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KR102696265B1 - 식물 발현 시스템을 이용한 알팔파 모자이크 바이러스 유사 입자 제조 방법 및 이의 활용 - Google Patents

식물 발현 시스템을 이용한 알팔파 모자이크 바이러스 유사 입자 제조 방법 및 이의 활용 Download PDF

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KR102696265B1
KR102696265B1 KR1020210025902A KR20210025902A KR102696265B1 KR 102696265 B1 KR102696265 B1 KR 102696265B1 KR 1020210025902 A KR1020210025902 A KR 1020210025902A KR 20210025902 A KR20210025902 A KR 20210025902A KR 102696265 B1 KR102696265 B1 KR 102696265B1
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민경민
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Abstract

본 발명은 엽록체로 표적화되는 식물체 발현용 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 식물체에서 분리된 AMV(Alfalfa mosaic virus)를 VLP(virus-like particles) 형태로 제작 및 생산하는 기술과 관련된 것으로, 엽록체 표적화 단백질과 AMV 캡시드 단백질이 융합된 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터가 제공된다. 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 형질전환 식물체, 상기 형질전환 식물체로부터 목적 단백질을 분리정제 방법, 이를 이용하여 바이러스-유사 입자를 제조하는 방법 등이 제공된다.

Description

식물 발현 시스템을 이용한 알팔파 모자이크 바이러스 유사 입자 제조 방법 및 이의 활용{Method for manufacturing alfalfa mosaic virus-like particles using plant expression system and application thereof}
본 발명은 식물체를 이용하여 바이러스-유사 입자(virus-like particles; VLPs)를 생산하는 방법 및 그 응용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 식물체에서 고효율의 발현 벡터(expression vector)를 이용하여 재조합 AMV(Alfalfa mosaic virus) 캡시드(capsid) 단백질을 생산하는 방법 및 이를 VLP로 제조하는 방법에 관한 것이다.
바이러스 유사입자(Virus like particle, VLP)는 바이러스 구조 단백질들의 결합을 통하여 실제 바이러스와 유사한 형태로 조립되는 입자를 의미한다. VLP는 조립시 바이러스의 유전자를 포함하지 않고, 체내 주입시 증식이 불가능한 안전한 항원이라는 장점이 있다. 또한, 높은 면역원성을 나타내는 특징을 바탕으로 다양한 병원체에 VLP를 적용한 백신의 연구개발이 매우 활발하게 이루어지고 있다.
바이러스와 마찬가지로 VLP는 외피(envelope)의 유무에 따라 enveloped VLP와 non-enveloped VLP로 나눌 수 있다. Envelope VLP의 경우 숙주의 세포막을 envelope으로 사용하면서 그 외부 표면에 바이러스의 단백질을 항원으로 발현시킨 형태로, 숙주 세포막과의 융합 과정을 통해 세포 바깥으로 budding 되는 과정으로 생산된다. Envelope VLP는 non-envelope VLP에 비해 상대적으로 그 입자의 크기가 크다는 특징이 있으며, 다양한 병원체의 항원을 세포막에 발현시킬 경우, 여러 항원을 동시에 발현하는 VLP를 생산할 수 있는 특징이 있다. 대표적인 Envelope VLP로는 인플루엔자 바이러스, 레트로 바이러스, C형 간염 바이러스 VLP 등이 있다.
Non-envelope VLP의 경우, 숙주세포의 세포막을 필요로 하지 않으며 non-enveloped 바이러스의 capsid 단백질 중 하나 또는 여러 개의 단백질로 구성된다. Non-envelope VLP는 Envelope VLP와 마찬가지로 여러 항원을 동시 발현할 수 있는 특징이 있지만, 다른 병원체의 항원을 동시에 발현하는 유연성이 상대적으로 떨어진다고 할 수 있다. 대표적인 non-enveloped VLP로는 B형 간염 바이러스, 인유두종 바이러스, E형 간염 바이러스, 로타 바이러스 VLP 등이 있다.
현재 VLP 생산을 위한 발현 시스템으로는 세균, 효모, 곤충세포, 식물세포, 고등 동물(포유류, 조류 등)세포 등의 발현 시스템이 사용되고 있다. 세균 발현 시스템은 재조합 단백질을 생산하기 위해 가장 널리 사용되고 있으나 포유류와 유사한 단백질 번역 후 변형(post-translational modification, PTM)을 할 수 없기 때문에 VLP 생산에 불리한 단점이 있지만, 생산단가가 저렴하기 때문에 capsid 단백질들의 조합만으로 생산 가능한 non-enveloped VLP 위주로 사용되고 있다. 효모 역시, VLP 생산에 널리 사용되고 있으나 non-enveloped VLP의 개발에 사용되고 있다. B형 간염 바이러스, 인유두종 바이러스 등의 VLP 개발이 효모를 사용하여 이루어져 왔다.
곤충세포의 경우, 일부 glycosylation pattern을 제외하고는 포유동물세포와 매우 유사한 PTM 과정이 이루어져 enveloped VLP와 non-enveloped VLP 생산에 모두 사용 가능하며, 일반적으로 고등세포 대비 단백질의 생산량이 많다는 장점이 있다. 인플루엔자 바이러스, 인유두종 바이러스 등 다양한 바이러스에 대한 VLP 개발에 사용되고 있다.
식물세포의 경우, 아직 연구가 시작된지 오래되지 않은 발현 시스템이지만 VLP 개발 측면에서 많은 가능성을 가지고 있다. VLP 단백질 생산에서 발생할 수 있는 바이러스, 암 유전자, 장독소와 같은 여러 가지 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 유용물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물 세포 시스템과 비교하면 절대적으로 유리하기 때문에 최단기간에 저비용으로 대량생산이 가능하다는 장점이 있다. 또한, 포유류 세포와 유사한 PTM을 가지고 있어 enveloped VLP 및 non-enveloped VLP에 대해 모두 생산 가능하다는 특징이 있다.
그러나 상기 제시한 장점에도 불구하고 식물세포에서 단백질을 생산하는 것은 동물 세포 및 미생물을 포함하는 다른 숙주들에 비해 상대적으로 최적화되지 않은 분리정제 방법이 가장 큰 걸림돌이 되고 있다. 이에 많은 연구가 진행되고 있으며 다양한 방법으로 식물세포에서 단백질의 생산성을 높이기 위한 시도가 진행되고 있다. 예를 들면, 한국 등록특허공보 제10-1848082호에 따르면, 셀룰로스 결합 도메인 3을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환된 식물체에서 합성된 단백질들을 셀룰로스에 결합해 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 분리하는 것이 가능하며, 융합 단백질에 엔테로키나아제를 처리하여 목적 단백질과 셀룰로스 결합 도메인을 효율적으로 분리할 수 있다고 제시된 바 있다.
또한, 목적 단백질을 생산할 수 있게 하는 단백질 분리정제 기술의 또 다른 예로, 한국 공개특허공보 제10-2015-0113934호에 따르면, 생리활성 단백질 또는 펩타이드를 면역글로불린 Fc 단편과 결합시키면, 면역글로불린 Fc 단편이 결합되지 않은 생리활성 단백질 또는 펩타이드보다 생리활성 단백질 또는 펩타이드의 용해도를 개선하는 효과가 있음이 제시된 바 있다.
