旋接头(AH)替换FL1。

·CMB-01075通过在FL1之后添加Kex2P自切割位点修饰B64分子。Kex2P位点含有氨基酸IGKRGIGKRGIGKRG

·CMB-01053通过向实施例2中描述的分子(图5)的C-末端添加第二FL1和d22CP来修饰B64分子。

·CMB-01063通过向分子的C-末端添加第二FL1和d22CP来修饰CMB-01045分子。

·CMB-01067通过向分子的N-末端添加第二d22CP和FL1来修饰B64分子。

·CMB-01071通过向分子的N-末端添加第二d22CP和FL2来修饰B64分子。

构建体CMB-01047、CMB-01075、CMB-01067和CMB-01071生产极低水平的蛋白，从而阻碍了融合物比总蛋白比例的分析或颗粒形成。构建体CMB-01045和CMB-01049产生了蛋白质，但是VLP的量有限。两种CP² VLP分子CMB-01053和CMB-01063都产生了蛋白质，它们形成VLP，CMB-01053分子具有最高的表达。CMB-01053蛋白纯化为单一蛋白而没有降解(图13A)。与原始的A85 VLP相比，这种新开发的分子允许更高水平的蛋白质生产，并形成具有大大改善的抗原展示的VLP(图13B-C)。

在小鼠动物研究中比较三种Pfs25分子。在低Pfs25抗原剂量的范围内，CMB-01053VLP与B30分子和B29 VLP进行比较(图14A)。所述蛋白与铝胶佐剂一起肌内注射地施用。在研究的第56天(图14B)，在0.003μg剂量水平下，B30组的抗Pfs25 IgG滴度显著低于来自B29或CMB-01053 VLP的IgG滴度(p<0.05)。在研究的第168天(图14C)，0.003μg剂量的B30组具有比B29组显著更低的抗Pfs25 IgG滴度(p<0.05)，而在0.03μg Pfs25剂量水平下，CMB-01053组具有比B29 VLP组显著更高的抗Pfs25 IgG滴度(p<0.01)。这与CMB-01053VLP一致的是不仅展示每分子更多的Pfs25抗原，还更有效地展示抗原。使用Kruskal-Wallis分析和随后的Dunn多重对比检验进行统计，*＝p<0.05，**＝p<0.01。

为了确定分子是否具有传播阻断活性，在免疫后第56天和第168天采集血清，在离体标准膜饲喂分析(SMFA)中进行分析。所有三种Pfs25分子，包括CMB-01053 VLP，都展现了疟疾传播阻断活性(图14D)，仅0.003μg剂量的B30组在SMFA水平上显示了统计学上显著的差异，在第56天p<0.0001，在第168天p<0.05。使用单向ANOVA和随后的Tukey多重比较检验进行统计。

基于对CMB-01053开发的CP²设计试验了其他的抗原。在CP² VLP上成功地展示的抗原包括疟疾抗原Pfs230、黄热病抗原、几种流感抗原和东方马脑炎病毒抗原(图15)。

实施例6.AIMV的N-末端中的降解位点

使用程序SIB生物信息学资源入口(SIB Bioinformatics Resources Portal)ExPASy的“PeptideCutter”程序进行胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶敏感位点的基因芯片消化分析。利用N-末端测序从纯化的AIMV颗粒中鉴定AIMV的植物内切割位点。

使用程序PeptideCutter鉴定了AIMV蛋白的N-末端中的潜在降解位点，显示了许多可能的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶敏感位点。

纯化AIMV颗粒，进行N-末端测序，鉴定AIMV蛋白植物内切割的位点(图16B)。来自N-末端测序和基因芯片消化的信息用于鉴定要用柔性接头替换的AIMV分子内的氨基酸。这种修饰的AIMV序列具有大大降低的蛋白酶敏感位点数量(图16C)。