따라서 상기와 같은 종래기술들을 바탕으로 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산할 경우 기존에 사용되고 있는 방법인 동물 세포나 미생물을 이용한 생산 방법을 대체할 수 있는 효과가 있다. 첫째, 유용 생리활성 물질의 생산에 필요한 기간을 단축할 수 있으며 생산 단가 또한, 획기적으로 줄일 수 있다. 둘째, 동물 세포나 미생물에서 합성된 단백질을 분리정제하는 과정에서 생길 수 있는 세포독성과 같은 오염원을 원천 배제할 수 있으며, 셋째, 상품화되었을 경우 종자의 형태로 장기간 보관이 가능하여 저장 및 보관비용을 절감할 수 있다. 넷째, 안전한 종자의 형태로 운송할 수 있어 긴급을 요구하는 문제가 발생 시 필요한 지역 및 나라에 빠르게 공급할 수 있다. 다섯째, 생리 활성 물질에 대한 수요가 급증할 경우, 대량생산에 필요한 생산설비 및 시스템구축에 많은 기술이 요구되지 않아 쉽게 대량화할 수 있으며, 동물 세포 시스템을 이용한 생산 시스템과 비교 시 설치 비용과 제품생산 비용을 획기적으로 낮출 수 있는 장점이 있어 최단 시간에 대량생산이 가능하게 해 수요에 따른 충분한 공급이 가능하다.
전술한 바와 같이, 의학적으로 적용 가능한 VLP 단백질과 산업적으로 유용한 가치가 있는 효소를 포함하는 유용 생리활성 물질들을 식물체로부터 효과적으로 합성 및 분리정제하는 다양한 기술들이 제공되고 있음에도 불구하고 단백질마다 가지고 있는 고유한 특성이 서로 달라 특정 방법을 일괄적으로 적용하는 것은 바람직하지 않으므로 개별적인 연구가 필요한 실정이다.
KR 10-1848082 B1 KR 10-2015-0113934 A
본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 형질전환 식물체에서 목적 단백질인 바이러스-유사 입자를 형성하는 재조합 AMV(Alfalfa Mosaic Virus)를 생산함에 있어서, 번역 단계에서 단백질의 발현 수준을 높이기 위해 엽록체로 표적화되도록 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 목적 단백질에 융합하고 분리정제를 위해 폴리히스티딘을 부착한 경우 단백질의 발현 수준과 분리정제 효율이 높아지는 것을 확인하고, 이를 이용하여 형질전환 식물체에서 목적 단백질 생산 효율을 획기적으로 높일 수 있음을 확인하였다.
또한, 상기와 같이 분리정제된 AMV를 포함하는 용액의 조성, pH 및 NaCl 농도를 적절하게 조절해주면 바이러스-유사 입자가 형성됨을 다양한 실험적인 방법으로 확인하였다. 이러한 바이러스-유사 입자의 고분해능 3차 구조 규명을 통해 백신 및 치료제 개발에 활용 가능한 VLP 플랫폼(platform) 기술을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 AMV(Alfalfa mosaic virus) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 캡시드 단백질의 분리정제 방법을 제공하는 것이다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및
(Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 분리정제 방법에 의해 용출된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자(virus-like particle; VLP) 제조방법을 제공하는 것이다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계;
(Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계; 및
(Step 7) 상기 (Step 6)에서 용출된 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 약물 전달체를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 AMV(Alfalfa mosaic virus) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공한다.
상기 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하고, 상기 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3 또는 10으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 재조합 벡터는, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(polyhistidine-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 폴리히스티딘-태그는 상기 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 C-term 말단 또는 N-term 말단에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 재조합 벡터는 프로모터와 종결자(terminator) 사이에, (1) 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있거나; 또는 (2) 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있는 것일 수 있으나, 연결 순서에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 캡시드 단백질의 분리정제 방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및
(Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계.
본 발명의 일 구체예로, 상기 단백질 추출 완충용액은 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: (1) 10 내지 100mM 트리스(Tris), 100 내지 1500mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.01 내지 1% 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether), 및 5 내지 300mM 이미다졸(Imidazole)을 포함함; 또는 (2) pH는 7 내지 9임.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 아가로스는 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 (Step 1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 박테리아는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 양배추, 및 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 분리정제 방법에 의해 용출된, 재조합 AMV 캡시드 단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 재조합 AMV 캡시드 단백질은 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: (1) 삼량체(trimer) 구조로 존재함; 또는 (2) 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에서 삼량체의 분자량이 약 100kDa으로 나타남.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자(virus-like particle; VLP) 제조방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계;
(Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계; 및
(Step 7) 상기 (Step 6)에서 용출된 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계.
본 발명의 일 구체예로, 상기 (Step 7) 단계는 재조합 AMV 캡시드 단백질이 포함된 단백질 추출 완충용액을 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액으로 교체함으로써 바이러스-유사 입자를 제조하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액은 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: (1) 20 내지 100mM 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate) 및 100 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl)을 포함함; 또는 (2) pH는 6.9 내지 7.5임.
본 발명의 또다른 구체예로, 상기 제조방법은 자가조립된 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 정제하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자 제조방법에 의해 제조된, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예로, 상기 재조합 AMV 바이러스-유사 입자는 하기 특징 중 하나 이상을 만족할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다: (1) 크기-배제 크로마토그래피에서 분자량이 약 2,000kDa 이상으로 나타남; (2) 음성염색법으로 염색 후 투과전자현미경으로 관찰했을 때 지름이 10nm 이상 40nm 이하임; 또는 (3) 초저온투과전자현미경으로 관찰하고 3D구조 (3-dimensional structure)를 재구성(reconstruction)했을때, 3개의 복합체(trimeric complex)가 규칙적인 배열을 통해 총 20개가 조립된 구형의 VLP(3x20)임.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 재조합 AMV 캡시드 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계; 및
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 바이러스-유사 입자를 극초저온 전자현미경을 이용하여 3D 구조를 규명하는 단계; 및
(Step 5) 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 단계.
본 발명의 일 구체예로, 상기 백신 조성물의 제조방법은 애주번트(adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구체예로, 상기 백신 조성물의 제조방법은 하기 특징 중 하나를 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: (1) 상기 (Step 1) 단계의 재조합 벡터는 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하며, 상기 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 N-term 말단에 연결됨; 또는 (2) 상기 (Step 5)는 바이러스-유사 입자의 표면에 항원 단백질을 결합(conjugation)시키는 단계를 포함함.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물의 제조방법에 의해 제조된, 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 재조합 AMV 캡시드 단백질 용액을 제1 완충용액으로 교체하여 재조합 AMV 캡시드 단백질 삼량체를 제조하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3)의 용액에 약물을 첨가하는 단계; 및
(Step 5) 상기 (Step 4)의 제1 완충용액을 제2 완충용액으로 교체하여 바이러스-유사 입자를 제조하는 단계.
본 발명의 일 구체예로, 상기 (Step 5)의 제1 완충용액 및 제2 완충용액은 하기 특징을 만족할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: (1) 제1 완충용액은 10 내지 100mM Tris, 및 100 내지 500mM 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5임; 및 (2) 제2 완충용액은 20 내지 100mM 피로인산나트륨 및 100 내지 1000mM 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5임.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약물 전달체의 제조방법에 의해 제조된, 약물 전달체를 제공한다.
본 발명은 엽록체로 표적화되는 식물발현 벡터를 이용하여 식물에서 재조합 AMV를 고효율로 생산하는 방법 및 이를 이용한 재조합 AMV VLP 제조방법에 관한 것으로, 고분해능으로 규명된 재조합 AMV VLP의 3차 구조를 활용하여 백신 및 치료제 개발을 위한 플랫폼(Platform)으로 활용 가능하다. 또한, 식물발현 시스템을 이용하여 생산 비용을 파격적으로 줄일 수 있고, 종래 널리 알려진 방법(동물 세포나 미생물에서 단백질을 생산한 후 분리정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원 (바이러스, 암 유전자, 장독소 등)을 원천 차단할 수 있다. 게다가, 동물 세포가 필수적으로 포함하는 번역 후 변형 과정이 일어나는 진핵생물 단백질의 합성 경로를 포함하고 있어 생리활성을 유지하고 있는 단백질 생산이 가능하며, 상품화 단계에서도 동물 세포나 박테리아와는 달리 종자(seed stock)로서 관리가 가능하다는 점에서 유리하다. 나아가 해당 물질의 수요가 급증할 경우 대량생산에 필요한 설비 기술이나 비용 면에서 기존의 동물 세포 또는 박테리아를 이용한 생산 시스템과 비교하였을 때, 더 효율적이고 경제적이기 때문에 수요의 발생에 발맞추어 단기간에 대량생산 및 공급이 가능하다는 장점도 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현을 위한 여섯 가지 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현 카세트(expression cassette)를 나타낸 도면이다. 도 1의 N-term(상단)은 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 N-terminal 말단에 6xHis(폴리히스티딘-태그)를 부착된 형태로 세포질(cytosol), 소포체(endoplasmic reticulum), 또는 엽록체(chloroplast)에서 AMV 캡시드 단백질이 발현될 수 있도록 디자인된 식물발현 벡터의 카세트이다. 도 1의 C-term(하단)은 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 C-terminal 말단에 6xHis를 부착된 형태로 세포질, 소포체, 또는 엽록체에서 AMV 캡시드 단백질이 발현될 수 있도록 디자인된 식물발현 벡터의 카세트이다. (H, 폴리히스티딘-태그; HSP-T, Hsp 종결자(terminator); NR, 루비스코 트랜짓 펩타이드; NB, New BiP signal peptide; HDEL, ER retention signal peptide).
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 식물체에서 각기 다른 여섯 가지 식물발현 벡터에 의한 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현을 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 AMV 캡시드 단백질의 친화성 크로마토그래피를 이용한 분리정제 결과를 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯팅으로 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명에서 분리정제된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 삼량체(trimeric)형태에서 VLP 형태로 제작하는 조건을 확인하는 결과를 나타내는 도면이다. 도 4a는 실시예 4의 제1 완충용액으로 평형화된 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸다. 도 4b는 실시예 4의 제2 완충용액으로 평형화된 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리정제된 재조합 AMV VLP를 다양한 pH 조건을 처리하여 투과전자현미경으로 촬영한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명에서 분리정제된 재조합 AMV VLP를 극초저온 전자현미경(Cryo-electron microscopy)을 이용하여 촬영한 이미지를 나타낸 도면이다. 도 6a는 AMV VLP의 2D(two-dimensional) class average를 나타낸다. 도 6b는 2D class average를 바탕으로 구성한, AMV VLP의 20면체 3D 구조를 나타낸다. 도 6c는 AMV VLP의 3차 구조를 바탕으로 분해능을 측정한 결과를 나타낸다. 도 6d는 AMV VLP의 이미지 프로세싱과 모델빌딩의 진행절차를 나타낸 흐름도이다.
도 7은 본 발명에서 극초저온 전자현미경(Cryo-electron microscopy) 및 구조분석 소프트웨어를 이용하여 재조합 AMV VLP의 전체적인 구조, 단량체(monomer)의 구조 및 아미노산들의 위치를 분석한 도면이다. 도 7a는 Cryo-EM map의 Local resolution을, 도 7b는 atomic model의 B-factor를 나타낸다. 도 7c는 재조합 AMV 캡시드 단량체의 구조를 나타낸다. 도 7d는 재조합 AMV 캡시드 단량체 내의 아미노산의 서열(상단) 및 고분해능으로 분석된 대표적인 아미노산 잔기의 electron density map(하단)을 나타낸다.
본 발명자들은 형질전환 식물체에서 목적 단백질인 바이러스-유사 입자를 형성하는 재조합 AMV 캡시드 단백질을 생산함에 있어서, 번역 단계에서 단백질의 발현 수준을 높이기 위해 엽록체로 표적화되도록 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 목적 단백질에 융합하고 분리정제를 위해 폴리히스티딘-태그를 부착한 경우 단백질의 발현 수준과 분리정제 효율이 높아지는 것을 확인하고, 이를 이용하여 형질전환 식물체에서 목적 단백질 생산 효율을 획기적으로 높일 수 있음을 확인했으며 또한, 완충용액의 조성조절을 통해 AMV 캡시드 단백질이 VLP를 잘 형성할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명의 일 실시예에서는, N-term 말단과 C-term 말단에 폴리히스티딘-태그가 각각 융합된 AMV 캡시드 단백질이 세포질에서 발현될 수 있도록 pCAMBIA1300 식물발현 벡터(1)를 제작하였으며, 동일한 형태의 단백질을 엽록체에서 발현될 수 있도록 (1)에 Rbc-TP(루비스코 트랜짓 펩타이드)를 융합하거나, 소포체에서 발현할 수 있도록 (1)에 NB(New BiP) 신호 펩타이드 융합하였다. 또한, 각각의 세포 소기관에서 AMV 캡시드 단백질 코딩 폴리뉴클레오타이드의 N-term 또는 C-term 말단에서 AMV 캡시드 단백질이 발현되도록 디자인하여 총 6종의 식물발현 벡터를 제작하였다. (실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 식물발현 벡터를 아그로박테리아에 형질전환시킨 후, 이를 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하여 재조합 AMV 캡시드 단백질을 식물체에서 발현시켰다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기 재조합 AMV 캡시드 단백질이 발현되는 니코티아나 벤타미아나 잎으로부터 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스 레진이 충전된 컬럼을 이용하여 재조합 단백질을 분리 정제하고, 이를 바이러스-유사 입자를 만들기 위한 완충용액의 조성을 조절하여 AMV 캡시드 단백질의 자가조립을 유도하였다. 구체적으로, 제1 완충용액 중에서는 AMV 캡시드 단백질이 삼량체를 형성하고, 제2 완충용액 중에서는 AMV 캡시드 단백질이 바이러스-유사 입자를 조립하는 것을 확인하였다(실시예 3 내지 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 상기에서 얻은 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물을 투과전자 현미경을 이용하여 pH 변화에 따른 VLP의 안정성을 확인하였고, pH 5와 pH 7 사이에서 VLP 형태를 안정적으로 유지하고 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 극초저온 전자현미경을 이용하여 상기 AMV VLP의 고분해능 3차 구조를 확인하였다(실시예 6 및 7 참조).
이에 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(6xHis-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)”는, 루비스코(Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase) 스몰 서브유닛(small subunit)의 N-말단 트랜짓 펩타이드(N-terminal transit peptide)를 지칭하는 것으로서, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드는 형질전환 식물체에서 발현된 재조합 단백질을 엽록체 내로 이동시키기 위해 사용되는 것으로, 발현될 때 서열 일부가 잘려나가 일부 아미노산만이 남을 수도 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 루비스코 트랜짓 펩타이드가 융합된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 식물체에서 발현시키는 경우, 상기 루비스코 트랜짓 펩타이드의 앞쪽 54개 아미노산이 잘려서 없어지고, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열만 남을 수 있다. 또한, 이러한 경우 DNA frame을 맞추기 위하여 루비스코 트랜짓 펩타이드 서열과 AMV 캡시드 단백질 서열 사이에 추가적인 아미노산이 삽입될 수 있으며, 바람직하게는 글리신(Glycine), 또는 아이소루신(Isoleucine)이 추가로 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “NB(New BiP)”는 발현된 재조합 단백질을 소포체로 이동시키기 위해 사용된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 유전자이고, 가장 바람직하게는 서열번호 9로 표시되는 유전자이나, 서열번호 9의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 NB 유전자는 발현될 때 서열 전부가 잘려나가 BiP에 대한 어떤 아미노산도 남지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 “트랜짓 펩타이드(transit peptide)” 또는 “신호 펩타이드(signal peptide)”는, 특정 세포소기관, 세포 구획, 세포외로의 단백질의 수송 또는 국지화를 유도할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 이 용어는 트랜짓 펩타이드 및 트랜짓 펩타이드를 암호화하는 염기서열 모두를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “AMV”는, 알팔파 모자익크바이러스(Alfala mosic virus)를 지칭하는 것으로, 20면체의 외피 비보유(non-enveloped) DNA 바이러스이다. AMV는 식물에 모자이크 모양의 병변을 일으키는 바이러스이지만, 사람이나 동물에게는 어떠한 감염 및 병변을 일으키지 않는 것으로 알려져 있다. 본 발명에 있어서 "AMV"는 서열번호 3 또는 10의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 더욱 바람직하게는 서열번호 3 또는 10으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되며, 가장 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 3 또는 10의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “폴리뉴클레오타이드”는 디옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함한, 일반적으로 인산이에스테르 결합에 의해 서로 결합된 2 이상의 연결된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체를 포함하는 올리고머 또는 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 예를 들면 뉴클레오타이드 유사체, 또는 인산이에스테르 결합 이외의 “골격” 결합, 예를 들면 인산삼에스테르 결합, 포스포르아미데이트 결합, 포스포로티오에이트 결합, 티오에스테르 결합 또는 펩타이드 결합(펩타이드 핵산)을 포함하는 DNA 및 RNA 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)뿐만 아니라 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체들을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “벡터(vector)”란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 유전체(genome) 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주에 형질전환되면, 벡터는 숙주의 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 용어 “플라스미드(plasmid)” 및 “벡터(vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
본 발명의 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 또한 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3 또는 10으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에는 서열번호 1의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3 또는 10의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3 또는 10의 염기서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(Polyhistidine-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. 상기 폴리히스티딘-태그는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.