实施例7.昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞中的融合蛋白表达

由SEQ ID NO:5组成的融合蛋白使用下文描述的方法在昆虫细胞(图17和18)、酵母细胞(图19)和哺乳动物细胞(图20)中进行表达。所有表达的融合蛋白形成或预计形成病毒样颗粒。

杆状病毒表达系统。

编码CP-CP融合蛋白的基因进行优化以在昆虫细胞中表达，由GeneArt(ThermoFisher Scientific)合成。基因亚克隆到BamHI/HindIII消化的杆状病毒转移载体pFastBac1(ThermoFisher Scientific)中，验证亚克隆的序列。随后根据制造商的方案使用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统使病毒进行增殖。简要地说，产生的带有CP²基因的载体转化到含有杆状病毒基因组(杆粒DNA，bacmid DNA)的大肠杆菌DH10Bac细胞中。pFastBac1和杆粒之间发生转座产生具有CP²基因的重组杆粒。选择阳性克隆，分离重组杆粒，转染到草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf21)细胞中用于重组杆状病毒的增殖。

对于CP²蛋白的大规模表达，Sf21细胞在Sf–900^TMII SFM细胞培养基中以5×10⁶个细胞/mL在2.5的最佳感染复数(MOI)下用病毒感染，160rpm下混合在27℃下孵育。感染后48小时，通过以500×g离心10分钟收集昆虫细胞，之后将细胞溶解于pH 6.5的100mM焦磷酸盐缓冲液中，超声处理并通过在20,000×g离心20分钟澄清以除去细胞碎片。将上清液在Ti70转子中以60,000RPM离心2小时。将沉淀溶解于pH6.5的100mM焦磷酸盐缓冲液中并提交给TEM。

酵母表达系统。

编码CP²融合蛋白的基因进行优化以在酵母细胞中表达，由GeneArt(ThermoFisher Scientific)合成。基因亚克隆到BamHI/EcoRI消化的酵母载体pPIC3.5(ThermoFisher Scientific)中，验证亚克隆的序列。用SaiI将重组质粒线性化，然后通过电穿孔转化到巴斯德毕赤氏酵母GS115中。将转化体接种在不含组氨酸的MD(最小葡萄糖)平板上，并在30℃孵育2-3天。使用基因特异性引物通过PCR分析菌落。增殖阳性菌落，用甲醇诱导融合蛋白表达。哺乳动物表达系统。

编码CP²融合蛋白的基因进行优化以在哺乳动物细胞中表达，由GeneArt(ThermoFisher Scientific)合成。基因亚克隆到HindIII/XhoI消化的酵母载体pcDNA3.1(ThermoFisher Scientific)中，验证序列。质粒DNA用于使用LIPOFECTAMINE^TM2000转染Vero细胞。孵育两天后，通过在1000g离心5分钟沉淀细胞。

Western印迹分析和TEM。

为了表征融合蛋白在哺乳动物、昆虫或酵母细胞中的表达，通过在1×Laemmli样品缓冲液中煮沸10分钟来破坏细胞，此时蛋白质样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上，用小鼠抗四-His mAb(Qiagen)或兔抗-AIMV CP多克隆抗体(Fraunhofer)探测。HRP缀合的兔抗小鼠或山羊抗兔抗体分别用作二抗。

通过负染色透射电子显微镜评估颗粒形成。使用Zeiss LIBRA 120透射电子显微镜捕获负染色颗粒的图像。

实施例8.体外颗粒形成。

使用IMAC层析纯化抗原-CP²融合蛋白，并使用离心旋转浓缩器将洗脱的蛋白质浓缩至～10mg/mL。使用SRT-1000柱(Sepax)以1mL/min进行分析性空间排阻层析。通过将浓缩蛋白质透析到pH 6.0的80mM焦磷酸钠缓冲液中进行体外颗粒形成。