상기 폴리히스티딘-태그는 본 발명의 목적 단백질인 AMV 이외에 추가로 용이한 분리를 위해 포함되는 것으로서, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있다.
또한, 상기 폴리히스티딘-태그는 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 N-term 말단 또는 C-term 말단에 연결된 것일 수 있고, 바람직하게는 C-term 말단에 연결된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터는 프로모터와 종결자(terminator) 사이에, (1) 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있거나; 또는 (2) 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있는 것일 수 있으나, 연결 순서에 제한되는 것은 아니다. 상기 (1)의 경우, 재조합 벡터에 삽입되는 전체 insert 서열은 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 가장 바람직하게는 서열번호 11로 표시되는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되나, 서열번호 11의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 프로모터에는 일례로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 CaMV35S 프로모터일 수 있다. 상기 종결자는 일례로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 종결자, 파세올린 종결자, 아그로박테리움 투메파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 종결자, 대장균의 rrnB1/B2 종결자 등이 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 HSP 종결자일 수 있다. 그러나 상기와 같은 프로모터 또는 종결자의 예는 예시일 뿐 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “형질전환(transformation)”은 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환 식물체(transgenic plant)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 식물체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 식물체이며, 상기 식물체는 본 발명의 목적을 달성하기 위한 것이라면 제한이 없다.
또한, 본 발명에 따른 형질전환 식물체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기충격법(electroporation), 또는 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 캡시드 단백질의 분리정제 방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및
(Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계.
본 발명은 또한, 상기 분리정제 방법에 의해 용출된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM 트리스(Tris), 100 내지 1500mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.01 내지 1% 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether), 및 5 내지 300mM 이미다졸(Imidazole)을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 단백질 추출 완충용액은 10 내지 50mM Tris, 500 내지 1200mM MgCl2, 0.01 내지 0.7% 트리톤(Triton) X-100, 및 5 내지 100mM 이미다졸을 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 단백질 추출 완충 용액은 20mM Tris, 1M MgCl2, 0.5% 트리톤(Triton) X-100, 및 10mM 이미다졸을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 트리스(Tris)는 HCl로 pH가 8.0으로 적정된 것일 수 있다(Tris-HCl).
또한, 본 발명에 따른 단백질 추출 완충용액은 pH가 7 내지 9일 수 있고, 바람직하게는 pH가 7.5 내지 8.5일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 단백질 추출 완충용액은 pH가 8일 수 있다.
본 발명에 따른 아가로스는 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 (Step 1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것일 수 있으며, 상기 박테리아는 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 양배추, 및 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “식물체”는, 본 발명의 재조합 단백질을 대량 생산할 수 있는 식물이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 보다 구체적으로는 상기 열거한 식물체 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 담배일 수 있다. 본 발명에서의 담배는 담배 속(Nicotiana genus) 식물로서 단백질을 과발현할 수 있는 것이라면 특별히 종류의 제한을 받지 않으며, 형질전환 방법과 단백질 대량 생산의 목적에 맞게 적절한 품종을 선택하여 본 발명을 실시할 수 있다. 예를 들어 니코티아나 벤타미아나 L.(Nicotiana benthamiana L.) 또는 니코티아나 타바쿰 cv. 잔티(Nicotiana tabacum cv. Xanthi) 등의 품종을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "캡시드(capsid)"는 바이러스의 껍질(coat)을 구성하는 단백질을 지칭한다. 자연적으로, 캡시드는 자가조립(self-assembly) 하여 바이러스 껍질을 형성하며, 바이러스의 유전체는 상기 껍질 내에 패키징(packaging) 된다. 바이러스-유사 입자의 경우 바이러스 유전체 없이 캡시드만으로 구성된다. 본 발명에 따른 재조합 AMV 캡시드 단백질은 개별적(단량체)으로 존재하거나, 다량체(예를 들어, 삼량체) 상태로 존재할 수 있으며, 바이러스-유사 입자로 자가조립된 상태로 존재할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 AMV 캡시드 단백질의 삼량체는 크기-배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)에서 분자량이 약 100kDa으로 나타날 수 있다. 본 명세서 전반에 있어서, 용어 "약"은 ±10%를 의미한다. 따라서 분자량 약 100kDa은 900kDa 내지 1,100kDa을 의미한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자(virus-like particle; VLP) 제조방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
(Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계;
(Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계; 및
(Step 7) 상기 (Step 6)에서 용출된 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 제공한다.
상기 재조합 AMV 바이러스-유사 입자는 크기-배제 크로마토그래피에서 분자량이 약 2,000kDa 이상으로 나타나는 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 AMV 바이러스-유사 입자는 음성염색법으로 염색 후 투과전자현미경으로 관찰했을 때 지름이 10nm 이상 40nm 이하, 바람직하게는 20nm 이상 30nm 이하의 구형 또는 고리형인 것일 수 있다.
또한, 상기 재조합 AMV 바이러스-유사 입자는 초저온투과전자현미경으로 관찰하고 3D 구조(3-dimensional structure)를 재구성(reconstruction)했을 때, 3개의 복합체(trimeric complex)가 규칙적인 배열을 통해 총 20개가 조립된 구형의 VLP(3×20)인 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 (Step 7) 단계는 재조합 AMV 캡시드 단백질이 포함된 단백질 추출 완충용액을 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액으로 교체함으로써 바이러스-유사 입자를 제조하는 것일 수 있다. 즉, 재조합 AMV 캡시드 단백질은 상기 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액 중에서 바이러스-유사 입자로 자가조립된다.
구체적으로, 상기 바이러스-유사 입자 제조방법은, 재조합 AMV 캡시드 단백질이 자가조립에 의해 바이러스-유사 입자를 형성할 수 있도록 필터를 사용하여 단백질 추출 완충용액을 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액으로 교체하는 단계 및 농축하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액은 20 내지 100mM 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate) 및 100 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 완충용액은 30 내지 70mM 피로인산나트륨 및 300 내지 700mM NaCl을 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 완충용액은 50 mM 피로인산나트륨 및 500mM NaCl을 포함하는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 용어 "바이러스-유사 입자 조립용 완충용액"은 "제2 완충용액"과 상호교환적으로 사용된다.
또한, 상기 완충용액의 pH는 pH 6.9 내지 7.5, 바람직하게는 pH 6.9 내지 7.2, 가장 바람직하게는 pH 7일 수 있다.
또한, 상기 바이러스-유사 입자 제조방법은 자가조립된 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 정제하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 하기의 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 재조합 AMV 캡시드 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계; 및
(Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 바이러스-유사 입자를 극초저온 전자현미경을 이용하여 3D 구조를 규명하는 단계; 및
(Step 5) 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 단계.
본 발명에 있어서 "백신(vaccine)"은, 생체에 면역 반응을 일으키는 항원을 함유하는 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 사람이나 동물에 주사하거나 경구 투여함으로써 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 상기 동물은 인간 또는 비인간 동물로서, 상기 비인간 동물은 돼지, 소, 말, 개, 염소, 양 등을 지칭하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 "백신 조성물" 또는 "약물 전달체"는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물 또는 약물 전달체의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물, 약학적 조성물, 또는 약물 전달체의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용 없이 개체에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 백신 조성물의 제조방법은 애주번트(adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 "애주번트(Adjuvant)"는 백신 또는 약학적으로 활성 있는 성분들에 첨가되어 면역 반응을 증가시키거나 영향을 주는 물질 또는 조성물을 말한다. 대표적으로 면역원(immunogen)용 캐리어(carrier) 또는 보조 물질 및/또는 다른 약학적으로 활성 있는 물질 또는 조성물을 통상적으로 의미한다. 전형적으로, 용어 "애주번트"는 넓은 개념에서 해석되어야 하며, 상기 애주번트에 통합되거나 상기 애주번트와 함께 투여된 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증진시킬 수 있는 넓은 범위의 물질 또는 책략(stratagerm)을 의미한다. 또한, 애주번트는, 이에 제한되지 않고, 면역 강화제(immune potentiator), 항원 전달계 또는 이들의 조합으로 나뉘어질 수 있다.
또한, 상기 백신 조성물의 제조방법은 하기 특징 중 하나를 만족할 수 있다: (1) 상기 (Step 1) 단계의 재조합 벡터는 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하며, 상기 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 N-term 말단에 연결됨; 또는 (2) 상기 (Step 5)는 바이러스-유사 입자의 표면에 항원 단백질을 결합(conjugation)시키는 단계를 포함함.
본 발명에 있어서 "항원 단백질"은 본 발명에 따른 백신 조성물을 체내에 주입하였을 때 항체의 생성을 유도하기 위한 단백질을 의미한다. 상기 항원 단백질은 병원성 단백질 또는 재조합 단백질일 수 있으나, 항체 생성을 유도할 수 있는 단백질이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 항원 단백질은 본 발명에 따른 백신 조성물의 표면에 전시(display)된다. 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 N-term 말단에 연결되는 경우, 항원 단백질은 본 발명에 따른 재조합 벡터로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질과 함께 발현되어 캡시드 단백질의 바이러스-유사 입자 조립시 그 표면에 전시되도록 함께 조립된다. 또는, 본 발명에 따라 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 제조한 후 그 표면에 항원 단백질을 결합시킴으로써 백신 조성물에 항원 단백질이 전시되도록 할 수 있다. 바이러스-유사 입자의 표면에 외래 단백질을 결합시키는 방법은 당업계에 알려진 것이라면 제한 없이 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 백신 조성물 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물을 제공한다.
상기 백신 조성물에는 애주번트가 더 포함될 수 있다. 또한, 상기 애주번트는 알럼(alum)일 수 있으나, 애주번트로 사용하기에 적합한 어떤 종류의 알루미늄 솔트(aluminium salt)라도 본 발명에 사용될 수 있다. 알루미늄 솔트는 알루미늄 하이드록사이드(Al(OH)3), 알루미늄 포스페이트(AlPO4), 알루미늄 하이드로클로라이드, 알루미늄 설페이트, 암모늄 알럼, 포타슘 알럼 또는 알루미늄 실리케이트 등이 포함된다. 바람직하게는, 알루미늄 솔트 애주번트로서 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 약물 전달체의 제조방법을 제공한다:
(Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
(Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
(Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 재조합 AMV 캡시드 단백질 용액을 제1 완충용액으로 교체하여 재조합 AMV 캡시드 단백질 삼량체를 제조하는 단계;
(Step 4) 상기 (Step 3)의 용액에 약물을 첨가하는 단계; 및
(Step 5) 상기 (Step 4)의 제1 완충용액을 제2 완충용액으로 교체하여 바이러스-유사 입자를 제조하는 단계.
본 발명에 따른 약물 전달체는 본 발명에 따른 재조합 AMV 바이러스-유사 입자에 약물을 포함시켜 바이러스-유사 입자를 매개로 약물을 목표 지점에 전달한다.
상기 약물에는 항암제 등 모든 종류의 약제가 제한 없이 포함될 수 있으며, 두 가지 이상의 약물이 동시에 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자에 담지될 수도 있다.
본 발명에 다른 약물 전달체의 제조방법에 있어서, 상기 (Step 5)의 제1 완충용액 및 제2 완충용액은 하기 특징을 만족할 수 있다:(1) 제1 완충용액은 10 내지 100mM Tris, 및 100 내지 500mM 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5임; 및 (2) 제2 완충용액은 20 내지 100mM 피로인산나트륨 및 100 내지 1000mM 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5임.
구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시켜 재조합 AMV 캡시드 단백질을 단백질 추출 완충용액으로 분리정제한 후 버퍼를 제1 완충용액으로 교체하면 재조합 AMV 캡시드 단백질 단량체들이 삼량체를 형성하게 된다. 상기 제1 완충용액은 10 내지 100mM Tris, 및 100 내지 500mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 완충용액은 10 내지 50mM Tris, 및 200 내지 400mM NaCl을 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 완충용액은 25mM Tris, 및 300mM NaCl을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 트리스(Tris)는 HCl로 적정된 것일 수 있다(Tris-HCl).
이어서, 재조합 AMV 캡시드 단백질 삼량체에 약물을 첨가한 후 제1 완충용액을 제2 완충용액으로 교체하면 약물이 담지된 재조합 AMV 바이러스-유사 입자가 제조된다. 상기 약물은 바이러스-유사 입자 내부에 포함되어 있거나, 또는 바이러스-유사 입자 표면에 결합되어 있을 수 있으나, 위치에 한정되지 않는다. 상기 제2 완충용액은 20 내지 100mM 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate) 및 100 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 완충용액은 30 내지 70mM 피로인산나트륨 및 300 내지 700mM NaCl을 포함하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 완충용액은 50 mM 피로인산나트륨 및 500mM NaCl을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 상기 제1 완충용액 및 제2 완충용액의 pH는 pH 6.9 내지 7.5, 바람직하게는 pH 6.9 내지 7.2, 가장 바람직하게는 pH 7일 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 재조합 AMV 캡시드 단백질 발현용 식물발현 벡터 제작
도 1의 개열지도에 나타낸 바와 같이, 식물체에서 재조합 AMV 캡시드 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 식물체 발현용 벡터를 제작하였다.
보다 구체적으로, AMV 캡시드 단백질에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서의 발현에 최적화된 서열로 유전자(서열번호 4)를 합성하였다. 폴리히스티딘-태그(6xHis-tag)의 위치 및 표적 세포 소기관에 따른 AMV 캡시드 단백질의 발현 패턴을 확인하기 위해 하기와 같이 6가지의 발현용 벡터를 제작하였다.
세포질로 표적화되는 재조합 AMV 캡시드 단백질 식물발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터 유전자와 Hsp 종결자(terminator) 사이에 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)를 중간에 두고 앞(N-term) 또는 뒤(C-term)에 각각 6개의 연속된 히스티딘 (Histidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 5)를 순차적으로 연결하여 제작하였다.