为了显示可以在体外形成基于AIMV的VLP，在植物中表达抗原-CP²融合蛋白并通过IMAC层析进行纯化。浓缩洗脱的蛋白质，通过透析到pH 6.0的80mM焦磷酸钠缓冲液中进行体外颗粒形成。通过分析性空间排阻层析分析颗粒形成前后的蛋白质样品中VLP的存在，其中VLP在～9mL处解析(图21)。在颗粒形成前的条件下未观察到VLP相关峰，但在颗粒形成后的条件下观察到明显的VLP相关峰，证实了VLP的体外形成。

实施例9.多蛋白质生产系统中产生的CP-CP的颗粒形成

没有附着的抗原的CP²融合蛋白在植物(本生烟草)、酵母(巴斯德毕赤酵母)和昆虫细胞(草地夜蛾)中表达，并使用IMAC层析进行纯化。使用离心旋转浓缩器浓缩洗脱的蛋白质，并通过透析到pH 6.0的80mM焦磷酸钠缓冲液中形成颗粒。通过负染色透射电子显微镜分析证实了颗粒形成。

从植物、酵母和昆虫蛋白质表达系统中成功地表达和纯化了CP²融合蛋白。为了确认不同的表达系统中产生的蛋白可以成功地形成颗粒，将IMAC洗脱物进行浓缩，通过到pH6.0的80mM焦磷酸钠缓冲液中的缓冲液交换形成颗粒。负染色透射电子显微镜分析确认了颗粒的存在(图22A-C)。

实施例10.CP²分子上的酶展示

除了展示抗原之外，CP²分子还可以展示其他类型的蛋白质，例如酶。辣根过氧化酶C1(HRP)(EC编号1.11.1.7)利用过氧化氢来氧化有机和无机化合物。将HRP蛋白融合到CP²分子的N-末端，产生HRP-CP²融合蛋白CMB-03057，并在植物中表达。针对C-末端的His标签利用IMAC层析分离该蛋白。

利用考马斯染色的SDS-PAGE检测了300mM咪唑IMAC级分中HRP-CP²融合蛋白的存在(图23A)，并通过针对C-末端His标签的Western印迹确认(图23B)。使用化学发光测定法分析样品的HRP活性，其中将蛋白质级分和缓冲液与HRP底物一起孵育，并使用GeneGnomeHR相机(Syngene)检测光发射(图23C)。仅含有HRP-CP²融合蛋白的300mM咪唑IMAC级分显示出HRP活性，证实产生了HRP-CP²融合蛋白并且酶被正确折叠为功能性酶。通过负染色透射电子显微镜分析HRP-CP²样品，其证实存在颗粒(图23D)。

本文引用的所有文献、书籍、手册、论文、专利、公开的专利申请、指南、摘要和/或其他参考文献通过引用以它们的整体合并在本文中。考虑到本文公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。意图是，说明书和实施例被认为仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求指明。

序列表

<110> 弗劳恩霍费尔美国股份有限公司(FRAUNHOFER USA, Inc.)

<120> 用于目标分子展示的共价融合的病毒外被蛋白

<130> FCMB-111WO

<150> US 62/420,993

<151> 2016-11-11

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 221

<212> PRT

<213> 苜蓿花叶病毒

<400> 1

Met Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Pro Thr

1 5 10 15

Lys Arg Ser Gln Asn Tyr Ala Ala Leu Arg Lys Ala Gln Leu Pro Lys

20 25 30

Pro Pro Ala Leu Lys Val Pro Val Val Lys Pro Thr Asn Thr Ile Leu

35 40 45

Pro Gln Thr Gly Cys Val Trp Gln Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu

50 55 60

Ser Ser Phe Asn Gly Leu Gly Val Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Asp Phe Ala Gly Pro Arg Ile Leu Glu Glu Asp Leu Ile Tyr Arg Met

85 90 95

Val Phe Ser Ile Thr Pro Ser Tyr Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp

100 105 110

Asp Val Thr Thr Glu Asp Gly Arg Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met

115 120 125

Gln Glu Phe Pro His Gly Ala Phe His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe

130 135 140

Glu Leu Val Phe Thr Ala Pro Thr His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn

145 150 155 160

Phe Lys His Ser Tyr Ala Val Ala Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln

165 170 175

Pro Glu Gly Ser Lys Asn Pro Ser Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val

180 185 190

Glu Arg Lys Ala Phe Pro Arg Ala Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Thr

195 200 205

Val Gly Leu Phe Asp Glu Ala Asp Asp Leu Asp Arg His

210 215 220

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Pro Thr Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Val

20 25 30

Val Lys Pro Thr Asn Thr Ile Leu Pro Gln Thr Gly Cys Val Trp Gln

35 40 45

Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ser Phe Asn Gly Leu Gly Val

50 55 60

Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys Asp Phe Ala Gly Pro Arg Ile Leu

65 70 75 80

Glu Glu Asp Leu Ile Tyr Arg Met Val Phe Ser Ile Thr Pro Ser Tyr

85 90 95

Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp Asp Val Thr Thr Glu Asp Gly Arg

100 105 110

Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met Gln Glu Phe Pro His Gly Ala Phe

115 120 125

His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe Glu Leu Val Phe Thr Ala Pro Thr

130 135 140

His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn Phe Lys His Ser Tyr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln Pro Glu Gly Ser Lys Asn Pro Ser

165 170 175

Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val Glu Arg Lys Ala Phe Pro Arg Ala

180 185 190

Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Thr Val Gly Leu Phe Asp Glu Ala Asp

195 200 205

Asp Leu Asp Arg His

210

<210> 4

<211> 198

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Pro Thr Pro

1 5 10 15

Val Val Lys Pro Thr Asn Thr Ile Leu Pro Gln Thr Gly Cys Val Trp

20 25 30

Gln Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ser Phe Asn Gly Leu Gly

35 40 45

Val Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys Asp Phe Ala Gly Pro Arg Ile

50 55 60

Leu Glu Glu Asp Leu Ile Tyr Arg Met Val Phe Ser Ile Thr Pro Ser

65 70 75 80

Tyr Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp Asp Val Thr Thr Glu Asp Gly

85 90 95

Arg Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met Gln Glu Phe Pro His Gly Ala

100 105 110

Phe His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe Glu Leu Val Phe Thr Ala Pro

115 120 125

Thr His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn Phe Lys His Ser Tyr Ala Val

130 135 140

Ala Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln Pro Glu Gly Ser Lys Asn Pro

145 150 155 160

Ser Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val Glu Arg Lys Ala Phe Pro Arg

165 170 175

Ala Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Thr Val Gly Leu Phe Asp Glu Ala

180 185 190

Asp Asp Leu Asp Arg His

195

<210> 5

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Pro Thr Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Val

20 25 30

Val Lys Pro Thr Asn Thr Ile Leu Pro Gln Thr Gly Cys Val Trp Gln

35 40 45

Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ser Phe Asn Gly Leu Gly Val

50 55 60

Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys Asp Phe Ala Gly Pro Arg Ile Leu

65 70 75 80

Glu Glu Asp Leu Ile Tyr Arg Met Val Phe Ser Ile Thr Pro Ser Tyr

85 90 95

Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp Asp Val Thr Thr Glu Asp Gly Arg

100 105 110

Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met Gln Glu Phe Pro His Gly Ala Phe

115 120 125

His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe Glu Leu Val Phe Thr Ala Pro Thr

130 135 140

His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn Phe Lys His Ser Tyr Ala Val Ala

145 150 155 160

Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln Pro Glu Gly Ser Lys Asn Pro Ser

165 170 175

Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val Glu Arg Lys Ala Phe Pro Arg Ala

180 185 190

Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Thr Val Gly Leu Phe Asp Glu Ala Asp

195 200 205

Asp Leu Asp Arg His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

210 215 220

Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly

225 230 235 240

Lys Pro Thr Pro Val Val Lys Pro Thr Asn Thr Ile Leu Pro Gln Thr

245 250 255

Gly Cys Val Trp Gln Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu Ser Ser Phe