엽록체로 표적화되는 재조합 AMV 캡시드 단백질 식물발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터 유전자와 Hsp 종결자(terminator) 사이에 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 1), AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 3)를 순차적으로 연결하여 제작하였다. 이때, N-term 폴리히스티딘-태그와 C-term 폴리히스티딘-태그를 구분하기 위해 AMV의 앞 또는 뒤에 각각 6개의 연속된 히스티딘 (Histidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 5)를 삽입하였다.
소포체로 표적화되는 재조합 AMV 캡시드 단백질 식물발현 벡터는 pCAMBIA1300 벡터의 CaMV35S 프로모터 유전자와 Hsp 종결자(terminator) 사이에 NB(New BiP) 신호 펩타이드(signal peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 9), AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 3) 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 7)를 순서대로 연결하여 제작하였다. 이때, N-term 폴리히스티딘-태그와 C-term 폴리히스티딘-태그를 구분하기 위해 AMV의 앞 또는 뒤에 각각 6개의 연속된 히스티딘(Histidine)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(서열번호 5)를 삽입하였다.
실시예 2: 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현 확인
2.1. 식물발현 벡터 일과성 발현(transient expression)
상기 실시예 1에서 준비한 식물발현 벡터를 아그로박테리아 LBA4404 균주에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 형질전환된 아그로박테리아를 5mL의 YEP 액체배지(효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g, 카나마이신 50mg/L, 리팜피신 25mg/L)에서 28℃의 조건으로 16시간 동안 진탕배양한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양 하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아는 원심분리(7,000rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 600nm의 파장에서 흡광도(O.D) 값이 1.0이 되도록 인필트레이션(Infiltration) 버퍼[10mM MES (pH 5.7), 10mM MgCl₂, 200μM 아세토시링곤]에 현탁 시켰다. 아그로박테리아 현탁액은 주사바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
2.2. 형질전환 식물체에서 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현 확인
상기 실시예 2.1에서 준비한 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 수용성 분획(Supernatant; S)에 있는 단백질과 펠릿(Pellet; P) 분획에 있는 단백질, 수용성 분획과 펠릿을 모두 포함하는 분획(Total; T)을 각각 분리하여 웨스턴 블롯팅으로 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현을 확인하였다. 보다 자세하게는, 각 분획 30μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동 하여 크기별로 분리된 단백질 밴드를 확인하고, 이를 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 폴리히스티딘과 반응하는 항체를 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 재조합 AMV 캡시드 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 엽록체로 표적화되도록 루비스코 트랜짓 펩타이드를 융합한 재조합 AMV 캡시드 단백질이 높은 효율로 발현되었음을 확인하였고, 발현된 재조합 AMV 캡시드 단백질의 90-95% 이상이 수용성 분획에서 확인되었으며, 약 5-10%의 AMV 캡시드 단백질이 펠릿 분획에서 관찰되었다. 이와 비교하여, 세포질 및 소포체로 표적화한 재조합 AMV 캡시드 단백질은 엽록체로 표적화한 constructs 보다 발현 효율이 낮았다. 이에 따라, 하기 실시예는 엽록체로 표적화되는 루비스코 트랜짓 펩타이드를 융합한 재조합 AMV 캡시드 단백질(N-term 말단 또는 C-term 말단에 His-tag가 부착된)을 이용하여 진행하였다.
실시예 3: 형질전환 식물에서 발현된 재조합 AMV 캡시드 단백질 분리정제
상기 실시예 2.1에서 준비된 N-term 말단 또는 C-term 말단에 폴리히스티딘-태그(His-tag)가 융합된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 발현하는 각각의 니코티아나 벤타미아 잎 50g에 단백질 추출 용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M MgCl2, 10mM imidazole, 0.5% Triton X-100] 100mL을 첨가하고 블렌더로 조직을 파쇄한 후 13,000rpm으로 4℃에서 30분간 원심분리하여 단백질 추출액을 각각 회수하였다. 상기 두 조건(N-term 말단 또는 C-term 말단에 폴리히스티딘-태그가 융합)의 단백질 추출액으로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질의 분리정제를 위해 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스 레진(agarose resin)이 충진된 컬럼으로 친화성 크로마토그래피를 동시에 실시하였다. 상기 컬럼에 레진을 10mL 충진한 후 100mL의 세척용액[20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M MgCl2, 10mM Imidazole]으로 평형화시켰다. 회수한 각각의 단백질 추출액을 서로 다른 두 개의 컬럼에 적용하고 평형화시킨 다음, 세척 용액 100mL을 흘려보내 레진을 세척하고 용출용액(20mM Tris-HCl, pH 8.0, 1M MgCl2, 50mM 또는 100mM 또는 300mM Imidazole)으로 재조합 AMV 캡시드 단백질을 용출 하였다. 각각의 재조합 AMV 캡시드 단백질이 포함된 용출용액은 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색법(Coomassie staining)과 western blot 실험을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, C-term 말단에 His-tag를 융합한 재조합 AMV 캡시드 단백질이 N-term 말단에 His-tag를 융합한 재조합 AMV 캡시드 단백질에 비해 정제도 및 최종 회수율이 더 높은 것을 확인하였다. 이에 따라, 하기 실시예는 C-term 말단에 His-tag를 융합한 재조합 AMV 캡시드 단백질을 이용하여 진행하였다.
실시예 4: 재조합 AMV 캡시드 단백질의 VLP 형성 조건 확인
재조합 AMV 캡시드 단백질은 자기조립을 통해 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 형성한다. 따라서 재조합 AMV 바이러스-유사 입자 형성을 위한 조건 테스트 및 확인을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.
실시예 3에서 회수한 분리정제된 재조합 AMV 캡시드 단백질이 포함된 용출용액 5mg을 제1 완충용액(25mM Tris-HCl, pH 7.0, 300mM NaCl)으로 투석(Dialysis)을 진행한 후 제1 완충용액으로 평형화된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로딩하여 하나의 피크 분획을 획득하였다. 표준 size marker를 이용하여 분자량을 계산한 결과, 약 100 kDa인 삼량체(trimer) 구조를 확인했다(도 4a).
또한, 실시예 3에서 회수한 재조합 AMV 캡시드 단백질이 포함된 용출용액 5mg을 제2 완충용액(50mM Sodium pyrophosphate, pH 7.0, 500mM NaCl)으로 투석(Dialysis)을 진행한 후 제2 완충용액으로 평형화된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 로딩하여 AMV 캡시드 단백질의 크기의 변화가 있음을 확인했다(도 4b). 제1 완충용액과 비교하여 제2 완충용액의 조건에서는 기존 피크(P2)가 줄어든 반면 새로운 피크(P1)가 형성됨을 확인하였으며, P1과 P2 모두 재조합 AMV 캡시드 단백질임을 SDS-PAGE로 확인했다.
실시예 5: 재조합 AMV 바이러스-유사 입자 확인
크기 배제 크로마토그래피로 분리한 P1 분획에 포함된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 최종 농도가 100nM이 되도록 제2 완충용액(50mM Sodium pyrophosphate, pH 7.0, 500mM NaCl)에 희석하여 음성염색 (Negative-staining)을 수행하였다. 5μL의 단백질 용액을 카본이 코팅된 구리 그리드에서 1분간 반응시킨 후 거름종이를 이용하여 단백질 용액을 제거하고 3차 증류수로 3번 세척하였다. 이때 카본이 코팅된 구리 그리드는 플라즈마(Plasma)와 함께 1분간 반응하여 소수성(hydrophobic)의 특성을 친수성(hydrophilic) 특성으로 변환하여 단백질이 카본에 잘 부착되도록 한다. 최종적으로 1% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)로 1분간 반응시켜 음성염색(Negative-staining)한 후 거름종이로 염색용액을 제거하고 상온에서 12시간 건조하였다. 준비된 그리드는 투과전자현미경(Tecnai T10, Philips)을 사용하여 20,000배의 배율로 이미지를 획득하였다. 그 결과 도 5(pH 7.0)에 나타난 바와 같이, 재조합 AMV 캡시드 단백질로 구성된 바이러스-유사 입자를 관찰할 수 있었다.
또한, pH 조건 변화에 따른 VLP 안정성을 확인하기 위해 다양한 pH(3.0, 5,0, 9.0) 조건으로 완충용액의 pH를 변화시킨 테스트에서 pH 3.0 과 pH 9.0의 조건에서 VLP의 안정성이 감소되는 현상이 나타난 반면에, pH 5.0과 pH 7.0의 조건에서는 VLP의 안정성이 유지됨을 확인했고 그 결과는 도 5에 나타냈다.
실시예 6: 재조합 AMV 캡시드 단백질의 구조
6.1. 샘플 유리화(Vitrification) 및 데이터 수집
상기 실시예 5에서 확인된 재조합 AMV 캡시드 단백질의 VLP 구조를 분석하기 위해 극저온 전자현미경(Cryo-electron microscopy)을 사용했다. 3ul의 재조합 AMV 캡시드 단백질 VLP를 15mA 로 1분간 negatively glow-discharged된 holey carbon grid(Quantifoil R1.2/1.3 Cu 200 mesh, SPI)에 적용 후 4℃ with 100% 습도(humidity) 조건의 Vitrobot Mark IV 장치에서 6.5초간 blotting 하고 액체 질소(liquid nitrogen)로 온도를 낮춘 액체 에탄(liquid ethane)에 담궈 신속하게 고정했다. AMV VLP의 Cryo-EM 이미지는 300 kV Titan Krios(Thermo Fisher Scientific, USA) transmission electron microscopy에서 Falcon 3EC direct electron detector(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 확인하고 Automatic data acquisition software(EPU; Thermo Fisher Scientific, USA)로 수집했다(도 6a 참조).
6.2. AMV VLP 3차 구조 분석을 위한 이미지 프로세싱(image processing)과 모델 빌딩(model building)
상기 실시예 6.1에서 수집한 재조합 AMV 캡시드 단백질의 VLP 이미지를 분석하기 위해 cryoSPARC v2 소프트웨어를 사용했다. 빔 유도 모션 보정(Beam-induced motion correction) 과 선량 가중치(does weighting)는 소프트웨어에 포함된 motion correction을 사용하여 보정한 후 patch CTF(Contrast transfer function)를 이용하여 CTF 변수를 측정했다. 모션 드리프트(motion drift)가 발생한 이미지 또는 defocus가 너무 높거나 낮은 이미지는 이미지 프로세싱에 사용할 수 없으므로 육안으로 확인하여 제거했고, 1,803장의 이미지로부터 482,224개의 AMV VLP를 추출하여 2D class average 이미지를 제작했다. 이 이미지를 주형(template)으로 하여 상관관계가 낮은 이미지들을 추가로 제거 후 279,755개의 AMV VLP를 최종적으로 선정하고 이를 이용하여 새로운 2D class average를 제작했다(도 6a 하단). 신규 2D 이미지를 바탕으로 20면체(icosahedral) 3D 구조를 재구성했으며(도 6b 참조), AMV VLP 3차 구조를 바탕으로 분해능(resolution)을 측정한 결과는 도 6c에 나타냈으며, 2.41의 고분해능 구조를 획득했다. 이미지 프로세싱과 모델빌딩의 진행절차는 도 6d에 flow chart로 나타냈다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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aactatgctg ccttacggaa agctcagctt ccgaaaccac cggccttgaa ggtcccagtg 120 gtaaagccaa caaatacaat actgccacag actggttgcg tttggcaatc gttagggacg 180 cctttgagtc tttcatcttt taatggatta ggtgttagat tcctttatag ttttcttaag 240 gactttgcag gaccaagaat cctcgaagaa gatctgattt acaggatggt gttttccatt 300 acacccagct acgctggcac cttttgtctt actgatgacg tgaccactga agatggtagg 360 gcagttgctc atggaaatcc tatgcaagaa ttccctcacg gcgcatttca cgctaatgaa 420 aagtttgggt ttgagttggt ttttacagct cctacccatg ctggaatgca aaaccaaaat 480 ttcaagcatt cctatgccgt tgcgttgtgt ttggattttg acgcacagcc tgagggatct 540 aaaaatcctt catataggtt caacgaggtc tgggttgaga gaaaagcatt cccacgagca 600 ggacccctac gctctttgat tactgtagga ctactcgatg aagctgatga tcttgatcgt 660 cat 663 <210> 4 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Alfalfa mosaic virus capsid <400> 4 Met Ser Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly Gly Lys Ala Gly Lys Pro Thr 1 5 10 15 Lys Arg Ser Gln Asn Tyr Ala Ala Leu Arg Lys Ala Gln Leu Pro Lys 20 25 30 Pro Pro Ala Leu Lys Val Pro Val Val Lys Pro Thr Asn Thr Ile Leu 35 40 45 Pro Gln Thr Gly Cys Val Trp Gln Ser Leu Gly Thr Pro Leu Ser Leu 50 55 60 Ser Ser Phe Asn Gly Leu Gly Val Arg Phe Leu Tyr Ser Phe Leu Lys 65 70 75 80 Asp Phe Ala Gly Pro Arg Ile Leu Glu Glu Asp Leu Ile Tyr Arg Met 85 90 95 Val Phe Ser Ile Thr Pro Ser Tyr Ala Gly Thr Phe Cys Leu Thr Asp 100 105 110 Asp Val Thr Thr Glu Asp Gly Arg Ala Val Ala His Gly Asn Pro Met 115 120 125 Gln Glu Phe Pro His Gly Ala Phe His Ala Asn Glu Lys Phe Gly Phe 130 135 140 Glu Leu Val Phe Thr Ala Pro Thr His Ala Gly Met Gln Asn Gln Asn 145 150 155 160 Phe Lys His Ser Tyr Ala Val Ala Leu Cys Leu Asp Phe Asp Ala Gln 165 170 175 Pro Glu Gly Ser Lys Asn Pro Ser Tyr Arg Phe Asn Glu Val Trp Val 180 185 190 Glu Arg Lys Ala Phe Pro Arg Ala Gly Pro Leu Arg Ser Leu Ile Thr 195 200 205 Val Gly Leu Leu Asp Glu Ala Asp Asp Leu Asp Arg His 210 215 220 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of polyhistidine-tag <400> 5 caccaccatc accaccat 18 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of polyhistidine-tag <400> 6 His His His His His His 1 5 <210> 7 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of HDEL <400> 7 ctctagctcg ag 12 <210> 8 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HDEL <400> 8 His Asp Glu Leu 1 <210> 9 <211> 251 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of New BiP signal peptide <400> 9 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc a 251 <210> 10 <211> 666 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of Alfalfa mosaic virus capsid <400> 10 atgagttctt cacaaaagaa agctggtggg aaagctggta aacctactaa acgttctcag 60 aactatgctg ccttacgcaa agctcaactg ccgaagcctc cggcgttgaa agtcccggtt 120 gtaaaaccga cgaatactat actgccacag acgggctgcg tgtggcaaag cctcgggacc 180 cctctgagtc tgagctcttt taatgggctc ggcgtgagat tcctctacag ttttctgaag 240 gatttcgcgg gacctcggat cctcgaagag gatctgattt acaggatggt gttttccata 300 acaccgtcct atgccggcac cttttgtctc actgatgacg tgacgactga ggatggtagg 360 gccgttgcgc atggtaatcc catgcaagaa tttcctcatg gcgcgtttca cgctaatgag 420 aagttcgggt ttgagttggt cttcacagct cctacccatg cgggaatgca aaaccaaaat 480 ttcaagcatt cctatgccgt agccctctgt ctggacttcg acgcgcagcc tgagggatct 540 aaaaatccct cataccgatt caacgaagtt tgggtcgaga gaaaggcgtt cccgcgagca 600 gggcccctcc gcagtttgat tactgtgggg ctgctcgacg aagctgacga tcttgatcgt 660 cattga 666 <210> 11 <211> 971 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full insert seuqence(NR-AMV-His tag) <400> 11 tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gcttcctcta tgctctcttc cgctactatg 60 gttgcctctc cggctcaggc cactatggtc gctcctttca acggacttaa gtcctccgct 120 gccttcccag ccacccgcaa ggctaacaac gacactactt ccatcacaag caacggcgga 180 agagttaact gcatgcaggt gtggcctccg attggaaaga agaagtttga gactctctct 240 taccttcctg accttaccgg atccatgagt tcttcacaaa agaaagctgg tggtaaagct 300 ggtaagccta ctaagagatc tcagaactat gctgccttac ggaaagctca gcttccgaaa 360 ccaccggcct tgaaggtccc agtggtaaag ccaacaaata caatactgcc acagactggt 420 tgcgtttggc aatcgttagg gacgcctttg agtctttcat cttttaatgg attaggtgtt 480 agattccttt atagttttct taaggacttt gcaggaccaa gaatcctcga agaagatctg 540 atttacagga tggtgttttc cattacaccc agctacgctg gcaccttttg tcttactgat 600 gacgtgacca ctgaagatgg tagggcagtt gctcatggaa atcctatgca agaattccct 660 cacggcgcat ttcacgctaa tgaaaagttt gggtttgagt tggtttttac agctcctacc 720 catgctggaa tgcaaaacca aaatttcaag cattcctatg ccgttgcgtt gtgtttggat 780 tttgacgcac agcctgaggg atctaaaaat ccttcatata ggttcaacga ggtctgggtt 840 gagagaaaag cattcccacg agcaggaccc ctacgctctt tgattactgt aggactactc 900 gatgaagctg atgatcttga tcgtcatccc cggggtcacc accatcacca ccattagagc 960 tctaactcga g 971