260 265 270

Asn Gly Leu Gly Val Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys Asp Phe Ala

275 280 285

Gly Pro Arg Ile Leu Glu Glu Asp Leu Ile Tyr Arg Met Val Phe Ser

290 295 300

Ile Thr Pro Ser Tyr Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp Asp Val Thr

305 310 315 320

Thr Glu Asp Gly Arg Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met Gln Glu Phe

325 330 335

Pro His Gly Ala Phe His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe Glu Leu Val

340 345 350

Phe Thr Ala Pro Thr His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn Phe Lys His

355 360 365

Ser Tyr Ala Val Ala Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln Pro Glu Gly

370 375 380

Ser Lys Asn Pro Ser Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val Glu Arg Lys

385 390 395 400

Ala Phe Pro Arg Ala Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Thr Val Gly Leu

405 410 415

Phe Asp Glu Ala Asp Asp Leu Asp Arg His His His His His His

420 425 430

Claims

1.一种融合蛋白，其包含第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽，其中所述第一重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的N-末端连接，其中所述第二重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的C-末端连接，其中所述第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列，和其中所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。

2.一种融合蛋白，其包含目标蛋白、第一重组病毒外被蛋白、第二重组病毒外被蛋白和第一连接肽，其中所述目标蛋白处在所述第一重组病毒外被蛋白的N-末端，其中所述第一重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的N-末端连接，其中所述第二重组病毒外被蛋白与所述第一连接肽的C-末端连接，其中所述第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列，和其中所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述第一连接肽由SEQ ID NO:2组成。

4.根据权利要求2或3所述的融合蛋白，其进一步包含第二连接肽，其中所述目标蛋白与所述第二连接肽的N-末端连接，和其中所述第一重组病毒外被蛋白与所述第二连接肽的C-末端连接。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中所述第二连接肽由SEQ ID NO:2组成。

6.根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，其中所述第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个胰蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。

7.根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，其中所述第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有胰凝乳蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。

8.根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，其中所述第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个植物内消化位点的突变的氨基酸序列。

9.根据权利要求1-5任一项所述的融合蛋白，其中所述第一重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有残基17-38处的缺失、插入或取代的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中SEQ ID NO:1的残基17-38被由SEQ ID NO:2组成的第三连接肽取代。

11.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述第一重组病毒外被蛋白由SEQ ID NO:3组成。

12.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述第一重组病毒外被蛋白进一步包含一个或多个胰蛋白酶位点的突变。

13.根据权利要求1-12任一项所述的融合蛋白，其中所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个胰蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。

14.根据权利要求1-12任一项所述的融合蛋白，其中所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有胰凝乳蛋白酶位点的突变的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-12任一项所述的融合蛋白，其中所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有一个或多个植物内消化位点的突变的氨基酸序列。

16.根据权利要求1-12任一项所述的融合蛋白，其中所述第二重组病毒外被蛋白包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的、具有残基17-38处的缺失、插入或取代的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述第二重组病毒外被蛋白由SEQ ID NO:4组成。

18.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中SEQ ID NO:1的残基17-38被第四连接肽取代。

19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述第四连接肽由SEQ ID NO:2组成。

20.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中所述第二重组病毒外被蛋白进一步包含一个或多个胰蛋白酶位点的突变。

21.根据权利要求1-20任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:5。

22.根据权利要求2-21任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是选自由免疫原性试剂、治疗试剂、诊断试剂和酶组成的组的试剂。

23.根据权利要求2-21任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是免疫原性试剂。

24.根据权利要求2-21任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是治疗试剂。

25.根据权利要求2-21任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是诊断试剂。

26.根据权利要求2-21任一项所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白是酶。

27.一种生产根据权利要求1-26任一项所述的融合蛋白的方法，其包括:

(a)向细胞中导入核酸分子，其中所述核酸分子编码所述融合蛋白，和

(b)在所述细胞中表达所述融合蛋白，从而产生所述融合蛋白。

28.一种生产根据权利要求2-26任一项所述的融合蛋白的方法，其包括:

29.根据权利要求27或28所述的方法，其进一步包括从所述细胞中纯化所述融合蛋白。

30.根据权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述细胞在植物或其一部分中。

31.根据权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述细胞是酵母细胞。

32.根据权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞。

33.根据权利要求27-29任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

34.一种组合物，其包含根据权利要求1-26任一项所述的融合蛋白。

35.一种病毒样颗粒，其由根据权利要求1-26任一项所述的融合蛋白形成。

36.一种病毒样颗粒，其由根据权利要求2-26任一项所述的融合蛋白形成，其中所述目标蛋白展示在所述病毒样颗粒的表面上。

37.根据权利要求35或36所述的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒在细胞、生物体或生物体的一部分中形成。

38.根据权利要求37所述的病毒样颗粒，其中所述细胞选自由植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞组成的组。

39.根据权利要求37所述的病毒样颗粒，其中所述细胞在植物或其一部分中。

40.根据权利要求39所述的病毒样颗粒，其中所述植物是烟草属物种。

41.根据权利要求37所述的病毒样颗粒，其中所述细胞是酵母细胞。

42.根据权利要求37所述的病毒样颗粒，其中所述细胞是昆虫细胞。

43.根据权利要求37所述的病毒样颗粒，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

44.一种组合物，其包含根据权利要求35-43任一项所述的病毒样颗粒。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中至少50％的所述病毒样颗粒的直径小于所述病毒样颗粒的平均直径的50％。

46.根据权利要求34、44和45任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。

47.一种生产病毒样颗粒的方法，其包括:

(a)向细胞、生物体或所述生物体的一部分中导入核酸分子，其中所述核酸分子编码根据权利要求1-26任一项所述的融合蛋白，

(b)在所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中表达所述融合蛋白，和

(c)由所述融合蛋白形成病毒样颗粒，由此生产所述病毒样颗粒。

48.一种生产病毒样颗粒的方法，其包括：

(a)向细胞、生物体或所述生物体的一部分中导入核酸分子，其中所述核酸分子编码根据权利要求2-26任一项所述的融合蛋白，

(c)由所述融合蛋白形成病毒样颗粒，由此生产所述病毒样颗粒，其中所述目标蛋白展示在所述病毒样颗粒的表面上。

49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述病毒样颗粒在所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中形成。

50.根据权利要求49所述的方法，其进一步包括从所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中纯化所述病毒样颗粒。

51.根据权利要求47或48所述的方法，其进一步包括在由所述融合蛋白形成病毒样颗粒之前从所述细胞、所述生物体或所述生物体的一部分中纯化所述融合蛋白。

52.根据权利要求47-51任一项所述的方法，其中至少50％的所述病毒样颗粒的直径小于所述病毒样颗粒的平均直径的50％。

53.根据权利要求47-52任一项所述的方法，其中所述病毒样颗粒由至少50％的所述融合蛋白形成。

54.一种诱导受试者中的免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求23所述的融合蛋白或由根据权利要求23所述的融合蛋白形成的病毒样颗粒。

55.一种治疗受试者中的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求24所述的融合蛋白或由根据权利要求24所述的融合蛋白形成的病毒样颗粒。

56.一种检测来自受试者的样品中的生物标志物的方法，其包括使所述样品与有效量的根据权利要求25所述的融合蛋白或由根据权利要求25所述的融合蛋白形成的病毒样颗粒接触，其中诊断试剂结合所述生物标志物。

57.一种通过试剂催化反应的方法，其包括使所述试剂与有效量的根据权利要求26所述的融合蛋白或由根据权利要求26所述的融合蛋白形成的病毒样颗粒接触，其中酶催化所述反应。