Claims (24)

  1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 루비스코 트랜짓 펩타이드(Rubisco transit peptide)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진, AMV(Alfalfa mosaic virus) 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 식물체 발현용 재조합 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 것인, 식물체 발현용 재조합 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리히스티딘-태그(polyhistidine-tag)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하는 것인, 식물체 발현용 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 폴리히스티딘-태그는 상기 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 C-term 말단 또는 N-term 말단에 연결된 것인, 식물체 발현용 재조합 벡터.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 프로모터와 종결자(terminator) 사이에,
    (1) 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있거나; 또는
    (2) 루비스코 트랜짓 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 폴리히스티딘-태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 순차적으로 연결되어 있는, 식물체 발현용 재조합 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환 식물체.
  7. 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 캡시드 단백질의 분리정제 방법:
    (Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
    (Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
    (Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
    (Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
    (Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계; 및
    (Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계;
    여기서, 상기 (Step 2) 단계의 단백질 추출 완충용액은 10 내지 100mM 트리스(Tris), 100 내지 1500mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.01 내지 1% 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenylether), 및 5 내지 300mM 이미다졸(Imidazole)을 포함하고, pH는 7 내지 9이다.
  8. 삭제
  9. 제7항에 있어서,
    상기 아가로스는 Ni-IDA(Iminodiacetic acid) 아가로스인 것인, 분리정제 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 (Step 1) 단계는 재조합 벡터가 도입된 박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 것인, 분리정제 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 박테리아는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)인 것인, 분리정제 방법.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 양배추, 및 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물인 것인, 분리정제 방법.
  13. 제7항에 따른 분리정제 방법에 의해 용출된, 재조합 AMV 캡시드 단백질.
  14. 하기 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자(virus-like particle; VLP) 제조방법:
    (Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
    (Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체를 단백질 추출 완충용액과 혼합하여 식물체 혼합액을 제조하는 단계;
    (Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 혼합액에서 식물 찌꺼기(debris)가 제거된 혼합액을 회수하는 단계;
    (Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 혼합액을 아가로스(agarose)가 충전된 컬럼에 주입하여, 폴리히스티딘-태그가 연결된 재조합 AMV 캡시드 단백질을 상기 아가로스에 흡착시키는 단계;
    (Step 5) 세척 용액을 컬럼에 주입하여 세척하는 단계;
    (Step 6) 용출 용액을 컬럼에 주입하여 아가로스에 흡착된 상기 재조합 단백질을 용출시키는 단계; 및
    (Step 7) 상기 (Step 6) 단계에서 용출된 단백질이 포함된 단백질 추출 완충용액을 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액으로 교체함으로써 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계;
    여기서, 상기 (Step 7) 단계의 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액은 20 내지 100mM 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate), 및 100 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5이다.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제14항에 있어서,
    자가조립된 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 정제하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함하는, 제조방법.
  18. 제14항에 따른 제조방법에 의해 제조된 재조합 AMV 바이러스-유사 입자로서, 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것인, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자:
    (1) 크기-배제 크로마토그래피에서 분자량이 약 2,000kDa 이상으로 나타남;
    (2) 음성염색법으로 염색 후 투과전자현미경으로 관찰했을 때 지름이 10nm 이상 40nm 이하임; 또는
    (3) 초저온투과전자현미경으로 관찰하고 3D 구조(3-dimensional structure)를 재구성(reconstruction)했을 때, 3개의 복합체(trimeric complex)가 규칙적인 배열을 통해 총 20개가 조립된 구형의 VLP(3x20)임.
  19. 하기의 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물의 제조방법:
    (Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
    (Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
    (Step 3) 20 내지 100mM 피로인산나트륨(Sodium pyrophosphate), 및 100 내지 1000mM 염화나트륨(NaCl)을 포함하고, pH가 6.9 내지 7.5인 바이러스-유사 입자 조립용 완충용액을 이용하여, 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 재조합 AMV 캡시드 단백질을 바이러스-유사 입자로 제조하는 단계;
    (Step 4) 상기 (Step 3) 단계에서 수득한 바이러스-유사 입자를 극초저온 전자현미경을 이용하여 3D 구조를 규명하는 단계; 및
    (Step 5) 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 백신 조성물을 제조하는 단계.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 백신 조성물의 제조방법은 애주번트(adjuvant)를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  21. 제19항에 있어서,
    하기 특징 중 하나를 만족하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
    (1) 상기 (Step 1) 단계의 재조합 벡터는 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 더 포함하며, 상기 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 AMV 캡시드 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 N-term 말단에 연결됨; 또는
    (2) 상기 (Step 5)는 바이러스-유사 입자의 표면에 항원 단백질을 결합(conjugation)시키는 단계를 포함함.
  22. 제19항에 따른 제조방법에 의해 제조된, 백신 조성물.
  23. 하기의 단계를 포함하는, 재조합 AMV 바이러스-유사 입자를 포함하는 약물 전달체의 제조방법:
    (Step 1) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 단계;
    (Step 2) 상기 (Step 1) 단계에서 얻은 형질전환 식물체로부터 재조합 AMV 캡시드 단백질을 분리정제하는 단계;
    (Step 3) 상기 (Step 2) 단계에서 수득한 재조합 AMV 캡시드 단백질 용액을 제1 완충용액으로 교체하여 재조합 AMV 캡시드 단백질 삼량체를 제조하는 단계, 여기서, 상기 제1 완충용액은 10 내지 100mM Tris, 및 100 내지 500mM 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5임;
    (Step 4) 상기 (Step 3)의 용액에 약물을 첨가하는 단계; 및
    (Step 5) 상기 (Step 4)의 제1 완충용액을 제2 완충용액으로 교체하여 바이러스-유사 입자를 제조하는 단계, 여기서, 상기 제2 완충용액은 20 내지 100mM 피로인산나트륨, 및 100 내지 1000mM 염화나트륨을 포함하고, pH는 6.9 내지 7.5임.
  24. 삭제
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